WO1998049327A1 - Proteinas de fusion recombinantes basadas en adhesinas bacterianas para el desarollo de ensayos diagnosticos - Google Patents

Proteinas de fusion recombinantes basadas en adhesinas bacterianas para el desarollo de ensayos diagnosticos Download PDF

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Freya M. Freyre Almeida
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Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, in particular with the development of recombinant fusion proteins based on bacterial adhesins and their use in hemagglutination diagnostic tests for the specific detection of antibodies or antigens in blood and other biological samples.
  • BACKGROUND ART Strains of entero-pathogenic bacteria frequently have proteins on their surface that act as adhesion factors (hereinafter referred to as "adhesins") and that allow the bacteria to adhere to the host cells (Gaastra, W. and de Graaf, FK 1982. Microbiol. Rev. 46. 129-161).
  • the adhesive activity is associated with the predominant protein subunit in polymeric tubular structures that it has on its surface (which we will call indistinctly fimbria and p ⁇ lus-pili) (Jacobs, AA, Venema, J., Leevan, R., van Pelt-Heers-Chap, H. and de Graaf, FK 1987. 169. 735-741).
  • fimbria Pap it works as a support for the adhesive elements at its end (Lindberg, F., Lund, B., Johanssen, L. and Normark, S. 1987. Nature. 328. 84-87).
  • the subunits responsible for adhesion are also gene products different from the majority protein of the pili (Maurer, L. and Orndorff, PE 1987. J. Bacteriol. 169. 640-645; hacker, J., Schmitd, G., Hughes, S., Knapp, S., Marget, M. and Goebel, W. 1985. Infect. Immun. 47. 434-440).
  • Bacterial adhesins are not always assembled in p conlus-shaped structures. Many adhesins cannot be visualized using ordinary electron microscopy techniques, so they are then considered "no-pilus". The architecture of these is not well known, but it is assumed that they are proteins associated with the bacterial surface as simple monomers or oligomers. In nature, many microbes can live in a wide variety of ecological niches, while others are restricted to specific micro-environments. The recognition of receptors in host cells by adhesins of both the püus and non-pilus type is a very well tuned process, which causes a very selective interaction.
  • the Gram-negative bacterium Escherichia coli (E. coli) can colonize the intestinal tract of several mammals and other vertebrates and cause a large number of infections in them.
  • the adhesive pili of Gram-negative bacteria generally adopt two basic morphologies: (a) a tubular structure with a diameter of approximately 7 nm or (b) a flexible and thin fimbria with a diameter of 2-5 nm (from Graaf, FK and Mooi, FR 1986. Adv. Microb. Phyisiol. 28. 65-143).
  • the pili type 1 are tubular structures that join tricky, and the pili P rigid helical polymeric structures (Gong, M. and Makowski, L. 1992. J. Mol.
  • pili such as those that facilitate intestinal colonization, and those that are associated with E. coli producing whole toxins, form an open helical structure without axial cutting and are therefore thinner and less rigid structures (of Graaf, FK and Mooi, FR 1986. Adv. Microb. Phyisiol. 28. 65-143; de Gaaf, FK, Klemm, P. and Gaastra, W. 1981. Infect. Immun. 33. 877-883).
  • the genes involved in the biosynthesis and expression of the pili P are grouped in an operon structure in the bacterial chromosome of about 5- 10% of the isolates of human fecal E. coli and of up to 90% of the isolated strains of the urinary tract of children with acute pyelonephritis (Hull, RA, Gil ⁇ , RE, Hsu, P., Minshaw, BH and Falkow, S. 1981. Infect Immun 33. 933-938; Lund, B., Marklund, BI, Stromberg, N., Lindberg, F., Karlsson, KA and Normark, S. 1988. Nature. 328.
  • Pap G adhesin is apparently a molecule with two domains. Purification studies of Pap G variants with the truncated amino terminal end, using affinity chromatography with Gal (1-4) Gal, have shown that said domain contains the receptor binding site (Hultgren, S., Lindberg, F ., Magnusson, G., Kihlberg, JM, Tennent, JM and Normark, S. 1989. PNAS USA. 86. 4357-4361). In addition, fusion of the 5 'end of the pap G gene, which codes for the receptor binding site, with the gene encoding the maltose binding protein, resulted in a soluble end product that binds both maltose and Gal ( l-4) Gal.
  • the carboxyl-terminal domain of Pap G contains the recognition surface for the periplasmic chaperone protein Pap D.
  • the adhesin-chaperone interaction is a prerequisite for the presentation of the adhesin on the bacterial surface, as it allows it to be assembled in the pilus and that The domain that contains the receptor binding site becomes accessible for the recognition of receptors in eukaryotic cells.
  • Chaperone binds to the carboxyl terminal domain of Pap G so that it does not interfere with the receptor binding activity of the amino terminal domain (Hultgren, S., Lindberg, F., Magnusson, G., Kihlberg, J., Tennent, JM and Normark, S. 1989. PNAS USA 86. 4357-4361).
  • the Pap G protein has virtually the same specificity and affinity for the galabiosa when it is bound to Pap D in a pre-assembly state, than when it is present at the end of the p ⁇ us (Hultgren, S., Lindberg, F., Magnusson, G ., Kihlberg, J., Tennent, JM and Normark, S. 1989. PNAS USA. 86. 4357-4361).
  • the binding between pyelonephritic E. coli and human P erythrocytes has been investigated using several receptor analogs (Kilhberg, J., Hultgren, SJ, Normark, S. and Magnusson, G. 1989. J. Am. Chem. Soc. 1 11.
  • This adhesin provides the bacterium with an antigenic and haemagglutinating surface that causes adhesion to interstitial cells (Chien, S. 1975. In: DM Surgenor (ed.). The Red Blood Cell, vol. 2. Acad. Press, Inc. New York; Morris, JA, Thorns, CJ, Scott, AC, Sojka, WJ and Wells, GA 1983. Infec. Immun. 36. 1 146-1153; Morris, JA, Thorns, CJ, Scott, AC, Sojka, WJ and Wells, GA 1983. J. Gen. Microbiol. 129. 2753-2759).
  • This antigen has a subunit of approximate molecular weight (Mw) of 29,500 daltons (Da), and has been shown to be protective in the infant mouse model and in vaccinations in piglets (Morris, JA, Thorns, CJ, Scott, AC, Sojka , WJ and Wells, GA 1983. Infec. Immun. 36. 1 146-1153).
  • Glycoforin A a major glycoprotein in the human erythrocyte membrane, acts as a receptor for urotogenic E. coli IM 1 1 165 and for those expressing adhesin F41 (Jokinen, M., Ehnholm , C.,. Visnen-Rhen, V., Korhonen, T., Pipkoru, R., Kalkkinen, N and Gamberg, GC 1985. Eur. J. Biochem. 147. 47-52; Vaisanen, V., Korhonen, T., Jokinen, M., Gamberg, CG and Ehnholm, C. 1982. Lancet i. 1192).
  • GFA belongs to a group of sialoglycopeptides found in human erythrocytes. GFA is the majority representative of this group (about 75% of the total), and is composed of a single polypeptide chain of 131 amino acids, and carbohydrates that make up up to 60% of its molecular mass. The 70 amino acids of amino-terminal end protrude from the double lipid layer of the membrane, and 16 of them are bound to carbohydrates. It was shown that the binding capacity by F41 is increased for the blood group M. It is known that the M or N blood polymorphism lies in the first and fifth amino acids of the amino terminal end of the GFA polypeptide chain (23).
  • the amino terminus is a serine and a glycine occupies the fifth position, while in the NN these positions are covered by leucine and glutamic acid, respectively.
  • GFA isolated from individuals with MN blood subgroup contains equimolar amounts of each species.
  • the second, third and fourth amino acids are O-glycosylated with a tetrasaccharide containing two residues of N-acetyl neuraminic acid (NANA). These oligosaccharides inhibit GFA binding, but NANA is not involved in that binding.
  • F41 is chromosomally encoded.
  • the genetic determinants for F41 have been cloned and expressed in E. coli K 12.
  • This operon contains a porin of 86 kDa, an accessory protein of 29 kDa, which can act as a periplasmic chaperone, and the F41 antigen of 29 kDa.
  • This genetic organization is similar to that reported for other fimbria adhesins, such as K 88 and pilus P.
  • a new type of assay employs the self agglutination of the red cells of the individuals tested.
  • the basis of this system is a bivalent molecule, formed by an antibody (or one of its binding sites) specific for erythrocytes, and by an antigenic portion of an infectious agent for humans. If these molecules come in contact with a small blood sample of a seropositive individual, the erythrocytes will agglutinate in seconds because the anti-antigen antibodies act as a bridge between the fusion proteins bound to the red cells by their binding sites (s). In a sample of a seronegative individual there is no recognition of antigen and therefore, hemagglutination does not occur.
  • the total DNA content of peeled bacteria was extracted. These DNAs were used as templates for specific amplification reactions of the genes encoding F41 and Pap G proteins (specific for human GFA and human red cell P antigen, respectively). In these experiments both the polymerase chain reaction (RCP) technique and a set of synthetic oligonucleotides designed on the basis of published DNA sequences for these two proteins were used.
  • RCP polymerase chain reaction
  • the amplified genes were cloned into three different expression vectors, together with a 3 'sequence encoding the HIV-1 gp41 diagnostic peptide.
  • the sequence of this 16 amino acid peptide was previously assembled "in vitro" from two synthetic sequences. complementary, and then linked to the cloned CPR products.
  • the first two expression vectors contained an operon that includes an inducible tryptophan promoter [tryp), a signal peptide for periplasmic secretion (ompA) in pPACIB.7 + , a 26 amino acid peptide of Human Interleukin 2 in pPACIB.9 + , a sequence of six histidines for purification by Immobilized Metallic Ion Affinity Chromatography (IMAC), and a T4 phage transcription terminator, all over the base of a plasmid pBR322.
  • tryp tryp
  • ompA signal peptide for periplasmic secretion
  • the third plasmid used in our experiments was the Qiagen vector pQE 60, which contains the T5 phage promoter and two lac operators, a synthetic ribosome binding site, a 3 'histidine sequence and two strong transcription terminators, on a pBR322 base.
  • All genetic constructs, linked to the corresponding expression vector, were used to transform competent XL 1- Blue cells, from Stratagene. Colonies that grew in selective solid medium were evaluated according to their digestion patterns with restriction enzymes. Plasmid DNA extracted from selected clones was sequenced. The selected plasmids, designated pPAP-HIVs and pF41-HIVs for the periplasm soluble expression constructs, and pPAP-HIVi and pF41-HIVi for the cytoplasmic expression constructs, were used to Transform different strains of E. coli and perform the corresponding expression studies.
  • Recombinant fusion proteins were extracted from the periplasmic fraction by repeated freeze-thaw cycles, or from the bacterial cytoplasm by sonication and solubilizing agents.
  • the four fusion proteins were purified by IMAC using Cu +2 or Ni +2 as transition metals and a pH gradient for elution.
  • IMAC IMAC
  • Ni +2 transition metals
  • pH gradient for elution.
  • In vitro refolding of the two cytoplasmic proteins was performed by controlled dialysis in redox buffers.
  • the gene inserts of both fusion proteins were cloned into the InVitrogen vector for Pichia pastoris pHIL-Sl. Plasmid DNA from bacterial cells carrying the recombinant vectors was prepared, linearized, electroporphic in Pichia pastoris and seeded in selective medium. Positive yeast clones were identified by colony CPR to require integration and subjected to induction conditions. Cellular content and culture supernatant was evaluated by SDS-PAGE and Western blot for the expression of the two fusion proteins.
  • the four purified fusion proteins and the two impure ones from yeast were tested for their agglutination capacity using suspensions of human O + erythrocytes to which were added: (a) a specific antiserum against each adhesin, (b) a human serum containing specific antibodies against the 15 amino acid peptide of HIV 1, or (c) an unrelated serum serum.
  • the fusion proteins produced a visible agglutination of the erythrocytes in the red cell samples containing the specific antiserum against the adhesin in question, and the specific human serum against the peptide.
  • the six fusion proteins were evaluated for agglutination of direct blood samples from HIV-1 seropositive and seronegative individuals, using different dilutions of both purified proteins and blood samples. A visible agglutination was observed in all seropositive blood samples. Fusion proteins did not bind the erythrocytes of seronegative donors that were used as negative controls.
  • the CPR technique was used for the specific amplification of the F41 and Pap G adhesin genes, from the first amino acid reported for each mature protein, to the respective stop codons.
  • Synthetic oligonucleotides were designed based on the sequences reported for both genes (Lund, B., Lindberg, F., Marklund, BI. And Normark, S. 1987. PNAS USA. 84. 5898-5902; Anderson, D. and Moseley, S. 1988. J Bacteriol. 170. 4890-4898), and included convenient restriction sites for cloning (Table 1). The PCR conditions were optimized for each gene separately. Table 1.- Synthetic oligonucleotides used for the specific PCR amplification of the genes that code for F41 and Pap adhesins.
  • Oligo No. 4.- 5 'F41 gene Co. I. 5X .. CCATCGATG AAA AAG ACT CTG ATT GCA CTG GCT G ..
  • amplified DNA fragments were purified from low melting agarose gels, using saturated phenol for extraction, and finally digested with the appropriate restriction enzymes for cloning into expression vectors (Sambrook, J., Fritisch, EF and Maniatis, T. 1989. In: Molecular Cloning, A laboratory Manual, Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Procedure (c) Cloning of the adhesin genes obtained by amplification, in the plasmid vector designed for periplasmic expression.
  • the vector pPACIB.7 + (see ref. 30 for a related vector) was digested EcoRI-EcoRV (or Clal-EcoRV), and linked to the inserts obtained by CPR in two separate reactions: (1) pPACIB.7 + + Pap G, and (2) pPACIB.7 + + F41.
  • the products of the binding reactions were used for the transformation of competent E. coli (strain XL-1 Blue), which were then plated in selective solid medium and grown for 16 hours at 37 ° C (Sambrook, J., Fritisch , EF and Maniatis, T. 1989.
  • the genes were sequenced in both directions using specific primers designed for this purpose that hybridize externally to the cloning regions of the pPACIB.7 + vector.
  • the sequences obtained for the genes of the amplified and cloned adhesins agreed with those reported in the literature for Pap G and F41 (Lund, B., Lindberg, F., Marklund, BI. And Normark, S. 1987. PNAS USA. 84 5898-5902; Anderson, D. and Moseley, S. 1988. J Bacteriol. 170. 4890-4898).
  • Procedure (d) Cloning of the adhesin genes obtained by amplification, in the plasmid vector designed for intracellular expression.
  • the vector pQE 60 (Qiagen) was digested NcoI-BamHI.
  • the pPACIB.7 + vectors containing each insert of each adhesin were also digested NcoI-BamHI.
  • the 1 kb DNA fragments (Pap G) and 630 bp (F41) were purified from low melting agarose gels and ligated to the vector pQE 60 (Qiagen), previously prepared. The products of this linkage were used for the transformation of competent cells of strain XL 1 Blue, which were subsequently plated in selective semi-solid medium and grew for 16 hours at 37 ° C (Sambrook, J., Fritisch, EF and Maniatis, T. 1989. In: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Recombinant plasmids were selected after purification of the plasmid DNA from several colonies and their digestion with restriction enzymes (Sambrook, J., Fritisch, EF and Maniatis, T. 1989. In: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) to check the expected binding products, that is, a 3.5 kb band corresponding to the linearized pQE 60 vector, and bands corresponding to 1 kb and 630 bp for Pap G genes and F41, respectively.
  • Recombinant plasmids were selected after the purification of plasmid DNA from several colonies and their digestion with restriction enzymes (Sambrook, J., Fritisch, EF and Maniatis, T. 1989. In: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Procedure (a) Basically, the recombinant bacteria were grown for 16 hours at 37 ° C in liquid medium (LB) with ampicillin (Sambrook, J.,
  • EXAMPLE 3 Cloning of fusion proteins in the expression vector of Pichia pastoris pHIL-S l and generation of recombinant yeasts.
  • PCR was performed with the oligonucleotides presented in Table III on the F41-HIV and PapG-HIV fusion protein genes cloned in the vectors for bacterial expression described above. In this way the required restriction sites were introduced.
  • pHIL-S vector was digested EcoRI BamHI and ligated with the previously digested insert in separate reactions.
  • A pHIL-S l + F41-HIV
  • B pHIL-S l + PapG-HIV.
  • MD minimal Dextrose
  • Procedure (a) Growth of His + Mut + recombinants in buffered glycerol medium (BMGY) and induction.
  • BMGY buffered glycerol medium
  • the five and seven positive transformants for CPR of F41-HIV and PapG-HIV were grown in ten ml of BMGY at 30 C until a final OD of 2-6.
  • the cells were harvested in methanol medium until IDO and incubated at 30 C with shaking. Samples were taken for analysis every 24 hours for four days, within 24 hours of adding methanol to a final concentration of 0.5% to maintain induction.
  • Procedure (b) Analysis of the presence of fusion proteins in culture supernatant by SDS PAGE and Western blot.- One ml of culture was centrifuged at each experimental point and the supernatant was transferred to a separate tube for expression analysis. The samples were previously concentrated ten times by precipitation with 100% TCA. Analysis of the samples in 15% SDS-polyacrylamide gels indicated that under these conditions new proteins were expressed whose molecular size corresponds to that expected. Expression was confirmed by Westrn blot analysis with a human serum specific for the HIV peptide.
  • EXAMPLE 5 Production of fusion proteins from bacterial cultures, renaturation, and specificity tests of bacterial and yeast fusion proteins with human erythrocytes.
  • the cells containing the recombinant products were frozen and thawed for three consecutive times, after which they were centrifuged, the supernatant containing the fusion proteins was recovered, and dialyzed against 0.1 M sodium phosphate and 0.5 M NaCl, pH 8.0 (coupling buffer) before proceeding to the purification process.
  • Procedure (c) Purification of fusion proteins using immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) .-
  • Preparations containing the fusion proteins obtained by the procedures described in subsections (a) and (b) were applied directly to matrices of Sepharose-IDA-Cu +2 or Ni +2 . Once the proteins were coupled, the gels were first washed with 10 times their volume using coupling buffer adjusted to pH 6.3, and then and similarly with the buffer adjusted to pH 5.0 (for elution of E. coli contaminating proteins) . Elution of the fusion proteins was performed at pH 4.0 with the same solution, neutralizing the eluates immediately with Tris-base.
  • cytoplasmic fusion proteins pPAP HIVi and pF41 HIVi were renaturated by extensive dialysis at 4 ° C, in a redox buffer designed for this purpose, after a total reduction with DTT. Protein preparations were concentrated by ultrafiltration, after discarding the aggregates by centrifugation.
  • recombinant fusion proteins visibly agglutinated the correct samples (those containing an antiserum for specific adhesin, or human serum antibodies specific for the HIV-1 peptide).

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Abstract

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología, en particular con el desarrollo de proteínas de fusión recombinantes basadas en adhesinas bacterianas y su uso en ensayos diagnósticos de hemaglutinación para la detección específica de anticuerpos o antígenos en sangre y otras muestras biológicas. Su objetivo técnico es obtener proteínas de fusión recombinantes, o conjugados bioquímicos, útiles para el desarrollo de sistemas simples de ensayo diagnóstico, basados en adhesinas bacterianas o sus dominios de interacción molecular con las células rojas. El uso de proteínas de adhesión de E. coli como base de proteínas recombinantes de fusión con actividad de unión a eritrocitos humanos, favorece las características de expresión en este hospedero, eliminando problemas potenciales en los rendimientos de producción asociados a la toxicidad bacteriana.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES BASADAS EN ADHESINAS BACTERIANAS PARA EL DESARROLLO DE ENSAYOS DIAGNÓSTICOS. Sector técnico
La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología, en particular con el desarrollo de proteínas de fusión recombinantes basadas en adhesinas bacterianas y su uso en ensayos diagnósticos de hemaglutinación para la detección específica de anticuerpos o antígenos en sangre y otras muestras biológicas. Técnica anterior Las cepas de bacterias entero-patogénicas poseen frecuentemente proteínas en su superficie que actúan como factores de adhesión (de aquí en adelante denominadas "adhesinas") y que le permiten a la bacteria adherirse a la células hospederas (Gaastra, W. y de Graaf, F.K. 1982. Microbiol. Rev. 46. 129- 161). En algunos casos, tal como el la cepa K88, la actividad adhesiva está asociada con la subunidad proteica predominante en estructuras tubulares poliméricas que posee en su superficie (que denominaremos indistintamente fimbria y pϊlus-pili) (Jacobs, A.A., Venema, J., Leevan, R., van Pelt-Heers-Chap, H. y de Graaf, F.K. 1987. 169. 735-741). En otros casos, tal como el de la fimbria Pap, esta funciona como soporte de los elementos adhesivos que se hallan en su extremo (Lindberg, F., Lund, B., Johanssen, L. y Normark, S. 1987. Nature. 328. 84-87). En fimbrias tipo I y X las subunidades responsables de la adhesión son también productos génicos diferentes de la proteína mayoritaria de los pili (Maurer, L. y Orndorff, P.E. 1987. J. Bacteriol. 169. 640-645; Hacker, J., Schmitd, G., Hughes, S., Knapp, S., Marget, M. y Goebel, W. 1985. Infect. Immun. 47. 434-440).
Las adhesinas bacterianas no siempre están ensambladas en estructuras con forma de pϊlus. Muchas adhesinas no se pueden visualizar utilizando técnicas de microscopía electrónica ordinarias, por lo que son entonces consideradas "no-pilus". La arquitectura de éstas no es bien conocida, pero se presupone que son proteínas asociadas a la superficie bacteriana como monómeros u oligómeros simples. En la naturaleza, muchos microbios pueden vivir en una gran variedad de nichos ecológicos, mientras que otros están restringidos a micro-ambientes específicos. El reconocimiento de los receptores en las células hospederas por adhesinas tanto del tipo püus como no pilus es un proceso muy bien afinado, que origina una interacción muy selectiva.
La bacteria Gram-negativa Escherichia coli (E. coli) puede colonizar el tracto intestinal de varios mamíferos y de otros vertebrados y causar un gran número de infecciones en ellos. Los pili adhesivos de las bacterias Gram- negativas generalmente adoptan dos morfologías básicas: (a) una estructura tubular con un diámetro de aproximadamente 7 nm ó (b) una fimbria flexible y fina con un diámetro de 2-5 nm (de Graaf, F. K. y Mooi, F. R. 1986. Adv. Microb. Phyisiol. 28. 65-143). Por ejemplo, los pili tipo 1 son estructuras tubulares que unen mañosa, y los pili P estructuras poliméricas helicoidales rígidas (Gong, M. y Makowski, L. 1992. J. Mol. Biol. 228. 735-742) que se unen al carbohidrato alfa-D-galactopiranosil-(l-4)-beta-D-galacto-piranósido (Gal(l-4)Gal) presente en las globoseries de los glicolípidos de las células que recubren el tracto urinario (Bock, K., Breimer, M., Hansson, G. C, Karlsson, K.A., Larson, G., Leffer, H., Samuelsson, B. E., Stomberg, N., Svanborg- Eden, C. y Turin, J. J. Biol. Chem. 260. 8545- 8551 ; Leffer, H. y Svanborg- Edén, C. 1980. FEMS Microbiol. Lett. 8. 127- 134; Stromberg, N., Nyholm, P.G., Pasher, I. y Normark, S. 1991. PNAS USA. 88. 9340- 9344). En contraste, otros pili, como son los que facilitan la colonización intestinal, y los que están asociados con E. coli productoras de entero toxinas, forman una estructura helicoidal abierta sin corte axial y, son por tanto estructuras más delgadas y menos rígidas (de Graaf, F. K. y Mooi, F. R. 1986. Adv. Microb. Phyisiol. 28. 65-143; de Gaaf, F. K., Klemm, P. y Gaastra, W. 1981. Infect. Immun. 33. 877- 883).
Los genes involucrados en la biosíntesis y expresión de los pili P están agrupados en una estructura de operón en el cromosoma bacteriano de cerca de 5- 10 % de los aislamientos de las E. coli fecales humanas y de hasta un 90% de las cepas aisladas del tracto urinario de niños con pielonefritis aguda (Hull, R.A., Gilí, R.E., Hsu, P., Minshaw, B.H. y Falkow, S. 1981. Infect. Immun. 33. 933-938; Lund, B., Marklund, B.I., Stromberg, N., Lindberg, F., Karlsson, K. A. y Normark, S. 1988. Nature. 328. 84-87; Marlund, B.I., Tennet, J.M., García, E., Hamers, A., Baga, M., Lindberg, F., Gaastra, W. y Normark, S. 1992. Mol. Microbiol. 6. 2225- 2242; Píos, K., Cárter, T., Hull, S., Hull, R. y Svanborg-Eden, C. 1990. J. Infect. Dis. 163. 549- 558). Se ha determinado la estructura completa del agregado génico pap, habiéndose demostrado que contiene 11 genes, cada uno de los cuales ha sido estudiado mediante análisis mutacional extensivo.
La adhesina Pap G es aparentemente una molécula con dos dominios. Los estudios de purificación de variantes de Pap G con el extremo amino terminal truncado, empleando cromatografía de afinidad con Gal (1-4) Gal, han demostrado que dicho dominio contiene el sitio de unión al receptor (Hultgren, S., Lindberg, F., Magnusson, G., Kihlberg, JM, Tennent, J.M. y Normark, S. 1989. PNAS USA. 86. 4357- 4361). Además, la fusión del extremo 5' del gen pap G, que codifica para el sitio de unión al receptor, con el gen que codifica para la proteína de unión a la maltosa, resultó en un producto final soluble que une tanto maltosa como Gal (l-4)Gal.
El dominio carboxilo-terminal de Pap G contiene la superficie de reconocimiento para la pro teína chaperona periplasmática Pap D. La interacción adhesina-chaperona es un prerequisito para la presentación de la adhesina en la superficie bacteriana, pues le permite ensamblarse en el pilus y que el dominio que contiene el sitio de unión al receptor se haga accesible para el reconocimiento de los receptores en las células eucariotas. La chaperona se une al dominio carboxilo terminal de Pap G de forma que no interfiere con la actividad de unión al receptor del dominio amino terminal (Hultgren, S., Lindberg, F., Magnusson, G., Kihlberg, J., Tennent, J.M. y Normark, S. 1989. PNAS USA. 86. 4357- 4361). La proteína Pap G posee virtualmente la misma especificidad y afinidad por la galabiosa cuando está unida a Pap D en estado de pre-ensamblaje, que cuando está presente en el extremo del püus (Hultgren, S., Lindberg, F., Magnusson, G., Kihlberg, J., Tennent, J.M. y Normark, S. 1989. PNAS USA. 86. 4357- 4361). La unión entre las E. coli pielonefríticas y los eritrocitos humanos P ha sido investigada usando varios análogos de receptores (Kilhberg, J., Hultgren, S.J., Normark, S. y Magnusson, G. 1989. J. Am. Chem. Soc. 1 11. 6364- 6368). Se encontró que la porción beta-galabiosa de los glicolípidos de los eritrocitos se une al extremo del pilus donde se localiza la adhesina Pap G formando puentes de hidrógeno dirigidos hacia cinco átomos de oxígeno situados a un borde del disacárido, y mediante interacciones hidrofóbicas con la cavidad apolar de la adhesina (Kilhberg, J., Hultgren, S.J., Normark, S. y Magnusson, G. 1989. J. Am. Chem. Soc. 111. 6364-6368). La F41 es una adhesina derivada del subgrupo O de E. coli, asociada con la diarrea en ovejas y terneros {E. coli enterotoxigénica, ETEC). Esta adhesina le proporciona a la bacteria una superficie antigénica y hemaglutinante que provoca adherencia a células intersticiales (Chien, S. 1975. En: D.M. Surgenor (ed.). The Red Blood Cell, vol. 2. Acad. Press, Inc. New York; Morris, J. A., Thorns, C. J., Scott, A.C., Sojka, W.J. y Wells, G.A. 1983. Infec. Immun. 36. 1 146-1153; Morris, J. A., Thorns, C. J., Scott, A.C., Sojka, W.J. y Wells, G.A. 1983. J. Gen. Microbiol. 129. 2753-2759). Este antígeno tiene una subunidad de peso molecular aproximado (Mw) de 29 500 daltons (Da), y ha mostrado ser protector en el modelo de ratón infante y en vacunaciones en cerditos (Morris, J. A., Thorns, C. J., Scott, A.C., Sojka, W.J. y Wells, G.A. 1983. Infec. Immun. 36. 1 146- 1153).
Se ha demostrado que la Glicoforina A (GFA), una glicoproteína mayoritaria en la membrana de los eritrocitos humanos, actúa como receptor de la E. coli IM 1 1 165 uropatogénica y para aquellas que expresan la adhesina F41 (Jokinen, M., Ehnholm, C.,. Visnen-Rhen, V., Korhonen, T., Pipkoru, R., Kalkkinen, N y Gamberg, C. G. 1985. Eur. J. Biochem. 147. 47-52; Vaisanen, V., Korhonen, T., Jokinen, M., Gamberg, C.G. y Ehnholm, C. 1982. Lancet i. 1192). La GFA pertenece a un grupo de sialoglicopéptidos encontrados en eritrocitos humanos. La GFA es el representante mayoritario de este grupo (cerca del 75 % del total), y está compuesta por una única cadena polipeptídica de 131 aminoácidos, y por carbohidratos que conforman hasta el 60% de su masa molecular. Los 70 aminoácidos del extremo amino-terminal sobresalen de la doble capa lipídica de la membrana, y 16 de ellos están unidos a carbohidratos. Se demostró que la capacidad de unión por F41 está aumentada para el grupo sanguíneo M. Se conoce que el polimorfismo sanguíneo M ó N radica en los primeros y quinto aminoácidos del extremo amino terminal de la cadena polipeptídica de la GFA (23). En la glicoforina MM, el extremo amino es una serina y una glicina ocupa la quinta posición, mientras que en la NN estas posiciones están cubiertas por leucina y ácido glutámico, respectivamente. La GFA aislada de individuos con subgrupo sanguíneo MN contiene cantidades equimolares de cada especie. En todos los casos, el segundo, tercer y cuarto aminoácido son O-glicosilados con un tetrasacárido que contiene dos residuos de ácido N- acetil neuramínico (NANA). Estos oligosacáridos inhiben la unión a GFA, pero NANA no está involucrado es esa unión.
A diferencia de la mayoría de las otras adhesinas de ETEC conocidas, que están codificadas por plásmidos, la F41 está codificada cromosomalmente. Los determinantes genéticos para F41 han sido clonados y expresados en E. coli K 12. Este operón contiene una porina de 86 kDa, una pro teína accesoria de 29 kDa, que puede actuar como una chaperona periplasmática, y el antígeno F41 de 29 kDa. Esta organización genética es similar a la reportada para otras adhesinas de fimbrias, tales como la K 88 y el pilus P.
Existen muchos sistemas diagnósticos de aglutinación en el mercado, para una gran variedad de enfermedades y estados. La gran mayoría emplea partículas de látex, recubiertas con antígenos ó anticuerpos, en correspondencia con la naturaleza específica del diagnóstico a realizar. La hemaglutinación, una técnica diagnóstica muy vieja, es también aún usada debido a su factibilidad y simplicidad.
Muy recientemente se ha desarrollado un nuevo tipo de ensayo que emplea la auto aglutinación de las células rojas de los individuos sometidos a la prueba. La base de este sistema es una molécula bivalente, formada por un anticuerpo (o uno de sus sitios de unión) específico para los eritrocitos, y por una porción antigénica de una agente infeccioso para el ser humano. Si estas moléculas se ponen en contacto con una pequeña muestra de sangre de un individuo seropositivo, los eritrocitos se aglutinarán en segundos debido a que los anticuerpos anti-antígeno actúan de puente entre las proteínas de fusión unidas a las células rojas por su(s) sitios(s) de unión. En una muestra de un individuo seronegativo no hay reconocimiento de antígeno y por lo tanto, no ocurre hemaglutinación.
El concepto de la auto -aglutinación de los eritrocitos de una muestra de sangre, usando un anticuerpo específico contra GFA conjugado a péptidos diagnósticos, ha sido desarrollado para la creación de un ensayo de detección de infección por VIH y es la base de un sistema diagnóstico comercial (SimpliRed. CSIRO. Australia).
A la "versión de primera generación" de este reactivo de auto-aglutinación, hecha por conjugación química de un anticuerpo específico contra GFA a péptidos de VIH- 1, han seguido trabajos de este mismo grupo empleando fragmentos recombinantes tipo Fab y Fv de simple cadena (scFv), específicos para GFA, unidos genéticamente a secuencias codificantes para péptidos diagnósticos de VIH- 1 y VIH-2 (Lilley, G., Dolezal, O., Hillyard, C.J., Bernard, C y Hudson, P.J. 1994. J. Immuno. Meth. 171 (2), 21 1-226).
Esta variante elimina en teoría las dificultades relacionadas con la conjugación bioquímica. En una conferencia reciente, Lilley y sus colaboradores (Lilley, G., Dolezal, O., Hillyard, C.J., Bernard, C y Hudson, P.J. 1994. J. Immuno. Meth. 171 (2), 21 1-226) reportaron la producción exitosa de tales proteínas de fusión, y presentaron datos sugestivos del mejor comportamiento diagnóstico de estas moléculas, en comparación con los conjugados bioquímicos. Este grupo ha realizado solicitudes de patente en Europa, Australia, los EE.UU y otros países para proteínas recombinantes bifuncionales como las descritas, específicamente dirigidas a dianas como el VIH, el HBsAg, el dímero D, y un antígeno canino (Lilley, G. et al. (1993) Reagent for agglutination assays. Solicitud de patente PCT: WO 93/24630. Diciembre 9). Descripción detallada de la invención
Para la construcción de las proteínas de fusión adhesina-péptido, se extrajo el contenido total de ADN de bacterias pifiadas. Estos ADNs se usaron como moldes para reacciones específicas de amplificación de los genes que codifican para las proteínas F41 y Pap G (específicas para la GFA humana y el antígeno P de células rojas humanas, respectivamente). En estos experimentos se utilizaron tanto la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) como un conjunto de oligonucleótidos sintéticos diseñados sobre la base de las secuencias de ADN publicadas para estas dos proteínas.
Los genes amplificados se clonaron en tres vectores de expresión diferentes, junto a una secuencia 3' codificante para el péptido diagnóstico de gp41del VIH- 1. La secuencia de este péptido de 16 aminoácidos se emsambló previamente "in vitro" a partir de dos secuencias sintéticas complementarias, y luego se ligó a los productos de RCP clonados. Los primeros dos vectores de expresión, desarrollados en nuestro laboratorio y denominados pPACIB.7+ y pPACIB.9+, contienen un operón que incluye un promotor triptófano inducible [tryp), un péptido señal para secreción periplasmática (ompA) en pPACIB.7+, un peptido de 26 aminoácidos de la Interleucina 2 Humana en pPACIB.9+, una secuencia de seis histidinas para la purificación por Cromatografía de Afinidad por Iones Metálicos Inmovilizados (IMAC), y un terminador de la transcripción del fago T4, todo sobre la base de un plásmido pBR322. El tercer plásmido empleado en nuestros experimentos fue el vector pQE 60 de Qiagen, que contiene el promotor del fago T5 y dos operadores lac, un sitio sintético de unión al ribosoma, una secuencia 3' de histidinas y dos terminadores fuertes de la transcripción, sobre una base pBR322.
Todas las construcciones genéticas, ligadas al vector de expresión correspondiente, se emplearon para transformar células competentes XL 1- Blue, de Stratagene. Las colonias que crecieron en medio sólido selectivo se evaluaron de acuerdo a sus patrones de digestión con enzimas de restricción. El ADN plasmídico extraído de clones seleccionados se sometió a secuenciación. Los plásmidos seleccionados, denominados pPAP-HIVs y pF41-HIVs para las construcciones de expresión soluble en periplasma, y pPAP-HIVi y pF41-HIVi para las construcciones de expresión citoplasmática, se usaron para transformar diferentes cepas de E. coli y realizar los estudios de expresión correspondientes .
En el sobrenadante de cultivo y en la fracción periplasmática de las células transformadas con los plásmidos derivados del vector pPACIB.7+ se identificaron nuevas proteínas solubles de tallas aproximadas a 35 kDa (para pPAP-HIVls) y 31 kDa (para pF41-HIV), mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Utilizando Western blot y antisueros específicos contra estas adhesinas se demostró que estas proteínas se correspondían con la fusión de las adhesinas Pap G y F41 al péptido de VIH- 1.
En el caso del estudio de expresión para las proteínas de fusión en el citoplasma bacteriano, usando pPACIB.9+ y pQE 60 como vectores, se detectaron en SDS-PAGE altos niveles de nuevas proteínas intracelulares con pesos moleculares aparentes cercanos a los esperados. Estas proteínas también se reconocieron específicamente en Western blot por antisueros para las adhesinas y contra el péptido de VIH- 1.
Las proteínas de fusión recombinantes se extrajeron de la fracción periplasmática mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación, ó del citoplasma bacteriano por sonicación y agentes solubilizantes. Las cuatro proteínas de fusión fueron purificadas por IMAC usando Cu+2 ó Ni +2 como metales de transición y un gradiente de pH para la elución. El replegamiento in vitro de las dos proteínas citoplásmicas se realizó mediante diálisis controlada en tampones redox.
En el caso de la estrategia de expresión en levaduras, los insertos génicos de ambas proteínas de fusión fueron clonados in el vector de InVitrogen para Pichia pastoris pHIL-Sl . Se preparó DNA plasmídico de células bacterianas que portaban los vectores recombinantes, se linealizó, se electroporó en Pichia pastoris y se sembraron en medio selectivo. Los clones de levaduras positivos fueron identificados por RCP de colonias para precisar integración y sometidos a condiciones de inducción. Contenido celular y sobrenadante de cultivo fuéevaluado por SDS-PAGE y Western blot para la expresión de las dos proteínas de fusión. Las cuatro proteínas de fusión purificadas y las dos impuras provenientes de levadura se ensayaron para su capacidad de aglutinación utilizando suspensiones de eritrocitos humanos O+ a las cuales se les añadió: (a) un antisuero específico contra cada adhesina, (b) un suero humano conteniendo anticuerpos específicos contra el péptido de 15 aminoácidos del VIH 1 , o (c ) un an ti suero no relacionado. Las proteínas de fusión produjeron un aglutinación visible de los eritrocitos en las muestras de células rojas conteniendo el antisuero específico contra la adhesina en cuestión, y el suero humano específico contra el péptido. Finalmente, las seis proteínas de fusión se evaluaron para la aglutinación de muestras directas de sangre provenientes de individuos seropositivos y seronegativos para VIH- 1 , empleando diferentes diluciones tanto de las proteínas purificadas como de las muestras de sangre. Se observó una aglutinación visible en todas las muestras de sangre de seropositivos. Las proteínas de fusión no aglutinaron los eritrocitos de los donantes seronegativos que se utilizaron como controles negativos.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
EJEMPLO 1
Amplificación de los genes que codifican para las adhesinas F41 y Pap G de bacterias E. coli pifiadas, utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(RCP). Clonaje y secuenciación de bases.
Procedimiento (a). Purificación del ADN.-
Se purificó el ADN total (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En:
Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) de ETEC 1593 (K99-, F41+) para la adhesina F41 , y de E. coli J96 para la Pap G.
Procedimiento (b). Amplificación de ADN.-
Se utilizó la técnica de la RCP para la amplificación específica de los genes de las adhesinas F41 y Pap G, desde el primer aminoácido reportado para cada proteínas maduras, hasta los respectivos codones de parada. Los oligonucleótidos sintéticos se diseñaron basados en las secuencias reportadas para ambos genes (Lund, B., Lindberg, F., Marklund, B-I. y Normark, S. 1987. PNAS USA. 84. 5898-5902; Anderson, D. y Moseley, S. 1988. J Bacteriol. 170. 4890-4898), e incluyeron sitios de restricción convenientes para el clonaje (Tabla 1). Las condiciones de la RCP se optimizaron para cada gen por separado. Tabla 1.- Oligonucleótidos sintéticos utilizados para la amplificación específica por RCP de los genes que codifican para las adhesinas F41 y Pap
Oligo No. 1.- 5' gen Pap G. Cía I.
5' ...CCATCGATG AAA AAA TGG TTC CCT GCT TTT TTA.. Oligo No. 2.- 5' gen Pap G. EcoR 1/ Neo I.
5M ..CG GAATTCT T CCATGG GA TGG CAC AAT GTC ATG TTT TAT GC.
Oligo No. 3.- 3' gen Pap G . Eco RV. Antisentido.
5' ...GG GATATC GGG GAA ACT CAG AAC CAT AGT C.
Oligo No. 4.- 5' gen F41. Cía I. 5X.. CCATCGATG AAA AAG ACT CTG ATT GCA CTG GCT G..
Oligo No. 5.- 5' gen F41. EcoRI/ Neo I.
5' ...CG GAATTCT T CCATGG CT GCT GAT TGG ACG GAA GGT C.
Oligo No.6.- 3' gen F41. EcoRV. Antisentido.
5' ...GG GATATC ACC CGC AAC ATC CTT ATT TAA ATT C. Nota: Los sitios de restricción aparecen subrayados.
Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron de geles de agarosa de bajo punto de fusión, usando fenol saturado para la extracción, y finalmente se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas para su clonaje en los vectores de expresión (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Procedimiento (c). Clonaje de los genes de las adhesinas obtenidos por amplificación, en el vector plasmídico diseñado para expresión periplasmática. El vector pPACIB.7+ (véase ref. 30 para un vector relacionado) se digirió EcoRI-EcoRV (o Clal-EcoRV), y se ligó a los insertos obtenidos por RCP en dos reacciones separadas: (1) pPACIB.7+ + Pap G, y (2) pPACIB.7+ + F41. Los productos de las reacciones de ligazón se emplearon para la transformación de E. coli competentes (cepa XL- 1 Blue), que luego se plaquearon en medio sólido selectivo y se crecieron durante 16 horas a 37°C (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Los plásmidos recombinantes fueron seleccionados después de la purificación del ADN plasmídico a partir de varias colonias, y el correspondiente chequeo por digestión con enzimas de restricción para los productos de ligazón esperados (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). En este análisis se obtuvieron bandas de 3 kb correspondientes al vector pPACIB.7+ linealizado y bandas de 1 kb y 630 pb para los genes Pap G y F41, respectivamente.
Se secuenciaron por métodos convencionales (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) no menos de tres clones para cada adhesina. La secuencias se realizaron mediante la desnaturalización de ambas cadenas de la doble hélice del ADN plasmídico mediante tratamiento con NaOH 10 N, y de acuerdo al método de Sanger (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los genes se secuenciaron en las dos direcciones utilizando cebadores específicos diseñados para este propósito que hibridizan externamente a las regiones de clonaje del vector pPACIB.7+. Las secuencias obtenidas para los genes de las adhesinas amplificadas y clonadas concordaron con las reportadas en la literatura para Pap G y F41 (Lund, B., Lindberg, F., Marklund, B-I. y Normark, S. 1987. PNAS USA. 84. 5898-5902; Anderson, D. y Moseley, S. 1988. J Bacteriol. 170. 4890-4898). Procedimiento (d). Clonaje de los genes de adhesinas obtenidos por amplificación, en el vector plasmídico diseñado para expresión intracelular.
El vector pQE 60 (Qiagen) fué digerido NcoI-BamHI. Los vectores pPACIB.7+ conteniendo cada los insertos de cada adhesina, también fueron digeridos NcoI-BamHI. Los fragmentos de ADN de 1 kb (Pap G) y 630 pb (F41) se purificaron de geles de agarosa de bajo punto de fusión y ligaron al vector pQE 60 (Qiagen), preparado previamente. Los productos de esta ligazón se utilizaron para la transformación de células competentes de la cepa XL 1 Blue, las que posteriormente se plaquearon en medio semisólido selectivo y crecieron por 16 horas a 37°C (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los plásmidos recombinantes se seleccionaron después de la purificación del ADN plasmídico de varias colonias y su digestión con enzimas de restricción (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) para chequear los productos de ligazón esperados, es decir, una banda de 3.5 kb correspondientes al vector pQE 60 linealizado, y bandas correspondientes a 1 kb y 630 pb para los genes Pap G y F41, respectivamente. EJEMPLO 2.-
Construcción de las proteínas de fusión adhesinas-péptido de VIH- 1. Procedimiento (a). Construcción de los genes fusionados. Los dos oligonucleótidos que codifican para el péptido de 15 aminoácidos de la gρ41 del VIH- 1 (Tabla 2) se hibridizaron a 70°C y fosforilaron usando PNK (27). Los plásmidos pPAPs, pF41s, pPAPi y pF41I se digirieron Sall-Apal y ligaron al ADN ensamblado. Los productos de la ligazón se emplearon para transformar células competentes de E. coli (XL- 1 Blue), que se plaquearon en medio semisólido selectivo y crecieron durante 16 horas a 37°C (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratoiy Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los plásmidos recombinantes se seleccionaron después de la purificación del ADN plasmídico de varias colonias y su digestión con enzimas de restricción (Sambrook, J., Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los clones con patrones de restricción esperados se secuenciaron como se describió en el Ejemplo 1. Tabla 2. Oligonucleótidos sintéticos para el ensamblaje del gen codificante para el péptido de 15 aminoácidos del VIH- 1.
Oligo No.7. Péptido de VIH- 1 , sentido
5' ...TCGAC GAT CAG CAG CTG CTG GGC ATC TGG GGC TGC AGC GGT AAA CTG TGC GGGCC...3' Oligo No. 8. Péptido de VIH- 1, antisentido
5' ...C GCA CAG TTT ACC GCT GCA GCC CCA GAT GCC CAG CAG CTG CTG ATC G...3'
Procedimiento (b). Expresión de los genes fusionados en E. coli.
Las mismas cepas bacterianas evaluadas para la expresión de las adhesinas fueron evaluadas para las cuatro construcciones genéticas descritas en el
Procedimiento (a). Básicamente, las bacterias recombinantes se crecieron por 16 horas a 37°C en medio líquido (LB) con ampicillina (Sambrook, J.,
Fritisch, E.F. y Maniatis, T. 1989. En: Molecular Cloning. A laboratory
Manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Posteriormente se inocularon cultivos frescos en LB más ampicillina, que se incubaron tres horas a 37°C. La expresión de las proteínas de interés se indujo añadiendo a los cultivos ácido beta-indoleacrílico para las construcciones de expresión periplásmica, o IPTG para las construcciones de expresión en citoplasma. Las muestras bacterianas se analizaron en SDS- PAGE al 15% observándose en estas condiciones la expresión de proteínas nuevas con pesos moleculares compatibles con los esperados. La expresión fué confirmada por Western blot utilizando un antisuero humano específico contra el péptido del VIH- 1 , pre-adsorbido contra otras proteínas de E. coli para evitar señales inespecíficas.
EJEMPLO 3.- Clnaje de las proteínas de fusión en el vector de expresión de Pichia pastoris pHIL-S l y generación de las levaduras recombinantes.
Procedimiento (a). Amplificación del ADN.-
Se hizo RCP con los oligonucleótidos presentados en la Tabla III sobre los genes de las proteínas de fusión F41-VIH y PapG-VIH clonados en los vectores para expresión en bacteria descritos anteriormente. De esta forma se introdujeron los sitios de restricción requeridos.
Tabla 3. Oligonucleótidos sintéticos para el clonaje en el vector de levaduras.
Oligo No. 9. PapG. EcoRI sentido.
5 ..CG GAATTCT CCA TGG GAT GGC ACÁ ATG TCA TGT TTT ATG C... Oligo No. 10. F41. EcoRI sentido.
5 ..CG GAATTCT CCA TGG CTG CTG ATT GGA CGG AAG GTC. Oligo No. 11. Terminador T4 antisentido.
5M ..GGT CAT TCA AAA GGT CAT CCA C
Procedimiento (b). Clonación de Los genes F41-VIH y PapG-VIH en el vector. pHIL-Sl
El vector pHIL-S l se digirió EcoRI BamHI y se ligó con el inserto de previamente digerido en reacciones separadas. (A) pHIL-S l+ F41-VIH, (B) pHIL-S l+ PapG-VIH.
Los productos de esta ligazón se usaron para transformar células competentes Top 10, las cuales se plaquearon en medio semisólido selectivo y se crecieron a 37 C durante toda la noche. Se seleccionaron diez colonias resistentes a amplicilina, se inocularon en medio LB con 50 μg/ml de ampicillina y se crecieron a 37 C durante toda la noche con agitación. El plasmidio purificado se digirió con enzimas de restricción [para verificar la presencia de productos de ligazón esperados. Se seleccionaron un mínimo de tres clones diferentes para cada gen de fusión y se secuenciaron usando Los oligonucleótidos 5' AOX1 y 3' AOX1.
Procedimiento (c). Transformació de la cepa de Pichia pastoris GS115. Los plásmidos con Los genes F41-VIH y PapG-VIH en la orientación correcta se prepararon para transformar en Pichia pastoris mediante la digestión del sitio único Stu I y extracción con fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (24:25: 1). El ADN precipitado se resuspendió en diez μl de TE. Las células GS 115 se crecieron durante toda la noche a 30 C y se prepararon para la electroporación. Diez μl de ADN se usaron para electroporar (BioRad Gene Pulser). Las células elecxtroporadas se plaquearon en medio mínimo de Dextrosa (MD) y se crecieron a 30 C hasta que las colonias fueron visibles.
Procedimiento (d). Pesquisaje y confirmación de integración en tranformantes His+ para cepas Mut+ y MutS.-
La transformación de la cepa GS115 con las construcciones linealizadas Stul favorecen la recombinación en el locus His4. Se identificaron transformantes Mut+ y MutS mediante plaqueo con réplica en medio MD y Metanol mínimo (MM). Se evaluaron diez transformantes de cada construcción y todos fueron Mut+. La confirmación de la integración de realizó mediante RCP con "Hot Start". Los cebadores 5'AOXl y 3'AOXl amplificaron las bandas clonadas. Cinco y siete de Los diez clones estudiados para PapG-VIH y F41-VIH, respectivamente mostraron las bandas de 1Kb y 700 bp indicativas de integración. EJEMPLO 4.-
Expresión de las proteínas de fusión Adhesina-Péptido VIH en Pichia pastoris.
Procedimiento (a). Crecimiento de Los recombinantes His+ Mut+ en medio glicerol tamponado (BMGY) e induction. Los cinco y siete transformantes positivos por RCP de F41-VIH y PapG-VIH se crecieron en diez mi de BMGY a 30 C hasta una DO final de 2-6. Las células se cosecharon en medio metanol hasta IDO e incubaron a 30 C con agitación. Se tomaron muestras para análisis cada 24 horas durante cuatro días, ada 24 horas de añadió metanol hasta una concentración final de 0.5 % para mantener la inducción.
Procedimiento (b). Análisis de la presencia de las proteínas de fusión en sobrenadante de cultivo mediante SDS PAGE y Western blot.- Se centrifugó un mi de cultivo en cada punto experimental y el sobrenadante se transfirió a un tubo separado para el análisis de la expresión. Las muestras se concentraron previamente diez veces por precipitación con 100% TCA. El análisis de las muestras en geles de 15% SDS-poliacrilamida indicó que en esas condiciones se expresaron nuevas proteínas cuya talla molecular corresponde con la esperada. La expresión se confirrmó por análisis de Westrn blot con un suero humano específico para el péptido del VIH.
EJEMPLO 5.- Producción de las proteínas de fusión a partir de los cultivos bacterianos, renaturalización, y ensayos de especificidad de las proteínas de fusión bacterianas y de levaduras con eritrocitos humanos.
Procedimiento (a). Extracción de las proteínas de fusión citoplasmáticas (pPAP HIVi y pF41 HlVi).- Las bacterias recombinantes portadoras de los plásmidos diseñados para la expresión en citoplasma se sometieron a un proceso de inducción como descrito antes, luego del cual se lisaron mediante ultrasonido y se separaron las fracciones soluble e insoluble. Se comprobó por Western blot con ambas fracciones que las dos proteínas recombinantes de fusión estabas asociadas a la fracción celular insoluble. Las proteínas específicas se separaron del resto de los contaminantes empleando un agente cao trópico solubilizante, y se dializaron contra 0.1 M de fosfato de sodio y 0.5 M de NaCl, pH 8.0 (tampón de acoplamiento) antes de pasar al proceso de purificación.
Procedimiento (b). Extracción de las proteínas de fusión a partir de periplasma (pPAP HIVs y pF41 HIVs).-
Para la extracción de las proteínas recombinantes de fusión expresadas en el periplasma, las células conteniendo los productos recombinantes se congelaron y descongelaron por tres veces consecutivas, tras lo cual se centrifugaron, se recuperó el sobrenadante conteniendo las proteínas de fusión, y se dializaron contra 0.1 M de fosfato de sodio y 0.5 M de NaCl, pH 8.0 (tampón de acoplamiento) antes de pasar al proceso de purificación. Procedimiento (c). Purificación de las proteínas de fusión utilizando cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC).-
Para la purificación se aprovechó la presencia del dominio de histidinas en las proteínas recombinantes. Estas secuencias confieren a las proteínas una afinidad muy alta por iones metálicos (por ejemplo, Zn+2, Cu+2> Ni+2) que pueden ser quelados a diferentes soportes cromatográficos, posibilitando una purificación fácil y reproducible.
Las preparaciones conteniendo las proteínas de fusión obtenidas por los procedimientos descritos en los incisos (a) y (b) se aplicaron directamente a matrices de Sefarosa-IDA-Cu+2 ó Ni+2. Una vez acopladas las proteínas, los geles se lavaron primero con 10 veces su volumen empleando tampón de acoplamiento ajustado a pH 6.3, y seguidamente y de forma similar con el tampón ajustado a pH 5.0 (para la elución de proteínas contaminantes de E. coli). La elución de las proteínas de fusión se realizó a pH 4.0 con la misma solución, neutralizando los eluatos de inmediato con Tris-base.
Procedimiento (d). Renaturalización de las proteínas de fusión expresadas en el citoplasma (pPAP HIVi y pF41 HIVi).
Las proteínas de fusión citoplasmáticas pPAP HIVi y pF41 HIVi se renaturalizaron mediante una diálisis extensiva a 4°C, en un tampón redox diseñado al efecto, luego de una reducción total con DTT. Las preparaciones de proteínas se concentraron por ultrafiltración, luego de descartar los agregados mediante centrifugación.
Procedimiento (e) Ensayo de agglutinación utilizando eritrocitos humanos. Las proteínas de fusión bacterianas purificadas y Los sobrenadantes de levaduras recombinantes, se ensayaron para su capacidad de aglutinar eritrocitos humanos. Se prepararon diluciones dobles sucesivas de las proteínas de fusión en PBS (a partir de una concentración inicial de 100 ug/ml), en los pozos de placas de micro titulación, y a un volumen final de 50 ul por pozo. Se le adicionaron entonces a cada pozo 50 ul de una suspensión 1% (vol/vol) de eritrocitos humanos 0+, mezclados con antisueros específicos para cada adhesina, con un antisuero humano conteniendo anticuerpos específicos para el péptido de VIH- 1 , o un antisuero no relacionado. Las placas se incubaron entre 1 y 5 minutos a temperatura ambiente y luego se evaluaron de forma visual. Se encontró que las proteínas de fusión recombinantes aglutinaron de manera visible las muestras correctas (las que contenían un antisuero para contra la adhesina específica, o el anticuerpos de suero humano específicos para el péptido de VIH-1).
Procedimiento (f) Ensayo de aglutinación usando directamente sangre humana.
Diluciones doble sucesivas en PBS de las soluciones de las proteínas de fusión (con una concentración inicial de 100 ug/ml), se dispensaron a razón de 50 ul/pozo en placas de micro titulación. Posteriormente, se adicionaron 50 ul de una dilución de sangre fresca proveniente de individuos seropositivos o seronegativos al VIH-1 , en cada pozo. Las placas se incubaron entre 1 y 5 minutos a temperatura ambiente y se evaluaron de forma visual. Todas las preparaciones de las proteínas de fusión mostraron una actividad de aglutinación específica (sólo en los individuos seropositivos) para diluciones definidas de la sangre y de la proteína de fusión.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión caracterizada por estar compuesta por al menos una adhesina bacteriana capaz de unirse específicamente a la superficie de las células rojas humanas y un polipéptido capaz de ser reconocido como un antígeno.
2. Una proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque la parte con actividad de unión a la célula roja de la sangre está restringida sólo a uno o varios de los dominios originales de la molécula adhesina bacteriana.
3. Una pro teína de fusión según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque la parte con actividad de unión a la célula roja de la sangre puede ser originada o modificada opcionalmente mediante la tecnología de ADN recombinante.
4. Una pro teína de fusión según la reivindicación 1, caracterizada porque la parte no adhesina de la molécula puede ser opcionalmente uno a más sitios de unión de un anticuerpo.
5. Una pro teína de fusión según las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque es obtenida mediante tecnología de ADN recombinante o mediante el acoplamiento químico de moléculas producidas individualmente.
6. Una proteína según las reivindicaciones de la 1 a la 5 caracterizada porque es útil como reactivo para el desarrollo de ensayos de aglutinación de células rojas de la sangre.
7. Una pro teína según la reivindicación 6 caracterizada porque ésta puede ser detectada visualmente o empleando equipamiento apropiado.
8. Uso de la pro teína de fusión según las reivindicaciones de la 1 a la 7 en la obtención de un reactivo útil para el desarrollo de ensayos de aglutinación de células rojas de la sangre.
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