FR2764702A1 - Procede d'identification et/ou de dosage de substances biologiques, presentes dans un liquide conducteur, dispositif et capteur d'affinite utiles pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Abstract

L'invention a pour but de fournir un procédé perfectionné d'identification et/ ou de dosage de polynucléotides PN présents dans un milieu liquide conducteur. Ce procédé consiste à faire intervenir un capteur d'affinité comprenant une structure multicouches semi-conducteur/isolant/sondes = polynucléotides PNc complémentaires aux PN du milieu.Selon ce procédé, on sélectionne des sondes PNc non marquées, on polarise le semi-conducteur,on l'éclaire périodiquement, on mesure les variations du potentiel de bandes plates induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques entre PN et PNc, et enfin on interprète les signaux recueillis en terme d'identification et/ ou de dosage des PN. L'invention concerne également le dispositif et le capteur utile pour la mise en oeuvre de ce procédé.Application : analyse en biologie moléculaire, e. g diagnostic de maladies virales ou génétiques.

Description

Le domaine de l'invention est celui de la détection de produits, de

préférence biologiques ("affins "), tels que les acides nucléiques, ou bien encore les

biopolymères de nature protéique.

Plus précisément, la présente invention concerne, d'une part, un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques SBC, de préférence des polynucléotides PN présentes dans un milieu liquide (solution ou gel) conducteur LC, par l'intermédiaire de mesures optoélectrochimiques et, d'autre part, les

dispositifs et les capteurs d'affinité destinés à la mise en oeuvre de ce procédé.

Les substances biologiques, plus particulièrement mais non limitativement, visées par l'invention sont les polynucléotides PN. Sous ce terme général, on englobe conformément à l'invention, les molécules composées d'au moins deux nucléotides (oligonucléotides et polynucléotides stricto sensu), dont notamment les acides nucléiques ARN ou ADN et toute structure génétique en comprenant. L'invention concerne également les composés susceptibles d'être impliqués dans des réactions de couplage immunologique [Antigène Ag/anticorps Ac], voire de reconnaissance

Enzyme/Substitut E/S.

Pour détecter, identifier ou doser ces molécules, on a exploité leurs propriétés de bioaffinité, à savoir leur aptitude singulière à s'apparier spécifiquement avec leurs complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique PN/PNc, (PN0 = PolyNucléotide complémentaire) de couplage immunologique Ag/Ac ou de

reconnaissance E/S.

C'est ainsi que, dans le domaine immunologique, on connaît des méthodes qui sont fondées sur le couplage antigène/anticorps et qui font intervenir une étape de révélation des couples formés à l'aide de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, colorés ou analogues. De telles méthodes sont longues et complexes à mettre en oeuvre. De plus, les réactifs utilisés sont peu disponibles et onéreux. Enfin,

ces méthodes ne permettent pas des mesures en continu et encore moins in vivo.

Ces techniques ont été transposées avec leurs défauts au domaine de la détection de séquences nucléiques, qui doivent ainsi nécessairement être marquées pour pouvoir

être dosées et/ou identifiées.

Dans un autre registre, il a été proposé de s'attacher à la détection des signaux physiques de toute nature, susceptibles d'être induits par les réactions biochimiques d'hybridation nucléotidique ou couplage immunologique. Pour ce faire, il convient, tout d'abord, d'isoler un type de signaux particuliers et caractéristiques, puis d'adopter un transducteur apte à convertir lesdits signaux en une grandeur physique mesurable. Ces signaux peuvent être, par exemple, la production d'une espèce chimique, une variation d'épaisseur, d'indice optique, de masse ou bien encore une variation de propriétés électriques. Les transducteurs peuvent donc être des capteurs électrochimiques, piézoélectriques, optiques ou électriques. Toute la difficulté réside dans la mise en évidence des signaux spécifiques de l'appariement et dans la mise au point d'un transducteur correspondant fiable, sensible et fidèle. L'invention décrite dans la demande de brevet français n 94 08688 s'insère parfaitement dans cet état de la technique fondé sur la détection des signaux

électriques, induits par des hybridations PN/PNc ou par des réactions antigène-

anticorps, dans un milieu liquide conducteur de l'électricité.

Cette demande de brevet décrit un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques, en particulier, des polynucléotides, des antigènes, des anticorps, des enzymes, des substrats, dans lequel on met en oeuvre une structure multicouches comprenant une plaquette de semi-conducteur recouverte d'un isolant dont la surface est fonctionnalisée par l'une des espèces des paires de substances biologiques sus-visées, appariables spécifiquement. Selon ce procédé, on polarise le semi-conducteur contenant des polynucléotides PN -à doser ou à identifier, on recueille les variations des signaux électriques induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lié aux appariements des substances biologiques visées avec leurs ligands complémentaires fixés sur l'isolant, éventuellement par

l'intermédiaire d'une membrane sensible.

Cette technique de mesure par transduction électrique ne nécessite pas d'intermédaire de réaction, pas plus que de marqueur spécifique ni de réaction enzymatique. Elle donne satisfaction mais reste néanmoins perfectible en ce qui concerne la simplicité de mise en oeuvre et l'accès à une possibilité de réalisation de séries de mesures rapides de différents substrats, sans utiliser autant de capteurs qu'il existe de natures

différentes de substrats à analyser.

Selon cette technique, le phénomène d'effet de charges peut être appréhendé par mesure d'impédance électrochimique d'une structure semiconducteur/isolant/ membrane sensible/liquide conducteur. Selon une variante, la caractérisation de l'effet de champ dû à la variation de la charge superficielle induite par l'appariement, peut être réalisée à l'aide d'un transistor à effet de champ polarisé et sur lequel on

mesure les variations du potentiel grille/source induit par l'effet de champ.

Il existe par ailleurs, des propositions techniques d'identification et/ou de dosage de molécules biologiques, qui combinent * d'une part, des moyens de révélation des substances à doser faisant appel à des marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, colorés, modificateurs de potentiel redox ou de pH, ou analogues, * et d'autre part, des moyens de transduction électrochimiques ou optoélectrochimiques. Malheureusement, une telle combinaison n'est pas de nature à supprimer les inconvénients liés aux techniques basées sur la révélation, ni à améliorer les techniques

d'analyse électrochimique.

C'est ainsi que les brevets américains N 4 591 550 et 5 500 188 divulguent un procédé et un dispositif pour la détermination et le dosage d'une ou plusieurs substances contenues dans un milieu liquide gazeux ou solide et capables de modifier les caractéristiques de photoréponse d'un élément photosensible, comprenant des moyens de reconnaissance desdites substances. Ces derniers impliquent un mécanisme de révélation par un ou plusieurs produits traceurs susceptibles de modifier les caractéristiques physicochimiques du milieu d'analyse (pH, potentiel redox) et/ou

susceptibles d'être mis en évidence par un marqueur radioactif coloré ou fluorescent.

Il s'agit donc d'une technique hybride associant des moyens de transduction

optoélectrochimique et des moyens de révélation physicochimiques.

Le dispositif mis en oeuvre dans ce procédé connu comprend un ou plusieurs capteurs constitués chacun par une plaquette de semi- conducteur (silicium recouvert d'une couche d'isolant SiO2 ou nitrure de silicium), la surface de cette dernière étant éventuellement fonctionnalisée par des moyens de reconnaissance des substances à doser et/ou à identifier. Ce dispositif est également pourvu de moyens de polarisation de la structure semi-conducteur/isolant (e.g. circuit d'application d'une tension de polarisation, ledit circuit comprenant d'une part, une contre-électrode et une électrode de référence et étant relié, d'autre part, à la structure senmi-conducteur/isolant). Le dispositif comporte, en outre, des moyens d'irradiation du ou des éléments photosensibles ainsi que des moyens de mesure de signaux électriques résultants, de

détection et/ou d'identification des substances considérées.

Il est à noter que chaque élément photosensible comprenant la structure semi-

conducteur/isolant est nécessairement associé à des moyens d'éclairement, des moyens de polarisation et des moyens de mesure. Il s'ensuit une extrême complexité du dispositif dans ses variantes visant la multidétection de substances différentes, à la fois sur le plan de la structure en tant que telle et sur le plan de la prise en charge et

du traitement des mesures et des signaux résultants.

La couche d'isolant des éléments photosensibles selon cet art antérieur, est fonctionnalisée dans le cas o les substances à analyser sont des systèmes affins PN/PNc, E/S, Ag/Ac. Dans ce cas, les ligands de reconnaissance fonctionnalisant la couche d'isolant sont systématiquement marqués. Cela est illustré notamment pour l'analyse d'ADN ou ARN, dans laquelle les ligands complémentaires de

reconnaissance sont marqués avec le biotine (Cf. colonne 14 lignes 49 à 63 de l'US-

A-5 500 188). Dans de telles configurations, on doit donc supporter tous les inconvénients liés à ces techniques de révélation par marqueur. Il convient d'ailleurs d'observer que celles qui font intervenir l'absorption ou l'émission de radiations lumineuses, risquent de surcroît de perturber l'irradiation d'activation prévue selon ce procédé. Dans l'hypothèse o il ne s'agit pas de systèmes affins sous-tendant une fonctionnalisation spécifique de l'isolant des capteurs, les moyens traceurs sont e.g. des variations de pH ou de potentiel Redox. Il doit être considéré que ces moyens ne sont pas des plus fiables car il existe bon nombre de facteurs dans le milieu d'analyse, qui est par exemple un liquide conducteur, susceptibles d'interférer sur ces paramètres, sans que cela ne soit lié au dosage et à l'identification des substances visées. De plus, bien qu'il n'exclut pas le fait que le signal mesuré au sortir de leur capteur puisse être le photopotentiel, la photoconductance, la photocapacitance ou la photoinductance, ou des combinaisons de celles-ci (colonne 3, lignes 36 et 37-US-A-5 500 188), il est précisé lignes 41 à 43 colonne 3 de ce même brevet que le signal mesuré est la résultante d'un changement d'un courant continu d'un courant alternatif ou de l'effet d'un courant continu sur un courant alternatif. Cette préférence quant à la prise en compte du photocourant comme signal résultant, ressort également de manière claire et exclusive des exemples de ces brevets US, dans lesquels on prend en compte soit le courant nécessaire pour maintenir un potentiel constant entre l'élément sensible et la référence (colonne 19 lignes 4 à 7), soit les variations de ce courant, qui correspondent aux changements de l'environnement chimique au voisinage de l'isolant de l'élement sensible (colonne 19 lignes 43 à 45) soit le potentiel requis pour maintenir un courant constant (colonne 19 lignes 62 à 65), soit la variation du courant d'alimentation des moyens d'irradiation nécessaires pour maintenir un potentiel constant entre la structure de mesure et la référence (colonne 20 lignes 42 à 49). Cela

ressort également des passages colonne 26 lignes 7 à 9 et lignes 30 à 34.

Il apparaît donc que le signal central pris en considération dans le procédé et le dispositif selon les brevets US-A-4 591 550 et 5 500 188, est le photocourant mesuré de manière directe ou indirecte. Or, la relation entre l'éclairement et ce photocourant est mal définie et englobe plusieurs phénomènes physiques. Il en résulte donc une

incertitude sur l'interprétation des mesures.

Force est donc de constater, que cette proposition technique hybride évoquée ci-

dessus, ne donne nullement satisfaction en matière d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, en particulier biologiques, et plus particulièrement encore polynucléotidiques. Les Demandeurs en veulent d'ailleurs pour preuve qu'il n'existe à ce jour sur le marché aucune application industrielle et commerciale de l'invention

décrite dans ces brevets US NO 4 591 550 et 5 500 188.

Aussi, pour poser la problématique à la base de la présente invention, les inventeurs se sont fixés notamment comme objectif essentiel de fournir un procédé d'identification et de dosage de substances biologiques, de préférence de polynucléotides, ce procédé devant intégrer notamment les spécifications suivantes: - spécificité, - haute sensibilité, - commodité de mise en oeuvre, - "applicabilité " à une grande variété de. substances biologiques, et notamment aux substances polynucléotidiques, - faible coût de revient, - miniaturisation possible de façon à permettre des mesures analytiques, in situ et/ou in vivo, de façon continue ou discontinue; grande fiabilité - bonne reproductibilité - accès à la multidétection, c'est-à-dire l'identification et/ou le dosage de substances différentes (polynucléotides hétéroclites) contenues dans un seul et même milieu d'analyse, - application au diagnostic de maladies virales, génétiques, dès lors qu'il s'agit de multidétection simple à mettre en oeuvre à interpréter

vis-à-vis de polynucléotides.

Pour satisfaire à ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de mettre en évidence, de façon tout à fait surprenante et inattendue, que les appariements spécifiques entre des molécules de préférence biologiques et plus préférentiellement encore entre des brins polynucléotidiques complémentaires, induisent une modification de la charge électrique superficielle dans une structure multicouches, semi-conducteur Sc/isolant Is fonctionnalisé superficiellement. Cette modification intervient plus précisément à l'interface avec un milieu liquide conducteur LC, ledit effet de charge constituant le signal de base d'identification et de dosage, perçu de

manière directe ou indirecte par des moyens de transduction optoélectrochimiques.

La mise en pratique de ce concept original et avantageux s'est exprimé au travers de la présente invention, qui a donc pour objet un procédé d'identification et/ou de dosage de substances biologiques - de préférence électriquement chargées - SBC, présentes dans un milieu Liquide Conducteur LC, à l'aide d'au moins un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi- conducteur Sc, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface au moins une sonde So, en contact avec le milieu conducteur LC et comprenant une ou plusieurs substances biologiques de reconnaissance spécifique SBR par interaction affine, des SBC du milieu LC sus-visé, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à: - a sélectionner à titre de sonde(s) So, des SBR non-marquées, - b - faire en sorte que le niveau de Fermi du Se corresponde sensiblement au, ou passe par le' niveau intrinsèque en surface du Sc, - c- soumettre le Sc à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à 1 'énergie de la bande interdite du Sc, - d - mesurer directement ou indirectement les variations AVbp du potentiel de bandes plates Vbp du Sc, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des SBC du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires SBR de la ou des sondes So, à l'exclusion: (i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs,

colorés, e.g.).

- e - et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification

et/ou de dosage des SBC du LC.

Un tel mode de mesure par transduction optoélectrochimique répond aux spécifications recherchées de simplicité, sensibilité, spécificité, fiabilité et reproductibilité. Par ailleurs, la technique selon l'invention présente également l'avantage d'être réversible. En effet, on peut aisément réaliser le désappariement des espèces complémentaires ayant réagi spécifiquement au niveau de la membrane sensible de la structure semi-conductrice. La membrane sensible peut être ainsi régénérée après

chaque utilisation et ce à de multiples reprises.

De tels résultats avantageux étaient, a priori, difficilement prévisibles.

En particulier, cette technique s'est révélée être d'une efficacité remarquable dans le cadre de la reconnaissance de séquences polynucléotidiques par hybridation des monobrins d'acides nucléiques (ligands), qui forment ces séquences, avec des monobrins polynucléotidiques complémentaires, immobilisés sur la couche d'isolant de la structure Sc/Is. Ainsi, selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention les SBC sont des polynucléotides PN et les SBR sont des

polynucléotides PNc.

La présente invention permet d'envisager, notamment, la reconnaissance de séquences nucléotidiques, par exemple en vue de la détection de maladies génétiques, de la détection et la caractérisation de virus, de bactéries et de parasites ou pour l'établissement de cartes génétiques, l'étude de l'expression et/ou de la mutation des gènes. Outre, l'hybridation nucléotidique, il est envisageable d'exploiter d'autres appariements spécifiques que sont par exemple, les mécanismes biochimiques de couplage immunologique, voire de complexation enzyme/substrat, pour peu que

l'appariement entraîne une variation de charges électriques à la surface de Is.

Le principe d'analyse qui gouverne le procédé selon l'invention est exclusivement optoélectrique ou optoélectrochimique. Cela signifie que l'on a à faire à une reconnaissance biochimique affine, c'est-à-dire qui ne fait pas intervenir de réactions chimiques ou enzymatiques et qui se déroule sans production ou consommation d'espèces chimiques intermédiaires. En outre, la révélation de cette reconnaissance biochimique affine ne se fait pas au travers d'une détection indirecte à l'aide de moyens physicochimiques de révélation: traceurs colorés, fluorescents, radioactifs, potentiels redox, pH. Conformément à l'invention, la reconnaissance biochimique s'opère essentiellement, voire exclusivement par une transduction optoélectronique soustendant la polarisation de la structure Se/Is par rapport à LC,

ainsi que l'éclairement périodique de ladite structure.

Au sens de l'invention, l'expression " électriquement chargées " signifie que lors de l'interaction affine de la PNc avec la PN, la charge électrique de surface est modifiée. La première étape - a - du procédé selon l'invention consiste à mettre

exclusivement en oeuvre des sondes So, en particulier des PNc, non marqués, c'est-à-

dire non porteurs de moyens de révélation physicochimiques (fluorescence,

colorimétrie, radioactivité, potentiel redox, pH).

Dans le cas d'une structure fonctionnalisée en surface par des sondes constituées par des monobrins polynucléotidiques PNc par exemple d'ADN, l'hybridation de ces derniers avec les brins à doser ou à identifier dans le milieu LC entraîne un accroissement de charges sur la surface de la structure. Ceci conduit à une modification de la répartition des porteurs de charge dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur, afin de satisfaire au nouvel équilibre thermodynamique de la structure. Cette nouvelle répartition se traduit par une modification de la courbure des

bandes du semi-conducteur dans sa zone interfaciale en contact avec le diélectrique.

Le potentiel de bandes plates Vbp est le potentiel qu'il faut appliquer au semi-

conducteur par rapport au milieu LC (électrolyte) en contact avec le diélectrique Is pour obtenir une courbure nulle des bandes du Sc. Conformément à l'invention, on mesure cette grandeur physique Vbp ou sa variation AVbp, de manière à caractériser l'état d'équilibre de la structure. Ainsi, la modification de la charge de surface correspond à une variation de Vbp, qui est elle-même une signature de l'hybridation PN/PNc. Pour qu'il y ait variation de la courbure de bandes du Sc et donc de Vbp, il convient conformément à l'étape b du procédé selon l'invention, de créer une courbure de bande initiale du Se, en procédant à l'ajustement des niveaux de fermi du Sc et du milieu LC, de préférence par l'imposition d'une tension de polarisation Vp continue à

la structure Sc/Is - PNc, par rapport au milieu LC.

Conformément à un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'ajustement du niveau de Fermi du semi-conducteur Se sensiblement à son niveau intrinsèque en surface, s'opère en imposant une tension de polarisation Vp au Se par rapport au LC, selon un balayage entre une tension négative et une tension positive limites, choisies de telle sorte que le niveau de Fermi du Se passe par son niveau intrinsèque en surface, Vp évoluant ainsi avantageusement dans une gamme de

tension correspondant au régime de désertion et de faible inversion du Sc.

Cette polarisation continue est associée, d'une part à l'éclairement périodique selon l'étape c et d'autre part, à une mesure des variations de Vbp suivant l'étape d. Cette mesure est effectuée comme suit: > recueil du photopotentiel (Vph) aux bornes du Sc (entre Sc et LC) et/ou du photocourant (Iph) > calcul des impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq pour chaque valeur de Vp, > réalisation de la (ou des) courbe(s) Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph en fonction de Vp, > et suivi du déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspondant

aux variations de Vbp recherchées.

Les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq permettent d'accéder aux propriétés énergétiques de la structure ScIs-So ainsi que de sa zone interfaciale avec

le LC, et notamment aux différents effets de charge pouvant intervenir aux interfaces.

Ces impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont liées au photopotentiel Vph et au courant Ihv, générés suite à l'excitation lumineuse périodique du Sc, par ailleurs soumis à une polarisation continue. En effet, l'éclairement modulé - c - du Sc par des photons d'énergie supérieure ou égale à la largeur de sa bande interdite, génère des paires électrons-trous, porteurs de charge. Ces derniers sont séparés sous l'effet du champ électrique existant dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur Sc (dans la zone en contact avec le diélectrique Is). Ce phénomène entraîne l'apparition de Ihv périodique dans le semi-conducteur Se, ce qui conduit aux bornes de la structure Sc/ls-So à un photopotentiel Vph périodique ou à un photocourant Iph

périodique.

Il est donc possible d'utiliser indifféremment Vph et/ou Iph et/ou les composantes impédimétriques Zop et/ou Zoq, en tant que paramètres de transduction des phénomènes énergétiques d'effet de charge, directement liés aux appariements

auxquels on s'intéresse.

Dans le cas o la puissance de l'éclairement selon l'étape c est faible, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont des fonctions de transfert reliant Vph à Ihv induit par l'éclairement modulé. Plus précisément, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq de la région de la zone de charge d'espace du Sc sont directement proportionnelles aux valeurs efficaces des composantes en phase et en quadrature du Vph mesuré. Le coefficient de proportionnalité dépend de l'intensité

ou de la puissance, de l'éclairement.

Le photopotentiel est donc l'image de l'impédance opto-électrochimique de la structure. Dans cette variante, on préfère que l'éclairement soit non seulement faible

mais également sensiblement sinusoïdal.

Dans le cas o l'éclairement mis en oeuvre à l'étape c est fort, on accède aux variations de Vbp, dans le cadre de l'étape d, de préférence: * en recueillant Vph et/ou Iph, * en établissant la courbe Vph = f (Vp) et/ou Iph = f(Vp), * et en suivant le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspond aux AVbp recherchées. En effet, à fort éclairement, si la charge de surface varie du fait de l'appariement des PN du LC avec les PNc des sondes So de la structure Sc/Is, il s'ensuit une modification du Vbp qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur efficace du photopotentiel Vph et/ou du photocourant Iph, parallèlemient à l'axe des potentiels

de polarisation de la structure.

Selon l'invention, les notions de faible et fort éclairement sont définies comme suit: - le faible éclairement est un éclairement qui conduit à une perturbation du second ordre de la structure par rapport à l'équilibre thermodynamique dans l'obscurité. Il est de préférence inférieur ou égal à 10 gW/cm2 et préférentiellement à

1 pW/cm2.

- le fort éclairement est un éclairement qui perturbe fortement l'équilibre thermodynamique de la structure dans l'obscurité. Il est de préférence supérieur à

10 gW/cm2.

Dans les variantes à faible et à fort éclairement évoquées ci-dessus, pour

la description du premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les

calculs de Zop et/ou Zoq, le pilotage et l'acquisition des mesures, ainsi que le traçage des courbes Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph = f(Vp), se font par l'intermédiaire d'un microordinateur, selon des procédures connues en soi (notamment calcul des

impédances selon la loi d'Ohm).

Conformément à un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on adopte la méthodologie suivante: A dans l'étape b: on fixe le niveau de Fermi du Sc sensiblement au niveau intrinsèque en surface du Sc, en imposant une tension de polarisation Vpi correspondant environ à l'abscisse du point ll d'inflexion de la courbe Vph = f (Vp) ou Zoq = f(Vp) ou Iph = f(Vp), Vph, Zoq et Iph étant tels que définis supra (p.9 1.4 à 7), de telle sorte que l'ordonnée de ce point d'inflexion corresponde environ à Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2; A et dans l'étape d, on appréhende les variations AVbp de Vbp: (i) par la mesure de l'évolution de Vph et/ou Iph et/ou Zoq, dans le cas o les variations AVbp sont faibles et en considérant queVbp varie linéairement avec Vph, alors AVbp = KAVph, o K représente la pente de la courbe Vph = f(Vp) au point d'inflexion; (ii) et/ou par la prise en compte des variations de la tension de polarisation AVp, rendues nécessaires pour réguler et maintenir constant Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2, cet ajustement AVp

étant le reflet de AVbp.

Il s'agit donc selon ce mode de mise en oeuvre de polariser la structure Sc/Is de telle sorte que le niveau de Fermi soit au voisinagé de la position intrinsèque du semi-conducteur. Le potentiel imposé Vpi est voisin du potentiel correspondant au point d'inflexion de la courbe d'allure sigmoïdale du photopotentiel Vph, du photocourant Iph ou de l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq en

fonction du potentiel de polarisation Vp.

Au sens de l'invention, on entend par " voisinage " du niveau de Fermi par rapport au niveau intrinsèque en surface du Sc, la position voisine du milieu de la bande interdite du semiconducteur à sa surface au contact de l'isolant Is, dans une plage telle que le semiconducteur se trouve en surface en situation de désertion ou faible inversion, de telle sorte que le photopotentiel Vph, et/ou le photocourant Iph, et/ou l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq varie beaucoup avec le

potentiel de polarisation Vp.

Par suite, " Vpi correspondant environ au potentiel du point d'inflexion ",

doit s'entendre, selon l'invention, par une plage d'incertitude de + 0Volt.

L'ordonnée du point d'inflexion de ces courbes Vph, Iph ou Zoq = f (Vp) est avantageusement choisie comme paramètre de référence à maintenir constant dans le cadre de cette régulation par ajustement de Vp. La référence est en pratique donnée par la valeur maximale qu'atteint Vph, Iph ou Zoq dans chacune des courbes

sigmoïdales caractéristiques.

Vph max, Iph max et Zoq max correspondent en d'autres termes à la valeur maximale du photopotentiel, du photocourant et de l'impédance optoélectrochimique en quadrature, respectivement, lorsque le semiconducteur est en

régime de forte inversion.

Dans la mesure o la détermination de la valeur de consigne Vpi passe par la prise en compte de l'abscisse et de l'ordonnée du point d'inflexion d'au moins l'une des courbes Vph ou Zoq ou Iph = f(Vp), il est prévu dans ce deuxième mode de mise en oeuvre d'établir au moins l'une desdites courbes, de préférence comme décrit

supra pour le premier mode de mise en oeuvre.

La variante (i) de l'étape d selon ce deuxième mode de mise en oeuvre consiste à suivre AVbp par la mesure de la variation de Vph, Iph ou Zoq, après calibration. Cela revient à établir la courbe Vph et/ou Iph et/ou Zoq = f(t) et de considérer que toute variation AVph, AIph ou AZoq correspond à une variation AVbp. La variante (i) est utilisable dans le cas d'une variation modérée du Vbp

permettant d'établir une relation simple (linéaire par exemple) entre A Vph et AVbp.

En pratique, on préfère recourir à la variante (ii) de l'étape d selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé conforme-à l'invention. Dans cette variante, on maintient Vph max/2 constant en ajustant la polarisation Vp de la

structure, de préférence par l'intermédiaire d'une régulation électronique.

Le AVp de régulation correspond au AVbp que l'on cherche à mesurer.

Selon une disposition avantageuse de l'invention, la régulation électronique que l'on peut mettre en oeuvre dans le cadre de la variante (ii) de prise en compte de AVp, s'effectue de la façon suivante: - on détecte vph, - on amplifie éventuellement le signal vph, - on redresse éventuellement ce signal de manière à disposer d'un signal continu v'ph, on compare ce signal vph continu à un signal de référence U correspondant sensiblement à la valeur de v'ph max/2 (ordonnée de point d'inflexion de la courbe v'ph = F (Vp) soit v'ph max/2), - on recueille la différence A (v'ph-U) entre V'ph et U, - on amplifie éventuellement A(v'ph-U), - on applique A(v'ph-U) éventuellement amplifiée entre Sc et LC en complément de Vp,

- on enregistre A(V'ph-U).

L'intérêt d'une telle procédure de régulation résulte du fait que le potentiel électriquement imposé est directement et linéairement l'image des variations de Vbp provoquées par les interactions à la surface du diélectrique Is. Il est donc indépendant des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne sensibilité et

une excellente reproductibilité de mesure.

Selon la nomenclature adoptée dans le présent exposé, Vph désigne aussi bien le photopotentiel primaire vph mesuré entre Sc et LC que V'ph correspondant à vph redressé et éventuellement amplifié. S'agissant de l'étape c d'éclairement, qui est commune aux deux modes de mise en oeuvre évoqués ci-dessus, il y a lieu de préciser que ledit éclairement peut être effectué en regard de n'importe quelle zone des faces externes de la structure Sc/Is-So, y compris sur son épaisseur le cas échéant, voire sur la totalité de l'extérieur

de cette structure.

En d'autres termes, l'éclairement périodique de la structure Sc/Is est donc effectué soit en regard de la ou des faces externes du Sc, soit en regard de la ou des faces

externes de l'isolant Is, soit en regard de toutes les faces externes de la structure.

De préférence, pour l'étape c, on choisit la longueur d'onde de l'éclairement 3 de telle sorte qu'elle soit supérieure ou égale à 30 =. 14. nm,_ de E(6nergie bande interdite) préférence comprise entre 100 et 3000 nm, E étant l'énergie de la bande interdite de

Sc exprimée en électron-volt.

Ce seuil.0 est fonction de la nature du semi conducteur.

Selon un troisième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut éliminer radicalement les réponses non spécifiques, en mettant en oeuvre une mesure différentielle, selon laquelle, on fait intervenir dans le capteur d'affinité au moins une autre structure Sc/Is de référence, dans laquelle Is n'est pas fonctionnalisé par So, et en suivant la différence entre les Vbp mesurées par les 2 capteurs, ainsi que

la variation de cette différence.

Dans ce troisième mode de mise en oeuvre la structure Sc/Is-So de mesure et la structure Sc/Is de référence sont mises au contact du même milieu LC. Elles sont polarisées de la même façon, de préférence au moyen d'une même contre-électrode, une électrode de référence n'étant pas nécessaire. Enfin, conformément à l'étape c,

elles sont soumises à un même éclairement de lumière modulée.

Par ailleurs, les moyens d'interprétation des signaux recueillis mis en oeuvre dans l'étape d sont choisis de manière à permettre le suivi de la différence entre les

potentiels de bande plate VbpO et Vbpl propres aux deux structures Sc/Is et Sc/Is-

So, respectivement.

Cette disposition permet d'obtenir une mesure très précise et en continu de la variation du Vbpl de la structure Sc/Is-So fonctionnalisé, en s'affranchissant des phénomènes parasites pouvant apparaître et qui sont liés à d'autres paramètres que

l'appariement et, en particulier, que l'hybridation PN/PNc.

Un quatrième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est caractérisé, en ce que, dans une étape préalable ao, on fonctionnalise différentes zones de la surface d'une couche d'isolant Is d'une même structure Sc/Is, par plusieurs sondes So différentes de par la nature des PNc qui les composent, et on réalise ensuite à l'aide de cette structure l'analyse de LC contenant un ou différents substrats PN: - par éclairements successifs des zones de la surface de l'Ls, lesdites zones étant chacune fonctionnalisée par une même So (PNc identiques), la nature des So variant d'une zone à l'autre,

- et par recueil et interprétation des AVbp.

Ce quatrième mode de mise en oeuvre correspond à la multidétection de substrats, en particulier de PN, de natures différentes, dans le domaine de la génétique. La multidétection selon l'invention permet d'accéder à des méthodes de détection simple et rapide de maladies virales et de maladies génétiques. Il est également envisageable de réaliser des vérifications de compatibilité tissulaire, de même que des cartographies de populations hétérogènes de polynucléotides, par exemple de génômes. Cela constitue en outre un outil pour l'étude de la mutation des gènes, de l'expression des

gènes, ou du séquençage génomique.

L'intérêt de la multidétection selon ce quatrième mode de mise en oeuvre réside dans la simplicité méthodologique et structurelle du procédé et du dispositif correspondants. De manière commune aux troisième et quatrième modes de mise en oeuvre évoqués ci-dessus, à savoir respectivement la mesure différentielle et la multidétection, il y a lieu de noter que l'étape de mesure directe ou indirecte de AVbp peut être réalisée conformément à la procédure décrite pour le premier mode de mise en oeuvre dans l'une ou l'autre de ces variantes à faible ou à fort éclairement, de même que selon la procédure propre au deuxième mode de mise en oeuvre, quelle que

soit la variante (i) ou (ii) retenue.

Il va de soi que l'invention n'est pas limitée à ces quatre modes de mise en oeuvre, mais elle englobe également toutes les méthodes de mesure envisageables et analogues, fondées sur la reconnaissance de la variation du potentiel de bandes plates (AVbp) d'une structure Sc/ls-So possédant une zone sensible faite de sondes So à base de substances biologiques de reconnaissance SBR (e.g. des PNc) aptes à réagir spécifiquement avec des susbtances biologiques électriquement chargées SBC (e.g.

des PN) dans un milieu LC.

Avantageusement, les substrats à analyser sont des PN, de préférence choisis dans la liste suivante: nucléotides, oligonucléotides, polynucléotides, acides nucléiques (ADN ou ARN)

ainsi que les analogues et les mélanges desdits substrats.

Conformément à l'invention, les sondes So mises en oeuvre dans le procédé sont des

moyens de reconnaissance spécifique, en particulier des PNc, non-marqués, c'est-à-

dire non porteurs de moyens de révélation de l'appariement PN/PNc (fluorescence,

colorimétrie, radioactivité).

Bien que l'on privilégie des substances biologiques du type séquence polynucléotidique (ARN, ADN, gène, plasmide ou tout autre matériel génétique), cela n'exclut pas pour autant d'autres substances biologiques du type antigène, haptène, anticorps ou, de manière générale, toute espèce d'un couple formé par une macromoléculaire biologique et son complément spécifique. Comme exemples de couples ou de paires d'appariement spécifique, on peut citer: antigène-anticorps, haptène- anticorps, ADNc/ADN, ARNc/ARN, poly dT-ARNm, eucaryote, lectineglycoconjugué, marqueur de cellules (ou de microorganismes)- cellules (ou

microorganisme), HcG- récepteur tissulaire et T3 - TGB (thyroxin binding protein).

Le procédé selon l'invention passe tout d'abord par l'immobilisation d'au moins un type de ces espèces biologiques PNc réactives pour constituer la ou les sondes So. Celle-ci peut se faire directement sur la couche isolante ou à l'aide d'un matériau intermédiaire (composés d'espacement par exemple), accolé à l'isolant Is et apte à recevoir par liaison physique (e.g. adsorption-absorption) et/ou chimique (e.g.

liaison covalente), les ligands biologiques spécifiques PNc.

Selon l'invention, il est parfaitement envisageable de prévoir une des sondes So hétérospécifiques, formées d'espèces biologiques PNc de natures

différentes, aptes à réagir avec leurs complémentaires.

Le milieu liquide conducteur LC utilisé peut être toute solution tampon compatible avec les substances biologiques considérées PN. Ce milieu liquide LC possède avantageusement une conductivité équivalente à celle d'une solution aqueuse de NaCl ayant une concentration pouvant aller de 0,005M à 3M et préférentiellement de l'ordre de 0,1 M. Le pH du milieu liquide peut être compris entre 0 et 12, de préférence entre 6 et 8 de façon à favoriser les appariements par bioaffinité. La stringence du milieu liquide peut

également être ajustée pour favoriser l'hybridation.

Les interactions non spécifiques, par échange d'ions ou par interactions hydrophobes, peuvent être supprimées en tout ou partie à l'aide de tampon de force ionique

appropriée. (e.g. Tris-HCI/Tris-base).

Avantageusement, la température de mesure peut être comprise entre 0 et 50 C. Elle est contrôlée plus précisément de façon à favoriser les réactions

biochimiques concernées.

La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que décrit supra, ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un capteur d'affinité formé par au moins une structure Sc/Is-So dans laquelle la ou les sondes So comprennent des ligands SBR aptes à s'hybrider spécifiquement avec les substances biologiques SBC à analyser, contenues dans le milieu liquide conducteur LC, en provoquant un phénomène d'effet de charge, à l'origine des AVbp du Sc, - des moyens de polarisation du Sc par rapport au LC, - des moyens d'éclairement du Sc du capteur, - des moyens de mesure du photopotentiel Vph ou du photocourant Iph, - des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp, - et des moyens de calcul et d'interprétation des AVbp en termes

d'identification et/ou de dosage des substances biologiques SBC.

Grossièrement, ce dispositif comprend donc - d'une part une ou des structures multicouches semi-conductrices simples, assimilables à des électrodes de mesure, - de deuxième part, une source de lumière modulée pour l'éclairement de cette ou ces structures, - et de troisième part, des périphériques électroniques de polarisation

électrique, de mesure, de calcul et d'interprétation.

Les mesures du photopotentiel Vph et/ou des impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq sont réalisées dans une configuration de circuit ouvert c'est-à-dire que le circuit de mesure doit comporter une très forte impédance

de charge.

Les mesures de photocourant Iph sont réalisées avantageusement dans une

configuration de circuit fermé (court-circuit).

Ces moyens techniques relèvent de technologies classiques et parfaitement maitrisées

par les hommes de l'art.

En outre, ce dispositif bénéficie d'un faible coût de revient. Il peut être produit aisément à l'échelle industrielle et offre une grande fiabilité et une bonne reproductibilité de mesure. De surcroît, le caractère déjà miniaturisé voire " miniaturisable " des capteurs d'affinité constituant le dispositif, ouvre des perspectives prometteuses

notamment pour certaines applications in vivo ou in vitro.

De manière préférée, mais non limitative, l'electrode de mesure (c'est-à-

dire la structure multicouches Sc/Is-So) du capteur d'affinité du dispositif, est formée par au moins une plaquette de Sc, de préférence en silicium, recouverte sur l'une de ses faces d'au moins une couche Is d'isolant de préférence en silice, à la surface de laquelle sont fixées au moins une sonde So sensible comprenant au moins un ligand d'appariement biospécifique, de préférence des polynucléotides PNc de reconnaissance spécifique par hybridation, ce capteur comportant également au moins un contact ohmique permettant la connexion de la structure Sc/Is-So, notamment, avec les moyens de polarisation et/ou

les moyens de mesure de Vph.

Le dispositif comprend outre cette structure Sc/Is-So, au moins une

électrode auxiliaire, éventuellement prévue sur la couche Is de la Structure Sc/Is-So.

Avantageusement, la couche de matériau diélectrique bloquant Is est par exemple, une couche d'oxyde et/ou de nitrure ou tout autre matériau minéral ou

organique de faible épaisseur, empêchant ou limitant les phénomènes faradiques.

Cette structure est associée à un milieu liquide conducteur contenant les substances

SBC à doser à détecter ou à identifier LC.

En pratique, le silicium choisi à titre de semi-conducteur est du type n ou p moyennement dopé, de préférence à hauteur de 1015 à 1019 cm-3, de préférence 1016 cm-3. L'épaisseur de la plaquette de silicium est, par exemple, comprise entre 0,01 et 2 mm. La couche isolante Is est avantageusement constituée de silice ou de nitrure de silicium. Elle a pour fonction d'anihiler d'éventuels processus faradiques qui

pourraient perturber les mesures, par l'intermédiaire de signaux électriques parasites.

Cette couche Is permet également d'éviter les difficultés liées à une possible corrosion

du matériau semi-conducteur par le milieu conducteur LC en contact.

L'épaisseur de cette couche Is est comprise entre 1 et 500 nanomètres, de préférence

entre 1 et 50, et plus préférentiellement encore est de l'ordre de 10 nanomètres.

La couche diélectrique Is supporte les sondes So PNc, lesquelles constituent ce qu'on

pourrait dénommer membrane bio-réceptrice en contact avec le milieu LC.

DESCRIPTION DES FIGURES

- La Figure 1 est une représentation schématique du dispositif d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques, de préférence polynucléotidiques PN présent dans un milieu liquide conducteur LC, conforme à l'invention. - Les Figures 2 et 3 sont des vues en coupe transversale droite, de

variantes de réalisation du capteur d'affinité montré à la Figure 1.

- La Figure 4 représente le schéma du circuit électrique de mesure des impédances optoélectrochimiques Zop, Zoq du capteur d'affinité selon l'invention, conformément au premier mode de mise en oeuvre du procédé, dans sa variante faible

éclairement.

- La Figure 5 représente le schéma synoptique d'une forme d'exécution particulière du dispositif de mesure selon l'invention correspondant à la variante ii de

la deuxième forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

- La Figure 6 est une représentation schématique en coupe transversale droite d'une forme d'exécution du dispositif selon l'invention, à savoir le capteur

différentiel correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé.

- La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure

multicapteur Sc/Is-SoI à Son.

- La figure 8 annexée montre les courbes Zop et Zoq = F(Vp) obtenues.

- La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la reconnaissance de

brins simples d'ADN.

- La Figure 10 est une courbe Vph = F(Vp) obtenue à l'exemple 3 pour

illustrer un premier mode de mise en oeuvre du procédé à fort éclairement.

- La Figure 11 donne la réponse en AVp de la structure fonctionnalisée

pour la détection d'oligonucléotides. Exemple 4 - 2èrne mode de mise en oeuvre -

variante (ii) -

La présente invention sera comprise à la lumière de la description qui suit, d'exemples

de réalisation du dispositif et de mise en oeuvre du procédé qu'elle concerne, en référence aux dessins annexés. Ces illustrations non limitatives font ressortir de

nombreux avantages et variantes de l'invention.

La Figure I montre le dispositif selon l'invention qui comprend un capteur d'affinité 1 formé par une structure 7 Sc/Is-So au contact, par sa face supportant les So, avec un milieu liquide conducteur LC, désigné par la référence 2. Ce dispositif comporte également des moyens de polarisation 3, des moyens d'éclairement 4, des moyens 5 de mesure de Vph, et une unité 6 de calcul et de commande comprenant des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp et des moyens de calcul et d'interprétation des AVbp en terme d'identification et/ou de dosage des

substances biologiques électriquement chargées à analyser, également désignées SBC.

Le capteur d'affinité 1 est constitué par une structure 7 Sc/Is-So, ellemême formée par une plaquette Sc de silicium 7.1, une couche d'isolant Is en silice 7.2 et des sondes So désignées par la référence 7.3, fixées sur la surface de l'isolant Is 7.2 pour fonctionnaliser cette dernière. Selon une variante, on peut déposer éventuellement à la surface, une couche fonctionnelle permettant de mieux accrocher les sondes So. Le capteur d'affinité 1 est pourvu sur sa face externe opposée à celle porteuse des sondes So 7.3, d'un contact ohmique 8 relié aux moyens de polarisation 3. Le contact ohmique 8 est isolé du milieu LC 2 par l'intermédiaire d'un joint 8, périphérique. Ce dernier coopère par contact étanche avec un support isolant 82 sur lequel repose en somme le capteur 1. Avantageusement, ces sondes sont constituées par des Substances Biologiques de Reconnaissance spécifique (SBR) des SBC. Dans le

présent exemple, les SBC et les SBR sont des polynucléotides PN et PNc.

Une électrode de référence 9 et une contre-électrode 10 baignent également au sein du milieu 2 conducteur LC avec le capteur d'affinité 1. Ces deux électrodes 9 et 10

sont connectées aux moyens de polarisation 3.

Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, une résistance de charge élevée est prévue dans le circuit potentiostatique de mesure. Avantageusement, cette résistance élevée RL est insérée dans la connexion reliant la contre-électrode aux moyens de polarisation 3. En pratique, la résistance RL est préférablement supérieure à 100 kn, de préférence 50 MQ et plus préférentiellement encore est de l'ordre de MQ. Les Figures 2 et 3 montrent chacune une variante de réalisation du capteur d'affinité 1 dans laquelle la structure 7 constitue le fond d'une cellule de mesure comprenant des parois 11 et un joint 12 assurant l'étanchéité entre le fond 7 et

lesdites parois 1l.

Les éléments communs aux Figures 1 à 3 sont désignés par les mêmes références. La variante de la Figure 2 se distingue de celle de la Figure 3 en ce que la zone sensible comprenant les sondes So 73 est délimitée dans la première alors qu'elle

ne l'est pas dans la seconde (toute la surface de l'IS comporte des sondes So 73).

Les moyens de polarisation 3 du dispositif selon l'invention sont, de préférence, constitués par un potentiostat adapté, ayant par exemple une forte constante de temps (supérieure à 1 s). Il permet la polarisation de la structure tout en ne perturbant pas le

photopotentiel Vph.

Dans l'exemple montré sur le schéma synoptique de la Fig. 1, qui correspond à une réalisation préférée de l'invention, les moyens d'éclairement 4 comportent au moins une source de lumière, en l'occurence une, disposée * soit en regard de la membrane bioréceptrice 7.3. formée par les sondes So fixées sur l'isolant Is 7.2, soit en regard de la face du Sc 7.1 opposée à la face 7.3. porteuse du contact ohmique 8 (hypothèse symbolisée par des pointillés sur le schéma de la Figure 1),

À soit en regard de tout ou partie de l'extérieur de la structure 7.

Cette source lumineuse 4 est, par exemple, constituée par un laser tel qu'un laser

hélium-néon ayant une longueur d'onde d'émission égale = 632,8 nm.

Avantageusement, le faisceau lumineux traverse un modulateur acoustooptique (non représenté sur Fig.1) dont le contrôleur est piloté par un générateur basse fréquence,

désigné par la référence 4.1 sur la Fig.1.

Un filtre non représenté permet d'ajuster la puissance lumineuse à des valeurs inférieures, égales ou supérieures, au seuil déterminant les plages de faible éclairement et de fort éclairement. De préférence, la puissance lumineuse est de l'ordre ou inférieure ou égale à 1 gIW/cm2 pour les conditions de faible éclairement et supérieure

à 10 pW/cm2 pour le fort éclairement.

Les moyens 5 de mesure de Vph sont, en pratique, constitués, par exemple, par un adaptateur d'impédance présentant une impédance d'entrée comprise entre i0OM et

1012 , plus préférentiellement de l'ordre de 1010 f.

Les moyens de mesure 5 comprennent également un organe de détection synchrone piloté par le générateur basse fréquence 4.1. qui, on l'a vu ci-dessus, détermine par ailleurs, la modulation de l'éclairement. Cet organe de détection synchrone donne les

composantes en phase et en quadrature de Vph.

Le micro-ordinateur 6 comprend les moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp ainsi que les moyens de calcul et d'interprétation AVbp, en termes d'identification et/ou de dosage des substances biologiques en l'occurence des

polynucléotides PN.

Le schéma du circuit électrique de mesure est représenté sur la Fig. 4.

Dans la variante à faible éclairement, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq

sont les fonctions de transfert reliant Vph à l'intensité de l'éclairement.

Comme le montre la Fig. 4, l'effet de l'éclairement peut être représenté par un générateur de courant en parallèle avec la région de charge d'espace dont l'impédance, notée Zsc, inclut les paramètres liés à la surface. Zd, est l'impédance du diélectrique. Elle peut être représentée par une capacitance pure. Rel et Re2 sont les impédances de la solution electrolytique, respectivement, entre l'électrode de travail et l'électrode de référence, et entre l'électrode de référence et la contreélectrode. Zp est la résistance interne du potentiostat. RL est la résistance de charge introduite dans le circuit potentiostatique de mesure. Son rôle est de conférer au circuit de mesure les propriétés de circuit quasi ouvert vis-à-vis du photopotentiel, tout en permettant la polarisation de la structure; sa valeur doit donc être suffisamment élevée par rapport aux autres impédances intervenant dans la mesure. Vph est le photopotentiel mesuré et V1 est le photopotentiel qui apparaît aux bornes du semi-conducteur. D'après le schéma électrique, le courant total Ihv généré par l'éclairement a deux composantes: Il qui traverse le semiconducteur et 12 qui circule dans le circuit de mesure. On peut alors écrire les relations suivantes: Ihv = Il + 12= (Vl / Zsc) + (Vl/(RL+ Rel + Re2 + Zd + Zp)) si RL " Re, + Re2+ Zd + Zp alors: Vph = VI et Ihv = (Vph / Zsc) + (Vph/RL)

*d'o Zsc = Vph / Ihv.

Ainsi, les impédances optoélectrochimiques en phase et en quadrature de la région de la zone de charge d'espace du semi-conducteur sont directement proportionnelles aux composantes du photopotentiel mesuré: le coefficient de proportionnalité dépend de

l'intensité de l'éclairement.

La mesure des impédances optoélectrochimiques peut donc être utilisée pour la détection du processus d'appariement, en particulier d'hybridation de PN/PNc, lequel

processus étant le reflet quantitatif et qualitatif des SBC (PN) à analyser.

Les Exemples 1 et 2 ci-après illustrent la variante faible éclairement du

premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

S'agissant de la variante fort éclairement de ce premier mode, il consiste à accéder aux variations du potentiel de bande plate Vbp du Sc, consécutives au phénomène de reconnaissance biologique, par l'intermédiaire de la valeur efficace de Vph (ou selon une variante de Iph). Dans ce cas, l'éclairement modulé - de préférence à basse fréquence - utilisable n'est pas nécessairement sinusoïdal, mais peut être simplement périodique. Ainsi, dans le dispositif de la Figure 1, si la charge de surface varie avec la présence de l'espèce cible PN dans le milieu LC désigné par la référence 2, cela entraîne un AVbp, qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur efficace

de Vph, parallèlement à l'axe des potentiels de polarisation de la structure.

L'exemple 3 ci-après illustre cette variante fort éclairement du premier mode de

mise en oeuvre du procédé de l'invention, à l'aide du dispositif adapté.

Selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on polarise la structure Sc/Is-So, de telle sorte que le niveau de fermi du Sc soit au voisinage de la position intrinsèque en surface du Sc. Le potentiel Vp alors imposé est voisin du potentiel correspondant au point d'inflexion de la courbe d'allure sigmoïdale

de la valeur efficace de Vph, de Iph ou de Zoq.

La mesure de la variation de la valeur efficace de Vph de Iph ou de Zoq après

calibration, permet d'accéder au AVbp.

Selon la variante (ii), on ajuste la valeur efficace de Vph à une valeur proche de sa valeur Vph max = Vphi en jouant sur la polarisation continue initiale, qui sera une valeur de consigne Vpi. On maintient ensuite constante la valeur efficace de Vphi, Iphi ou de Zoqi, en ajustant Vp par rapport à la valeur de consigne Vpi de la structure, au moyen d'une régulation électronique. Cet ajustement de la polarisation est directement l'image de AVbp. Les valeurs efficaces de Vph, de Iph et de Zoq sont respectivement Vph. max Iph. max Zoq. max Elles représentent chacune 2 y 2 y 2 sensiblement l'ordonnée du point d'inflexion de la courbe correspondante.

L'exemple 4 illustre le deuxième mode de mise en oeuvre sans fort éclairement dans

la variante (ii).

Pour la mise en oeuvre de cette variante (ii), on a recours à une forme particulière d'exécution du dispositif selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'évaluation de la variation du signal Vph ou Iph, ou Zoq par rapport à une référence U imposée par une polarisation Vp se surajoutant à l'éclairement ainsi que des moyens de correction et de régulation de la variation par action sur les moyens de polarisation. La Figure 5 annexée présente le schéma synoptique d'un exemple de cette forme particulière d'exécution du dispositif selon l'invention. Dans cet exemple, on choisit

Vph comme signal traceur.

Comme le montre cette Figure 5, dans laquelle les éléments communs avec ceux de la Figure 1, sont repérés par les mêmes références, le photopotentiel vph est détecté aux bornes du capteur d'affinité 1 (cellule de mesure) au moyen d'un adaptateur d'impédance 14 présentant une forte impédance d'entrée de manière à ne pas perturber la structure. Le signal est ensuite amplifié au moyen d'un amplificateur alternatif basse fréquence 15, transformé en un signal continu v'ph grâce à une détection synchrone 5 et à un circuit RC 16 qui permet de diminuer le bruit et de

stabiliser la régulation.

Le signal continu v'ph est amplifié au moyen d'un amplificateur continu 17, de gain G17. G1 est le gain de l'ensemble amplificateurs 15 et 17 et détection synchrone 5. Le signal continu v'ph amplifié est ensuite comparé à un signal de référence U à l'aide d'un amplificateur différentiel 18. U est ajusté à la valeur de Vpi qui donne au photopotentiel une valeur moitié du photopotentiel correspondant à la forte inversion (Vph.max/2). La différence de valeur résiduelle A(v'ph- U) de ces deux signaux est

amplifiée par l'amplificateur différentiel 18 de gain G2 et la tension de sortie A (v'ph-

U) est appliquée à la structure 1 en même temps que la polarisation continue Vp imposée par un générateur de tension 19 couplé à un sommateur 20. Un générateur de signal basse fréquence 4.1. (BF) permet, après amplification à l'aide d'un amplificateur 2.1., de commander la diode 4 dont le faisceau excite la structure 1 et également de référencer la détection synchrone 5. Le microordinateur 6, qui est notamment relié à un organe 22 d'acquisition de la variable A(v'ph-U), permet de suivre et d'enregistrer la variation de polarisation de la structure AVp occasionnée

par la variation du potentiel de bandes plates (AVbp).

L'intérêt d'un tel montage est que le potentiel électroniquement imposé est directement et linéairement l'image des variations du potentiel de bandes plates Vbp, provoquées par les interactions à la surface du diélectrique. Il est donc indépendant des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne sensibilité et une

excellente reproductibilité.

La cellule (capteur) est semblable à celle décrite supra en référence à la Figure 1.

La mesure du photopotentiel étant réalisée au moyen d'un circuit de mesure possédant une forte impédance d'entrée, il est possible d'admettre un contact ohmique de médiocre qualité. Pour mesurer le photopotentiel du semiconducteur par rapport à la solution, une électrode possédant un potentiel constant par rapport à la solution est nécessaire. Cependant, du fait de la forte impédance du circuit de mesure, il est possible d'utiliser une pseudo-électrode de référence constituée par un métal noble tel que le platine, par exemple. L'électrode peut être indépendante ou être réalisée par dépôt, sous forme d'une grille ou d'un anneau externe, sur la surface du diélectrique de façon à satisfaire à la miniaturisation du capteur. L'éclairement de la structure peut être obtenu au moyen d'une diode laser ou d'une diode électroluminescente émettant dans le domaine de longueur d'onde du visible ou du très proche infra-rouge, entre 400 et 1000 nm avec une puissance lumineuse de l'ordre de 0,1 jiW à 100 m/cm2. Il est tout à fait technologiquement concevable d'envisager l'éclairement de la structure par la face arrière et même d'intégrer au capteur la partie génératrice de la lumière. Ces possibilités techniques permettraient de disposer d'un capteur de très faibles dimensions, dont seule la face avant serait au contact de la solution et qui serait ainsi, de part la nature des matériaux qui la

composent, très peu sensible à l'agression chimique.

Il est tout à fait possible d'utiliser comme signal traceur Iph' Dans ce cas, l'adaptateur

d'impédance 14 est remplacé par un convertisseur courant/tension.

Les formes d'exécution du dispositif selon l'invention représentées aux

Fig. 1 et 5 décrites supra sont dénommées arbitrairement GENOPTEL.

Conformément à une autre forme d'exécution du dispositif selon l'invention, correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé, ledit dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So et au moins une structure de référence Sc/Is non fonctionnalisée

par So, de manière à pouvoir réaliser une mesure différentielle.

Cette forme d'exécution que l'on appelera DIGENOPT est représentée à la Figure 6.

Elle correspond au cas o l'on a un capteur d'affinité 1 ou cellule de mesure comprenant avantageusement deux structures Sc/Is 31 et 32 quasi identiques, l'une étant fonctionnalisée par So, l'autre non. Ces deux structures (ou électrodes) sont mises en contact avec le même mnilieu 2 LC et sont polarisées au moyen d'une même contre-électrode 33. Une électrode de référence n'est pas nécessaire. Elles sont

éclairées de manière identique par une lumière modulée fournie par une diode 4.

L'acheminement de la lumière vers le milieu LC 2 se fait par l'intermédiaire d'un

conducteur optique 34, ménagé au travers du corps 35 du capteur 1.

Les deux structures Sc/Is 31 et 32 (électrodes) sont montées chacune à la pointe d'un

élément 36 vissable dans le corps 35 du capteur 1.

Le corps 35 comprend une cavité fermée latéralement par les électrodes 31 et 32,

contenant le milieu LC - 2 -.

Des joints 37 sont prévus pour assurer l'étanchéité entre les différentes parois. La paroi du dessus recoît les moyens d'éclairement 4 et 34. Le fond est traversé par la contre-électrode 33. Les périphériques électroniques adaptés permettent de suivre la

différence de leur Vbp respectif= Vbpl - VbpO.

On terminera l'illustration non limitative du dispositif de l'invention, en décrivant une dernière forme d'exécution, mais non la moindre, qui est celle selon laquelle le dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So, dans laquelle les sondes So sont de différentes natures, les sondes So de même nature étant regroupées dans une même zone de la couche d'Is, chaque zone étant circonscrite par rapport aux autres de manière à pouvoir être

éclairée séparément partiellement ou en totalité par les moyens d'éclairement.

Cette forme d'exécution arbitrairement désignée par l'expression GENMAP, a été rendue possible en raison du fait que le principe de la mesure selon l'invention est telle que le photopotentiel et/ou le photocourant dépend du flux de lumière mais est pratiquement indépendant de l'aire de la surface éclairée. Il est donc ainsi envisageable de réaliser sur la même structure Sc/Is des régions différemment fonctionnalisées qui répondent de manière spécifique à différentes espèces cibles (e.g. PN, à PN.), la lecture de l'appariement ou de l'hybridation étant effectué au moyen d'un faisceau lumineux par scrutation successive ou de manière simultanée par plusieurs faisceaux

lumineux.

Une telle structure Sc/Is est assimilable à un multicapteur biologique donnant accès à

la multidétection.

Les différentes zones de la surface de l'Is peuvent être délimitées ou non physiquement. La lecture multizone par les moyens d'éclairement permet d'accéder au potentiel de bande plate local de chaque zone fonctionnalisée spécifiquement: - soit par mesure de l'impédance optoélectrochimique selon le premier mode de mise en oeuvre - variante faible ou fort éclairement, soit par mesure de la valeur efficace de Vph-variante (i) du deuxième mode de mise en oeuvre, - soit par prise en compte des variations de Vp permettant la régulation et le maintien de Vph à une valeur proche de sa valeur moyenne (variante ii du deuxième

mode de mise en oeuvre).

En d'autres termes, l'acquisition de Vbp peut s'effectuer selon l'un quelconque des

modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure multicapteur Sc/Is-Soj à So,. On a repris les mêmes références que sur la Figure 1 pour désigner les moyens d'éclairement 4, les sondes So1 à So% repérées par la référence 7.3, la couche Is 7.2. et la plaquette de semi-conducteur Sc référencée par 7.1. On retrouve également le contact ohmique 8. Ce type de dispositif ouvre la voie des applications nombreuses et variées dans le domaine de la génétique: détection de maladies virales, et de maladies génétiques, vérification de la compatibilité cellulaire, réalisation de cartes de génômes, expression ou mutation de gènes etc. L'intérêt de ce dispositif comparativement aux autres dispositifs utilisés pour la multidétection, réside dans sa simplicité de réalisation et dans la simplicité du mode de

lecture associé à la reconnaissance directe du processus d'hybridation.

Selon un autre de ces aspects, l'invention concerne également les capteurs d'affinité, c'est-à-dire les structures Sc/Is-So de mesure et Sc/Is de référence, telles

que décrites supra.

Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et ses variantes, tant sur le plan du procédé que sur celui du dispositif

EXEMPLES

EXEMPLE 1: MESURE DES IMPEDANCES OPTOELECTROCHIMIQUES A L'AIDE DU

DISPOSITIF DE L'INVENTION COMPRENANT UNE STRUCTURE SC/IS ELEMENT DE

BASE DU BIOCAPTEUR

1.1. APPAREILLAGE

Le dispositif mis en oeuvre dans cet exemple correspond à celui

représenté à la Fig.1.

La structure Sc/ls comprend: - un semiconducteur ayant une épaisseur de 0,03mm est du Silicium dopé p à hauteur d'environ 1015 cm-3, avec en face arrière une couche Au/Cr assurant le

contact ohmique.

- et un isolant Is est de la silice d'une épaisseur de 10 nm obtenue par

oxydation thermique.

1.2. MILIEU LIQUIDELC: SOLUTION TAMPON TRIS IM.

Cette solution tampon de pH 7.1 est composée de 10 mM TrisHCI

(Sigma) et 50 mM NaCl.

1.3. LESCONDITIONS EXPERIMENTALESSONTLESSUIVANTES:

la fréquence des modulations de la lumière est de 316 Hertz.

La source lumineuse est un laser hélium-néon émettant un éclairement de

longueur d'onde X = 632,8 nm.

La puissance lumineuse est de 0,6.IW/cm2

1.4. RESULTATS

La figure 8 annexée montre les courbes d'impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq en fonction de Vp obtenues pour la structure

décrite précedemment.

Dans le domaine de polarisation négative, l'impédance en quadrature est due à la capacité de la zone de charge d'espace du semi-conducteur, celle-ci est directement liée au dopage du semiconducteur. Dans le domaine de polarisation positive, l'impédance en quadrature est très faible car le semi-conducteur est en

situation d'accumulation et la capacité de la zone de charge d'espace est très élevée.

Dans le domaine de polarisation intermédiaire, le semiconducteur passe successivement de la situation d'inversion, à la désertion, puis à l'accumulation, lorsque la polarisation augmente. L'impédance en phase présente un pic dans le domaine intermédiaire. Ce pic est dû à la présence d'états d'interface situés entre le semiconducteur et la couche d'oxyde. Ainsi, les impédances optoélectrochimiques donnent les informations énergétiques sur le semi-conducteur et sur les états de surface du semiconducteur mais ne donne pas d'informations sur la couche diélectrique. Cependant, elles permettent de déterminer le potentiel de bandes plates du semiconducteur. La valeur du potentiel de bandes plates est corrélée à la position de la courbe d'impédance en quadrature par rapport à l'axe des potentiels. C'est le

paramètre qui permet de caractériser la charge de surface de la structure.

EXEMPLE 2: APPLICATION DES MESURES D'IMPEDANCES SELON L'EXEMPLE A LA

DETECTION BIOLOGIQUE: PN = ADN (OLIGO dT) 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE-

VARIANTE FAIBLE ECLAIREMENT

2.1. LE DISPOSITIF

Le dispositif utilisé, y compris la structure Sc/Is et le milieu conducteur LC, sont les mêmes qu'à l'exemple 1, à la différence près que la structure Sc/Is est fonctionnalisée par des sondes So constituées par des nucléotides PNc

complémentaires à des espèces cibles PN contenues dans LC.

2.2. FONCTIONNALISATION DE LA SURFACE DE L 'ISOLANT IS PAR DES SONDES SO

CONSTITUES PAR DES OLIGONUCLEOTIDES dT DE 20 BASES Après hydroxylation de la surface de Si/So2, on dépose une couche polymérique d'APTS (AminoPropylTriéthoxySilane). Les brins d'oligonucléotides (dT) sont greffés sur la surface par bromation: cette méthode permet de fixer à I'APTS le nucléotide sans utiliser les sites intervenant dans l'hybridation. Enfin l'hybridation est obtenue après avoir laissé la structure au contact d'une solution

contenant des brins complémentaires poly (dA) à ceux fixés sur la surface.

2.3. RESULTATS

La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la reconnaissance de

brins simples d'ADN.

Les courbes de la Figure 9 montrent le déplacement lié à l'hybridation des

brins complémentaires PNc /PN d'ADN.

EXEMPLE 3: ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE DU DISPOSITIF SELON

L'INVENTION (FIG 1) - 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE

FORT ECLAIREMENT

La Fig. 10 représente la courbe Vph = f(Vp) GENOPTRODE

EXEMPLE 4: ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE D'UNE VARIANTE DU

DISPOSITIF SELON L'INVENTION (FIGURE 5), SELON LE DEUXIEME MODE DE MISE

EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE (ii)

4.1. LE DISPOSITIF

Le dispositif utilisé est celui décrit en Figure 5. La cellule de mesure et le capteur d'affinité sont ceux représentés sur la Figure 2. La lumière modulée est fournie au moyen d'une diode électroluminescente; la puissance lumineuse utilisée est

de 10 mW/cm2.

4.2. CONDITIONS EXPERAENATALES ET FONCTIONNALISATION

Le liquide conducteur LC est une solution aqueuse de 10 mM tris(hydromethyl)aminomethane hydrochloride (Sigma) et 50 mM NaCI; l'ensemble de la solution est à pH 7.1. La mesure est faite à température ambiante, soit 22 C,

dans l'obscurité.

La structure Sc/Is-So est telle que décrite dans les exemples précédents.

Dans cet exemple, les sondes sont des PNc, et plus précisémment des oligos dT de 20 bases, déposées sur la zone comme représenté en7.3 de la figure 2 à partir d'une solution composée de 20 pl de solution aqueuse de n-bromosuccinimide en concentration de 0,01 M ajoutée à I ml de solution aqueuse IM NaHCO3 contenant des oligos (dT)20 en concentration de lmg/ml. La structure est laissée une nuit en contact avec la solution des Pnc, puis abondamment rincée avec le liquide LC, puis montée sur la cellule de mesure. Cette cellule est alors remplie de LC et la chaine de

mesure initialisée.

4.3 RESULTATS

La Figure 11 donne la réponse en AVp au cours du temps de la structure

fonctionnalisée Sc/Is-So o les sondes sont des oligo dT.

La courbe A correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles (polynucléotides dC en

concentration de 1 pIg/ml) non complémentaire aux sondes fixées sur le capteur.

La courbe B correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles (polynucléotides dA en

concentration de 1 lig/ml) complémentaires aux sondes fixées sur le capteur.

Claims (16)

REVENDICATIONS:

1 - Procédé d'identification et/ou de dosage de substances biologiques SBC présentes dans un milieu Liquide Conducteur LC, à l'aide d'au moins un capteur

d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-

conducteur Sc, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface au moins une sonde So, en contact avec le milieu conducteur LC et comprenant une ou plusieurs substances biologiques

de reconnaissance spécifique par interaction affine SBR, des SBC du milieu LC sus-

visé, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à: - a sélectionner à titre de sonde(s) So, des SBR non-marquées, - b - faire en sorte que le niveau de Fermi du Sc corresponde sensiblement au, ou passe par le niveau intrinsèque en surface du Sc, - c - soumettre le Sc à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à 1 'énergie de la bande interdite du Sc, - d - mesurer directement ou indirectement les variations AVbp du potentiel de bandes plates Vbp du Sc, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des SBC du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires SBR de la ou des sondes So, à l'exclusion: (i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués.par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs,

colorés, e.g.).

- e - et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification

et/ou de dosage des SBC du LC.

2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les SBC sont

des polynucléotides PN et en ce que les SBR sont des polynucléotides PNc.

3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé e en ce que, dans l'étape b, on polarise le Sc par rapport au LC en imposant une tension de polarisation Vp selon un balayage entre une tension négative et une tension positive limites, choisies de telle sorte que le niveau de Fermi du Sc passe par son niveau intrinsèque en surface, Vp évoluant ainsi avantageusement dans une gamme de tension correspondant au régime de désertion et de faible inversion du Sc, * et en ce que, selon l'étape d, on mesure AVbp: > en recueillant le photopotentiel Vph aux bornes du Sc, (entre Sc et LC) et/ou le photocourant Iph, > en calculant éventuellement les impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq, pour chaque valeur de Vp, > en établissant la (ou les) courbe(s) Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph en fonction de Vp, > et en suivant le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit

déplacement correspondant aux variations de Vbp recherchées.

4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé

en ce que l'on met en oeuvre un faible éclairement, sensiblement sinusoïdal.

- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé

en ce que l'on met en oeuvre un fort éclairement.

6 - Procédé selon les revendications 3 et 5, caractérisé en ce que, selon

l'étape d, on appréhende les variations de Vbp: * en recueillant Vph et/ou Iph, * en établissant la courbe Vph = f (Vp) et/ou Iph = f (Vp); * et en suivant le déplacement de cette (ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspond aux AVbp

recherchées.

7 - Procédé selon la revendication 1 et la revendication 3, caractérisé * en ce que, dans l'étape b, on fixe le niveau de Fermi du (Sc) sensiblement au niveau intrinsèque en surface du (Sc), en imposant une tension de polarisation Vpi correspondant environ, à l'abscisse du point d'inflexion de la courbe Vph = f (Vp), ou Zoq = f (Vp) Iph = f (Vp); Vph, Zoq et Iph étant tels que défini dans la revendication 3, de telle sorte que l'ordonnée de ce point d'inflexion corresponde à environ Vph max/2, Zoq max/1 ou Iph max/2, * et en ce que, selon l'étape d, on appréhende les variations de Vbp: (i) par la mesure de l'évolution de Vph et/ou Iph et/ou Zoq, (ii) et/ou par la prise en compte des variations de la tension de polarisation AVp, rendues nécessaires pour maintenir constant Vph max/2, Zoq max/2, ou Iph max/2, cet ajustement AVp étant le reflet

de AVbp.

8 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour la prise en compte (ii) de AVp; - on détecte vph, - on amplifie éventuellement le signal Vph, - on redresse éventuellement ce signal de manière à disposer d'un signal continu V'ph, - on compare ce signal v'ph continu à un signal de référence U correspondant sensiblement à la valeur de v'ph max/2 (ordonnée de point d'inflexion de la courbe v'ph = F(Vp), soit V'ph max/2), - on recueille la différence A(V'ph-U) entre V 'ph et U, - on amplifie éventuellement A(v'ph-U), - on applique A(v'ph-U) éventuellement amplifiée entre Sc et LC en complément de Vp,

- on enregistre A(v'ph-U).

9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé

en ce que, pour l'étape c, on choisit la longueur d'onde de l'éclairement X de telle sorte qu'elle soit supérieure ou égale à.0 = 1240 nm, de E(énergie bande interdite)

préférence comprise entre 100 et 3000 nm.

- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé

en ce que l'on met en oeuvre une mesure différentielle, en faisant intervenir dans le capteur d'affinité au moins une autre structure Sc/Is de référence, dans laquelle Is n'est pas fonctionnalisé par So, et en suivant la différence entre les Vbp mesurées par

les 2 capteurs, ainsi que la variation de cette différence.

11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé

en ce que, (dans une étape préalable a.), on fonctionnalise la surface d'une couche d'isolant Is d'une même structure Sc/Is, par plusieurs sondes So différentes de par la nature des PNc qui les composent, et on réalise ensuite à l'aide de cette structure l'analyse de LC contenant différents substrats PN: - par éclairements successifs des zones de la surface de l'Is, lesdites zones étant chacune fonctionnalisée par une même So (PNc identiques), la nature des So variant d'une zone à l'autre,

- et par recueil et interprétation des AVbp.

12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé

en ce que les substrats à analyser PN sont choisis dans la liste suivante: nucléotides,

oligonucléotides, polynucléotides, acides nucléiques (ADN/ARN) et leurs mélanges.

13 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque

des revendications I à 12, caractérisé en ce qu'il comprend:

- au moins un capteur d'affinité formé par au moins une structure Sc/IsSo dans laquelle la ou les sondes So comprennent des ligands SBR aptes à s'hybrider spécifiquement avec les substances biologiques SBC à analyser, contenues dans le milieu liquide conducteur LC, en provoquant un phénomène d'effet de charge, à l'origine des AVbp du Sc, - des moyens de polarisation du Sc par rapport au LC, - des moyens d'éclairement du Sc du capteur, - des moyens de mesure du photopotentiel Vph ou du photocourant Iph, - des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp, - et des moyens de calcul et d'interprétation des AVbp en termes

d'identification et/ou de dosage des substances biologiques SBC.

14 - Dispositif selon la revendication 13 caractérisé en ce que la structure Sc/Is-So de son capteur d'affinité est formée par au moins une plaquette de Sc de préférence en silicium, recouverte sur l'une de ses faces d'une couche Is d'isolant de préférence en silice, à la surface de laquelle sont fixées des sondes So sensibles comprenant des polynucléotides PNc de reconnaissance spécifique par hybridation, ce capteur comportant également au moins un contact ohmique permettant la connexion de la structure Sc/Is-So, notamment, avec les moyens de polarisation et/ou les moyens de mesure de Vph ou Iph, et en ce qu'il comporte également au moins une électrode auxiliaire,

éventuellement prévue sur la couche Is de la structure Sc/Is-So.

15 - Dispositif selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'évaluation de la variation du signal Vph par rapport à une référence U, ainsi que des moyens de correction de cette variation par action sur les

moyens de polarisation.

16 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15,

caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So et au moins une structure de référence non fonctionnalisée par So, de manière à

pouvoir réaliser une mesure différentielle.

17 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15,

caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So dans laquelle les sondes (So) sont de différentes natures, les sondes So de même nature étant regroupées dans une même zone sur la couche d'Is, chaque zone pouvant

être éclairée séparément et/ou successivement par les moyens d'éclairement.

18 - Capteur d'affinité tel que défini dans l'une quelconque

des revendications 13, 14, 16 et 17.