EP1339484A1 - Procede et dispositif de fabrication d'un support porteur d'une pluralite de sequences polynucleotidiques et/ou peptidiques differentes - Google Patents

Procede et dispositif de fabrication d'un support porteur d'une pluralite de sequences polynucleotidiques et/ou peptidiques differentes

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EP1339484A1
EP1339484A1 EP00964379A EP00964379A EP1339484A1 EP 1339484 A1 EP1339484 A1 EP 1339484A1 EP 00964379 A EP00964379 A EP 00964379A EP 00964379 A EP00964379 A EP 00964379A EP 1339484 A1 EP1339484 A1 EP 1339484A1
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EP
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localized
ogn
support
wells
sequences
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Application number
EP00964379A
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German (de)
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Jean-Yves; Jezequel
Michel Cabrera
Jean-René MARTIN
Eliane Souteyrand
Mehdi Jaber
François BESSUEILLE
Jean-Pierre Cloarec
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Centrale de Lyon
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Centrale de Lyon
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Publication date
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    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the field of the invention is that of the manufacture of microsensors useful in the analysis of nucleotide and / or peptide sequences. This type of analysis opens access to the detection and identification of all or part of genes or peptides which may be the tracers of higher biological entities (cells, tissues, bacteria, viruses, fungi, yeasts,. ..).
  • the production in question in this presentation is an anchoring and / or a localized chemical synthesis of polymer probes (oligonucleotides and / or peptides) on a support intended to form a network of probes, some of which are likely to pair with target sequences contained in the analysis medium.
  • polymer probes oligonucleotides and / or peptides
  • the revelation of these pairings can be carried out using fluorescent, colored, radioactive markers or by electronic transductance.
  • the invention relates to a method of manufacturing a support carrying on at least one of its faces a plurality of sequences - poly - preferably oligo - nucleotide and / or peptide (OGN sequences) advantageously different from each other and apparent from their complementary (target sequences) by affine interaction, these OGN sequences being obtained by localized chemical synthesis, in the presence of volatile solvents.
  • OGN sequences oligo - nucleotide and / or peptide
  • the invention also relates to a method for detecting and / or identifying target OGN sequences using biosensors manufactured by the above-mentioned method.
  • the OGN sequences correspond to poly- preferably oligo-nucleotide and / or peptide sequences.
  • it can be: - oligonucleotides each carrying an ATCG nitrogen base,
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • nucleic acid sequences this need for an efficient analysis tool is expressed for numerous applications such as for example the study of gene mutation, the detection of pathogens, or even the sequencing of genomes.
  • the principle of the analysis of nucleotide and / or peptide sequences is relatively simple since it involves reading the arrangement of the 4 nucleotide comonomers A, C, T and G in the case of polynucleotides and PNAs and the arrangement about twenty amino acids with regard to the polypeptides. This simplicity of principle is only matched by the difficulty arising from the considerable amount of information to be processed.
  • the genome of the bacterium Escherichia Coli which is one of the shortest, contains 4,000 genes with 4.7 million nucleotides while the human genome consists of approximately 100,000 genes, which represents 3 billion nucleotides. . Added to this is the fact that the decryption of a gene or a protein is nothing compared to the understanding of the complex action of these nucleic or peptide polymers in normal or abnormal living mechanisms.
  • a support for example a glass plate, comprising a network or a complete set of oligonucleotide sequences (OGN probes) capable of hybridizing with complementary target OGN sequences contained in the analysis medium.
  • OGN probes oligonucleotide sequences
  • the 5 'ends of the nucleotides are protected by DMT (dimethoxytrityl) and the 3' ends by ⁇ -cyanoethylphosphoramidite.
  • the couplings of the nucleotides of rank 1 and on the silanes and of the nucleotides of rank 2 to n between them are carried out using tetrazole.
  • the solvent is acetonitrile.
  • This reaction is carried out under anhydrous conditions in a sealed container.
  • This container includes the glass plate covered with a silicone rubber ribbon which is hollowed out to leave only the edges which define a single reaction site.
  • a Teflon plate of the same size and thickness as the glass support plate covers the reaction site and the silicone border.
  • a short plastic tube connects the reaction volume with the outside and allows the injection and draining of the reaction liquids as well as the filling of the reaction volume with argon, these operations being carried out by means of a syringe. After each nucleotide coupling, this assembly is. disassembled to continue the reaction by immersing the support of the reagent baths or reaction liquids, to then be reassembled in order to carry out the following coupling.
  • FODOR et al corresponding to the article Science vol 251, 767 - 773, 1991; discloses an in situ synthesis localized on the support, photochemically.
  • the nucleotide bases are protected at their 5 ′ end by a photolabile group such as nitrotératryloxycarbonyl (NVOC) which replaces the protective group (DMT), used in the synthesis according to the chemistry of phosphoramidites.
  • NVOC nitrotératryloxycarbonyl
  • DMT protective group
  • the support is a glass plate carrying amine or hydroxyl groups also protected by N OC. The action of localized light radiation on the substrate leads to the photochemical cleavage of the photolabile group and to the deprotection of the irradiated surface.
  • technique 1 a block of channels is used comprising a set of parallel grooves which are brought into contact with the surface of the substrate so as to thus define the channels in which the reaction liquids are intended to circulate.
  • the method then consists in fixing one or more different monomers of rank 1, in dismantling the substrate assembly, channel block, for the steps of washing the protections, in reassembling the assembly to anchor the monomer (s) of rank 2 and so on until the monomer of rank n.
  • the combinatorial strategy consists of moving the substrate relative to the block of channels in rotation (90 °) or even in translation. According to a variant of technique 1, there is provided as shown in FIG.
  • a support comprising a plurality of reaction wells and a reagent dispenser comprising a set of tubes for dispensing reagents or reaction liquids into the wells of the support.
  • a mask between the distributor tubes and the wells of the support so as to control the supply of the reaction liquids in given regions of the support.
  • this PCT application generally discloses supports comprising at least 10,000 reaction regions per cm 2 . No concrete embodiment of this type of support is exemplified.
  • This PCT application also describes means for distributing reaction liquids in these reaction regions of the support.
  • the inkjet printer heads are cited as examples of means for distributing reaction liquids in the reaction regions of the support.
  • reaction regions on the support are those of obtaining surface tension wells on the surface of the support by creating hydrophobic zones delimiting hydrophilic zones, for example by applying a layer of hydrophilic resin carrying protected hydrophobic groups and by deprotecting these hydrophobic groups in the zones intended to form the contours of the surface tension wells.
  • the reaction regions can be formed by three-dimensional wells delimited by walls as shown in FIG. 12.
  • OGN sequences of oligonucleotides are synthesized in all the reaction regions.
  • the block of reaction liquid circulation channels is used which it is attached to the surface of the substrate already comprising OGN sequences of 6 seas each.
  • the 7 th nucleotide is distributed by a set of parallel channels of given direction and the 8 th nucleotide is distributed by flows circulating in channels whose direction is perpendicular to that of the channels intended to receive the 7 em ⁇ nucleotide.
  • Patent No. 5,658,802 of the United States of America relates to a process of ex and in situ synthesis based on the localized projection of drops of reagents on a substrate, using piezo systems. electric. Since in practice the most widely used solvent for diluting nucleotide bases is acetonitrile and this solvent has a low wetting angle, this results in problems of spreading the drops of solvent on the substrate on several hundred microns. This makes it difficult to locate reactions on an appropriate scale. In addition, the acetonitrile thus used is volatile and therefore subject to massive evaporation.
  • the device according to US Pat. No. 5,658,802 comprises a substrate of the type of those used for the production of integrated circuits optionally having patterns. There is no question of delimiting reaction sites of very small area according to this patent.
  • Each piezoelectric ejection means is associated with a liquid reservoir. All these piezoelectric ejection means and its reservoirs form a distribution assembly. Also provided in this device are positioning means, means for ejecting liquid and / or the substrate.
  • PCT application WO 94/27,719 concerning a method and a device for producing a chemical reaction network on the surface of a support.
  • surface tension wells are formed on the surface of the support using photoresists of the phenol / formaldehyde or polymethacrylate type.
  • the use of means for distributing reaction liquids of the piezoelectric inkjet printer head type is recommended in this PCT application.
  • one of the essential objectives of the present invention is to provide a method and a device for manufacturing a support carrying on at least one of its faces a plurality of poly - preferably oligo - sequences. nucleotide and / or peptide, these OGN sequences different from each other being, on the one hand, apparent to their complementary by affine interaction and, on the other hand, obtained by chemical synthesis in the presence of volatile solvents;
  • This process should also allow obtaining networks comprising from a few tens to several hundred million OGN sequences, and this with good chemical yield and subsequently with a low percentage of error in the sequences.
  • Another essential objective of the present invention is to provide a simple, economical and industrial device for implementing the above process.
  • Another essential objective of the present invention is to provide a support usable in the method and in the above-mentioned device, which is easy to obtain and which allows optimal implementation of the fabrication of OGN sequence networks.
  • Another essential objective of the present invention is to provide a method for detecting and / or identifying target OGN sequences, involving a biosensor comprising a support carrying a network of OGN probes obtained by the above-mentioned method, such a detection and / or identification method having to be most reliable and most specific.
  • the present invention which firstly relates to a process for manufacturing a support carrying on at least one of its faces a plurality of poly-preferably oligo- nucleotide and / or peptide, these sequences (OGN), advantageously different from each other, being, on the one hand, visible to their complementary by affine interaction and, on the other hand, obtained by chemical synthesis in the presence of volatile solvents; said process essentially consisting in: 1) using a support whose (or the) face (s) intended (s) to carry the OGN present) a network of reaction wells, each of these wells being intended to serve as seat for anchoring and / or localized chemical synthesis (s) of a given OGN sequence; these wells being obtained by application of a photocrosslinkable resin, by crosslinking of this resin by exposure to actinic radiation in the zones intended to define the wells and by elimination of the non-crosslinked resin to obtain a grid of resin forming the walls which delimit the wells ;
  • the method according to the invention corresponds to the production of oligonucleotide networks by chemical synthesis in situ (or even ex situ) which better meets the needs of the practice than the methods of the prior art.
  • the method according to the invention makes it possible to envisage a wide diffusion of the technology of the OGN networks in particular of oligonucleotides in all the techniques of genetic analysis applicable in medicine and in bioindustries.
  • the method according to the invention makes it possible to flexibly manufacture networks of very diverse composition, combinatorial or not, on supports of a few square millimeters at 300 cm 2, for example silicon plates, the surface of a pixel. being between 1000 x 1000 ⁇ m 2 and 10 x 10 ⁇ m 2 .
  • the number of pixels can therefore vary from a few units to several hundred million units.
  • the OGN sequences which are fixed and possibly which are produced in situ on the support can be likened to probes capable of reacting with complementary target sequences by affine interaction.
  • These OGN sequences advantageously consist of several comonomers which are nucleotides, and / or repeating units of Nucleic Acid Peptide (APN) and / or amino acids.
  • APN Nucleic Acid Peptide
  • the number of nucleotide and / or APN and / or amino acid comonomers that these polymers, or more precisely these oligomers, count, can vary from a few units to a few tens of units, preferably from 15 to 25 units.
  • the material constituting the support is chosen from the group of material comprising: glass, quartz, silicon optionally coated with at least one layer of oxide or nitride.
  • Silicon or other semiconductor materials are preferred in particular in the case where the support is intended to be integrated in a biosensor which operates on a mode of revealing pairings of the electronic transductance type, for example with field effect.
  • photocrosslinkable resin preferably selected from the group comprising: positive or negative resins, preferably in the subgroup comprising negative resins and more preferably still in the class comprising: (meth) acrylate, epoxy, polyester and / or polystyrene resins photocrosslinkable by the radical and / or cationic route.
  • positive resin is meant in the sense of the invention a resin made very soluble by irradiation.
  • negative resin is meant in the sense of the invention a resin made insoluble by irradiation.
  • Negative resins more especially used, have the advantage of making it possible to obtain thick chemically resistant layers which adhere to the substrate.
  • the removal of the non-crosslinked resin at the unmasked locations corresponding to the wells is carried out by dissolving the resin in an organic solvent.
  • an organic solvent may, for example, be acetone, ⁇ -butyrolactone, Propylene-Glycol-Methyl-Ether-Acetate (PGMEA), acetonitrile or even other solvents known to those skilled in the art.
  • PMEA Propylene-Glycol-Methyl-Ether-Acetate
  • acetonitrile even other solvents known to those skilled in the art.
  • FIGS. 1 and 2 provide other details useful for the non-limiting description of the support and its production.
  • the support is treated at the surface so as to give it anchoring sites capable of forming non-labile bonds with the leading comonomers of the OGN sequences, this treatment preferably being a silanization with using an epoxidized alkoxysilane or else an ester function before and / or after the preparation of the network of microwells.
  • the silanizing agent is glycidoxypropyltrimethoxy-silane.
  • silanizing agents mention may be made of glycidoxypropyldimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, or alternatively carboxymethyltriethoxysilane.
  • this silanization is to provide solid anchor points for all of the rank 1 monomers (e.g. nucleotides) constituting the OGN n-sequences of the network produced in situ.
  • the bridging of silanes with the monomers (nucleotides) of rank 1 is advantageously carried out by means of hydroxyl groups, for example.
  • a saturation step preferably using a gas stream comprising suitable saturating vapors and a neutral gas. In doing so, the evaporation rate of the solvents used is controlled and all the microreactions necessary for obtaining the network are controlled.
  • the evaporation is controlled by its saturation technique, it is possible to be able to cause the evaporation of the solvents so as to stop the reactions localized on the support.
  • the carrier gas used for saturation can be: argon or helium.
  • this gas flow is such that it determines an overpressure in the reaction chamber relative to the surrounding atmosphere.
  • the gas flow determines a pressure of 0.01 to
  • the localized supply means and the support are movable relatively with respect to each other in the three dimensions X, Y, Z, by means of displacement.
  • OGN for example oligonucleotides
  • fluids gases, solvents, etc.
  • reagents bases, deprotection agents, coupling agents, etc.
  • These fluids (liquid consumables) and these reagents can be classified into two categories: 1) The fluids and reagents intended to be sent pixel by pixel to obtain the network and which will be designated below by
  • non-localized liquid the elimination of liquid according to step 3 (iii) of the process is carried out so that the wells concerned are free of liquid up to at least 90% of their volume, preferably at least 95% and more preferably still at least 98%.
  • the liquid is removed by drying, by injecting gas, preferably neutral, into the reaction vessel, and / or by increasing the temperature of the reaction vessel and / or of the support and / or by lowering the vapor pressure of the liquid to be eliminated in the reaction vessel.
  • gas preferably neutral
  • the method according to the invention makes it possible: to provide the support with a superstructure defining microreactors corresponding to the pixels of the network and making it possible to control the spreading of localized liquids; to control the rate of evaporation of the solvents from the liquids located in the microreactors, so as to control the chemical microreactions necessary for obtaining the network of OGN sequences; and to dispose of the used chemicals at the end of these microreactions so as to continue manufacturing the network.
  • the present invention relates to a device for implementing the method as defined above.
  • This device is characterized in that it comprises: at least one support whose (or the) face (s) intended to carry the OGN, present) a network of reaction wells, each of these wells intended to serve as a seat for anchoring and localized chemical synthesis of a given OGN sequence, these wells being obtained by application of a photocrosslinkable resin, by crosslinking of this resin by exposure to actinic radiation in the zones intended to define the wells and by elimination of the non-crosslinked resin to obtain a grid of resin forming the walls which delimit the wells; at least one reaction enclosure intended to contain the support; means for localized supply of the reaction wells with specific localized liquids (reagents / consumables) suitable for allowing the anchoring and synthesis of a given OGN sequence in each of the wells of the support, means for moving the supply means localized relative to the support and / or vice versa; means for non-localized supply of the
  • FIG. 1 shows a perspective view of the support on which the OGN sequence network is intended to be manufactured in accordance with the invention.
  • FIG. 2 is a view in vertical section along line II-II of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a schematic representation of a first embodiment of the device according to the invention.
  • FIG. 3A is a schematic view of a variant of a drop projection system of localized reagents.
  • FIG. 4A is an extract from FIG. 3 comprising the reaction vessel, the support and the localized supply means, this FIG. 4A illustrating the displacement of the support and of a part of the reaction vessel with respect to the supply means located along the X axis.
  • FIG. 4B is a sectional view along the line IV-IV of FIG. 4A, this FIG. 4B illustrating the movement of the support and of a lower part of the reaction vessel with respect to the supply means located along the Y axis.
  • FIG. 4C uses the same elements as FIG. 4A but illustrates for its part the displacement of the lower part of the reaction vessel and of the support with respect to the supply means located along the axis of the Z.
  • FIG. 5 and 6 are enlarged photographs of a support 1 comprising a grid 3 made of photoresist defining several tens of microwells intended to serve as seats for chemical reactions of anchoring and / or synthesis of OGNs.
  • the difference between Figs. 5 and 6 is due to the presence of a drop of reagents located in the microwell surrounded by a circle of the support of FIG. 6.
  • - Fig. 7 is a general schematic perspective view of a device according to a second embodiment.
  • FIG. 7 is a detailed perspective view of FIG. 7 showing the support 1 and its displacement means 7 as well as the localized supply means and their displacement means 30.
  • Figs. 9A, 9B, 9C and 9D represent the non-localized supply means.
  • FIG. 9A is a front view of the piston 80 belonging to these non-localized supply means 8.
  • FIG. 9B is a diametrical section view of the piston of FIG. 9A.
  • FIG. 9C is a top view of the piston 80 of FIGS. 9 A and 9B.
  • - Fig. 9D is a partial view in diametral section of the piston 80 applied to the support 1.
  • Fig. 10 represents the network 64 oligonucleotides with a length of 3 seas each produced in the examples.
  • Figs. 1 and 2 show the support 1 which is an integral part of the device according to the invention.
  • this support 1 comprises:
  • At least one substrate plate 2 made from a material chosen from the group comprising: glass, quartz, silicon optionally coated with at least one layer of oxide or nitride;
  • the grid 3 of resin is compatible with the treatments of the substrate necessary for the attachment of the monomers (nucleotides) of rank 1.
  • This grid 3 can be manufactured before or after these treatments.
  • This grid 3 of resin adheres to the plate 2 of substrate during the manufacture of the OGN sequence network. It can possibly be eliminated before being used in a biosensor although this grid is not in itself troublesome for the operations of reading the networks in these biosensors.
  • reaction wells 4 defined by this grid 3 define as many reaction sites which will give rise to the pixels of the array. These wells limit the spread of very wetting solvents such as acetonitrile.
  • This network or this grid 3 of reaction wells 4 is obtained by conventional lithography techniques with positive or negative resins, by depositing resin on the substrate, and, for example in the case of negative resins, by exposing the corresponding zones. to the walls with actinic radiation so as to crosslink them and by dissolving selectively the noncrosslinked zones so as to form the wells.
  • microwells of height varying between 0.1 to 1000 ⁇ m, preferably from 50 to 500 ⁇ m with surfaces of between 10 ⁇ 10 ⁇ m and 1000 ⁇ m ⁇ 1000 ⁇ m.
  • the network or grid 3 of reaction microwells 4 makes it possible to localize the chemical reactions independently of the nature and / or of the preparation of the support, so that it is possible to use supports of various, non-homogeneous nature having undergone physicochemical surface treatments (oxidation, silanization, nitriding, etc.).
  • the device of FIG. 3 comprises a support 1 having on its surface reaction wells 4 defined by a grid of resin 3, this support 1 being contained in a reaction enclosure designated by the general reference 5.
  • the device of FIG. 3 also includes localized supply means 6, displacement means 7 for the support 1 relative to the localized supply means 6.
  • means 8 are provided. These means 8 are associated with means 9 for evacuating non-localized liquids.
  • the device further comprises members 10 for saturation of the reaction vessel 5 using a gas flow loaded with neutral gas and solvent.
  • References 11, 12 and 13 in FIG. 3 respectively designate the localized liquid, non-localized liquid and effluent drain containers.
  • the automated control of the process is ensured by a memory 15 and a central unit 16 for reading the memory 15 and for generating control signals (dotted arrows).
  • chassis and / or gantries The various constituent elements of this device are, in practice, supported by chassis and / or gantries and / or adapted bases.
  • the device is characterized in that the reaction chamber comprises a sealed bellows one of whose ends carries the localized supply means and whose other end has , opposite the latter, a reaction site intended to receive the support and comprising the non-localized supply means, the carrying end of the localized supply means being preferably fixed and the other carrying end of the support preferably movable in the three dimensions x, y, z, by means of displacement.
  • the device is characterized in that the localized supply means are capable of being set in motion in the 3 dimensions x, y, z under the action of the means displacement, relative to a fixed part of the reaction vessel intended to receive the support and associated with the non-localized supply means.
  • Fig. 3 corresponds to an example of a device according to the first embodiment of the first embodiment, in which the locahsee supply means are fixed relative to the movable part of the enclosure reaction intended to receive the support.
  • This movable part is provided to the displacement means 7 in the directions x, y, z.
  • the reaction chamber 5 is composed of a lower part 5 ⁇ which is useful as a receptacle for the support 1, an upper part 5 2 equipped with part of the localized supply means 6, and with an intermediate part 5 3 constituted by a sealed bellows connecting the lower 5 ⁇ and upper 5 2 parts to each other.
  • the upper part 5 2 of the reaction enclosure may or may not be integral or not with the bellows 5 3 .
  • the waterproof 5 3 bellows is advantageously made of a chemically inert material such as polytetrafluoroethylene (TEFLON ®).
  • the localized supply means 6 comprise a projection system.
  • the projection system is advantageously chosen from the following systems:
  • the projection system is of type 1-a. and comprises at least one nozzle 6 ⁇ for spraying or depositing localized liquids.
  • This piezoelectric nozzle 6 ⁇ is connected, via a conduit 6 2 , to one or more localized liquid tanks 11.
  • piezoelectric systems Another advantage of piezoelectric systems is the commercial availability of products with 64 to 128 6 X nozzles controlled independently at frequencies from 1 to 10 KHZ, for example the company's P64 and P128 systems.
  • the projection system can be of the l.b. type. drop by jet interrupted by electrostatic effect as described in the article by J.J. ELTGEN mentioned above. This system achieves higher resolutions
  • the variant of the type 2 projection system as represented in FIG. 3 A involves, in place of the piezoelectric nozzle or nozzles of the type (6 ⁇ ), mechanical parts (20) produced from of materials inert towards non-localized liquid reagents. It can be stainless steel, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyamide (NYLON ® ).
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • NYLON ® polyamide
  • Each piece (20) has a fine through channel (21).
  • the inlet opening (22) of this channel (21) is connected via a conduit (23) to a solenoid valve (24) which governs the admission of liquid located in the channel (21) of the piece (20).
  • This solenoid valve (24) is supplied with localized reactive liquid (25) by a reservoir (26).
  • a neutral gas (28) for example argon
  • overpressure e.g.: 0.5 bar
  • the conduits (23) (27) whose diameter is for example 1 mm are advantageously made of the same material as the part (20) e.g.: PTFE.
  • the outlet opening (29) - that is to say the nozzle - of the part (20) is arranged opposite a substrate 1 comprising microwells 4 defined by a grid 3 made of photoresist.
  • the diameter of the nozzle (29) is for example 100 ⁇ m.
  • the solenoid valve (24) is controlled by the central electronic control unit 16 according to FIG. 3 (not shown in Fig. 3A). This unit 16 is able to command the opening (eg: 0.1 to 10 ms) for a short controlled period and then the closing of the solenoid valve (24) so as to expel a small amount (30) of localized reactive liquid ( 25) and to supply the microwell 4 of the support 1.
  • This unit 16 is able to command the opening (eg: 0.1 to 10 ms) for a short controlled period and then the closing of the solenoid valve (24) so as to expel a small amount (30) of localized reactive liquid ( 25) and to supply the microwell 4 of the support 1.
  • the quantity (30) delivered is adapted to a support 1 with microwells 4 with a surface area of 400 ⁇ 400 ⁇ m and a height of 400 ⁇ m.
  • the elements (20) (21) (29) can be, for example, the constituent elements of a microsyringe with a diameter less than 100 ⁇ m.
  • the solenoid valve (24) can be made up of the valve INKX 0510100 from the company LEE COMPANY (USA) which also forms a system with 7 nozzles (29) under the reference INZX 0510100.
  • the elastomer valve can be replaced with a fluorinated elastomer valve (KALREZ ® or CHEMRAZ ® ).
  • the localized supply means 6 also comprise a pipe 6 3 for supplying pressurized gas allowing the localized liquid contained in the reservoir 11 to be conveyed to the nozzle 6j via the pipe of the pipe 6 2 .
  • the latter is equipped with a solenoid valve 6 4 for controlling the projection.
  • the elements 6 to 6 which form the localized supply means 6 are controlled by the central control unit 16 which advantageously governs the opening and closing of the valve 6.
  • the central unit 16 also controls the supply of propellant gas through line 6 3 . In the most frequent case where there are several reservoirs 11 of localized liquids, the central unit 16 also governs the selection of the liquid to be sprayed using appropriate organs.
  • the non-localized supply means 8 comprise a supply conduit 8 ⁇ for liquid not located in the lower part 5 ⁇ of the reaction vessel containing the support.
  • This pipe 8 X connects an opening 8 2 formed in the lower part 5 of the reaction vessel 5 to the reservoir 12 of localized liquid.
  • This pipe 8 is equipped with a solenoid valve 8 3 making it possible to control the flow of non-localized liquid intended to supply the support.
  • These non-localized supply means 8 also comprise a conduit 8 4 for propellant gas supply making it possible to generate the flow of liquid not located in the conduit 8 ⁇ . It is easily understood that it is possible to include in these non-localized supply means 8 other non-localized liquid tanks 12 by providing means for selecting the non-localized liquid to be introduced into the lower part of the reaction vessel 5 , on the support 1. Just like the means 6 of localized supply, the means 8 of non-localized supply are controlled by the central unit 16 (dotted arrows) which controls the routing of the non-localized liquids via propellant gas supplied via line 8 4 and via solenoi
  • These means 8 are associated with means 9 for evacuating non-localized liquids which are brought in by means 8 and which temporarily stay in the lower part 5j of the reaction vessel 5, to drown the support 1.
  • These evacuation means 9 comprise a pipe 9 ⁇ connecting an outlet orifice 9 2 formed in the lower part 5 ⁇ of the enclosure 5 and the effluent tank 13.
  • the pipe 9 ⁇ is equipped with a solenoid valve 9 3 controlled by the central unit 16 which governs effluent discharge at the appropriate time.
  • the engine of this evacuation can be for example an overpressure of gas and / or the action of a suction pump (not shown in Fig. 3) making it possible to draw off the liquids.
  • the members 10 allowing the circulation of a saturation flow in volatile solvents comprise a solvent tank 10 ⁇ , an inlet 10 2 and an outlet 10 3 of the saturation gas stream in the lower part 5 t of the reaction vessel.
  • the flow is generated by a neutral gas such as argon penetrating through line 10 into the reservoir 10 ⁇ of solvent and carrying with it solvent vapors in line 10 5 which enters the enclosure through inlet 10 2 and which can be evacuated from the latter via the outlet 10 3 which is extended by an evacuation duct 10 6 .
  • the conduits 10 s and 10 ⁇ comprise solenoid valves 10 7 and 10 8 controlled by the central unit 16 which thus controls the flow of saturation gas.
  • the saturation members 10 of the reaction vessel are designed so as to allow the circulation of a saturating gas flow comprising vapors of the volatile solvent (s) used and at least one neutral gas.
  • the optional gas supply members 14 communicate with the reaction vessel via an inlet made in the lower part.
  • These organs 14 are equipped with a solenoid valve not referenced and also managed by the central unit.
  • these means 7 are shown in a manner symbolic in fig. 3 which also shows through the dotted arrow the control of these displacement means 7 to the central unit 16.
  • the displacement means have sufficient chemical resistance to the reagents used for the synthesis of OGN, in particular the solvent (s) used for saturation.
  • These displacement means 7 can be constituted by any known and appropriate means for setting in motion the lower part 5 X of the reaction vessel 5.
  • This lower part 5 t has, thanks to the bellows 5 3 , a certain mobility relative to the upper part 5 2 of the enclosure 5 comprising the projection nozzle 6 ⁇ .
  • rack / pinion systems in the three directions which can be driven mechanically, of sliding systems or of systems comprising cross-motion carriages and / or micrometric displacement plates motorized in translation and / or in rotation.
  • Commercial products corresponding to these systems are offered in particular by the companies MICROCONTROLE, NEWPORT, OWIS.
  • Figs. 4A, 4B and 4C illustrate the displacements along x, y and z of the support 1 carried by the lower part 5 ⁇ relative to the projection nozzle 6 ⁇ .
  • Such displacement means make it possible to supply the reaction wells 4 of the support 1 with localized liquid.
  • FIGS. 5 and 6 are enlarged photographs of a support (1) comprising several tens of microwells (4) each having a surface of 150 ⁇ 150 ⁇ m and a height of approximately 100 ⁇ m. These microwells are defined by a grid (3) of photocrosslinked epoxy resin.
  • the photograph of FIG. 5 shows the microwell array 4, in particular the microwell 4 'surrounded by a circle, empty of any trace of localized liquid.
  • the photograph of FIG. 6 shows the network of FIG.
  • the embodiment of the method according to the invention described in Figures 3, 3 A and 4 A, 4B, 4C has the advantage of being easy to perform with a flexible PTFE bellows.
  • the saturated volume is low, which facilitates its control (chemical composition, concentration (s) of solvent (s), pressure, temperature, etc.).
  • the displacement means are entirely outside the saturated volume and are therefore protected from corrosion.
  • the amplitude of the mean displacements of microdeposition / bellows is limited to the deflections of the bellows, ie a few centimeters.
  • Figs. 7, 8 and 9 show a second embodiment of the device according to the invention.
  • the essential differences between this second mode and the first mode described above are due to the fact that, in addition to the support that can be displaced using the means 7 for moving the support 1 along the X axis, the means 6 of localized feed are movable along the Y axis and the means 8 of non-localized feed are movable along the Z axis and have large deflections, at least along the axes X, Y to allow working on large substrates.
  • the means 7 for moving the support 1, as well as the means 30 and 40 for moving the localized 6 and non-localized 8 supply means respectively, are at least partially included in the reaction enclosure 5.
  • the latter is advantageously of greater dimension as the device according to the first embodiment, for example 1.5 x 1.5 x lm.
  • This enclosure 5 is designed so as to be able to be saturated, for example, with a gas flow charged with neutral gas such as argon and with vapor of volatile solvent.
  • the saturation bodies 10 of the enclosure 5 are provided. They are identical to those described for the first embodiment of the device according to the invention. Identical elements are designated by the same references.
  • the device according to the second embodiment is more suited to an industrial operating mode.
  • the important thing in this regard is to be able to constantly maintain the saturation of the reaction chamber, as it is clear that any break in saturation would entail a significant consumption of time for re-saturation, given the large volume of this chamber.
  • this second embodiment of the device is that the parts of the displacement means 7, 30, 40 arranged outside the enclosure 5 are the motors 31, 41 and 71 as well as the electrical supplies (not shown in the drawings) of said engine while the internal mechanical parts to (5) described in more detail hereinafter moving means 7, 30, 40 are made from inert materials such as TEFLON ® (PTFE), steel stainless, perfluorinated elastomers (KALREZ ® , CHEMRAZ ® ), polyamides (NYLON ® ).
  • TEFLON ® PTFE
  • steel stainless perfluorinated elastomers
  • PALREZ ® perfluorinated elastomers
  • CHEMRAZ ® perfluorinated elastomers
  • polyamides NYLON ®
  • Fig. 8 shows in more detail the localized supply means 6 with their displacement means 30 along the Y axis, as well as the support 1 and these displacement means 7 along the X axis.
  • the wall of the reaction vessel 5 is symbolized in FIG. 8 by mixed lines.
  • the means 7 for moving the support or the substrate 1 comprising a grid of resin 3 defining a network of reaction microwells 4, comprise a translational carriage 72 capable of sliding on sliding guides 73 under the action of a motor 71, capable of generating a rotational movement transformable into translation by means of a worm 74 transmission.
  • the sliding guides 73 which are for example metal rods of polygonal or circular section, and the worm gear 74 for transmission are parallel to each other.
  • Each end of the sliding guides 73 is provided with a stop block 75.
  • the end of the transmission worm 74 opposite to that connected to the motor 71 is also equipped with a stop block 76.
  • the end parts of the elements 73 , 74, the stop blocks 75, 76 and the motor 71 are arranged outside the enclosure 5.
  • the sealing at the level of the passages of the sliding guides 73 and of the transmission endless screw 74 through the wall of the enclosure 5, are fitted with O-rings, for example made of KALREZ.
  • the stop blocks 75 of the sliding guides 73 can be an integral part of the wall of the enclosure 5 so as to save openings which must be sealed.
  • the materials constituting the parts located at least in part in the enclosure 5 are chosen from materials resistant to chemical reagents for anchoring and / or synthesis, in particular of OGNs. Examples of constituent materials include PTFE, stainless steel, KALREZ.
  • displacement means 30 are designed to ensure displacement in translation along the Y axis of a microphone station 60 -deposits of liquids or reagents located in the microwells 4 in the network of the support 1.
  • displacement means 30 comprise a motor 31 connected to one end of a screw without end 34 of transmission terminated at the other end by the stopper 36, as well as sliding guides 33, the ends of which carry the stopper block 35. As indicated above, some of these elements and the terminal part of others these elements are arranged outside the enclosure 5. Reference will be made to the description of the means 7 above for more details.
  • the micro-deposition station 60 capable of being driven by the endless screw 34 in translation along the sliding guides 33 (along the Y axis), it is formed, on the one hand, by a carriage provided with an element 61 carrying reagent bottles 62 (only one of which is shown in FIG. 8) and parallel to the Y axis and, on the other hand, a battery 64 which supports a series of micro-organ deposits 65 (only one of which is shown in Fig. 8).
  • This battery 64, parallel to the Y axis, is laterally opposite the element 61 carrying reagent bottles 62.
  • the elements of the means 6 and 30 disposed inside the saturated enclosure 5 are made of materials resistant to the reagents used, for example acetonitrile, and / or are sealed from said pregnant. Examples of resistant materials are given above.
  • the reagent bottles 62 could be arranged outside the working volume defined by the reaction enclosure 5. It would then be necessary to provide the "ad hoc" fluidic connections.
  • the difference along the axis Z between the substrate or support 1 and the micro-deposit members 65 is adjusted so as to address the drops of reagent located on the entire network of microwells 4 defined by the grid of resin 3 of the support 1, using the movements of the carriages 60 and / or 72 along the axes X and / or Y.
  • Figs. 9A, 9B, 9C, 9D detail the non-localized supply means 8 and more specifically a particular element thereof constituted by a piston 80. As shown in FIG. 7, the piston 80 of the non-localized supply means 8 is displaceable in translation along the axis Z.
  • the displacement means 40 provided for this purpose comprise, analogously to the displacement means 7 and 30 described above, a motor 41 connected to an endless screw 44 for translational translation of the Z axis of the piston 80 along two sliding guides 43 parallel to said axis Z and to the endless screw 44.
  • the lower ends of the guides 43 and of the screws 44 include stop blocks 45 and 46.
  • the piston 80 is integral with a carriage 81 cooperating with the displacement means 40.
  • the vertical axis Z of the piston 80 is perpendicular to the axis X of movement of the support 1 and to the axis Y of movement of the station.
  • the underside of the piston 80 is provided with an annular O-ring 82 produced, preferably in KALREZ.
  • This annular O-ring is coaxial with the piston and has a diameter substantially smaller than the diameter of the underside of said piston 81.
  • this annular O-ring 82 defines an interstitial space 83 between the underside 84 of the piston 81 and the surface of the support 1 against which said piston 81 is applied, by means of displacement means 40.
  • the piston 81 consists of a wall 85 which has a lower end portion of greater thickness and which defines an internal hollow volume 86.
  • the lower part of the wall 85 which is arranged in the diametral plane, has an external face forming the lower face 84 of the piston 81 and an internal face 87 equipped with tubular elements 88 peripheral arranged at the angular positions 0 °, 90 °, 180 ° and 270 °.
  • tubular elements 88 put the interior 86 of the piston 81 in communication with the exterior and in particular with the interstitial space 83 in the pressed position of the piston 80 on the support 1 as shown in FIG. 9D.
  • These tubular elements 88 are connected by means of pipes not shown in the drawing to non-localized reagent tanks, which are also not shown in the drawing and corresponding to the tanks 12 and 13 of FIG. 3 illustrating the first embodiment. It is thus possible to supply non-localized reagents with the interstitial space 83 of very reduced volume, without breaking the saturation of the entire reaction vessel 5.
  • the tubular elements 88 allow also ensuring the evacuation of said non-localized reagents and / or the drying of the substrate, by passing for example using a gas flow or even by suction, pumping.
  • the non-localized supply means 8 and their displacement means 40 are controlled by a central unit control capable of managing all the washing, rinsing, evacuation, drying, etc. feeding procedures useful in the context of the inking and / or synthesis process of localized OGNs specific to the invention.
  • the invention relates to a support carrying an OGN sequence network as defined above.
  • the present invention also relates to a method for detecting and / or identifying target OGN sequences using biosensors comprising probes formed from OGN sequences complementary to the target OGN sequences and capable of pairing with each other by affine interaction, characterized
  • the "picogreen” is a molecule presenting a fluorescence signal in the presence of double strands of DNA.
  • the picogreen does not require any particular reaction, and must simply be placed in the presence of the double strands for 5 min before the fluorescence measurement.
  • This molecule therefore has several advantages over the products conventionally used for the detection of double strands, whether they are fluorescent markers (fluorescein, rhodamine, etc.), or intercalators (ethidium bromide, Hoechst 33258).
  • Picogreen does not require any labeling reaction, unlike fluorescent probes used in DNA chips. Its fluorescence signal has excellent linearity over a wide range of concentrations. It thus makes it possible to detect double strands at concentrations much lower than those measurable with conventional intercalators, even in the presence of contaminants (single strands of DNA, RNA) in the measurement solution. Thus the sensitivity of picogreen is up to 400 times better than Hoechst 33258, itself having better sensitivity than ethidium bromide.
  • the picogreen is therefore more suitable than these intercalators for the detection of hybridization on high or medium density chips, which involve hybridization units of reduced size.
  • the fluorescence signal is independent of the base composition of the sequence tested, unlike the Hoechst product.
  • the subject of the invention is a method for detecting and / or identifying target OGN sequences using biosensors comprising probes formed from OGN sequences complementary to the target OGN sequences and capable of pairing with each other by affine interaction, characterized
  • this support is conformed by an affinity sensor comprising at least one structure comprising at least one semiconductor material Se, coated on at least one of its faces with at least one layer of Is insulator, the latter having OGN probes on its surface,
  • Table 1 shows an example of classification in the case of phosphoramidite chemistry which will be used later. Many variations are possible without changing the scope of the invention.
  • Table 1 Example of classification of the modes of action of products and reagents (phosphoramidite chemistry) 1.2. Device
  • the device used is that described above with reference to FIG. 3.
  • This device comprises a projection system (6) formed by 6 microvalve devices of the type of those shown in FIG. 3 A, to project reagents A, C and D from Table 1 (1 valve for reagent A, 1 valve for reagent D, valves for the 4 bases of C).
  • the device further comprises 6 non-localized supply means (10) of the type of those shown in FIG. 3 for reagents A, B, E, F and G of Table 1.
  • the device also includes means for drying the substrate with argon gas (ie the reagent H in Table 1).
  • the support consists of a silicon or glass plate comprising 256 wells in lithographic resin (epoxy).
  • Each microwell has a surface of 415 x 415 ⁇ m and a height of approximately 415 ⁇ m.
  • the volume of the wells must be such that it is filled without overflowing by the projection of a drop of base and a drop of activator.
  • the protocol for manufacturing microwells on this size of silicon is as follows: 1. Cleaning of the substrate (acetone, alcohol, etc.) 2. Drying with dry argon
  • the crosslinking of the resin is sufficiently advanced for the superstructure to be inert with respect to the synthesis of oligonucleotides.
  • the control of the displacement means is adjusted so that the distance between the tip of the nozzles is approximately 1 mm from the opening of the well 4, when projecting localized liquids.
  • the pressure of the bottles containing the localized reagents is between:
  • the memory 15 and the central unit 16 are loaded so as to produce the network comprising all the variants of the following OGN (written in the manufacturing direction 3 'to 5'):
  • Xi, X 2 , and X 3 form the 64 possible combinations of A, C, G and T. This example was chosen because the special case X ⁇ X 2 X 3 ⁇ ACG is the OGN L226 of biological interest.
  • the invention finds a preferred application for the manufacture of a support carrying on at least one of its faces a plurality of polynucleotide sequences preferably oligo nucleotide and / or peptide different from each other and corresponding to their complementary.

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Abstract

L'invention concerne la fabrication de microcapteurs ('puces') électroniques pour l'analyse de séquences nucléotidiques et/ou peptidiques. Le but est de fixer à la surface de ces 'puces' un très grand nombre de séquences sondes différentes, de manière aisée et économique. Le procédé de fabrication de réseaux de séquences sondes sur un support par ancrage et/ou synthèse chimique localisé(s) en présence de solvants volatils. Selon ce procédé, on met en oeuvre un support sur lequel est réalisé un quadrillage de puits réactionnels en résine photoréticulée (époxy). On place ensuite le support dans une enceinte réactionnelle que l'on sature à l'aide de vapeurs du solvant de synthèse (acétonitrile). On réalise enfin l'ancrage et éventuellement la synthèse chimique localisé(s) in situ des séquences sondes dans les puits en mettant en oeuvre une alimentation localisée en liquides/réactifs dans chaque puits correspondant à une séquence-sonde donnée, en alimentant collectivement les puits en liquides/réactifs communs et en faisant en sorte que préalablement à chaque opération d'alimentation localisée le liquide contenu dans chaque puits soit éliminé. L'invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE FABRICATION D'UN SUPPORT PORTEUR D'UNE PLURALITE DE SEQUENCES POLYNUCLEOTTDIQUES ET/OU PEPTIDIQUES DD7FERENTES
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine de l'invention est celui de la fabrication de microcapteurs utiles dans l'analyse de séquences nucléotidiques et/ou peptidiques. Ce type d'analyse ouvre l'accès à la détection et à l'identification de tout ou partie de gènes ou de peptides qui peuvent être les traceurs d'entités biologiques supérieures (cellules, tissus, bactéries, virus, champignons, levures, ...).
La fabrication dont il est question dans le présent exposé est un ancrage et/ou une synthèse chimique localisés de sondes polymères (oligonucléotides et/ou peptides) sur un support destiné à former un réseau de sondes, dont certaines sont susceptibles de s'apparier avec des séquences cibles contenues dans le milieu d'analyse. La révélation de ces appariements peut être effectuée à l'aide de marqueurs fluorescents, colorés, radioactifs ou par transductance électronique.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un support porteur sur au moins l'une de ses faces d'une pluralité de séquences - poly - de préférence oligo - nucléotidiques et/ou peptidiques (séquences OGN) avantageusement différentes les unes des autres et appariables à leurs complémentaires (séquences cibles) par interaction affine, ces séquences OGN étant obtenues par synthèse chimique localisée, en présence de solvants volatils. La présente invention concerne également le dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, ainsi que le support compris dans ce dispositif et utilisé dans le procédé.
L'invention vise également un procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles à l'aide de biocapteurs fabriqués par le procédé sus-visé. Au sens du présent exposé, les séquences OGN correspondent à des séquences poly- de préférence oligo-nucléotidiques et/ou peptidiques. En d'autres termes, il peut s'agir : - d'oligonucléotides porteurs chacun d'une base azotée ATCG,
- d'oligopeptides dont l'unité récurrente est un acide aminé,
- ou d'acides peptides-nucléiques -APN - ("PNA = Peptide Nucleic Acid") qui sont des polymères à squelette petptidique comprenant par exemple des unités récurrentes N-(2-aminoéthyl)glycine reliées les unes aux autres par des liaisons amide, chaque unité étant porteuse d'une base azotée pyrimidique ou purique,
- ou bien encore de chimères à structure mixte acides nucléiques et acides peptides-nucléiques. L'explosion de la génétique, de la génomique et des biotechnologies dans le domaine médical et dans l'industrie toute entière, crée un besoin d'outil d'analyse de séquences d'acides nucléiques ou aminés, cet outil se devant d'être à haute résolution, extrêmement rapide et fiable. S'agissant des séquences d'acides nucléiques, ce besoin en outil d'analyse performant s'exprime pour de nombreuses applications comme par exemple l'étude de la mutation des gènes, la détection de pathogènes, ou bien encore le séquençage de génomes.
Le principe de l'analyse de séquences nucléotidiques et/ou peptidiques est relativement simple puisqu'il s'agit de lire l'agencement des 4 comonomères nucléotides A, C, T et G dans le cas des polynucléotides et des PNA et l'agencement d'une vingtaine d'aminoacides pour ce qui concerne les polypeptides. Cette simplicité de principe n'a d'égal que la difficulté provenant de la quantité considérable d'informations à traiter. Ainsi le génome de la bactérie Escherichia Coli, qui est l'un des plus courts, contient 4 000 gènes avec 4,7 millions de nucléotides tandis que le génome humain est constitué d'environ 100 000 gènes, ce qui représente 3 milliards de nucléotides. S'ajoute à cela le fait que le décryptage d'un gène ou d'une protéine n'est rien au regard de la compréhension de l'action complexe de ces polymères nucléiques ou peptidiques dans les mécanismes normaux ou anormaux du vivant.
Cela souligne encore, si besoin était, le fait qu'il serait donc particulièrement utile de disposer d'outils ou de capteurs permettant de procéder rapidement et de manière fiable à l'analyse d'un grand nombre de séquences d'acides nucléiques ou aminés. TECHNIQUE ANTERIEURE
Pour répondre à ce besoin, il a donc été proposé dans l'art antérieur différents outils d'analyse et différentes techniques de réalisation de ces outils. La demande internationale PCT WO 89/10 977 (inventeur : Southern), décrit un procédé et un dispositif pour l'analyse d'une séquence polynucléotidique. Selon cette invention, on met en oeuvre un support, par exemple une plaque de verre, comprenant un réseau ou un jeu complet de séquences oligonucléotidiques (sondes OGN) apte à s'hybrider avec des séquences OGN cibles complémentaires contenues dans le milieu d'analyse. La révélation des hybridations susceptibles d'intervenir sur le réseau d'OGN est effectuée à l'aide d'agents de marquage qui peuvent être portés par les sondes, et/ou par les cibles. Ce concept de biocapteurs porteurs d'un réseau de sondes OGN permet d'obtenir une empreinte digitale du contenu génétique du milieu d'analyse ainsi qu'un séquençage partiel ou complet dudit contenu génétique, et ce en une seule analyse. En théorie, ce concept est d'autant plus séduisant qu'il devrait être possible avec un réseau de sondes OGN (que l'on peut également appeler "pixels" par analogie avec la photographie), différentes entre elles et nombreuses (de quelques centaines à plusieurs millions), de faire des analyses dans un milieu comprenant de multiples populations de séquences polynucléotidiques, sans qu'il soit nécessaire de procéder à des clonages. Mais au delà de l'intérêt théorique évident, on se trouve confronté à un difficile problème pratique qui est celui de la réalisation des supports porteurs de réseaux de séquences sondes OGN de longueur égale à une, deux ou trois dizaines de mers chacune. Il s'agit en effet de fixer des sondes OGN de taille macromoléculaire sur des unités de surface de taille extrêmement réduite et selon une localisation précise et déterminée de chaque sonde.
La solution concrète à ce problème pratique adoptée dans les exemples de la demande PCT WO 89/10 977 est la suivante. Des plaques en verre porte-objet pour microscope sont utilisées comme support. Ces plaques sont soumises à une silanisation c'est-à-dire à un traitement à l'aide de 3-glycidoxypropyltriéthoxysilane destiné à se fixer à la surface du verre pour former un point d'ancrage pour les séquences OGN. Les motifs silane sont soumis à un traitement à l'acide pour offrir des groupements hydroxyles propres à réagir avec les monomères de tête (rang 1) des séquences OGN. Cette synthèse des oligonucléotides OGN est effectuée selon la chimie connue dite des phosphoramidites. Les extrémités 5' des nucléotides sont protégées par du DMT (diméthoxytrityl) et les extrémités 3' par du β- cyanoéthylphosphoramidite. Les couplages des nucléotides de rang 1 et sur les silanes et des nucléotides de rang 2 à n entre eux sont effectués à l'aide de tétrazole. Le solvant est l'acétonitrile. Cette réaction est effectuée dans des conditions anhydres dans un conteneur étanche. Ce conteneur comprend la plaque en verre porte-objet recouverte d'un ruban de caoutchouc silicone que l'on évide pour ne laisser que des bordures qui définissent un seul site réactionnel. Une plaque en téflon de même taille et de même épaisseur que la plaque support en verre recouvre le site réactionnel et la bordure en silicone. Un court tube en plastique met en communication le volume réactionnel avec l'extérieur et permet l'injection et la vidange des liquides réactionnels ainsi que le remplissage du volume réactionnel avec de l'argon, ces opérations étant effectuées au moyen d'une seringue. Après chaque couplage de nucléotides, cet assemblage est. démonté pour poursuivre la réaction en immergeant le support des bains de réactifs ou de liquides réactionnels, pour ensuite être remonté afin d'effectuer le couplage suivant.
Il va sans dire que cette technique de fabrication de capteurs à réseaux de sondes OGN n'est absolument pas industrielle, notamment en raison de sa lourdeur et de sa complexité. En outre, elle permet de réaliser seulement dans les exemples de ce PCT, des réseaux comprenant très peu d'oligonucléotides, à savoir 24 et 72 unités. Ces réseaux représentés aux tableaux la et lb de la demande PCT. La composition des séquences OGN varie très peu et par ailleurs bon nombre de bases sont manquantes. Il apparaît donc que la technique de fabrication de réseaux d'OGN pratiquée selon le PCT WO 89 / 10 977 est grandement perfectible.
Les auteurs de la demande PCT WO 89/10 977 émettent l'hypothèse selon laquelle il devrait être possible de fabriquer la matrice d'OGN en synthétisant des oligonucléotides dans les cellules d'un réseau, à l'aide d'un équipement automatique comprenant un dispositif d'impression asservi à un ordinateur et comportant une tête d'impression par jet d'encre. Mais il ne s'agit que d'une idée qui n'a pas été réduite en pratique. Et en réalité, cette réduction en pratique s'avère être des plus délicates. La complexité et le nombre de réactions à mettre en oeuvre sont telles que la fabrication d'un réseau d'OGN ne peut être une simple adaptation des techniques connues d'ancrage et de synthèse sur support d'oligonucléotides ou d'oligopeptides. Les techniques évoquées dans la demande PCT WO 89/10 977 relèvent d'un mode de fabrication qu'on peut appeler "in situ" consistant à synthétiser les sondes sur le substrat par incrémentation, base par base, simultanément pour l'ensemble des PIXELS du support.
Il existe un autre groupe de techniques de fabrication que l'on peut qualifier d'"ex- situ" basées sur la production préalable du jeu de sondes OGN indépendamment du traitement du support, cette production étant suivie par la fixation desdites sondes sur le support.
Ces techniques s'avèrent difficiles à mettre en oeuvre lorsque le jeu de sondes d'OGN dépasse quelques dizaines d'unités et s'avèrent impraticables au-delà de quelques centaines d'unités. La demande de brevet internationale PCT WO 92/10 092 (inventeurs :
FODOR et al) correspondant à l'article Science vol 251, 767 - 773, 1991 ; divulgue une synthèse in situ localisée sur le support, par voie photochimique. A cette fin, les bases nucléotidiques sont protégées au niveau de leur extrémité 5' par un groupement photolabile tel que le nitrotératryloxycarbonyl (NVOC) qui remplace le groupement protecteur (DMT), utilisé dans la synthèse selon la chimie des phosphoramidites. Le support est une plaque de verre portant des groupements aminé ou hydroxyle eux aussi protégés par le N OC. L'action d'un rayonnement lumineux localisé sur le substrat conduit à la coupure photochimique du groupement photolabile et à la déprotection de la surface irradiée. Il est alors possible de procéder localement à l'addition d'un oligonucléotide, lui aussi protégé par un groupement NVOC. En illuminant différentes zones du support suivant une stratégie de synthèse combinatoire, FODOR et al synthétisent un réseau de sondes OGN. L'inconvénient majeur de cette technique FODOR et al est liée à l'influence néfaste du groupement NNOC sur le rendement de synthèse. Cela conduit à des erreurs de séquençage et donc à une réduction de la surface utile des capteurs. En outre, ce procédé FODOR est cher et rigide dans sa mise en oeuvre (masque, réactifs non disponibles dans le commerce). Un autre inconvénient de cette méthode de fabrication est que la stratégie combinatoire mise en oeuvre conduit à des réseaux dont la composition varie peu d'un pixel à l'autre, le plus souvent la composition de la sonde ne varie que d'une base d'un pixel à l'autre. La différenciation des hybridations de pixels voisins peut donc s'avérer difficile.
Cette technique de synthèse d'OGN faisant intervenir des groupements protecteurs photolabiles de type NVOC, est également évoquée dans la demande internationale PCT WO 93 / 09 668 qui décrit des stratégies combinatoires pour la synthèse réseaux de polymères nucléotidiques ou peptidiques sur un substrat. Il est fait référence dans cette demande PCT à une synthèse in situ localisée des différents monomères OGN dans des régions prédéfinies du substrat. Les techniques préconisées dans cette demande PCT pour les synthèses chimiques sont de deux types :
1 - circulation d'un flux de liquides réactionnels à l'intérieur de canaux façonnés dans un bloc et dont l'une des puces est formée par la surface du substrat dans des régions définies ou prédéfinies ;
2 - dépôt ou projection de gouttes de liquide réactionnel sur des régions prédéfinies du substrat,
3 - combinaison des techniques 1 et 2. Dans la technique 1, on fait intervenir un bloc de canaux comprenant un ensemble de rainures parallèles qui sont mises en contact avec la surface du substrat de manière à définir ainsi les canaux dans lesquels les liquides réactionnels sont destinés à circuler. Le procédé consiste ensuite à fixer un ou plusieurs monomères différents de rang 1, à démonter l'assemblage substrat, bloc de canaux, pour les étapes de lavage des protections, à remonter l'assemblage pour effectuer l'ancrage du ou des monomères de rang 2 et ainsi de suite jusqu'au monomère de rang n. La stratégie combinatoire consiste à déplacer le substrat par rapport au bloc de canaux en rotation (90°) voire en translation. Selon une variante de la technique 1, il est prévu comme représenté à la figure 12, un support comprenant une pluralité de puits réactionnels et un distributeur de réactifs comprenant un ensemble de tubes de distribution de réactifs ou de liquides réactionnels dans les puits du support. Selon cette variante, il est possible d'interposer un masque entre les tubes distributeurs et les puits du support de façon à contrôler l'apport des liquides réactionnels dans des régions données du support. Concernant la technique 2, cette demande PCT divulgue de manière générale des supports comprenant au moins 10 000 régions réactionnelles par cm2. Aucune réalisation concrète de ce type de support n'est exemplifiée. Cette demande PCT décrit également des moyens de distribution de liquides réactionnels dans ces régions réactionnelles du support. Les têtes d'imprimante jet d'encre sont citées à titre d'exemples de moyens de distribution de liquides réactionnels dans les régions réactionnelles du support. L'une des techniques proposées pour réaliser des régions réactionnelles sur le support est celle consistant à obtenir des puits de tension de surface à la surface du support en créant des zones hydrophobes délimitant des zones hydrophiles par exemple en appliquant une couche de résine hydrophile porteuse de groupements hydrophobes protégés et en déprotégeant ces groupements hydrophobes dans les zones destinées à former les contours des puits de tension de surface. Selon une alternative les régions réactionnelles peuvent être formées par des puits tridimensionnels délimités par des parois comme représentées à la Figure 12.
La déprotection des groupements hydrophobes est avantageusement effectuée selon cette demande PCT par photolyse. Cette demande PCT WO 93/09 668 fait également allusion aux problèmes d'évaporation de solvants qui peuvent affecter les synthèses des séquences OGN. Pour surmonter cette difficulté, il est proposé d'utiliser des enceintes réactionnelles étanches, de diminuer la tension de vapeur (basse température) et/ou de saturer la chambre réactionnelle en solvants volatils. II y a lieu de noter qu'il existe un pas non négligeable entre ces généralités spéculatives et des réalisations pratiques concrètes qui fonctionnent. Ceci est confirmé par le fait que les exemples donnés dans cette demande PCT concernent uniquement des illustrations de la technique 1 qui fait appel à des canaux de circulation de fluides réactionnels. Cette technique permet de réaliser, dans les exemples, un réseau comprenant 2 500 régions réactionnelles. Des séquences OGN d'oligonucléotides sont synthétisées dans toutes les régions réactionnelles. Pour l'accrochage des 7eme et 8eme monomères, on utilise le bloc de canaux de circulation de liquides réactionnels que l'on accole à la surface du substrat comportant déjà des séquences OGN de 6 mers chacune. Le 7eme nucléotide est distribué par un ensemble de canaux parallèles de direction donnée et le 8èmβ nucléotide est distribué par des flux circulant dans des canaux dont la direction est perpendiculaire à celle des canaux destinés à recevoir le 7emβ nucléotide. Dans cet exemple, on crée donc des séquences OGN octamères uniquement aux intersections entre les canaux.
Il n'apparaît pas que le procédé selon cette demande PCT WO 93 09 668 permette l'obtention rapide, fiable et aisée de réseaux d'oligonucléotides de compositon différente. A chaque rotation du substrat par rapport au bloc de canaux, il convient de désassembler le dispositif, ce qui alourdi notablement le procédé de synthèse in situ et de localiser OGN.
Le brevet N° 5 658 802 des Etats-Unis d'Amérique (D.J. HAYES et al) concerne un procédé de synthèse ex et in situ basé sur la projection localisée de gouttes de réactifs sur un substrat, à l'aide de systèmes piézo-électriques. Etant donné que dans la pratique, le solvant le plus utilisé pour la dilution des bases de nucléotides est l'acétonitrile et que ce solvant présente un faible angle de mouillage, il en résulte des problèmes d'étalement des gouttes de solvant sur le substrat sur plusieurs centaines de microns. Ce qui rend difficile la localisation des réactions à une échelle appropriée. En outre, l'acétonitrile ainsi utilisé est volatil et donc sujet à une évaporation massive.
Le dispositif selon le brevet US 5 658 802 comprend un substrat du type de ceux utilisés pour la réalisation de circuits intégrés présentant éventuellement des motifs. Il n'est pas question de délimitation de sites réactionnels de très petite surface selon ce brevet. Chaque moyen d'éjection piézoélectrique est associé à un réservoir de liquide. Tous ces moyens d'éjection piézoélectrique et ses réservoirs forment un ensemble de distribution. Sont également prévus dans ce dispositif des moyens de positionnement, des moyens d'éjection de liquide et/ou du substrat.
Il ressort de ce qui précède que le procédé et le dispositif selon ce brevet US N° 5 658 802 ne sont pas opérationnels pour la réalisation de réseaux de séquences OGN par synthèse chimique localisée, à l'aide de solvants volatils.
Concernant le problème de contrôle de l'étalement des gouttes de liquide réactionnel sur le substrat et leur cantonnement dans de multiples sites réactionnels distincts et isolés les uns des autres, il est fait référence dans la demande PCT WO 93 / 09 668 étudiée ci-dessus, à la technique des puits de tension de surface qui consistent à créer des zones hydrophobes entourant des zones hydrophiles d'environ 100 μm de diamètre de façon à délimiter une pluralité de sites réactionnels grâce à des différentiels de tension de surface. Le document AP BLANCHARD et al (biosensors - bioelectronics 11, 687 - 690 - 1996) traite également de cette technique. Mais il faut bien reconnaître que cette dernière ne résout, de manière satisfaisante, ce problème que pour des solvants aqueux. Or, il se trouve que ce ne sont pas des solvants idoines pour les réactions de synthèse d'oligonucléotides ou d'oligopeptides. En réalité, la technique des puits de tension de surface n'est pas appropriée dans le cas où les liquides réactionnels sont constitués par des solvants organiques volatils tels que l'acétonitrile. En effet, compte tenu des caractéristiques de tension de surface de tels solvants volatiles, la séparation des sites réactionnels par le jeu d'un différentiel de tension de surface est peu efficace. En outre, le problème de l'évaporation des solvants distribués en très faible quantité reste entier dans les propositions techniques qui font intervenir des puits de tension de surface.
La demande PCT WO 94 / 27 719 concernant un procédé et un dispositif pour la réalisation d'un réseau de réaction chimique sur surface d'un support. Selon cette demande PCT des puits de tension de surface sont ménagés sur la surface du support en utilisant des photorésines du type phénol / formol ou polyméthacrylates. Le recours à des moyens de distribution des liquides réactionnels du type tête d'imprimante jet d'encre piézoélectrique, est préconisé dans cette demande PCT.
Force est donc de constater que l'art antérieur ne propose pas de procédé efficace et performant pour la réalisation de la surface d'un support, d'un réseau comprenant un très grand nombre de séquences OGN de nature différente et variée. Il apparaît en effet que bon nombre des procédés et dispositifs décrits dans la littérature n'ont pas d'application concrète et n'ont pas été réduits en pratique. Par ailleurs, ceux qui échappent à cette règle conduisent à des réseaux de séquence OGN comportant un nombre faible de pixel ou présentant de nombreuses séquences OGN erronées. Ce dernier point traduit la faiblesse de ces procédés en ce qui concerne les rendements de synthèse. On sait en effet qu'un rendement moyen de 92 % réduit la surface utile de chaque pixel à 51 % pour des sondes 8 mers et à 36 pour des sondes 12 mers. La présence de séquences erronées sur une partie importante des capteurs compliquent la détection des hybridations ou des appariements affins et obligent à concevoir des capteurs redondants ou à limiter la longueur des sondes. Un tel défaut se vérifie particulièrement pour ce qui concerne les procédés photochimiques faisant intervenir des groupements protecteurs NVOC. De plus, les procédés de fabrication connus sont peu flexibles, en ce sens qu'il est difficile de changer facilement la composition des séquences OGN constituant les réseaux.
Enfin on peut considérer que les procédés connus sont d'une manière générale complexes peu fiables, pas assez rapides, peu économiques et en définitive, peu industriels.
Dans ces circonstances, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un procédé et un dispositif de fabrication d'un support porteur sur au moins l'une de ses faces d'une pluralité de séquences poly - de préférence oligo - nucléotidique et/ou peptidique, ces séquences OGN différentes les unes des autres étant, d'une part, appariables à leurs complémentaires par interaction affine et, d'autre part, obtenues par synthèse chimique en présence de solvants volatils ;
- ce procédé se devant de fonctionner correctement en pratique avec une bonne flexibilité, fiabilité, rapidité et simplicité ;
- ce procédé devant en outre permettre l'obtention de réseaux comprenant de quelques dizaines à plusieurs centaines de millions de séquences OGN, et ce avec un bon rendement chimique et subséquemment avec un faible pourcentage d'erreur dans les séquences.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un dispositif simple, économique et industriel pour la mise en oeuvre du procédé sus- visé.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un support utilisable dans le procédé et dans le dispositif sus-visé, qui soit facile à obtenir et qui permette une mise en oeuvre optimale de la fabrication de réseaux de séquences OGN.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles, faisant intervenir un biocapteur comprenant un support porteur d'un réseau de sondes OGN obtenu par le procédé sus-visé, un tel procédé de détection et/ou d'identification se devant d'être des plus fiables et des plus spécifiques.
EXPOSE DE L'INVENTION
Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord un procédé de fabrication d'un support porteur sur au moins l'une de ses faces d'une pluralité de séquences poly -de préférence oligo- nucléotidiques et/ou peptidiques, ces séquences (OGN), avantageusement différentes les unes des autres, étant, d'une part, appariables à leurs complémentaires par interaction affine et, d'autre part, obtenues par synthèse chimique en présence de solvants volatils ; ledit procédé consistant essentiellement : 1) à mettre en oeuvre un support dont la (ou les) face(s) destinée(s) à porter les OGN présentent) un réseau de puits réactionnels, chacun de ces puits ayant vocation à servir de siège pour l'ancrage et/ou la synthèse chimique localisé(s) d'une séquence OGN donnée ; ces puits étant obtenus par application d'une résine photoréticulable, par réticulation de cette résine par exposition à un rayonnement actinique dans les zones destinées à définir les puits et par élimination de la résine non réticulée pour obtenir un quadrillage de résine formant les parois qui délimitent les puits ;
2) à placer ce support dans une enceinte réactionnelle et à saturer cette enceinte à l'aide de vapeurs du ou des solvants, volatils mis en oeuvre dans l'ancrage et la synthèse chimique localisé(s) d'OGN, de préférence en faisant circuler au travers de l'enceinte réactionnelle un flux gazeux comprenant les vapeurs saturantes appropriées ;
3) à réaliser l'ancrage et/ou la synthèse chimique localisé(s) (par incrémentation) des séquences OGN dans au moins une partie des puits, cette opération étant effectuée :
(i) en alimentant localement et séparément chaque puits concerné en réactifs et en produits consommables liquides propres à permettre l'ancrage et/ou la synthèse de la séquence OGN correspondante,
(ii) en alimentant collectivement (non localement) les puits concernés en réactifs et/ou produits consommables liquides communs aux réactions destinées à intervenir dans tous ces puits ; (iii) et en faisant en sorte, préalablement à chaque opération d'alimentation localisée des puits (4), d'éliminer au moins partiellement le liquide éventuellement contenu dans chaque puits destiné à être alimenté de manière localisée.
Le procédé selon l'invention correspond à une production de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique in situ (voire ex situ) qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de l'art antérieur.
Les avantages de ce procédé sont nombreux. On peut citer entre autres le fait qu'il permet de fabriquer des réseaux de séquences OGN de composition, de taille, et de densité très diverses avec une mise en oeuvre simple et flexible. Cela répond ainsi, en particulier, aux besoins de la recherche en génétique. De plus, le procédé a lieu à une échelle telle que la consommation en réactifs très onéreux utilisés pour la synthèse d'OGN en particulier, d'oligonucléotides, est particulièrement faible. Cela permet d'envisager la fabrication en série de réseaux à un coût réduit. De surcroît, il est à noter que le procédé selon l'invention ne fait appel qu'à des commodités qui concernent les liquides réactionnels et le matériel mis en oeuvre.
Par ailleurs, le procédé selon l'invention permet d'envisager une large diffusion de la technologie des réseaux OGN en particulier d'oligonucléotides dans toutes les techniques d'analyse génétiques applicables en médecine et dans les bioindustries. Le procédé selon l'invention permet de fabriquer de manière flexible des réseaux de composition très diverses, combinatoires ou non, sur des supports de quelques millimètres carrés à 300 cm2 par exemple des plaques en silicium, la surface d'un pixel étant comprise entre 1 000 x 1 000 μm2 et 10 x 10 μm2. Le nombre de pixels peut donc varier de quelques unités à plusieurs centaines de millions d'unités.
Les séquences OGN que l'on fixe et éventuellement que l'on fabrique in situ sur le support sont assimilables à des sondes propres à réagir avec des séquences cibles complémentaires par interaction affine. Ces séquences OGN sont avantageusement constituées de plusieurs comonomères qui sont des nucléotides, et/ou des unités récurrentes d'Acide Peptide Nucléique (APN) et/ou des acides aminés. Le nombre de comonomères nucléotides et/ou APN et/ou acides aminés que comptent ces polymères ou plus précisément ces oligomères, peut varier de quelques unités à quelques dizaines d'unités, de préférence de 15 à 25 unités.
Il est préférable conformément à l'invention de réaliser non seulement l'ancrage mais aussi la synthèse localisée in situ des OGN dans les puits. Mais il est également envisageable de synthétiser les OGN ex situ et de les fixer seulement ensuite dans les puits du support de manière localisée. Idéalement, le matériau constitutif du support est choisi dans le groupe de matériau comprenant : verre, quartz, silicium éventuellement revêtu d'au moins une couche d'oxyde ou de nitrure.
Le silicium ou d'autres matériaux semi-conducteurs sont préférés notamment dans le cas où le support est destiné à être intégré dans un biocapteur qui fonctionne sur un mode de révélation des appariements de type transductance électronique par exemple à effet de champ.
Une autre caractéristique de ce support est de présenter à sa surface un réseau de puits réactionnels formé par des bordures en résine photoréticulable de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : les résines positives ou négatives, de préférence dans le sous-groupe comprenant les résines négatives et plus préférentiellement encore dans la classe comportant : les résines (méth)acrylates, époxy, polyester et/ou polystyréniques photoréticulables par voie radicalaire et/ou cationique. Par résine "positive", on entend au sens de l'invention une résine rendue très soluble par irradiation. Par résine "négative", on entend au sens de l'invention une résine rendue insoluble par irradiation.
Les résines négatives, plus spécialement mises en oeuvre ont l'avantage de permettre l'obtention de couches épaisses résistantes chimiquement et adhérentes au substrat.
Avantageusement, l'élimination de la résine non réticulée aux endroits non masqués correspondant aux puits, est effectuée par dissolution dans un solvant organique de la résine. Il peut s'agir par exemple d'acétone, de γ-butyrolactone, de Propylène-Glycol- Méthyl-Ether-Acétate (PGMEA), d'acétonitrile ou bien encore d'autres solvants connus de l'homme de l'art. Cette réalisation des micropuits en résine lithographique suit des protocoles expérimentaux connus de nettoyage du support, de dépôt, de cuisson, d'exposition à un rayonnement actinique (UV), et de dissolution de la résine non réticulée.
Les exemples qui suivent et qui sont complétés par les illustrations fourmes par les dessins en particulier les figures 1 et 2 fournissent d'autres détails utiles pour la description non limitative du support et de son obtention.
Suivant une variante avantageuse de l'invention, on traite le support en surface de façon à lui conférer des sites d'ancrage aptes à former des liaisons non labiles avec les comonomères de tête des séquences OGN, ce traitement étant de préférence une silanisation à l'aide d'un alcoxysilane époxydé ou bien encore une fonction ester avant et/ou après la préparation du réseau de micropuits.
Classiquement l'agent de silanisation est le glycidoxypropyltriméthoxy- silane. Comme autres agents de silanisation, on peut citer le glycidoxypropyldiméthoxysilane, l'aminopropyltriéthoxysilane, ou encore le carboxyméthyltriéthoxysilane.
Cette silanisation a pour but de fournir des points d'ancrage solides pour l'ensemble des monomères (e.g. nucléotides) de rang 1 constitutif des n-séquences OGN du réseau fabriqué in situ. Le pontage des silanes avec les monomères (nucléotides) de rang 1 s'effectue avantageusement par l'intermédiaire de groupements hydroxyles, par exemple.
La prise en compte de l'évaporation des solvants volatils nécessaires aux réactions d'ancrage et de synthèse des séquences OGN, est parfaitement assumée par le procédé selon l'invention. C'est ainsi qu'il est prévu selon ce dernier une étape de saturation, de préférence à l'aide d'un flux gazeux comportant les vapeurs saturantes idoines ainsi qu'un gaz neutre. Ce faisant, on maîtrise la vitesse d'évaporation des solvants mis en oeuvre et on contrôle toutes les microréactions nécessaires à l'obtention du réseau.
Si l'on contrôle l'évaporation par sa technique de saturation, il est envisageable de pouvoir provoquer l'évaporation des solvants de façon à stopper les réactions localisées sur le support.
Naturellement, il est également possible de limiter l'évaporation en diminuant la tension de vapeur de tous les solvants volatils mis en oeuvre, par exemple par abaissement de la température, de préférence du support.
Avantageusement, le gaz vecteur mis en oeuvre pour la saturation peut être : l'argon ou l'hélium.
De préférence, ce flux gazeux est tel qu'il détermine une surpression dans l'enceinte réactionnelle par rapport à l'atmosphère environnante. Pour fixer les idées, on peut indiquer à titre non limitatif que le débit gazeux détermine une pression de 0,01 à
0,3 bar par rapport à l'atmosphère.
Concernant l'ancrage et/ou la synthèse chimique localisés des OGN sur le support, il est prévu conformémement à l'invention de mettre en oeuvre des moyens d'alimentation localisée et des moyens d'alimentation non localisée des puits réactionnels du support.
Avantageusement, les moyens d'alimentation localisés et le support sont déplaçables relativement les uns par rapport à l'autre dans les trois dimensions X, Y, Z, grâce à des moyens de déplacement. Conformément à l'invention, pour réaliser l'ancrage et/ou la synthèse sur le support de n-séquences OGN comportant chacune x comonomères :
±o stocke en mémoire la composition du réseau de n séquences OGN à réaliser en appréhendant cette composition selon une organisation en x rangs successifs comprenant chacun un comonomère et correspondant chacun à une série d'actions de soutirage, d'amenée et de dépôt de liquides réactifs localisés dans les n puits du support, lesquels liquides déterminent la nature des comonomères dans le rang Ri = 1 à x dans les n puits ; A et on commande, d'une part, aux moyens d'alimentation localisée et aux moyens de déplacement, l'exécution des différentes séries d'actions susvisées, et d'autre part, aux moyens d'alimentation non localisée d'effectuer le soutirage, le transport et l'apport des liquides non localisés dans les n puits du support à différents moments de la procédure d'ancrage et de synthèse des séquences OGN, chaque alimentation localisée étant suivie d'une étape d'évacuation des liquides présents dans les puits et plus généralement dans l'enceinte réactionnelle, ces commandes et les actions qu'elles induisent étant répétées en incrémentant i de 1 dans R jusqu'à i = x. Lors des différentes étapes de la fabrication d'un réseau de séquences
OGN (par exemple d'oligonucléotides), il est nécessaire d'alimenter l'enceinte réactionnelle en fluides (gaz, solvants, etc.) et réactifs (bases, agents de déprotection, de couplage, etc.). On peut classer ces fluides (produits consommables liquides) et ces réactifs en deux catégories : 1) Les fluides et réactifs destinés à être envoyés pixel par pixel pour obtenir le réseau et qui seront désignés ci-après par
"liquide localisé" ;
2) Les fluides et réactifs destinés à être envoyés simultanément sur tout ou partie du support et plus précisément sur tout ou partie des puits réactionnels du support de manière commune à tous ces puits. Ces fluides et réactifs sont désignés ci- dessous par "liquide non localisé". Suivant une caractéristique préférée de l'invention, l'élimination de liquide selon l'étape 3(iii) du procédé est réalisée de manière à ce que les puits concernés soient exempts de liquide à hauteur d'au moins 90 % de leur volume, de préférence au moins 95 % et plus préférentiellement encore au moins 98 %.
Avantageusement, on effectue l'élimination de liquide par séchage, en injectant du gaz, de préférence neutre, dans l'enceinte réactionnelle, et/ou en augmentant la température de l'enceinte réactionnelle et/ou du support et/ou en abaissant la tension dé vapeur du liquide à éliminer dans l'enceinte réactionnelle.
Ces dispositions ont pour but de permettre à la projection ou au dépôt de liquide localisé, d'être précis et de ne pas donner lieu à des souillures dans les puits voisins du puits que l'on alimente en liquide localisé donné, notamment par éclaboussures, comme cela risque d'être le cas si le puits contient du liquide avant le début de l'alimentation considérée.
Cette élimination de liquide par séchage à l'aide de gaz neutre permet, de plus, de supprimer les traces d'eau éventuelles qui peuvent compromettre la synthèse et/ou l'ancrage d'OGN. En effet, il est bien connu que les bases et les solvants susceptibles d'être utilisés comme liquides réactionnels doivent être stockés en milieu anhydre. Il est également envisageable d'effectuer une mise sous vide partiel et contrôlé de l'enceinte réactionnelle. En définitive, le procédé selon l'invention permet : de doter le support d'une surstructure définissant des microréacteurs correspondant aux pixels du réseau et permettant de contrôler l'étalement des liquides localisés ; de maîtriser la vitesse d'évaporation des solvants des liquides localisés dans les microréacteurs, de façon à contrôler les microréactions chimiques nécessaires à l'obtention du réseau de séquences OGN ; et d'évacuer les produits chimiques usagés à la fin de ces microréactions de façon à poursuivre la fabrication du réseau.
Suivant un autre de ces aspects, la présente invention concerne un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini supra. Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un support dont la (ou les) face(s) destinées à porter les OGN, présentent) un réseau de puits réactionnels, chacun de ces puits ayant vocation à servir de siège pour l'ancrage et la synthèse chimique localisés d'une séquence OGN donnée, ces puits étant obtenus par application d'une résine photoréticulable, par réticulation de cette résine par exposition à un rayonnement actinique dans les zones destinées à définir les puits et par élimination de la résine non réticulée pour obtenir un quadrillage de résine formant les parois qui délimitent les puits ; au moins une enceinte réactionnelle destinée à contenir le support ; des moyens d'alimentation localisée des puits réactionnels en liquides localisés spécifiques (réactifs / consommables) propres 5 à permettre l'ancrage et la synthèse d'une séquence OGN donnée dans chacun des puits du support, des moyens de déplacement des moyens d'alimentation localisée relativement au support et/ou inversement ; des moyens d'alimentation non localisée des puits réactionnels 10 en liquides (produits/consommables) non localisés et communs aux réactions destinées à intervenir dans tout ou partie des puits ; éventuellement des moyens de déplacement des moyens d'alimentation non localisée ; 15 des moyens d'évacuation des liquides non-localisés ; ces moyens d'évacuation étant associés aux moyens d'alimentation non localisée ; des organes aptes à permettre la saturation de l'enceinte réactionnelle à l'aide de vapeurs du ou des solvants volatils mis 20 en oeuvre dans l'ancrage et la synthèse chimique localisés d'OGN ; des conteneurs de liquides localisés, des conteneurs de liquides non-localisés, des conteneurs de liquides de vidange des effluents ; 25 - des moyens de déplacement du support par rapport aux moyens d'alimentation localisée et/ou réciproquement, éventuellement des organes d'amenée de gaz dans l'enceinte, éventuellement au moins une mémoire des différentes séquences OGN à ancrer et à synthétiser sur le support, 30 - éventuellement au moins un unité centrale de lecture de la mémoire et de génération de signaux de commande de l'alimentation en fluides et du déplacement des moyens d'alimentation localisée et du support l'un par rapport à l'autre. L'invention sera mieux comprise à la lumière de la description détaillée qui suit d'exemples préférés, mais non limitatifs, de formes de réalisation du dispositif et de mise en oeuvre du procédé qu'elle concerne.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Cette description détaillée est effectuée en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la Fig. 1 représente une vue en perspective du support sur lequel est destiné à être fabriqué le réseau de séquences OGN conformément à l'invention.
- la Fig. 2 est une vue en coupe verticale selon la ligne II-II de la Fig. 1.
- la Fig. 3 est une représentation schématique d'un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
- La Fig. 3A est une vue schématique d'une variante de système de projection de goutte de réactifs localisés.
- la Fig. 4A est un extrait de la Fig. 3 comprenant l'enceinte réactionnelle, le support et les moyens d'alimentation localisée, cette Fig. 4A illustrant le déplacement du support et d'une partie de l'enceinte réactionnelle par rapport au moyen d'alimentation localisée selon l'axe des X.
- La Fig. 4B est une vue en coupe selon la ligne IV-IV de la Fig. 4A, cette Fig. 4B illustrant le déplacement du support et d'une partie basse de l'enceinte réactionnelle par rapport aux moyens d'alimentation localisés selon l'axe des Y. - La Fig. 4C reprend les mêmes éléments que la Fig. 4A mais illustre quant à elle le déplacement de la partie basse de l'enceinte réactionnelle et du support par rapport aux moyens d'alimentation localisée selon l'axe des Z.
- Les Fig. 5 et 6 sont des photographies agrandies d'un support 1 comportant un quadrillage 3 en photorésine définissant plusieurs dizaines de micropuits destinés à servir de siège aux réactions chimiques d'ancrage et/ou de synthèse d'OGN. La différence entre les Fig. 5 et 6 tient à la présence d'une goutte de réactifs localisés dans le micropuits entouré d'un cercle du support de la Fig. 6. - La Fig. 7 est une vue schématique général en perspective d'un dispositif selon un deuxième mode de réalisation.
- La Fig. 8 est une vue de détail en perspective de la Fig. 7 montrant le support 1 et ses moyens de déplacement 7 ainsi que les moyens d'alimentation localisés et leurs moyens de déplacement 30.
- Les Fig. 9A, 9B, 9C et 9D représentent les moyens d'alimentation non localisés.
- La Fig. 9A est une vue de face du piston 80 appartenant à ces moyens d'alimentation non localisés 8. - La Fig. 9B est une vue en coupe diamétrale du piston de la Fig. 9A.
- La Fig. 9C est une vue de dessus du piston 80 des Fig. 9 A et 9B.
- La Fig. 9D est une vue partielle en coupe diamétrale du piston 80 appliquée sur le support 1.
- La Fig. 10 représente le réseau 64 oligonucléotides d'une longueur de 3 mers chacun réalisé dans les exemples.
Les Fig. 1 et 2 montrent le support 1 qui fait partie intégrante du dispositif selon l'invention.
MEILLEURE MANIERE DE REALISER L'INVENTION
De préférence, ce support 1 comprend :
- au moins une plaque 2 de substrat réalisé à partir d'un matériau choisi dans le groupe comportant : le verre, le quartz, le silicium éventuellement revêtu d'au moins une couche d'oxyde ou de nitrure ;
- au moins un réseau 3, de préférence un quadrillage, de résine photoréticulée solidaire de l'une des faces du substrat, ce réseau définissant une matrice de puits 4 réactionnels, la photorésine étant de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant les résines époxy ou (méth)acrylates photoréticulables par voie cationique et/ou radicalaire, les résines époxy étant tout particulièrement préférées. Avantageusement, le quadrillage 3 de résine est compatible avec les traitements du substrat nécessaire à l'accrochage des monomères (nucléotides) de rang 1. Ce quadrillage 3 peut être fabriqué avant ou après ces traitements. Ce quadrillage 3 de résine adhérent sur la plaque 2 de substrat pendant la fabrication du réseau de séquence OGN. Il peut être éventuellement éliminé avant d'être utilisé dans un biocapteur bien que ce quadrillage ne soit en lui-même pas gênant pour les opérations de lecture des réseaux dans ces biocapteurs.
Il est important que le quadrillage réalisé dans une résine qui n'est jamais complètement réticulée ne contamine pas les réactifs de synthèse et que, réciproquement ceux-ci ne dégradent pas le quadrillage ou ne provoquent un décollement quadrillage/substrat.
Les puits réactionnels 4 définis par ce quadrillage 3 définissent autant de sites réactionnels qui vont donner naissance aux pixels du réseau. Ces puits limitent l'étalement des solvants très mouillants tels que l'acétonitrile. Ce réseau ou ce quadrillage 3 de puits réactionnels 4 est obtenu grâce aux techniques classiques de lithographie avec des résines positives ou négatives, en déposant de la résine sur le substrat, et, par exemple dans le cas des résines négatives, en exposant les zones correspondants aux parois à un rayonnement actinique de façon à les faire réticuler et en dissolvant de manière sélective les zones non réticulées de façon à former les puits. Sans que cela ne soit limitatif, il est envisageable conformément à l'invention de fabriquer des micropuits de hauteur variant entre 0,1 à 1000 μm de préférence de 50 à 500 μm avec des surfaces comprises entre 10 x 10 μm à 1 000 μm x 1 000 μm. Selon une disposition avantageuse du procédé selon l'invention, le réseau ou quadrillage 3 de micropuits réactionnels 4 permet de localiser les réactions chimiques indépendamment de la nature et/ou de la préparation du support, de sorte qu'il est possible d'utiliser des supports de nature diverses, non homogènes ayant subis des traitements de surface physicochimiques (oxydation, silanisation, nitruration, etc.). Le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention représenté à la Fig. 3 comprend un support 1 présentant à sa surface des puits réactionnels 4 définis par un quadrillage de résine 3, ce support 1 étant contenu dans une enceinte réactionnelle désignée par la référence générale 5. Le dispositif de la Fig. 3 comprend également des moyens d'alimentation localisés 6, des moyens de déplacement 7 du support 1 par rapport aux moyens d'alimentation localisée 6.
Pour assurer l'alimentation non localisée en liquides réactionnels non localisés, des moyens 8 sont prévus. Ces moyens 8 sont associés à des moyens 9 d'évacuation des liquides non localisés.
Le dispositif comporte en outre des organes 10 de saturation de l'enceinte réactionnelle 5 à l'aide d'un flux gazeux chargé en gaz neutre et en solvant. Les références 11, 12 et 13 sur la Fig. 3 désignent respectivement les conteneurs de liquide localisé, de liquide non localisé et de vidange des effluents. Sont également prévus des organes 14 d'amenée de gaz dans l'enceinte réactionnelle 5.
Enfin, suivant une caractéristique préférée de l'invention, la conduite automatisée du procédé est assurée par une mémoire 15 et une unité centrale 16 de lecture de la mémoire 15 et de génération de signaux de commande (flèches en pointillés).
Les divers éléments constitutifs de ce dispositif sont, en pratique, supportés par des châssis et/ou des portiques et/ou des embases adaptés.
Suivant une première forme de mise en oeuvre de ce premier mode de réalisation, le dispositif est caractérisé en ce que l'enceinte réactionnelle comporte un soufflet étanche dont l'une des extrémités porte les moyens d'alimentation localisée et dont l'autre extrémité présente, en regard de ces derniers, un site réactionnel destiné à recevoir le support et comprenant les moyens d'alimentation non localisée, l'extrémité porteuse des moyens d'alimentation localisée étant de préférence fixe et l'autre extrémité porteuse du support étant de préférence déplaçable dans les trois dimensions x, y, z, grâce aux moyens de déplacement. Suivant une deuxième forme de mise en oeuvre du premier mode de réalisation, le dispositif est caractérisé en ce que les moyens d'alimentation localisée sont susceptibles d'être mis en mouvement dans les 3 dimensions x, y, z sous l'action des moyens de déplacement, par rapport à une partie fixe de l'enceinte réactionnelle destinée à recevoir le support et associé aux moyens d'alimentation non localisée.
La Fig. 3 correspond à un exemple de dispositif selon la première forme de mise en oeuvre du premier mode de réalisation, dans laquelle les moyens d'alimentation locahsee sont fixes par rapport à la partie mobile de l'enceinte réactionnelle destinée à recevoir le support. Cette partie mobile est assurée aux moyens de déplacement 7 dans les directions x, y, z.
Comme montré à la Fig. 3, l'enceinte réactionnelle 5 est composée d'une partie basse 5ι utile comme réceptacle du support 1, d'une partie haute 52 équipée d'une partie des moyens d'alimentation localisée 6, et d'une partie intermédiaire 53 constituée par un soufflet étanche reliant les parties basses 5ι et haute 52 l'une à l'autre. La partie haute 52 de l'enceinte réactionnelle peut être ou non solidaire ou non du soufflet 53. Le soufflet étanche 53 est avantageusement réalisé dans un matériau chimique inerte tel que le polytétrafluoroéthylène (TEFLON®). Conformément à une modalité préférée de l'invention, les moyens d'alimentation localisés 6 comportent un système de projection. Le système de projection est avantageusement choisi parmi les systèmes suivants :
1) éjection mécanique à l'aide de dispositifs du type : a) goutte à la demande par effet piézoélectrique ; b) goutte par jet interrompu par effet électrostatique ;
2) éjection par pression à l'aide de dispositifs à microvannes.
Dans l'exemple représenté à la Fig. 3, le système de projection est de type 1-a. et comprend au moins une buse 6ι de projection ou de dépôt de liquides localisés. Cette buse piézoélectrique 6ι est reliée, par l'intermédiaire d'un conduit 62, à un ou plusieurs réservoirs de liquides localisés 11.
Les systèmes l.a. d'éjection de goutte à la demande par effet piézoélectrique sont décrits dans l'article "Techniques d'impression d'images numérisées" de J.J. ELTGEN (TECHNIQUES DE L'INGENIEUR - traité d'électronique E5670). L'un des intérêts de ces systèmes l.a piézoélectriques est qu'ils permettent de déposer dans les micropuits 4 du support 1 des très faibles volumes de liquides localisés (réactifs), par exemple 50 picolitres, sur des surfaces de micropuits 4 des plus réduites (e.g. 70 x 70 à 300 x 300 μm).
Un autre intérêt des systèmes l.a. piézoélectriques est la disponibilité commerciale de produits dotés de 64 à 128 buses 6X commandées indépendamment à des fréquences de 1 à 10 KHZ par exemple les systèmes P64 et P128 de la société
MODULAR INK TECHNOLOGY (Suède). Avec de tels produits, il est donc envisageable d'alimenter simultanément de nombreux puits en projetant, les réactifs dilués dans l'acétonitrile.
Selon une variante, le système de projection peut être du type l.b. à goutte par jet interrompu par effet électrostatique tel que décrit dans l'article de J.J. ELTGEN susvisé. Ce système permet d'atteindre des résolutions supérieures
(typiquement de 30 x 30 μm).
Enfin, la variante de système de projection de type - 2 - telle que représentée à la Fig.3 A, fait intervenir, à la place de la ou des buses piézoélectriques du genre (6ι), des pièces mécaniques (20) réalisées à partir de matériaux inertes vis-à- vis des réactifs liquides non localisés. Il peut s'agir d'acier inoxydable, de polytétrafluoroéthylène (PTFE), de polyamide (NYLON®). Chaque pièce (20) comporte un canal fin (21) traversant. L'ouverture d'entrée (22) de ce canal (21) est reliée par l'intermédiaire d'un conduit (23) à une électrovanne (24) qui régit l'admission de liquide localisé dans le canal (21) de la pièce (20). Cette électrovanne (24) est alimentée en liquide réactif localisé (25) par un réservoir (26). Un conduit
(27) relie le réservoir (26) à l'électrovanne (24). Un gaz neutre (28) (par exemple l'argon) en surpression (e.g. : 0,5 bar) propulse le liquide (25) vers l'électrovanne (24).
Les conduits (23) (27) dont le diamètre est par exemple de 1 mm sont avantageusement réalisés dans le même matériau que la pièce (20) e.g. : PTFE. L'ouverture de sortie (29) - c'est-à-dire la buse - de la pièce (20) est disposée en regard d'un substrat 1 comprenant des micropuits 4 définis par un quadrillage 3 en photorésine.
Le diamètre de la buse (29) est par exemple de 100 μm.
L'électrovanne (24) est asservie à l'unité centrale 16 électronique de commande selon la Fig. 3 (non représentée sur la Fig. 3A). Cette unité 16 est apte à commander l'ouverture (e.g. : 0,1 à 10 ms) pendant une courte durée contrôlée puis la fermeture de l'électrovanne (24) de façon à expulser une petite quantité (30) de liquide réactif localisé (25) et à alimenter le micropuits 4 du support 1.
Avec des diamètres de conduits (23) (27) de 1mm, une surpression d'argon de 0,5 bar, une durée d'ouverture de l'électrovanne (24) de 0,1 à 10 ms, un diamètre de buse (29) de 100 μm, la quantité (30) délivrée est adaptée à un support 1 avec des micropuits 4 de 400 x 400 μm de surface et de 400 μm de hauteur. Les éléments (20) (21) (29) peuvent être, par exemple, les éléments constitutifs d'une microseringue de diamètre inférieur à 100 μm.
Dans la pratique, l'électrovanne (24) peut être, constituée de la vanne INKX 0510100 de la société LEE COMPANY (USA) qui forme aussi un système avec 7 buses (29) sous la référence INZX 0510100. Pour augmenter la compatibilité de cette vanne avec l'acétonitrile, il serait avantageux de remplacer le clapet en élastomère par un clapet en élastomère fluoré (KALREZ® ou CHEMRAZ®).
La variante de système de projection selon la Fig. 3 A est intéressante en raison de son coût réduit, de la simplicité de son fonctionnement et de sa fiabilité. Dans la forme de réalisation représentée à titre d'exemple à la Fig. 3, les moyens d'alimentation localisée 6 comprennent également une conduite 63 d'amenée de gaz sous pression permettant d'acheminer le liquide localisé contenu dans le réservoir 11 vers la buse 6j par l'intermédiaire du conduit de la conduite 62. Cette dernière est équipée d'une électro vanne 64 permettant de contrôler la projection. Les éléments 6ι à 6 qui forment les moyens d'alimentation localisée 6, sont asservis à l'unité centrale de commande 16 qui régit avantageusement l'ouverture et la fermeture de la vanne 6 . L'unité centrale 16 contrôle également l'amenée de gaz propulsant par la conduite 63. Dans le cas le plus fréquent où l'on a plusieurs réservoirs 11 de liquides localisés, l'unité centrale 16 régit également la sélection du liquide à projeter à l'aide d'organes appropriés.
Il est à observer que dans l'exemple de la Fig. 3 une seule buse de projection 6X est prévue, mais que selon des variantes, on peut envisager d'avoir autant de buses de projection que de liquides localisés différents à projeter.
Les moyens d'alimentation non localisés 8 comprennent un conduit d'amenée 8ι de liquide non localisé dans la partie basse 5ι de l'enceinte réactionnelle contenant le support. Cette canalisation 8X relie une ouverture 82 ménagée dans la partie basse 5ι de l'enceinte réactionnelle 5 au réservoir 12 de liquide localisé. Cette conduite 8ι est équipée d'une électrovanne 83 permettant de contrôler le flux de liquide non localisé destiné à alimenter le support. Ces moyens 8 d'alimentation non localisés comprennent également un conduit 84 d'amenée de gaz de propulsion permettant de générer le flux de liquide non localisé dans le conduit 8ι. On conçoit aisément qu'il est possible d'inclure dans ces moyens d'alimentation non localisés 8 d'autres réservoirs liquides non localisés 12 en prévoyant des moyens de sélection du liquide non localisé à introduire dans la partie basse de l'enceinte réactionnelle 5, sur le support 1. Tout comme les moyens 6 d'alimentation localisée, les moyens 8 d'alimentation non localisée sont asservis à l'unité centrale 16 (flèches en pointillé) qui contrôle l'acheminement des liquides non localisés par l'intermédiaire du gaz de propulsion amenés par le conduit 84 et par l'intermédiaire de l'électrovanne 83.
Ces moyens 8 sont associés à des moyens 9 d'évacuation des liquides non localisés qui sont amenés par les moyens 8 et qui séjournent temporairement dans la partie basse 5j de l'enceinte réactionnelle 5, pour noyer le support 1. Ces moyens d'évacuation 9 comprennent une conduite 9ι reliant un orifice de sortie 92 ménagé dans la partie basse 5ι de l'enceinte 5 et le réservoir à effluent 13. La conduite 9ι est équipée d'une électrovanne 93 asservie à l'unité centrale 16 qui gouverne l'évacuation des effluents au moment approprié. Le moteur de cette évacuation peut être par exemple une surpression de gaz et/ou l'action d'une pompe aspirante (non représentée sur la Fig. 3) permettant de soutirer les liquides.
Les organes 10 permettant la circulation d'un flux de saturation en solvants volatils comprennent un réservoir de solvant 10ι, une entrée 102 et une sortie 103 du flux gazeux de saturation dans la partie basse 5t de l'enceinte réactionnelle. Le flux est généré par un gaz neutre tel que l'argon pénétrant par la canalisation 10 dans le réservoir 10χ de solvant et entraînant avec lui des vapeurs de solvant dans la canalisation 105 qui pénètre dans l'enceinte par l'entrée 102 et qui peut être évacué de cette dernière par l'intermédiaire de la sortie 103 qui se prolonge par un conduit d'évacuation 106. Les conduits 10s et 10β comprennent des électrovannes 107 et 108 asservies à l'unité centrale 16 qui contrôle ainsi le flux de gaz de saturation.
De préférence, les organes de saturation 10 de l'enceinte réactionnelle sont conçus de manière à permettre la circulation d'un flux gazeux saturant comportant des vapeurs du (ou des) solvant(s) volatil(s) mis en oeuvre et au moins un gaz neutre.
Les organes d'amenée de gaz 14 facultatifs communiquent avec l'enceinte réactionnelle par l'intermédiaire d'une entrée ménagée dans la partie basse. Ces organes 14 sont équipés d'une électrovanne non référencée et également gérée par l'unité centrale. S'agissant des moyens de déplacement 7 du support 1 par rapport aux moyens 6, dans le cadre de la première forme de mise en pratique du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention, on constate que ces moyens 7 sont représentés de manière symbolique sur la fig. 3 qui fait également apparaître par l'intermédiaire de la flèche en pointillé l'asservissement de ces moyens de déplacement 7 à l'unité centrale 16. De manière générale, il est essentiel que les moyens de déplacement aient une résistance chimique suffisante aux réactifs utilisés pour la synthèse d'OGN, en particulier le(s) solvant(s) utilisé(s) pour la saturation. Le(s) solvant(s) étant inflammable(s), la conception des moyens de déplacement doit permettre d'éviter tout risque de feu. (d'où l'intérêt du gaz neutre). Ces conditions sont assurées pour le dispositif de la fig. 3 puisque les moyens de déplacement sont placés à l'extérieur du réacteur chimique grâce au soufflet.
Ces moyens de déplacement 7 peuvent être constitués par tous moyens connus et appropriés de mise en mouvement de la partie basse 5X de l'enceinte réactionnelle 5. Cette partie basse 5t dispose grâce au soufflet 53 d'une certaine mobilité par rapport à la partie haute 52 de l'enceinte 5 comprenant la buse de projection 6χ. A titre d'exemples, on peut citer des systèmes pignon / crémaillère dans les trois directions entraînables mécaniquement, des systèmes à glissière ou des systèmes comprenant des chariots à mouvements croisés et/ou des platines de déplacements micrométriques motorisés en translation et/ou en rotation. Des produits commerciaux correspondant à ces systèmes, sont proposées notamment par les sociétés MICROCONTROLE, NEWPORT, OWIS.
Les Fig. 4A, 4B et 4C illustrent les déplacements selon x, y et z du support 1 porté par la partie basse 5ι par rapport à la buse de projection 6χ. De tels moyens de déplacement permettent d'alimenter les puits réactionnels 4 du support 1 en liquide localisé.
Cet exemple d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention tel que montré à la Fig. 3, permet de distribuer dans les micropuits 4 du support 1, des gouttes de liquides localisés de très faible volume. A titre d'illustration les Fig. 5 et 6 sont des photographies agrandies d'un support (1) comprenant plusieurs dizaines de micropuits (4) ayant chacun une surface de 150 x 150 μm et une hauteur de 100 μm environ. Ces micropuits sont définis par un quadrillage (3) en résine époxy photoréticulée. La photographie de la Fig. 5 montre le réseau de micropuits 4, en particulier le micropuits 4' entouré d'un cercle, vide de toute trace de liquide localisé. La photographie de la Fig. 6 montre le réseau de la Fig. 5 dans lequel le micropuits (4') entouré d'un cercle contient une goutte G d'acétonitrile de 50 picolitres environ, qui a été envoyée par le système de projection par buse 6ι piézoélectrique du type goutte à la demande (1-a). Si le support 1 contenant la goutte G ne se trouvait pas dans les conditions procurées par le dispositif de la Fig. 3 (saturation) la goutte s'évaporerait en une fraction de seconde et il ne serait pas possible de la prendre en photo. En revanche, avec le dispositif de la Fig. 3, cette goutte se trouve par exemple, dans un volume saturé d'acétonitrile dans l'enceinte réactionnelle. Ainsi, elle se maintient entre 5 et 30 min, durée suffisante pour permettre des réactions chimiques d'ancrage et/ou de synthèse d'OGN.
Le mode de réalisation du procédé selon l'invention décrit dans les Figures 3, 3 A et 4 A, 4B, 4C présente l'avantage d'être facile à réaliser avec un soufflet flexible en PTFE. Le volume saturé est faible, ce qui facilite son contrôle (composition chimique, concentration(s) de(s) solvant(s), pression, température, etc). Les moyens de déplacement sont intégralement à l'extérieur du volume saturé et sont donc à l'abri de la corrosion. Par contre, l'amplitude des déplacements moyens de microdéposition/soufflet est limité aux débattements du soufflet, soit quelques centimètres.
Pour fabriquer des réseaux sur des supports ou substrats de grande dimension, par exemple substrat silicium "wafer 4 à 8 inches" c'est-à-dire 4 à 8 pouces soit 10,16 à 20,32 cm, il est préférable d'utiliser le dispositif selon un deuxième mode de réalisation décrit dans les Fig. 7 et 8 et s'expliquer plus en détails dans les Figures 9A, 9B, 9C, 9D.
Les Fig. 7, 8 et 9 représentent un deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention. Comme cela apparaît sur ces figures, les différences essentielles entre ce deuxième mode et le premier mode décrit ci-avant tiennent au fait que, outre le support déplaçable à l'aide des moyens 7 de déplacement du support 1 selon l'axe X, les moyens 6 d'alimentation localisée sont déplaçables selon l'axe Y et les moyens 8 d'alimentation non localisée sont déplaçables selon l'axe Z et ont des débattements importants, au moins suivant les axes X, Y pour permettre de travailler sur des substrats de grandes dimensions.
Les moyens 7 de déplacement du support 1, ainsi que les moyens de déplacement 30 et 40 des moyens d'alimentation localisés 6 et non localisés 8 respectivement, sont au moins partiellement compris dans l'enceinte réactionnelle 5. Cette dernière est avantageusement de plus grande dimension que le dispositif selon le premier mode de réalisation, par exemple 1,5 x 1,5 x lm. Cette enceinte 5 est conçue de manière à pouvoir être saturée par exemple par un flux gazeux chargé en gaz neutre tel que l'argon et en vapeur de solvant volatil. A cette fin, des organes 10 de saturation de l'enceinte 5 sont prévus. Ils sont identiques à ceux décrits pour le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention. Les éléments identiques sont désignés par les mêmes références.
Le dispositif selon le deuxième mode de réalisation est plus adapté à un mode de fonctionnement industriel. L'important à cet égard est de pouvoir maintenir constamment la saturation de l'enceinte réactionnelle, tant il est clair que toute rupture de saturation entraînerait une consommation importante de temps pour la remise en saturation, compte tenu du grand volume de cette enceinte.
Une autre caractéristique de ce deuxième mode de réalisation du dispositif est que les parties des moyens de déplacement 7, 30, 40 disposés à l'extérieur de l'enceinte 5 sont les moteurs 31, 41 et 71 ainsi que les alimentations électriques (non représentés sur les dessins) desdits moteurs alors que les parties mécaniques internes à (5) décrites plus en détail ci-après des moyens de déplacement 7, 30, 40 sont réalisés à partir de matériaux inertes comme le TEFLON® (PTFE), l'acier inoxydable, les élastomères perfluorés (KALREZ®, CHEMRAZ®), les polyamides (NYLON®). Pour ne pas rompre la saturation de l'enceinte 5, lors du chargement et du déchargement du support 1 porté par les moyens de déplacement 7, l'enceinte 5 est équipé d'un sas latéral 50.
La Fig. 8 montre de manière plus détaillée les moyens d'alimentation localisés 6 assortis de leur moyens de déplacement 30 selon l'axe Y, ainsi que le support 1 et ces moyens de déplacement 7 selon l'axe X. La paroi de l'enceinte réactionnelle 5 est symbolisée sur la Fig. 8 par des traits mixtes. Les moyens 7 de déplacement du support ou du substrat 1 comprenant un quadrillage en résine 3 définissant un réseau de micropuits réactionnels 4, comprennent un chariot de translation 72 apte à coulisser sur des guides de coulissement 73 sous l'action d'un moteur 71, susceptible de générer un mouvement de rotation transformable en translation par l'intermédiaire d'une vis sans fin 74 de transmission. Les guides de coulissement 73 qui sont par exemple des tiges métalliques de section polygonale ou circulaire, et la vis sans fin 74 de transmission sont parallèles entre eux. Chaque extrémité des guides de coulissement 73 est munie d'un bloc butoir 75. L'extrémité de la vis sans fin 74 de transmission opposée à celle reliée au moteur 71 est également équipé d'un bloc butoir 76. Les parties terminales des éléments 73, 74, les blocs butoirs 75, 76 et le moteur 71 sont disposés à l'extérieur de l'enceinte 5.
Avantageusement, l'étanchéité au niveau des passages des guides de coulissement 73 et de la vis sans fin de transmission 74 au travers de la paroi de l'enceinte 5, sont équipés de joints toriques, par exemple en KALREZ. Suivant une variante intéressante de l'invention, les blocs butoirs 75 des guides de coulissement 73 peuvent faire partie intégrante de la paroi de l'enceinte 5 de façon à faire l'économie d'ouvertures qui se doivent d'être étanches. Les matériaux constitutifs des pièces localisées au moins en partie dans l'enceinte 5, sont choisis parmi les matériaux résistant aux réactifs chimiques d'ancrage et/ou de synthèse en particulier d'OGN. A titre d'exemples, de matériaux constitutifs on peut citer le PTFE, l'acier inoxydable, le KALREZ.
Le moteur 71 externe est à l'abri des réactifs chimiques, ce qui prévient tout risque d'incendie ou d'explosion. S'agissant des moyens d'alimentation localisés 6 et de leurs moyens de déplacement 30, il y a lieu de remarquer que lesdits moyens de déplacement 30 sont conçus pour assurer le déplacement en translation selon l'axe Y d'une station 60 de micro-dépôts des liquides ou réactifs localisés dans les micropuits 4 en réseau du support 1. A l'instar des moyens de déplacement 7 décrits ci-dessus, des moyens de déplacement 30 comportent un moteur 31 relié à l'une des extrémités d'une vis sans fin 34 de transmission terminée à l'autre extrémité par le butoir 36, ainsi que des guides de coulissement 33 dont les extrémités sont porteuses de bloc butoir 35. Comme indiqué ci-dessus, certains de ces éléments et la partie terminale d'autres de ces éléments sont disposés à l'extérieur de l'enceinte 5. On se référera à la description des moyens 7 ci-dessus pour plus de détails.
Concernant la station de micro-dépôts 60 apte à être entraînée par la vis sans fin 34 en translation le long des guides de coulissement 33 (selon l'axe Y), elle est formée, d'une part, par un chariot pourvu d'un élément 61 porteur de bouteilles de réactif 62 (dont une seule est représentée sur la Fig. 8) et parallèle à l'axe Y et, d'autre part, d'une batterie 64 qui supporte une série d'organes de micro-dépôts 65 (dont un seul est représenté sur la Fig. 8). Cette batterie 64, parallèle à l'axe Y, est latéralement opposée à l'élément 61 porteur de bouteilles de réactif 62.
Comme indiqué ci-dessus, les éléments des moyens 6 et 30 disposés à l'intérieur de l'enceinte 5 saturée sont constitués de matériaux résistant aux réactifs employés, par exemple à l'acétonitrile, et/ou sont isolés de manière étanche de ladite enceinte. Des exemples de matériaux résistants sont indiqués ci-avant.
Le transfert des réactifs contenus dans les bouteilles 62 vers les organes 65 de microdépôts correspondant est effectué par l'intermédiaire de conduites 66 (1 seule est représentée sur la Fig. 8). La propulsion du réactif ou du liquide localisé est réalisée au moyen d'un flux de gaz neutre, par exemple l'argon, acheminé sous pression grâce à la canalisation 67.
Selon une variante, les bouteilles de réactif 62 pourraient être disposées à l'extérieur du volume de travail défini par l'enceinte réactionnelle 5. Il conviendrait alors de prévoir les connexions "fluidiques" ad hoc. L'écart suivant l'axe Z entre le substrat ou support 1 et les organes de micro-dépôts 65 est réglé de façon à adresser les gouttes de réactif localisé sur l'ensemble du réseau de micropuits 4 défini par le quadrillage en résine 3 du support 1, à l'aide des mouvements des chariots 60 et/ou 72 selon les axes X et/ou Y. Cet adressage par déplacement des chariots 60, 72 et ces micro-dépôts à l'aide des organes 65 (avec en amont les bouteilles de réactif 62 et le gaz propulseur) est contrôlé et géré par une unité de centrale de commande équipée d'une mémoire (ordinateur), non représentée sur le dessin. Les Fig. 9A, 9B, 9C, 9D détaillent les moyens d'alimentation non localisés 8 et plus spécialement un élément particulier de ceux-ci constitués par un piston 80. Comme le montre la Fig. 7, le piston 80 des moyens d'alimentation non localisés 8 est déplaçable en translation selon l'axe Z. Les moyens de déplacement 40 prévus à cet effet comprennent de manière analogue aux moyens de déplacement 7 et 30 décrits ci-dessus, un moteur 41 relié à une vis sans fin 44 d'entraînement en translation de l'axe Z du piston 80 le long de deux guides de coulissement 43 parallèles audit axe Z et à la vis sans fin 44. Les extrémités inférieures des guides 43 et de la vis 44 comprennent des blocs butoirs 45 et 46. Il en va de même pour ce qui concerne les extrémités supérieures des guides de coulissement 43. On se reportera aux descriptions des moyens de déplacement 7 et 30 ci-dessus pour plus de détails. Le piston 80 est solidaire d'un chariot 81 coopérant avec les moyens de déplacement 40. L'axe vertical Z du piston 80 est perpendiculaire à l'axe X de déplacement du support 1 et à l'axe Y de déplacement de la station de micro-dépôts 60, de sorte qu'il est possible en actionnant convenablement les moyens de déplacement 7 et 40 de faire coïncider l'axe du piston 80 avec le centre du support 1 et de faire également en sorte que le piston 80 vienne coiffer le support substrat 1. Comme le montre les Fig. 9A, 9B, 9C et 9D, la face inférieure du piston 80 est pourvue d'un joint torique annulaire 82 réalisé, de préférence en KALREZ. Ce joint torique annulaire est coaxial au piston et possède un diamètre sensiblement inférieur au diamètre de la face inférieure dudit piston 81.
Ainsi, comme le montre la Fig. 9D, ce joint torique annulaire 82 défini un espace interstitiel 83 entre la face inférieure 84 du piston 81 et la surface du support 1 contre laquelle ledit piston 81 est appliqué, grâce aux moyens de déplacement 40.
Dans cette situation où le piston 81 est plaqué sur le substrat 1, l'ensemble substrat + joint torique annulaire 82 + face inférieure 84 du piston 81 forme une enceinte étanche 83 de faible dimension par exemple de 5 à 10 cm3, pour un substrat de diamètre de 4 pouces (= 10,16 cm). Le piston 81 est constitué d'une paroi 85 qui présente une partie terminale inférieure de plus grande épaisseur et qui définit un volume creux intérieur 86. La partie inférieure de la paroi 85 qui est disposée dans le plan diamétral, présente une face externe formant la face inférieure 84 du piston 81 et une face interne 87 équipée d'éléments tubulaires 88 périphériques disposés aux positions angulaires 0°, 90°, 180° et 270°. Ces éléments tubulaires 88 mettent en communication l'intérieur 86 du piston 81 avec l'extérieur et en particulier avec l'espace interstitiel 83 en position plaquée du piston 80 sur le support 1 tel que représenté à la Fig. 9D. Ces éléments tubulaires 88 sont connectés par l'intermédiaire de tubulures non représentées sur le dessin à des réservoirs de réactifs non localisés, eux-aussi non représentés sur le dessin et correspondant aux réservoirs 12 et 13 de la Fig. 3 illustrant le premier mode de réalisation. Il est ainsi possible d'alimenter en réactifs non localisés l'espace interstitiel 83 de volume très réduit, sans rompre la saturation de l'ensemble de l'enceinte réactionnelle 5. Outre l'alimentation en réactif non localisée, les éléments tubulaires 88 permettent également d'assurer l'évacuation desdits réactifs non localisés et/ou le séchage du substrat, en passant par exemple à l'aide d'un flux gazeux ou encore par aspiration, pompage.
A l'instar des moyens d'alimentation localisés 6 et de leurs moyens de déplacement 30, ainsi que des moyens de déplacement 7 du substrat 1, les moyens d'alimentation non localisés 8 et leurs moyens de déplacement 40 sont asservis à une unité centrale de commande apte à gérer toutes les procédures d'alimentation de lavage de rinçage d'évacuation de séchage etc utiles dans le cadre du procédé d'encrage et/ou de synthèse d'OGN localisés propres à l'invention.
Il est à noter que l'homme de l'art dispose de nombreuses variantes techniques pour assurer l'étanchéité de l'enceinte réactionnelle 5. En particulier, après avoir recours à des roulements à bille étanches et à des joints de diverses formes, ces éléments de construction mécaniques étant par exemple exposés dans le livre "MEMOTEC, PRODUCTIQUE, conception et dessins" (C.Barlier et R. Bourgeois).
Selon un autre de ces aspects, l'invention concerne un support porteur d'un réseau de séquences OGN tel que défini supra.
La présente invention vise également un procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles à l'aide de biocapteurs comprenant des sondes formées des séquences OGN complémentaires des séquences OGN cibles et aptes à s'apparier entre elles par interaction affine, caractérisé
• en ce que l'on met en oeuvre un support porteur d'un réseau de sondes OGN tel que défini supra,
• et en ce que l'on révèle l'appariement sonde / cible à l'aide d'un marqueur fluorescent de type "picogreen".
Le "picogreen" est une molécule présentant un signal de fluorescence en présence de doubles brins d'ADN. Le picogreen ne nécessite aucune réaction particulière, et doit simplement être mis en présence des doubles brins pendant 5 min avant la mesure de fluorescence. Cette molécule possède donc plusieurs avantages sur les produits utilisés classiquement pour la détection de doubles brins, que ce soient des marqueurs fluorescents (fluorescéine, rhodamine... ), ou des intercalateurs (bromure d'éthidium, Hoechst 33258).
Le picogreen ne nécessite aucune réaction de marquage, contrairement aux sondes fluorescentes employées dans les puces à ADN. Son signal de fluorescence possède une excellente linéarité sur une large gamme de concentrations. Il permet ainsi de détecter des doubles brins à des concentrations très inférieures à celles mesurables avec les intercalateurs classiques, même en présence de contaminants (simples brins d'ADN, ARN) dans la solution de mesure. Ainsi la sensibilité du picogreen est jusqu'à 400 fois meilleure que le Hoechst 33258, lui-même présentant une meilleure sensibilité que le bromure d'éthidium.
Cette forte sensibilité permet de mesurer des niveaux de fluorescence locale que ne permettrait pas d'obtenir les intercalateurs classiques. Le picogreen est donc plus adapté que ces intercalateurs pour la détection de l'hybridation sur des puces de haute ou moyenne densité, qui font intervenir des unités d'hybridation de taille réduite. Le signal de fluorescence est indépendant de la composition en bases de la séquence testée, contrairement au produit Hoechst.
Le "picogreen" est excité selon les mêmes modalités que la fluorescéine (excitation 480 nm, émission 520 nm), ce qui la rend très pratique à utiliser avec un appareillage standard. Enfin, l'invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles à l'aide de biocapteurs comprenant des sondes formées des séquences OGN complémentaires des séquences OGN cibles et aptes à s'apparier entre elles par interaction affine, caractérisé
• en ce que l'on met en oeuvre un support porteur d'un réseau de sondes OGN tel que défini supra,
• et en ce que l'on conforme ce support en un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-conducteur Se, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface les sondes OGN,
• en ce que l'on met ces sondes OGN en contact avec un milieu liquide conducteur LC comprenant les séquences OGN cibles,
• et en ce que l'on applique le mode opératoire suivant : a) sélectionner des sondes OGN non marquées, b) faire en sorte que le niveau de Fermi du Se corresponde sensiblement au, ou passe par le niveau intrinsèque en surface du Se, c) soumettre le Se à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à l 'énergie de la bande interdite du Se, d) mesurer directement ou indirectement les variations ΔVbp du potentiel de bandes plates Vbp du Se, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des séquences OGN cibles du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires de la ou des sondes OGN, à l'exclusion :
(i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs, colorés, e.g.). e) et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des séquences OGN cibles du LC. Ce procédé associe les réseaux de séquences OGN préparés conformément au procédé décrit ci-dessus et le procédé d'identification et/ou de détection de substances biologiques telles que décrites dans la demande PCT / WO 98 / 57 157 que l'on incorpore totalement dans le présent exposé par référence.
Cette association conduit à un procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles particulièrement performant. Les exemples qui suivent illustrent le fonctionnement du procédé et du dispositif selon l'invention et plus particulièrement du dispositif selon le premier mode de réalisation.
EXEMPLES
EXEMPLE I :
1.1. Réactifs et méthodologie
Le Tableau 1 montre un exemple de classification dans le cas de la chimie des phosphoramidites qui sera utilisé par la suite. De nombreuses variantes sont possibles sans que cela change la portée de l'invention.
Tableau 1 : Exemple de classification des modes d'action des produits et réactifs (chimie des phosphoramidites) 1.2. Dispositif
Le dispositif utilisé est celui décrit supra en référence à la Fig. 3.
Ce dispositif comprend un système de projection (6) formé de 6 dispositifs à microvannes du type de ceux représentés à la Fig. 3 A, pour projeter les réactifs A, C et D du Tableau 1 (1 vanne pour le réactif A, 1 vanne pour le réactif D, les vannes pour les 4 bases de C).
Le dispositif comprend de plus 6 moyens d'alimentation non localisés (10) du type de ceux représentés à la Fig. 3 pour les réactifs A, B, E, F et G du Tableau 1.
Il est prévu que le produit A, l'acétonitrile puisse être envoyé à la fois de manière localisée et non localisée. Le dispositif comprend aussi des moyens de séchage du substrat avec du gaz argon, (soit le réactif H du Tableau 1).
Le support est constitué par une plaque en silicium ou de verre comprenant 256 puits en résine lithographique (époxy).
Chaque micropuits a une surface de 415 x 415 μm et une hauteur d'environ 415 μm. Le volume des puits doit être tel qu'il est rempli sans débordement par la projection d'une goutte de base et d'une goutte d'activateur.
Le protocole de fabrication des micropuits sur cette taille de silicium est le suivant : 1. Nettoyage du substrat (acétone, alcool...) 2. Séchage à l'argon sec
3. Dépôt sur le substrat d'une couche de résine lithographique à la tournette, par exemple, avec une résine époxy à polymérisation cationique (ex résine EPON SU8- 100 développé par IBM qui est fournie diluée avec du solvant γ-butyrolactone en différentes proportions) ; la vitesse de la tournette permet de contrôler l'épaisseur de la résine de 1 à 1 000 μm, typiquement 100 μm ; la résine citée en exemple est utilisée dans la fabrication de microsystèmes et permet d'obtenir des puits verticaux d'épaisseur importante avec des facteurs de forme jusqu'à 1/20 ; Les micropuits de hauteur 400 μm sont fabriqués
- soit par étalement à faible vitesse de rotation d'une seule couche de résine, - soit par étalement successif de 2 à 4 couches et répétition des étapes 4, 5, 6 ci- dessous pour chaque couche. 4. Cuisson à 90°C pendant 5 à 30' en fonction de l'épaisseur de résine et du substrat ;
5. Exposition sélective avec une source UV (lampe UV avec un jeu de masques ou directement avec un laser UV). La dose d'énergie (mJ/m2) absorbée par le substrat doit être ajustée de façon à obtenir une bonne adhésion résine / substrat pendant les différentes étapes de cuisson et de développement. La taille des micropuits varie de
5 μm x 5 μm à 1000 μm x 1 000 μm, typiquement de 415 μm x 415 μm ;
6. Deuxième cuisson à 50 à 100°C pendant 5 à 30' en fonction de l'épaisseur de résine et du substrat ;
7. Dissolution de la résine non exposée avec un solvant (acétone, y-butyrolactone, PGMEA ... ) avec éventuellement une activation par ultrasons ;
8. Cuisson finale pour augmenter la réticulation de la résine : 90 à 150°C pendant 5 à 30'. Cette étape est déterminante pour la tenue des micropuits aux réactifs de synthèse d'oligonucléotides.
9. Nettoyage du substrat au mélange sulfochromique pendant 5', puis rinçage à l'eau bidistillée ;
10. Silanisation par voie aqueuse par trempage pendant 45' dans un mélange GPTS / eau à 1 % v/v, puis passage à l'étuve à 125'C pendant 45' ;
Les paramètres du process sont ajustés de façon à ce que :
- les solvants (acétonitrile, dichlorométhane, THF, pyridine, etc) et les réactifs (iode, etc.) utilisés dans la synthèse d'oligonucléotides ne provoquent pas la dégradation de la surstructure en résine ou le décollement de celle-ci ;
- la réticulation de la résine soit suffisamment avancée pour que la surstructure soit inerte vis-à-vis de la synthèse d'oligonucléotides.
EXEMPLE π : PROTOCOLE D'ANCRAGE ET DE SYNTHESE CHIMIQUE SELON LA CHIMIE DES PHOSPHORAMIDITES
On règle la commande des moyens de déplacement de telle manière que la distance entre la pointe des buses soit à environ 1 mm de l'ouverture du puits 4, lors de la projection de liquides localisés. La pression des bouteilles contenant les réactifs localisés est comprise entre :
- une valeur minimum en dessous de laquelle le réactif n'est pas complètement projeté mais est adhérent à la base.
- une valeur maximum correspondant au volume du puits. Pour réduire les risques de contamination entre puits, seul 1 puits sur 2 est utilisé de sorte que sur les 256 puits du substrat, seuls 64 constituent les noeuds du réseau d'OGN.
La mémoire 15 et l'unité centrale 16 sont chargées de manière à réaliser le réseau comprenant toutes les variantes de l'OGN suivant (écrit dans le sens de fabrication 3' vers 5') :
3 'GAG GAT GGT XXX2X3 CCT GCT AGG TAT 5'
Xi, X2, et X3 forment les 64 combinaisons possibles de A, C, G et T. Cet exemple a été choisi parce que le cas particulier XιX2X3 ≈ ACG est l'OGN L226 d'intérêt biologique.
Dans la pratique, pour des questions d'encombrement stérique lors des hybridations, il est utile d'éloigner l'OGN du substrat. Pour ce faire, on allonge la séquence avec un en-tête de 10 C par exemple, ce qui donne : 3'CCC CCC CGC CGA GGA TGG TXιX2X3CC TGC TAG GTA TC 5'. La première et la troisième partie du réseau sont les séquences : CCC CCC CCC CGA GGA TGGT et CC TGC TAG GTA TC ont été fabriqués avec un synthétiseur d'OGN Expertise Perkin Elmer modifié de façon à pouvoir utiliser des substrats. La partie centrale XιX2X3 a été fabriqué avec le dispositif des Fig. 1 à 4 en fonction de la Fig. 10. On voit sur cette Fig. 10 que l'OGN L 226 est en position centrale et entouré de sondes de composition très différentes de sorte que l'hybridation du plot ACG est facile à détecter. De fait, il a été possible de détecter l'OGN U226 complémentaire du L226 avec un tel réseau.
APPLICATION INDUSTRIELLE
L'invention trouve une application préférée à la fabrication d'un support porteur sur au moins l'une de ses faces d'une pluralité de séquences polynucléotidiques de préférence oligo nucléotidiques et/ou peptidiques différentes les unes des autres et appariables à leurs complémentaires.

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Procédé de fabrication d'un support porteur sur au moins l'une de ses faces d'une pluralité de séquences poly -de préférence oligo- nucléotidiques et/ou peptidiques, ces séquences (OGN), avantageusement différentes les unes des autres, étant, d'une part, appariables à leurs complémentaires par interaction affine et, d'autre part, obtenues par synthèse chimique en présence de solvants volatils ; ledit procédé consistant essentiellement : a) à mettre en oeuvre un support (1) dont la (ou les) face(s) destinée(s) à porter les OGN présentent) un réseau de puits réactionnels (4), chacun de ces puits (4) ayant vocation à servir de siège pour l'ancrage et/ou la synthèse chimique localisé(s) d'une séquence OGN donnée ; ces puits étant obtenus par application d'une résine photoréticulable, par réticulation de cette résine par exposition à un rayonnement actinique dans les zones destinées à définir les puits et par élimination de la résine non réticulée pour obtenir un quadrillage
(3) de résine formant les parois qui délimitent les puits (4) ; b) à placer ce support (1) dans une enceinte réactionnelle (5) et à saturer cette enceinte à l'aide de vapeurs du ou des solvants, volatils mis en oeuvre dans l'ancrage et la synthèse chimique localisé(s) d'OGN, de préférence en faisant circuler au travers de l'enceinte réactionnelle (5) un flux gazeux comprenant les vapeurs saturantes appropriées ; c) à réaliser l'ancrage et/ou la synthèse chimique localisé(s) des séquences OGN dans au moins une partie des puits, cette opération étant effectuée :
(i) en alimentant localement et séparément chaque puits concerné en réactifs et en produits consommables liquides propres à permettre l'ancrage et/ou la synthèse de la séquence OGN correspondante, (ii) en alimentant collectivement (non localement) les puits concernés en réactifs et/ou produits consommables liquides communs aux réactions destinées à intervenir dans tous ces puits ;
(iii) et, en faisant en sorte, préalablement à chaque opération d'alimentation localisée des puits (4), d'éliminer au moins
' 5 partiellement le liquide éventuellement contenu dans chaque puits destiné à être alimenté de manière localisée.
2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on choisit le support dans le groupe de matériaux comprenant : verre, quartz, silicium éventuellement revêtu d'au moins une couche d'oxyde ou de 10 nitrure.
3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'on traite le support en surface de façon à lui conférer des sites d'ancrage aptes à former des liaisons non labiles avec les comonomères de tête des séquences OGN, ce traitement étant, de préférence, une silanisation à l'aide d'un alcoxysilane époxydé,
15 avant et/ou après la préparation du réseau de micropuits.
4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on sélectionne la résine photoréticulable dans le groupe comprenant : les résines positives ou négatives, de préférence dans le sous-groupe comprenant les résines négatives et plus préférentiellement encore dans la classe 20 comportant : les résines (méth)acrylates, époxy, polyester et/ou polystyréniques photoréticulables par voie radicalaire et/ou cationique.
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le flux gazeux de saturation de l'enceinte réactionnelle comporte au moins un gaz neutre en plus des vapeurs de solvant(s) conceraé(s), ce flux gazeux étant de
25 préférence tel qu'il détermine une surpression dans l'enceinte par rapport à l'atmosphère ambiante.
6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que pour assurer l'alimentation localisée et l'alimentation non localisée des puits, on met en oeuvre des moyens correspondants, les moyens -30 d'alimentation localisée et le support étant déplaçables relativement les uns par rapport à l'autre dans les trois dimensions (X, Y, Z) grâce à des moyens de déplacement ; et en ce que pour réaliser l'ancrage et la synthèse sur le support de n séquences OGN comportant chacune x comonomères :
*on stocke en mémoire la composition du réseau de n séquences OGN à réaliser en appréhendant cette composition selon une organisation en x rangs successifs comprenant chacun un comonomère et correspondant chacun à une série d'actions de soutirage, d'amenée et de dépôt de liquides réactifs localisés dans les n puits du support, lesquels liquides déterminent la nature des comonomères dans le rang Ri = 1 à x dans les n puits ;
A et on commande, d'une part, aux moyens d'alimentation localisée et aux moyens de déplacement l'exécution des différentes séries d'actions susvisées, et d'autre part, aux moyens d'alimentation non localisée d'effectuer le soutirage, le transport et l'apport des liquides non localisés dans les n puits du support à différents moments de la procédure d'ancrage et de synthèse des séquences OGN, chaque alimentation localisée étant suivie d'une étape d'évacuation des liquides présents dans les puits et plus généralement , dans l'enceinte réactionnelle, ces commandes et les actions qu'elles induisent étant répétées en incrémentant i de 1 dans Ri jusqu'à i = x.
7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que rélimination selon l'étape 3 (iii) de liquide est réalisée de manière à ce que les puits concernés soient selon exempts de liquide à hauteur d'au moins 90 % de leur volume, de préférence au moins 95 % et plus préférentiellement encore au moins 98
%.
8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on effectue l'élimination de liquide par séchage, avantageusement en injectant du gaz, de préférence neutre, dans l'enceinte réactionnelle et/ou en augmentant la température de l'enceinte réactionnelle et/ou du support et/ou en abaissant la tension de vapeur du liquide à éliminer dans l'enceinte réactionnelle.
9 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un support (1) dont la (ou les) face(s) destinées à porter les OGN, présentent) un réseau de puits réactionnels (4), chacun de ces puits ayant vocation à servir de siège pour l'ancrage et la synthèse chimique localisés d'une séquence OGN donnée, ces puits étant obtenus par application d'une résine photoréticulable, par réticulation de cette résine par exposition à un rayonnement actinique dans les zones destinées à définir 5 les puits et par élimination de la résine non réticulée pour obtenir un quadrillage (3) de résine formant les parois qui délimitent les puits (4) ; au moins une enceinte réactionnelle (5) destinée à contenir le support ;
10 - des moyens d'alimentation localisée (6) des puits réactionnels (4) en liquides localisés spécifiques (réactifs / consommables) propres à permettre l'ancrage et la synthèse d'une séquence OGN donnée dans chacun des puits (4) du support (1),
15 - des moyens de déplacement (7) (30) des moyens d'alimentation localisée (6) relativement au support (1) et/ou inversement ; des moyens d'alimentation non localisée (8) des puits réactionnels (4) en liquides (produits/consommables) non localisés et communs aux réactions destinées à intervenir dans
20 tout ou partie des puits (4) ; éventuellement des moyens de déplacement (40) des moyens d'alimentation non localisée (8) ; des moyens d'évacuation (9) (88) des liquides non-localisés ; ces moyens d'évacuation (9) (88) étant associés aux moyens
25 d'alimentation non localisée (8) ; des organes (10) aptes à permettre la saturation de l'enceinte réactionnelle à l'aide de vapeurs du ou des solvants volatils mis en oeuvre dans l'ancrage et la synthèse chimique localisés d'OGN ;
30 au moins un conteneur (11) (62) des conteneurs de liquides localisés, au moins un conteneur (12) de liquides non-localisés, au moins un conteneur (13) de liquides de vidange des effluents ; éventuellement des organes d'amenée de gaz dans l'enceinte, - éventuellement au moins une mémoire (15) des différentes séquences OGN à ancrer et à synthétiser sur le support, éventuellement au moins un unité centrale (16) de lecture de la mémoire et de génération de signaux de commande de l'alimentation en fluides et du déplacement des moyens d'alimentation localisée et du support l'un par rapport à l'autre.
10 - Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le support 1 comprend :
- au moins une plaque 2 de substrat réalisé à partir d'un matériau choisi dans le groupe comportant : le verre, le quartz, le silicium éventuellement revêtu d'au moins une couche d'oxyde ou de nitrure ;
- au moins un réseau 3, de préférence un quadrillage, de résine photoréticulée solidaire de l'une des faces du substrat, ce réseau définissant une matrice de puits 4 réactionnels, la photorésine étant de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : les résines époxy ou (méth)acrylates photoréticulables par voie cationique et/ou radicalaire.
11 - Dispositif selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les moyens d'alimentation localisée (6) comportent un système de projection ou de dépôt des liquides localisés, ce système étant avantageusement choisi parmi les systèmes suivants :
1) éjection mécanique à l'aide de dispositifs du type : a) goutte à la demande par effet piézoélectrique ; b) goutte par jet interrompu par effet électrostatique ; 2) éjection par pression à l'aide de dispositifs à microvannes.
12 - Dispositif selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que les organes (10) de saturation de l'enceinte réactionnelle (5) sont conçus de manière à permettre la circulation d'un flux gazeux saturant comportant des vapeurs du (ou des) solvant(s) volatil(s) mis en oeuvre et au moins un gaz neutre.
13 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'enceinte réactionnelle (5) comporte un soufflet étanche (53) dont l'une des extrémités (52) porte les moyens d'alimentation localisée (6) et dont l'autre extrémité (5ι), d'une part, présente, en regard de ces derniers, un site réactionnel destiné à recevoir le support (1) et, d'autre part, comprend les moyens d'alimentation non localisée (8), l'extrémité (52) porteuse des moyens d'alimentation localisée étant de préférence fixe et l'autre extrémité (5χ) porteuse de support (1) étant, de préférence, déplaçable dans les trois dimensions x, y, z, grâce aux moyens de déplacement (7).
14 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que les moyens d'alimentation localisée (6) sont susceptibles d'être mis en mouvement dans les 3 dimensions x, y, z sous l'action des moyens de déplacement (7), par rapport à une partie fixe de l'enceinte réactionnelle (5) destinée à recevoir le support (1) et associée aux moyens d'alimentation non localisée (8).
15 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé
- en ce que le support (1) est déplaçable en translation selon un axe x par l'intermédiaire des moyens de déplacement (7), les moyens d'alimentation localisée (6) sont déplaçables en translation selon un axe y par l'intermédiaire de moyens de déplacement (30), les moyens d'alimentation non localisée (8) sont déplaçables en translation selon un axe z, par l'intermédiaire de moyens de déplacement (40) ; x, y, z étant orthogonaux entre eux ;
- en ce que au moins une partie des moyens de déplacement (7), (30), (40) est située au dehors de l'enceinte réactionnelle (5) étanche et saturable, cette partie externe pour les moyens (7), (30), (40) comportant de préférence au moins un moteur électrique (7ι) (3χ), (4j) et son alimentation :
- et en ce qu'il comprend au moins un sas (50) pour le chargement et le déchargement du support (1). 16 - Support porteur d'un réseau de séquences OGN tel que défini dans les revendications 1 et 10.
17 - Procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles à l'aide de biocapteurs comprenant des sondes formées des séquences OGN complémentaires des séquences OGN cibles et aptes à s'apparier entre elles par interaction affine, caractérisé
- en ce que l'on met en oeuvre un support porteur d'un réseau de sondes OGN selon la revendication 16, - et en ce que l'on révèle l'appariement sonde / cible à l'aide d'un marqueur fluorescent de type "picogreen".
18 - Procédé de détection et/ou d'identification de séquences OGN cibles à l'aide de biocapteurs comprenant des sondes formées des séquences OGN complémentaires des séquences OGN cibles et aptes à s'apparier entre elles par interaction affine, caractérisé
- en ce que l'on met en oeuvre un support porteur d'un réseau de sondes OGN selon la revendication 16,
- en ce que l'on conforme ce support en un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-conducteur Se, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface les sondes OGN,
- en ce que l'on met ces sondes OGN en contact avec un milieu liquide conducteur LC comprenant les séquences OGN cibles,
- et en ce que l'on applique le mode opératoire suivant : a) sélectionner des sondes OGN non marquées, b) faire en sorte que le niveau de Fermi du Se corresponde sensiblement au, ou passe par le niveau intrinsèque en surface du Se, c) soumettre le Se à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à l 'énergie de la bande interdite du Se, d) mesurer directement ou indirectement les variations ΔVbp du 5 potentiel de bandes plates Vbp du Se, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des séquences OGN cibles du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires de la ou des sondes OGN, à l'exclusion : 10 (i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans 15 le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs, colorés, e.g.). 20 - et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des séquences OGN cibles du LC.
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