JP2007271266A - 光電流による高感度一塩基多型の検出方法 - Google Patents

光電流による高感度一塩基多型の検出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、光増感剤と二本鎖DNAを用いた新規SNP解析方法を提供する。具体的には、SNP部位を有するプローブDNAとターゲットDNAとのハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成させたまま、効率的かつ高い精度でターゲットDNA中のSNPの検出が可能な、新規SNP解析方法（即ち、SNPタイピング方法）を提供する。
【解決手段】一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成し、該二本鎖DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法に関する。
【選択図】図５

Description

本発明は、光電流を用いた高感度に一塩基多型(以下、「SNP」とも呼ぶ)を解析する方法に関する。
一塩基多型(SNP)とは、個々の人間における遺伝子配列の１か所の塩基の違いを意味し、疾病関連遺伝子や個人の薬剤感受性と関わっていることが知られている。したがって、迅速、簡便かつ安価なSNPタイピング手法の開発は、次世代テーラーメイド医療、高度医療の観点から必要不可欠である。一般的に、SNPは、ハイブリダイゼーションに基づく蛍光等のシグナル変化を検出することで識別される（例えば、非特許文献１又は２）。
しかしながら、二本鎖DNAにおけるミスマッチ配列またはフルマッチ配列の安定性の差、つまり複数のターゲットDNAとそれに相補的なプローブDNAとのハイブリダイゼーション形成におけるミスマッチまたはフルマッチの差異は、比較的小さく、その測定精度も必ずしも満足できるものではなかった。そのため、ターゲットDNAとプローブDNAの二本鎖を形成させたまま、SNPのミスマッチの検出が可能となればより簡便かつ検出の精度は飛躍的に増大するものと考えられる。
なお、非特許文献３及び４には、二本鎖DNAを電極表面に固定し、これに電気化学的にバイアスをかけて、バルク溶液から電極へと電子が移動する速度が、ミスマッチの有無に依存することを利用し、SNPのミスマッチを検出する方法が報告されている。しかし、光電流を用いたSNPミスマッチの検出方法については、記載も示唆もされていない。
また、二本鎖DNA中、核酸塩基のうちアデニンの連続配列において、連続的なアデニンホッピング（Adenine-hopping）現象により電荷移動が非常に効率よく起こり、その結果、長寿命電荷分離状態が効率よく生じることが報告されている（非特許文献５）。
Nature Biotechol, 1999, 17, 292 Genome Res, 2000, 10, 549 Nat Biotechnol, 2003, 21, 1192-9. Curr Opin Chem Biol, 2001, 5, 209-15. J Am Chem Soc, 2004, 126, 1125-1129
本発明の目的は、光増感剤と二本鎖DNAを用いた新規SNP解析方法を提供することにある。具体的には、SNP部位を有するプローブDNAとターゲットDNAとのハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成させたまま、効率的かつ高い精度でターゲットDNA中のSNPの検出が可能な、新規SNP解析方法（即ち、SNPタイピング方法）を提供することにある。
本発明者は、前記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、次の知見を得た。
二本鎖DNA鎖内に生じたホール（ラジカルカチオン）が、グアニン間のホッピング（以下、「グアニンホッピング」とも呼ぶ）を経て電極へ移動する際、二本鎖DNA内における一塩基のフルマッチ、ミスマッチにより、ホール移動速度（電荷移動速度）に大きな差異が生じることが分かった。すなわち、電荷移動速度は、該DNA内における一塩基のフルマッチ、ミスマッチに大きく依存することを見出した。そして、このDNA内の電荷移動速度を、光電流のシグナル強度変化として検出することで、効率の良いSNPタイピングが可能となると考えた。
光電流のシグナル強度変化を、高感度で検出するためには、強い光電流を得ることが望まれ、そのためには、二本鎖DNA上で効率よく長寿命の電荷分離状態を生成させることが必要である。これについては、光増感剤に結合したアデニン連続配列を有する二本鎖DNA内において、光増感剤の光励起で発生するホール（ラジカルカチオン）のアデニン間の連続ホッピング（以下、「アデニンホッピング」とも呼ぶ）現象により生じる、長寿命電荷分離状態を利用できると考えた（例えば、図１を参照）。
かかる知見に基づき、本発明者らは、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記のSNP解析方法（SNPタイピング方法）等を提供する。
項１．一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成し、該二本鎖DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法。
項２．一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
（１）末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
（２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
（３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
を含む項１に記載の方法。
項３．一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
（１ａ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、末端が電極に固定されかつ該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
（２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
（３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
を含む項１に記載の方法。
項４．一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
（１ｂ）光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
（２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
（３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
を含む項１に記載の方法。
項５．一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
（１ｃ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程。
（２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
（３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
を含む項１に記載の方法。
項６．プローブDNAが、１個の一塩基多型部位を有する項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．アデニン連続配列が、アデニンが３個以上連続配列している請求項６に記載の方法。
項８．光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群から選ばれる１種である項６に記載の方法。
以下、本発明について詳述する。
SNP解析方法（SNPタイピング方法）
本発明のSNP解析方法（SNPタイピング方法）は、一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成し、光増感剤の光励起により二本鎖DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法である。すなわち、二本鎖DNAにおける一塩基のフルマッチ又はミスマッチにより、該二本鎖DNAで発生する光電流の検出強度に差異が生ずることを利用する。
本発明のSNP解析方法は、一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
（１）末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
（２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
（３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
を含む方法である。その模式図を図２に示す。
第１工程
第１工程は、一方の末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAと、ターゲットDNAとの間でハイブリダイゼーションを行う工程である。
一塩基多型部位を有するプローブDNAは、ターゲットDNAに対し鋳型となる塩基配列を有するDNAであり、４つの核酸塩基、リボース、リン酸から、公知のDNA固相合成機を用いて、任意の配列を有するプローブDNAを合成することができる。
ここで、該プローブDNAの一塩基多型（SNP）部位とは、本発明による検出法により被検出対象となりうる塩基部分、つまり標的となる部分である。本発明は、１個のSNPをターゲットとした検出法であり、プローブDNA内には一塩基多型部位が１個存在している。
一塩基多型部位は、プローブDNA中の特定位置に存在し、プローブDNAのどの部位に存在していてもよい。中でも、プローブDNAの中心部に位置すれば、DNA二本鎖形成に対して、中心部のミスマッチの影響が電流値により強く反映されるので、検出感度が向上すると期待される。
該プローブDNAは、光増感剤が結合したアデニン連続配列を有している。これは、光増感剤により発生したホールのアデニン間の連続ホッピング（アデニンホッピング）に基づくホールシフト反応により、ハイブリダイズした２本鎖DNA上において電荷分離状態を効率よく発生させるためである。
本発明で用いられる光増感剤としては、その光励起状態がアデニンを酸化できるものであれば特に限定はない。具体的には、還元されやすい芳香族化合物であり、紫外から紫外可視領域に吸収をもつ一重項エネルギーが比較的大きいものが好ましい。例えば、ナフタルイミド、ナフタルジイミド（NI）、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン、キサントン等が挙げられる。特に、電子移動理論から、再結合が遅く電荷分離効率が向上するので、電流検出感度が上昇すると予想されるナフタルイミド、ジフェニルアセチレンが光増感剤として好ましい。
また、アデニン連続配列の数は、３個以上、好ましくは３〜８個程度、より好ましくは、４〜６個程度である。かかる範囲であれば、電荷分離寿命はマイクロ秒以上となり、所望の光電流が得られるため好ましい。
アデニン連続配列と光増感剤との結合は、光増感剤からアデニンへのホールの移動が速やかに行われるものであれば特に限定はない。例えば、図４にあるように、光増感剤（例、ナフタルイミド）がリンカー（炭素数が２〜６程度の炭化水素鎖）を介して５’−リン酸エステルの形でアデニンに導入されたものが例示される。なお、必要に応じ、アデニン連続配列の３’末端にリンカーが導入されたものであってもよいが、５’−リン酸エステルの形でアデニンに導入されたものは調製が容易であり好ましい。
光増感剤を、リンカーを介してアデニン連続配列に結合させる反応は、例えば、J. Org. Chem. 2000, 65, 5355-5359 又は J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 12838-12841の記載に準じて実施できる。具体的には、水酸基の結合したアルキルリンカーを有する光増感剤（例、ナフタルイミド、ジフェニルアセチレン等）をアミダイト化反応して活性化し、合成機上で一本鎖DNAの5'末端の水酸基とカップリングさせることで、プローブDNAに光増感剤を修飾することができる。
また、該プローブDNAの末端を電極に固定する方法は、例えば、該プローブDNAを電極固着部（メルカプト基（−SH基））等を有するリンカーで修飾し、これを電極に固定する等公知の方法を採用すればよい。リンカーとしては、炭素数が３〜６の炭化水素鎖があげられ、例えば、Glen research（株）より市販されているＣ３およびＣ６リンカーが挙げられる。このリンカーを介して、メルカプト基とプローブDNAの末端部とが結合している。リンカーは、プローブDNAのアデニン連続配列の３’末端又は５’末端のいずれに導入されていてもよいが、３’末端に導入されたものが好ましい。
本発明に利用されるプローブDNAを固着させるための電極は、プローブDNAにおける電極固着部が結合し得るものを用いる。具体的には、少なくとも表面が金から構成される電極などを挙げることができる。
少なくとも表面が金から構成される電極の具体例としては、電極全体が金からなる金電極や、金以外の材質からなる基材の表面周囲を金でめっきしたものや、金の蒸着法等により製造された基材が挙げられる。
プローブDNAの固着化処理は、公知の方法を採用できる。例えば、金電極を用いた場合、0.1 M MgCl2を含む50 mMリン酸緩衝液(pH 7,0)中で、金電極（表面）とチオール化DNAを１〜１０時間インキュベートすればよい。この操作で、プローブ一本鎖DNAが基板上に固定化される。
本発明に利用されるプローブDNAを、１の電極に対して１種のプローブDNAが対応するように配設させ、このようにして得られた電極を複数個用いることにより、多くのターゲットDNAのSNPを同時に検出することが可能となる。
得られた電極に固着させたプローブDNAを用いて、該プローブDNAとターゲットDNAとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション反応は、DNAの長さや反応条件に依存するが、通常４０〜６０℃程度において該反応に適したバッファー中で行うことが好ましい。バッファーとしては、例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムを混合した緩衝溶液）、リン酸バッファー、Tris塩酸塩バッファーなどを挙げることができる。
このようにしてターゲットDNAと、該ターゲットDNAの塩基配列と相補配列を有するプローブDNA部位との間で二本鎖DNA複合体が形成される。
さらに、本発明のSNP解析方法では、工程（１）に代えて、次のような工程（１ａ）〜工程（１ｃ）を採用してもよい。
（１ａ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、一方の末端が電極に固定されかつ該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程。その模式図を図３に示す。
（１ｂ）光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程。
（１ｃ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程。
これらの各工程では、上記の工程（１）で示した条件或いはそれを適宜修飾した条件を用いることができる。
第２工程
第２工程は、第１工程で形成された二本鎖DNA複合体に光照射して、光増感剤を光励起させて該複合体上に電荷分離状態を生成させて、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程である。
光照射に用いる光源としては、前記した光増感剤を光励起させることができ、二本鎖DNAに悪影響を与えないものであれば特に限定はなく、例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ブラックライト、エキシマレーザ、重水素ランプ、Hg-Zn-Pbランプ等から選ばれる１種類の光源または波長域の異なる２種類の光源を用いることができる。特に、光源が比較的安価であり光強度も強く、広い範囲の波長を取り出すことができる点から、キセノンランプと高圧水銀ランプが好適である。
光電流強度の検出は、電気化学的測定による。高感度の測定が可能なBioanalytical Systems, Inc. CV-50W（装置名）等を用いて測定される。測定条件は、例えば、実施例２にあるように、電子メディエーターであるメチルビオローゲンを含むリン酸緩衝溶液中に、366 nmの光を照射し、-100 mVのバイアスをかけて測定を行う。ここで、光増感剤からアデニンホッピングを経て生成する電荷分離状態、及びグアニンホッピングは、媒体である水分子の影響を受けない。また、ミスマッチを含む配列では、フルマッチの場合に比べて２本鎖DNA内の電子の流れが妨げられるため、電流強度が減少する傾向が観測される。
第３工程
第３工程は、測定される該電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程である。光を照射して得られる光電流強度から、フルマッチ（正常型）、ミスマッチ（異常型）の検出を行う。
本明細書において「フルマッチ」とは、二本鎖を形成したDNAの塩基対が完全に相補的である状態をいい、ターゲットDNAは正常型であることを意味する。一方、本明細書において「ミスマッチ」とは、二本鎖を形成したDNAの塩基対に、相補的な関係にない塩基対が一つ存在する状態をいい、ターゲットDNAは異常型であることを意味する。
今回、本発明者らは、DNA内の電荷移動速度は一塩基のフルマッチ、ミスマッチに大きく依存することを見出しており、光電流の強度を測定することによりフルマッチ、ミスマッチの相違に加え、ミスマッチの場合のターゲットDNAにおける塩基の種類を特定することが可能である。
例えば、図５にあるように、SNP部位がグアニン（Ｇ）であるプローブDNAに、ターゲットDNAがハイブリダイゼーションしたサンプルにおいて、ターゲットDNAのSNP部位に相補的な位置にくる塩基の種類によって光電流の強度が相違する。
具体的には、プローブDNAのSNP部位がグアニン（Ｇ）の場合は、相補位置にくる塩基がＣ＞＞Ｔ，Ａ＞Ｇの順で光電流の強度は減少する。また、プローブDNAのSNP部位がシトシン（Ｃ）の場合は、Ｇ＞＞Ｔ，Ｃ＞Ａの順で光電流の強度が減少し、プローブDNAのSNP部位がアデニン（Ａ）の場合は、Ｔ＞＞Ｃ＞Ａ，Ｇの順で光電流の強度が減少し、プローブDNAのSNP部位がチミン（Ｔ）の場合は、Ａ＞＞Ｃ＞Ａ，Ｇの順で光電流の強度が減少する。
これらの光電流強度の相違は大きいため、これらの強度を比較することにより、効率的かつ高い精度で各サンプルにおけるSNPの検出（SNPタイピング）が可能となる。なお、光電流の強度は、用いる光増感剤の種類や２本鎖DNAの長さ等によっても変化するが、上記の傾向は保持される。
本発明のように、有機化学的に設計されたDNAを使って光電流を観測した例は、これまで全く報告されていない。本発明の方法によれば、２本鎖DNA内の電荷移動速度が、一塩基のフルマッチ、ミスマッチに顕著に依存することを利用し、DNA内の電荷移動速度を光電流のシグナル強度変化として検出することで、迅速、簡便かつ安価なSNP検出（SNPタイピング）が可能となった。この方法論によれば、DNAチップへも適用することが可能であり、疾患関連遺伝子の探索などに用いられる。
さらに、SNPを簡便かつ迅速に検出する本方法は、疾病や病気へのかかりやすさなどに関わる個人の遺伝子に対する診断に適用可能であり、個体差に合わせて薬剤量の調整や種類の選択を行うことができテーラーメイド医療、遺伝子診断法の開発へとつながる。
本発明のSNP解析方法は、SNP部位におけるターゲットDNAのフルマッチ、ミスマッチに依存した光電流強度変化を高感度に検出できるため、ターゲットDNAとプローブDNAをハイブリダイゼーションさせるだけでよく、条件の最適化は必要とならない。さらに、電極反応を利用するため、DNAチップへの適用が容易であり、迅速、簡便かつ安価にSNP検出が可能となる。
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
一塩基のフルマッチ、ミスマッチに対し、DNA内の電荷移動速度がどのような依存性を示すかを検討した。
具体的には、光増感剤としてナフタルジイミド(NI)、正電荷のプローブ分子としてフェノチアジン(PTZ)をDNAの両末端に結合させたDNAとして、３種類の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（二本鎖DNA配列１〜３、図６を参照）を合成し、その水溶液中のナノ秒レーザーフラッシュホトリシスについて検討した。
ナノ秒パルスレーザー（波長355 nm）照射によってNI部位を光励起すると、NIの励起状態が生成し、近傍の核酸塩基との間での電荷分離反応が起こり、さらにＤＮＡ鎖内での正電荷の移動反応が生じた。これらの電荷移動速度を、時間分解過渡吸収測定法によって決定した。
その結果、アデニン間の連続ホッピングに基づくホールシフト反応により、NIと近傍のGとの間の電荷分離が効率よく起こることが分かった（例えば、図１を参照）。
ホール移動速度はフルマッチ（二本鎖DNA配列１）の場合は31×105 s-1、A-Cミスマッチ（二本鎖DNA配列３）、G-Tミスマッチ（二本鎖DNA配列２）はそれぞれ3.6×105 s-1、0.82×105 s-1と求められ、ミスマッチの有無でホール移動速度は10倍以上変化することが見出された。即ち、DNA内のホール移動速度は、大きく塩基配列に依存することが明らかになった。
実施例２
実施例１で得られた３種の二本鎖DNAのPTZ末端をチオール基に変換し、金電極と反応させて、金電極上にチオール基を介して該二本鎖DNAを結合させた。これに光照射を行い、上記の光電荷分離が生じた。これにより生じるDNA中の電流を、下記の電気化学的測定により検出した。
具体的には、電気化学測定には、Bioanalytical Systems, Inc. CV-50Wを使い、Au作用電極、プラチナワイヤー対電極、Ag/AgCl参照電極を用いた標準的な３電極方式を採用した（例えば、図７を参照）。光電気化学測定は、アルゴン雰囲気下、150 Wキセノンランプからの光を干渉フィルター（MIF-S, Vacuum Optics Corporation of Japan）を通し単色光とした後に、セルへ照射し、電流を検出した。電子メディエーターとしてmethyl viologenを存在させた水溶液を電解質溶液として用いた。光短絡電流は、DNAを修飾したAu作用電極とPt対電極の２電極系において、Keithley 2001 degital multimeterを用いて観測し、光強度はAnritsu ML9002AもしくはHamamatsu Si photodiodeを使って求めた。
光電流強度の測定結果を、表１に示す。
Figure 2007271266
 上記の結果より、電荷移動速度が光電流のシグナル強度変化に対応するので、光電流を高感度に検出することにより、SNP部位の塩基を検出することができる。
この方法は、新しいSNPタイピング法として用いられ、さらに遺伝子多型やミスマッチ等の遺伝子診断への高感度検出法として有用である。
アデニンホッピングを経由した二本鎖DNA内の電荷分離過程を示す模式図である。 本発明のSNP解析方法におけるハイブリダイゼーションの模式図である。 本発明のSNP解析方法におけるハイブリダイゼーションの模式図である。 アデニンと光増感剤との結合の一例を示す図である。 SNP部位がグアニン（Ｇ）であるプローブDNAに、ターゲットDNAがハイブリダイゼーションした二本鎖DNAにおいて、ターゲットDNAのSNP部位の塩基の種類によって光電流の強度が変化することを示す模式図である。 実施例１で用いられる二本鎖DNA配列１〜３を示す図である。 実施例２で用いられる電気化学的測定の模式図である。

Claims (8)

  1. 一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成し、該二本鎖DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法。
  2. 一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
    （１）末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
    （２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
    （３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
    を含む請求項１に記載の方法。
  3. 一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
    （１ａ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、末端が電極に固定されかつ該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
    （２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
    （３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
    を含む請求項１に記載の方法。
  4. 一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
    （１ｂ）光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程、
    （２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
    （３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
    を含む請求項１に記載の方法。
  5. 一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、
    （１ｃ）光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、該アデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNAとし、該二本鎖DNAの末端に電極を設けて二本鎖DNA複合体を形成する工程。
    （２）得られた二本鎖DNA複合体の光増感剤に光照射して該二本鎖DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該二本鎖DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び
    （３）測定される該光電流の強度に基づいてターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程
    を含む請求項１に記載の方法。
  6. プローブDNAが、１個の一塩基多型部位を有する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. アデニン連続配列が、アデニンが３個以上連続配列している請求項６に記載の方法。
  8. 光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群から選ばれる１種である請求項６に記載の方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012233878A (ja) * 2011-04-22 2012-11-29 Sysmex Corp 被検物質の電気化学的検出方法
CN105259349B (zh) * 2015-11-03 2017-11-14 青岛农业大学 一种免固定生物传感电极的制备及其在免标记均相光致电化学农残检测与癌症诊断中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2764702B1 (fr) * 1997-06-11 1999-09-03 Lyon Ecole Centrale Procede d'identification et/ou de dosage de substances biologiques, presentes dans un liquide conducteur, dispositif et capteur d'affinite utiles pour la mise en oeuvre de ce procede
DE10137342A1 (de) * 2001-07-31 2003-03-06 Infineon Technologies Ag Biosensor und Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020046269A (ja) * 2018-09-18 2020-03-26 株式会社東芝 有機物プローブおよび分子検出装置
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