WO2005116624A1

WO2005116624A1 - 光電流による高感度一塩基多型の検出方法

Info

Publication number: WO2005116624A1
Application number: PCT/JP2005/009139
Authority: WO
Inventors: Tetsuro Majima; Tadao Takada; Kiyohiko Kawai; Mamoru Fujitsuka
Original assignee: Osaka University; Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd.
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2005-12-08
Also published as: JP2007271266A

Abstract

　本発明は、光増感剤と二本鎖DNAを用いた新規SNP解析方法を提供する。具体的には、SNP部位を有するプローブDNAとターゲットDNAとのハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成させたまま、効率的かつ高い精度でターゲットDNA中のSNP塩基の検出が可能な、新規SNP解析方法（即ち、SNPタイピング方法）を提供する。一塩基多型部位を有するプローブDNAに、ターゲットDNAをハイブリダイズさせて二本鎖DNA複合体を形成し、該二本鎖DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲットDNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法に関する。

Description

明細書

光電流による高感度一塩基多型の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、光電流を用いた高感度に一塩基多型 (以下、「SNP」とも呼ぶ)を解析する方法に関する。

背景技術

[0002] 一塩基多型 (SNP)とは、個々の人間における遺伝子配列の 1か所の塩基の違いを意味し、疾病関連遺伝子や個人の薬剤感受性と関わっていることが知られている。したがって、迅速、簡便かつ安価な SNPタイピング手法の開発は、次世代テーラーメイド医療、高度医療の観点から必要不可欠である。一般的に、 SNPは、ターゲット DNA とプローブ DNAとのハイブリダィゼーシヨンに基づく蛍光等のシグナル変化を検出することで識別されて、る（例えば、非特許文献 1又は 2)。

[0003] しかしながら、二本鎖 DNAにおけるミスマッチ配列とフルマツチ配列との安定性の差、つまり、複数のターゲット DNAとそれに相補的なプローブ DNAのハイブリダィゼーシヨン形成におけるミスマッチとフルマツチのシグナル変化の差異は比較的小さぐその測定精度も必ずしも満足できるものではな力つた。そのため、ターゲット DNAとプロ一ブ DNAをハイブリダィズさせた二本鎖を形成させたまま、簡便かつ高精度に SNPのミスマッチを検出する方法が望まれて、る。

[0004] なお、非特許文献 3及び 4には、二本鎖 DNAを電極表面に固定し、これに電気化学的にバイアスをかけて、バルタ溶液力電極へと電子が移動する速度がミスマッチの有無に依存することを利用し、 SNPのミスマッチを検出する方法が報告されている。しかし、光電流を用いた SNPミスマッチの検出方法にっ、て記載はな!/、。

[0005] また、二本鎖 DNA中、核酸塩基のうちアデニンの連続配列において、連続的なァデニンホッピング (Adenine-hopping)現象により電荷移動が非常に効率よく起こり、その結果、長寿命電荷分離状態が効率よく生じることが報告されている (非特許文献 5

) o

非特許文献 l :Nature Biotech. 1999, 17, 292 非特許文献 2 : Genome Res. 2000, 10, 549

非特許文献 3 :Nature Biotech. 2003, 21, 1192-9.

非特許文献 4: Curr. Opin. Chem. Biol.2001, 5, 209-15.

非特許文献 5 : J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1125-1129

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明の目的は、光増感剤と二本鎖 DNAを用いた新規 SNP解析方法を提供することにある。具体的には、 SNP部位を有するプローブ DNAとターゲット DNAとのハイブリダイゼーシヨンによる二本鎖を形成させたまま、効率的かつ高、精度でターゲット DNA中の SNP塩基の検出が可能な、新規 SNP解析方法 (即ち、 SNPタイピング方法）を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者は、前記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、次の知見を得た。二本鎖 DNA鎖内に生じたホール (ラジカルカチオン）が、グァニン間のホッピング（以下、「グァニンホッピング」とも呼ぶ）を経て電極へ移動する際、二本鎖 DNA内における一塩基のフルマツチ、ミスマッチにより、ホール移動速度 (電荷移動速度）に大きな差異が生じることが分力つた。すなわち、電荷移動速度は、該 DNA内における一塩基のフルマツチ、ミスマッチに大きく依存することを見出した。そして、この DNA内の電荷移動速度を、光電流のシグナル強度変化として検出することで、効率の良い SNPタィビングが可能となると考えた。

[0008] 光電流のシグナル強度変化を、高感度で検出するためには、強、光電流を得ることが望まれ、そのためには、二本鎖 DNA上で効率よく長寿命の電荷分離状態を生成させることが必要である。これについては、光増感剤に結合したアデニン連続配列を有する二本鎖 DNA内において、光増感剤の光励起で発生するホール (ラジカルカチオン）のアデニン間の連続ホッピング（以下、「アデニンホッピング」とも呼ぶ）現象により生じる、長寿命電荷分離状態を利用できると考えた (例えば、図 1を参照)。

[0009] かかる知見に基づき、本発明者らは、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は、下記の SNP解析方法 (SNPタイピング方法)等を提供する。 [0010] 項 1.一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA複合体を形成し、該ニ本鎖 DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法。

[0011] 項 2.—塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、

(1)末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA複合体を形成する工程、

(2)得られた二本鎖 DNA複合体の光増感剤に光照射して該ニ本鎖 DNA複合体上に電荷分離状態を生成し、該ニ本鎖 DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程、及び

(3)測定される該光電流の強度に基づ!/、てターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程

を含む項 1に記載の方法。

[0012] 項 3.—塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、

(la)光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、末端が電極に固定されかつ該ァデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA複合体を形成する工程、

を含む項 1に記載の方法。

[0013] 項 4.一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、 (lb)光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをノヽイブリダィズさせて二本鎖 DNAとし、該ニ本鎖 DNAの末端に電極を設けて二本鎖 DNA複合体を形成する工程、

を含む項 1に記載の方法。

[0014] 項 5.—塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、

(lc)光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、該ァデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、タ一ゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNAとし、該ニ本鎖 DNAの末端に電極を設けて二本鎖 DNA複合体を形成する工程。

を含む項 1に記載の方法。

[0015] 項 6.プローブ DNAが、 1個の一塩基多型部位を有する項 1〜5のいずれかに記載の方法。

[0016] 項 7.アデニン連続配列力アデニンが 3個以上連続配列している請求項 6に記載の方法。

[0017] 項 8.光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフエ-ルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフエノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群力も選ばれる 1種である項 6に記載の方法。 [0018] 項 9.一塩基多型部位を有するプローブ DNAであって、その末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなるプローブ DNA。

[0019] 項 10.項 9に記載のプローブ DNAであって、その末端が S原子を介して電極に固定され、かつ、光増感剤が結合した 3個以上のアデニン連続配列で修飾されてなるプローブ DNA。

[0020] 以下、本発明につ、て詳述する。

[0021] 本発明の SNP解析方法 (SNPタイピング方法）は、ターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA複合体を形成し、光増感剤の光励起により二本鎖 DNA複合体に発生する光電流を測定することを特徴とする検出方法である。すなわち、二本鎖 DNAにおける一塩基のフルマツチ又はミスマッチにより、該ニ本鎖 DNAで発生する光電流の検出強度に差異が生ずることを利用した検出方法である。なお、該ターゲット DNAの一塩基多型部位とプローブ DNAの一塩基多型部位とは、相補的な位置関係にある。

[0022] 本発明の SNP解析方法は、一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをノヽイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であって、

を含む方法である。その模式図を図 2に示す。

[0023] 工程（1)：

工程（1)は、一方の末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAと、ターゲット

DNAとの間でハイブリダィゼーシヨンを行う工程である。

[0024] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAは、ターゲット DNAに対し铸型となる塩基配列を有する DNAであり、 4つの核酸塩基、リボース、リン酸力ら、公知の DNA固相合成機を用いて、任意の配列を有するプローブ DNAを合成することができる。

[0025] ここで、該プローブ DNAの一塩基多型 (SNP)部位とは、本発明の検出法により被検出対象となりうるターゲット DNAの一塩基多型部位と相補的な位置関係にある。つまり両者がハイブリダィズして二本鎖 DNAとなる際、ターゲット DNAの SNP部位と水素結合する部位である。

[0026] 本発明の検出法は、通常、ターゲット DNA中における 1個の一塩基多型部位の塩基を検出する方法であり、そのため被検出対象であるターゲット DNAは一塩基多型部位が 1個存在するものが選択される。本発明の検出法では、一塩基多型部位は、ターゲット DNA鎖中のどの部位に存在していても検出は可能である力特に、一塩基多型部位が DNA鎖の中心部に位置すれば、 DNA二本鎖形成に対して中心部のミスマッチの影響が電流値により強く反映されるので、検出感度が向上する。

[0027] また、該プローブ DNAは、光増感剤が結合したアデニン連続配列を有して、る。これは、光増感剤により発生したホールのアデニン間の連続ホッピング (アデ-ンホツビング）に基づくホールシフト反応により、ハイブリダィズした 2本鎖 DNA上において電荷分離状態を効率よく発生させるためである。アデニン連続配列におけるアデニンの数は、 3個以上、好ましくは 3〜8個程度、より好ましくは、 4〜6個程度である。かかる範囲であれば、電荷分離寿命はマイクロ秒以上となり、所望の光電流が得られるため好ましい。

[0028] 本発明で用いられる光増感剤としては、その光励起状態がアデニンを酸ィ匕できるものであれば特に限定はない。具体的には、還元されやすい芳香族化合物であり、紫外力紫外可視領域に吸収をもち、比較的大きい一重項エネルギーを有する光増感剤が好ましい。例えば、ナフタルイミド、ナフタルジイミド (NI)、ジフエ-ルァセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフエノン、ベンゾイン、キサントン等が挙げられる。特に、電子移動理論から、再結合が遅く電荷分離効率が向上するので、電流検出感度が上昇すると予想されるナフタルイミド、ジフエニルアセチレンが光増感剤として好ましい。

[0029] アデニン連続配列と光増感剤との結合様式は、光増感剤からアデニンへのホールの移動が速やかに行われるものであれば特に限定はない。例えば、図 4にあるように、光増感剤 (例、ナフタルイミド）カ^ンカ一 (炭素数が 2〜6程度の炭化水素鎖)を介して 5'—リン酸エステルの形でアデニンに導入されたものが例示される。なお、必要に応じ、アデニン連続配列の 3'末端にリンカ一が導入されたものであってもよいが、 5 '—リン酸エステルの形でアデニンに導入されたものは調製が容易であり好ましい。

[0030] 光増感剤を、リンカ一を介してアデニン連続配列に結合させる反応は、例えば、 J.

Org. Chem. 2000, 65, 5355-5359又は J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 12838-12841 の記載に準じて実施できる。具体的には、水酸基の結合したアルキルリンカ一を有する光増感剤（例、ナフタルイミド、ジフエ二ルアセチレン等）をアミダイトイ匕反応して活性化し、合成機上で一本鎖 DNAの 5'末端の水酸基とカップリングさせることで、プローブ DNAを光増感剤で修飾することができる。

[0031] また、プローブ DNAの末端を電極に固定する方法は、公知の方法を採用すればよぐ例えば、該プローブ DNAを電極固着部 (メルカプト基（一 SH基)）等を有するリンカ一で修飾し、これを電極に固定する方法等が例示される。リンカ一としては、炭素数力^〜 6の炭化水素鎖があげられ、例えば、 Glen research (株）より市販されている C3 又は C6のリンカ一が挙げられる。このリンカ一を介して、メルカプト基とプローブ DNA の末端部とが結合している。リンカ一は、プローブ DNAのアデニン連続配列の 3 '末端又は 5 '末端の、ずれに導入されて、てもよ、が、 3 '末端に導入されたものが好ましい。

[0032] 本発明に利用されるプローブ DNAを固着させるための電極は、プローブ DNAにおける電極固着部が結合し得るものを用いる。具体的には、少なくとも表面が金力も構成される電極などを挙げることができる。

[0033] 少なくとも表面が金力ゝら構成される電極の具体例としては、電極全体が金からなる金電極や、金以外の材質からなる基材の表面周囲を金でめっきした電極や、蒸着法等により基材上に金の層を設けた電極などが挙げられる。 [0034] プローブ DNAの電極への固着化処理は、公知の方法を採用できる。例えば、金電極を用いた場合、 0.1 M MgClを含む 50 mMリン酸緩衝液 (pH 7,0)中で、金電極 (表

2

面）とチオール化 DNAを 1〜10時間インキュベートすればよい。この操作で、プロ一ブー本鎖 DNAが基板上に固定ィ匕される。

[0035] 本発明に利用されるプローブ DNAを、 1の電極に対して 1種のプローブ DNAが対応するように配設させ、このようにして得られた電極を複数個用いることにより、多くのタ一ゲット DNAの SNPを同時に検出することが可能となる。即ち、マルチアレイ電極を用いることにより、複数の検体を同時に検出することも可能となる。

[0036] 得られた電極に固着させたプローブ DNAを用いて、該プローブ DNAとターゲット

DNAとの間でハイブリダィゼーシヨンを行う。ハイブリダィゼーシヨン反応は、 DNAの長さや反応条件に依存する力通常 40〜60°C程度において該反応に適したバッファ一中で行うことが好ましい。ノッファーとしては、例えば、 SSC (塩化ナトリウムとクェン酸ナトリウムを混合した緩衝溶液）、リン酸バッファー、 Tris塩酸塩バッファーなどを挙げることができる。

[0037] このようにしてターゲット DNAと、該ターゲット DNAの塩基配列と相補配列を有するプローブ DNAとの間で二本鎖 DNA複合体が形成される。

[0038] さらに、本発明の SNP解析方法では、工程（1)に代えて、次のような工程（la)〜ェ程（lc)を採用してもよい。

[0039] (la)光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、一方の末端が電極に固定されかつ該ァデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA 複合体を形成する工程。その模式図を図 3に示す。

[0040] (lb)光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNAとし、該ニ本鎖 DNAの末端に電極を設けて二本鎖 DNA複合体を形成する工程。

[0041] (lc)光増感剤が結合したアデニン連続配列の存在下、該ァデニン連続配列に相補的なチミン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをノヽイブリダィズさせて二本鎖 DNAとし、該ニ本鎖 DNAの末端に電極を設けて二本鎖 DNA複合体を形成する工程。

[0042] これらの各工程では、上記の工程（1)で示した条件或、はそれを適宜修飾した条件を用いることができる。工程（la)〜工程（lc)のいずれの場合も、操作は簡便であり、続く工程（2)及び（3)において高い感度でかつ正確にターゲット DNAの一塩基多型の塩基を検出することができる。

[0043] 工程（2)：

工程 (2)は、第 1工程で形成された二本鎖 DNA複合体に光照射して、光増感剤を光励起させて該複合体上に電荷分離状態を生成させて、該ニ本鎖 DNAに発生する光電流を電極にて測定する工程である。

[0044] 光照射に用いる光源としては、前記した光増感剤を光励起させることができ、二本鎖 DNAに悪影響を与えないものであれば特に限定はなぐ例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ブラックライト、エキシマレーザ、重水素ランプ、 Hg-Zn-Pbランプ等カも選ばれる 1種類の光源または波長域の異なる 2種類の光源を用いることができる。特に、光源が比較的安価であり光強度も強ぐ広い範囲の波長を取り出すことができる点から、キセノンランプと高圧水銀ランプが好適である。

[0045] 光電流強度の検出は、電気化学的測定による。具体的には、高感度の測定が可能な Bioanalytical Systems, Inc. CV- 50W (装置名）等を用いて測定できる。測定条件は、例えば、実施例 2にあるように、電子メディエーターであるメチルビオローゲンを含むリン酸緩衝溶液中に、 366 nmの光を照射し、 -100 mVのバイアスをかけて測定を行う。ここで、光増感剤からアデニンホッピングを経て生成する電荷分離状態、及びグァニンホッピングは、媒体である水分子の影響を受けない。また、ミスマッチを含む配列では、フルマツチの場合に比べて 2本鎖 DNA内の電子の流れが妨げられるため、電流強度が減少する傾向が観測される。

[0046] 工程（3)：

工程（3)は、測定される該電流の強度に基づいてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する工程である。光を照射して得られる光電流強度から、フルマツチ (正常型)、ミスマッチ (異常型)の検出を行う。

[0047] 本明細書にぉ、て「フルマツチ」とは、二本鎖を形成した DNAの塩基対が完全に相補的である状態をいい、ターゲット DNAは正常型であることを意味する。一方、本明細書において「ミスマッチ」とは、二本鎖を形成した DNAの塩基対に、相補的な関係にな、塩基対が一つ存在する状態を、、ターゲット DNAは異常型であることを意味する。

[0048] 今回、本発明者らは、二本鎖 DNA内の電荷移動速度が一塩基のフルマツチとミスマッチに大きく依存することを見出し、さらにミスマッチ塩基の種類に応じて光電流強度が変化することを見出した。本発明の検出法によれば、二本鎖 DNA複合体に流れる光電流の強度変化を測定することにより、フルマツチとミスマッチの相違の検出だけでなぐターゲット DNAにおけるミスマッチ塩基の種類を特定することが可能となる。通常、ミスマッチは DNAの構造を乱し電荷移動効率の減少を引き起こすため、いずれのミスマッチでも光電流強度が減少する。

[0049] 具体的には、被検対象として、あら力じめ一塩基多型部位が分力つている一本鎖タ一ゲット DNAを用い、該ターゲット DNAに相補的なプローブ DNAを合成し、該プローブ DNAの一塩基多型部位の塩基の種類を変えて光増感剤で生じる光電流強度の変化をモニターすることで、ターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基の種類を同定できる。つまり、強い光電流が観測される場合はフルマツチであり、光電流強度の減少の程度を観測することでミスマッチとなる塩基の種類を同定できるのである。これにより、精度の高、SNPの解析が可能となる。

[0050] 例えば、図 5にあるように、 SNP部位がグァニン（G)であるプローブ DNAに、ターゲット DNAがハイブリダィゼーシヨンしたサンプルにお!/、て、ターゲット DNAの SNP部位に相補的な位置にくる塩基の種類によって光電流の強度が相違する。

[0051] 具体的には、プローブ DNAの SNP部位がグァニン（G)の場合は、相補位置にくる塩基が C> >T, A>Gの順で光電流の強度は減少する。また、プローブ DNAの SNP部位がシトシン (C)の場合は、 G> >T, C> Aの順で光電流の強度が減少し、プロ一ブ DNAの SNP部位がアデニン (A)の場合は、 T> >C>A, Gの順で光電流の強度が減少し、プローブ DNAの SNP部位がチミン (T)の場合は、 A> >C>A, Gの順で光電流の強度が減少する。

[0052] これらの光電流強度の相違は大きいため、これらの強度を比較することにより、効率的かつ高い精度で各サンプルにおける SNP塩基の検出（SNPタイピング）が可能となる。なお、光電流の強度は、用いる光増感剤の種類や 2本鎖 DNAの長さ等によっても変化するが、上記の傾向は保持される。

[0053] 本発明のように、有機化学的に設計された DNAを使って光電流を観測した例は、これまで全く報告されていない。本発明の方法によれば、 2本鎖 DNA内の電荷移動速度力一塩基のフルマツチ、ミスマッチに顕著に依存することを利用し、 DNA内の電荷移動速度を光電流のシグナル強度変化として検出することで、迅速、簡便かつ安価な SNP検出（SNPタイピング）が可能となった。この方法論によれば、 DNAチップへも適用することが可能であり、疾患関連遺伝子の探索などに好適に用いられる。

[0054] さらに、 SNPを簡便かつ迅速に検出する本方法は、疾病や病気へのかかりやすさなどに関わる個人の遺伝子に対する診断に適用可能であり、個体差に合わせて薬剤量の調整や種類の選択を行うことができテーラーメイド医療、遺伝子診断法の開発へとつながる。

発明の効果

[0055] 本発明の SNP解析方法は、二本鎖 DNA複合体を構成するターゲット DNAとプロ一ブ DNAの SNP部位におけるフルマツチ、ミスマッチに依存した光電流強度変化を高感度に検出できる。そのため、ターゲット DNAとプローブ DNAをハイブリダィゼーシヨンさせるだけで、効率よく SNP部位の塩基を検出でき、複雑な条件の最適化は必要とならない。さらに、電極反応を利用するため、 DNAチップへの適用が容易であり、迅速、簡便かつ安価に高い精度で SNP検出が可能となる。

図面の簡単な説明

[0056] [図 1]アデニンホッピングを経由した二本鎖 DNA内の電荷分離過程を示す模式図である。

[図 2]本発明の SNP解析方法におけるハイブリダィゼーシヨンの模式図である。

[図 3]本発明の SNP解析方法におけるハイブリダィゼーシヨンの模式図である。

[図 4]アデニンと光増感剤との結合の一例を示す図である。

[図 5]SNP部位がグァニン（G)であるプローブ DNAに、ターゲット DNAがハイブリダィゼーシヨンした二本鎖 DNAにお!/、て、ターゲット DNAの SNP部位の塩基の種類によつて光電流の強度が変化することを示す模式図である。

[図 6]実施例 1で用いられる二本鎖 DNA配列 1〜3を示す図である。

[図 7]実施例 2で用いられる電気化学的測定の模式図である。

発明を実施するための最良の形態

[0057] 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

[0058] 実施例 1

一塩基のフルマツチ、ミスマッチに対し、 DNA内の電荷移動速度がどのような依存性を示すかにつ!/、て検討した。

[0059] 具体的には、光増感剤としてナフタルジイミド (NI)、及び正電荷のプローブ分子としてフエノチアジン (PTZ)を DNAの両末端に結合させた DNAとして、 3種類の二本鎖オリゴデォキシヌクレオチド（二本鎖 DNA配列 1〜3、図 6を参照）を合成し、その水溶液中のナノ秒レーザーフラッシュホトリシスについて検討した。

[0060] ナノ秒パルスレーザー（波長 355 nm)照射によって NI部位を光励起すると、 NIの励起状態が生成し、近傍の核酸塩基との間での電荷分離反応が起こり、さらに DNA鎖内での正電荷の移動反応が生じた。これらの電荷移動速度を、時間分解過渡吸収測定法によって決定した。

[0061] その結果、アデニン間の連続ホッピングに基づくホールシフト反応により、 NIと近傍の Gとの間の電荷分離が効率よく起こることが分力つた (例えば、図 1を参照)。

[0062] ホール移動速度はフルマツチ（二本鎖 DNA配列 1)の場合は 31 X 10⁵

A-Cミスマッチ（二本鎖 DNA配列 3)、 G-Tミスマッチ（二本鎖 DNA配列 2)はそれぞれ 3.6 X 10⁵ 0.82 X 10⁵ s—¹と求められ、ミスマッチの有無でホール移動速度は 10倍以上変化することが見出された。即ち、 DNA内のホール移動速度は、大きく塩基配列に依存することが明らかになった。

[0063] 実飾 12

実施例 1で得られた 3種の二本鎖 DNAの PTZ末端をチオール基に変換し、金電極と反応させて、金電極上にチオール基を介して該ニ本鎖 DNAを結合させた。これに光照射を行い、上記の光電荷分離が生じた。これにより生じる DNA中の電流を、下記の光電気化学測定により検出した。

[0064] 具体的には、電気化学測定には、 Bioanalytical Systems, Inc. CV- 50Wを使い、 Au 作用電極、プラチナワイヤー対電極、 Ag/AgCl参照電極を用いた標準的な 3電極方式を採用した (例えば、図 7を参照)。光電気化学測定は、アルゴン雰囲気下、 150 W キセノンランプからの光を干渉フィルター（MIF- S, Vacuum Optics Corporation of Japan)を通し単色光とした後に、セルへ照射し、電流を検出した。電子メディエータ一として methyl viologenを存在させた水溶液を電解質溶液として用いた。光短絡電流は、 DNAを修飾した Au作用電極と Pt対電極の 2電極系において、 Keithley 2001 degital multimeterを用いて観測し、光強度は Anritsu ML9002Aもしくは Hamamatsu Si photodiode 使って求めた。

[0065] 光電流強度の測定結果を、表 1に示す。

[0066] [表 1]

表 1 光電流強度

配列ピーク電流/ n A cm— ²

本鎖 DNA配列 1 10

(ノノ）1レ、ツ、/ノ、ノ

本鎖 DM配列 2 0. 2

(G-Tミスマッチ）

二本鎖 DNA配列 3 1

(A-Cミスマッチ）

[0067] 上記の結果より、電荷移動速度が光電流のシグナル強度変化に対応するので、光電流を高感度に検出することにより、 SNP部位の塩基を検出することができる。

[0068] この方法は、新、SNPタイピング法として用いられ、さらに遺伝子多型やミスマッチ等の遺伝子診断への高感度検出法として有用である。

Claims

請求の範囲 [1] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせて二本鎖 DNA複合体を形成し、該ニ本鎖 DNA複合体に発生する光電流を測定することにより、ターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法。 [2] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であつて、

を含む請求項 1に記載の方法。

[3] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であつて、

を含む請求項 1に記載の方法。

[4] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であつて、

(lb)光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなる一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをノヽイブリダィズさせて二本鎖 DNAとし、該ニ本鎖 DNAの末端に電極を設けて二本鎖 DNA複合体を形成する工程、

を含む請求項 1に記載の方法。

[5] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAに、ターゲット DNAをハイブリダィズさせてターゲット DNAの一塩基多型部位の塩基を検出する方法であつて、

を含む請求項 1に記載の方法。

[6] プローブ DNAが、 1個の一塩基多型部位を有する請求項 1〜5のいずれかに記載の方法。

[7] アデニン連続配列が、アデニンが 3個以上連続配列している請求項 6に記載の方法。

[8] 光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフエニルアセチレン、フラビン、ァントラキノン、ベンゾフエノン、ベンゾイン及びキサントン力なる群力選ばれる 1種である請求項 6に記載の方法。

[9] 一塩基多型部位を有するプローブ DNAであって、その末端が電極に固定され、かつ、光増感剤が結合したアデニン連続配列で修飾されてなるプローブ DNA。

[10] 請求項 9に記載のプローブ DNAであって、その末端が S原子を介して電極に固定され、かつ、光増感剤が結合した 3個以上のアデニン連続配列で修飾されてなるプローブ DNA。