WO1998037420A1 - Verfahren zum erkennen einer erkrankung eines organismus an einer transmissiblen spongiformen enzephalopathie - Google Patents

Verfahren zum erkennen einer erkrankung eines organismus an einer transmissiblen spongiformen enzephalopathie

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WO1998037420A1
WO1998037420A1 PCT/EP1998/001041 EP9801041W WO9837420A1 WO 1998037420 A1 WO1998037420 A1 WO 1998037420A1 EP 9801041 W EP9801041 W EP 9801041W WO 9837420 A1 WO9837420 A1 WO 9837420A1
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blood serum
protein
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disease
subunit
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PCT/EP1998/001041
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Markus Otto
Jens Wiltfang
Ekkehard Schütz
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Markus Otto
Jens Wiltfang
Schuetz Ekkehard
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the invention relates to a method for recognizing a disease of an organism from a transmissible spongiform encephalopathy, the concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100 in a body fluid of the organism being determined in vitro and the exceeding of a limit concentration of the ⁇ -subunit of the S100 protein is taken as an indication of the presence of the disease.
  • the transmissible spongiform encephalopathies include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans, scraping in sheep and goats and bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle.
  • CJD Creutzfeldt-Jakob disease
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • NVCD new form of Creutzfeldt-Jakob disease
  • Creutzfeldt-Jakob disease or BSE disease Treatment of Creutzfeldt-Jakob disease or BSE disease is currently not possible. However, it is possible to treat the symptoms of Creutzfeldt-Jakob disease and to delay the progression of the disease. Early detection of the disease is therefore desirable. It is also important to safely rule out other causes of dementia. The early detection of any disease of transmissible spongiform encephalopathy is of particular importance, but also when researching the possible transmission routes.
  • a quantitative immuno-luminescence serum test for the protein S100 is marketed by AB Sangtec Medical, Bromma, Sweden, under the trade name LIA-mat Sangtec 100.
  • the serum test is suitable for use in cerebrospinal fluid as well as in blood serum.
  • the protein S100 is an acidic calcium-binding protein with a molecular weight of 21,000, which occurs naturally as homodimer and heterodimer of two subunits ⁇ S100 and ßSlOO.
  • the ß subunit (SS100) occurs specifically only in glial cells and Schwann cells of the brain.
  • the well-known serum test only reacts to the ß subunits (ßSlOO).
  • Protein S100 is known to have a biological half-life of two hours due to its degradation by the kidneys. In the case of temporary brain damage, the concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100 in the cerebrospinal fluid and the blood serum therefore drops sharply within a short time.
  • the invention has for its object to develop a method of the type described above so that it can be carried out with less effort.
  • the extraction of cerebrospinal fluid is fundamentally complex. In cattle, it is associated with considerable difficulties.
  • this object is achieved in a method of the type described in the introduction in that the body fluid is a blood serum of the organism.
  • the concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100 in the blood serum is determined, conspicuous concentrations can be detected if there is a disease of transmissible spongiform encephalopathy.
  • the increased concentrations of the ⁇ -subunit of the protein S100 in the blood serum are not observed in every case of a disease of transmissible spongiform encephalopathy, and they are also not restricted to such a disease.
  • the determination of the concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100 in the blood serum is simply a very effective addition to the previous differential diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies.
  • the limit concentration that speaks in the new method for the presence of a disease in transmissible spongiform encephalopathy is between 150 and 300 pg / ml blood serum. As the limit concentration increases, the specificity of the criterion is naturally increased, but its sensitivity is reduced.
  • the range of 150 to 300 pg / ml blood serum takes into account the fact that in different organisms, i.e. H. For example, different animal species that fluctuate within certain limits due to the general composition of the blood serum, which indicates the presence of a transmissible spongiform encephalopathy limit concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100.
  • a reasonable limit concentration is between 180 and 260 pg / ml blood serum and preferably 220 pg / ml blood serum, i.e. H. between 200 and 240 pg / ml blood serum.
  • the limit concentration of 220 pg / ml blood serum has shown a sensitivity of about 76% of all definitive and probable cases of Creutzfeldt-Jakob diseases and a specificity of over 82% when testing the new method.
  • the positive predictive value was 86% and the negative predictive value was 70%.
  • a reasonable limit concentration is 500 pg / ml blood serum, i.e. H. between 400 and 600 pg / ml blood serum.
  • the sensitivity and, above all, the specificity of the new method can be significantly increased if the concentration of the ⁇ -subunit of the protein S100 in blood sera taken from the organism at different times determines, whereby only a continuous exceeding of the limit concentration indicates the existence of the disease is evaluated.
  • a quick one A drop in the concentration of the SlOO protein indicates a temporary, harmful effect on the brain.
  • transmissible spongiform encephalopathy however, the damage to the brain progresses with the known fatal consequences. This is in line with persistent high concentrations of the ⁇ -subunit of the protein SlOO in blood sera taken from the organism at different times. Due to a larger number of blood sera from the same organism, it is also easier to recognize and separate out low individual values, which has a positive effect on the sensitivity of the new method.
  • the concentration of the ⁇ -subunit of the protein SlOO in the blood serum must be determined with a detection limit and a resolution of better than 100 pg / ml blood serum.
  • a detection limit and a resolution of better than 50 pg / ml blood serum, preferably at least 20 pg / ml blood serum should be used.
  • the known quantitative immune-luminescence serum test for the protein SlOO with antibodies to the ⁇ -subunit of the protein SlOO can be used.
  • the ⁇ -subunits of the SlOO protein are fixed in a first incubation step on antibodies which are themselves fixed and in a second incubation step are labeled with antibodies which are in turn labeled, the antibodies being monoclonal antibodies SMST 12, SMSK 25 and SMSK 28.
  • the blood serum of 224 patients who were suspected of Creutzfeldt-Jakob disease was examined. In 65 cases the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease was confirmed neuropathologically, 43 cases were probable diseases, 36 cases were possible diseases, 6 cases were genetic diseases and 74 patients had other diseases associated with dementia. In addition to these 224 cases, the blood serum of 35 patients with non-dementia diseases was examined, which can be regarded as a control sample.
  • a classification as probable Creutzfeldt-Jakob disease was made if there was progressive dementia of less than two years and if there were typical EEG changes [periodic Sharp-Wave complexes (PSWC)] and if at least two of the following four clinical ones Criteria were met:
  • a possible Creutzfeldt-Jakob disease was assumed if there was progressive dementia of less than two years and if of the four clinical ones mentioned above Symptoms 1 to 4 were given at least two, but there was no atypical EEG or no EEG at all. All other cases were classified as other diseases.
  • Blood serum samples were taken from the patients and cooled to -80 ° C within 24 hours. The concentration of the ⁇ -subunit of the protein SlOO in the blood sera was carried out using a quantitative immuno-luminescence serum test (LIA-mat Sangtec 100 from AB Sangtec Medical, Bromma, Sweden). This serum test is commercially available. It is a two-sided antibody test (sandwich principle) with monoclonal antibodies.
  • the ⁇ -subunits of the SlOO protein are bound to a substrate and in the second step marked with a tracer, which is a luminescence tracer.
  • the serum test is evaluated using a LIA mat luminescence analyzer from Byk Sangtec using the standards supplied with the LIA-mat Sangtec 100 serum test. The serum test was carried out exactly according to the instructions for use attached to it, to which express reference is made here.
  • the attached boxplot diagram shows the concentrations of the ⁇ -subunit of the protein SlOO in the blood serum for the definitive and probable CJD cases, the possible CJD cases, the other dementia and the non-dementia cases.
  • the 10th, 25th, 50th, 75th and 90th percentiles are given in the box plots of the ßSOO concentrations, as well as the individual values which lie outside these ranges, in particular the concentrations of the ß-subunit of the protein S100 were in the definitive and probable CJD cases, graphically summarized, between 95 pg / ml blood serum and 2016 pg / ml blood serum.
  • the mean was 493 pg / ml blood serum and the standard deviation was 386 pg / ml blood serum.
  • the concentrations were between 120 pg / ml blood serum and 2016 pg / ml blood serum with an average of 552 pg / ml blood serum and a standard deviation of 440 pg / ml blood serum.
  • the ßSlOO concentrations were between 95 pg / ml blood serum and 1199 pg / ml blood serum with an average value of 405 pg / ml blood serum and a standard deviation of 269 pg / ml blood serum.
  • the ßSlOO concentration was between 0 pg / ml blood serum and 742 pg / ml blood serum, the mean value being 194 pg / ml blood serum and the standard deviation being 178 pg / ml blood serum.
  • the genetic cases are not listed in the boxplot diagram. These were two cases of fatal familial insomnia (FFI), in which ßSlOO concentrations of 0 pg / ml blood serum and 22 pg / ml blood serum were found.
  • FFI fatal familial insomnia
  • a patient with an insert mutation had a concentration of the ⁇ -subunit of the protein SlOO of 178 pg / ml blood serum.
  • a patient with Gerstmann-St syndrome (GSS) and two patients with a V 2001 mutation had ßSlOO concentrations of 1434 pg / ml, 296 pg / ml and 757 pg / ml blood serum.
  • the attached Kaplan-Meier curves show the survival rates of CJD sufferers who were classified into three different groups according to the initially detectable concentration of the ⁇ -subunit of the protein SlOO in blood serum.
  • the course of the Kaplan-Meier curves shows an interaction between the concentration of ßSlOO and the medium-term mortality.
  • the medium-term mortality is higher the higher the initial concentration of ßSlOO.
  • a higher concentration of ßSlOO tends to indicate that the disease has already progressed; or vice versa, the concentration of ßSlOO increases with the progress of the CJD disease.
  • Table III documents the applicability of the quantitative examination of the blood serum to the ⁇ -subunit of the protein SlOO to detect scrapie disease (a transmissible spongiform encephalopathy) in hamsters.
  • the sample included five blood sera from five diseased animals, partially intracerebral and partially abdominally infected, and five blood sera from healthy animals as a control.
  • a limit of 500 pg / ml results in a sensitivity of 80% and a specificity of 100%. There is no difference between the intracerebral and the abdominally infected animals.

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Abstract

Ein Verfahren dient zum Erkennen einer Erkrankung eines Organismus an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie. Bei dem Verfahren wird in vitro die Konzentration der β-Untereinheit des Proteins S100 (βS100) in einem Blutserum des Organismus bestimmt. Das Überschreiten einer Grenzkonzentration der β-Untereinheit des Proteins S100 wird als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet.

Description

Verfahren zum Erkennen einer Erkrankung eines Organismus an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erkennen einer Erkrankung eines Organismus an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, wobei in vitro die Konzentration der ß-Unter- einheit des Proteins S100 in einer Körperflüssigkeit des Organismus bestimmt wird und wobei das Überschreiten einer Grenzkonzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet wird.
Zu den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien gehören die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, die Traberkrankheit bei Schafen und Ziegen und die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind. Das Entstehen der BSE-Krankheit wird auf das Verfüttern von Tiermehl aus an der Traberkrankheit erkrankten Schafen zurückgeführt. Es besteht der Verdacht, daß eine neue Form (NVCD) der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit durch Kontakt mit BSE-erkrankten Rindern und/oder den Verzehr von Teilen solcher Rinder beim Menschen ausgelöst werden kann.
Eine Behandlung der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit oder der BSE- Krankheit ist derzeit nicht möglich. Es ist aber möglich, die Symptome der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit zu behandeln und das Fortschreiten der Krankheit zu verzögern. Von daher ist eine Früherkennung der Krankheit wünschenswert . Daneben ist es wichtig, andere Ursachen einer auftretenden Demenz sicher auszuschließen. Besondere Bedeutung hat die Früherkennung jeglicher Erkrankung an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie aber auch bei der Erforschung der möglichen Übertragungswege .
Eine absolute Diagnose auf das Vorliegen einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie ist derzeit nur durch einen neuro- pathologischen Nachweis der pathologischen Isoform des Prion- Proteins im befallenen Gehirngewebe möglich (Prion= Protein- aceous infective Agent) . Die Diagnose intravitam ist nur differenziell möglich. Sie erfolgt anhand von klinischen und elektroencephalographischen Kriterien. Das Diagnoseergebnis kann durch biochemischen Analysen abgesichert werden. Derzeit werden betreffen solche biochemischen Analysen die Cerebrospinal- flüssigkeit (CSF) , die auf das Vorliegen bzw. eine erhöhte Konzentrationen der neuronenspezifischen Enolase (NSE) , des Proteins 14-3-3 und/oder des Protein S100 untersucht wird.
So ist aus Jimi T, Wakayama Y, Shibuya S, et al . "High Levels of nervous System-specific proteins in cerospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease" Clin Chim Acta 1992; 211 (1-2) : 37-46 ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art bekannt . Aus der US 4 654 313 ist bekannt, Blutserum von Patienten, bei denen ein Verdacht auf eine Gehirnschädigung besteht, auf eine erhöhte Konzentrationen des Proteins S100 zu untersuchen. Hierzu wird auch das Beispiel einer nicht näher spezifizierten Demenz gebracht. Ein Hinweis auf die Erkennbarkeit einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie ist nicht gegeben und angesichts der Besonderheiten des typischen Krankheitsverlaufs mit der zunächst langsam fortschreitenden Gehirnschädigung auch nicht zu erwarten.
Unter der Handelsbezeichung LIA-mat Sangtec 100 wird von der Firma AB Sangtec Medical, Bromma, Schweden ein quantitativer Immun-Lumineszenz-Serumtest auf das Protein S100 vertrieben. Der Serumtest ist sowohl zur Anwendung in Cerebrospinalflüssigkeit als auch in Blutserum geeignet. Das Protein S100 ist ein saures Kalzium-bindendes Protein mit einem Molekulargewicht von 21.000, das als Homodimer und Heterodimer von zwei Untereinheiten αS100 und ßSlOO natürlich auftritt. Die ß-Untereinheit (SS100) tritt spezifisch nur in Glialzellen und Schwannzellen des Gehirns auf. Der bekannte Serumtest reagiert nur auf die ß-Untereinheiten (ßSlOO) . In der Produktinformation/Bedienungsanleitung zu dem bekannten Serumtest wird darauf verwiesen, daß Gehirnschädigungen, beispielsweise aufgrund von Kopfverletzungen, mit einer erhöhten Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 sowohl in der Cerebrospinalflüssigkeit als auch im Blutserum einhergehen und daher ein Test auf die ß-Untereinheit des Proteins S100 zur Quantifizierung des Ausmaßes solcher Gehirnschädigungen herangezogen werden kann.
Es ist bekannt, daß das Protein S100 eine biologische Halbwertszeit von zwei Stunden aufgrund seines Abbaus durch die Nieren aufweist. Bei zeitlich begrenzten Gehirnschädigungen fällt die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 in der Cerebrospinalflüssigkeit und dem Blutserum daher binnen kurzer Zeit stark ab. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art so weiterzuentwickeln, daß es mit geringerem Aufwand durchgeführt werden kann. Die Entnahmen von Cerebrospinalflüssigkeit ist grundsätzlich aufwendig. Bei Rindern ist sie invitram mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, daß die Körperflüssigkeit ein Blutserum des Organismus ist. Überraschenderweise stellt sich heraus, daß sich auch bei der Bestimmung der Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 im Blutserum auffällige Konzentrationen nachweisen lassen, wenn eine Erkrankung an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie vorliegt. Die erhöhten Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins S100 im Blutserum werden zwar nicht in jedem Fall einer Erkrankung an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie beobachtet und sie sind auch nicht auf eine solche Erkrankung beschränkt . Die Bestimmung der Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 im Blutserum stellt aber eine einfach sehr wirkungsvolle Ergänzung der bisherigen differenziellen Diagnose von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien dar.
Da Blutserum auch bei Rindern sehr leicht gewonnen werden kann und das neue Verfahren daher insgesamt einen vergleichsweise geringen Aufwand erfordert, sind erstmals Reihenuntersuchungen von Tieren auf eine Erkrankung an BSE möglich. Dabei ist von großem Vorteil, daß die erhöhten Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins S100 bereits dann auftreten, wenn andere Anzeichen für eine Erkrankung an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie noch nicht oder noch nicht in eindeutiger Weise vorliegen.
Bei dem neuen Verfahren wird nur die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 bestimmt, weil nur aus dem Gehirn stammendes ßSlOO in eindeutiger Weise in Beziehung zu einer Beeinträchtigung des Gehirns steht .
Die Grenzkonzentration, die bei dem neuen Verfahren für das vorliegen einer Erkrankung an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie spricht, ist zwischen 150 und 300 pg/ml Blutserum festzulegen. Mit steigender Grenzkonzentration wird naturgemäß die Spezifizität des Kriterium gesteigert, aber seine Sensitivität gesenkt. Die Bandbreite von 150 bis 300 pg/ml Blutserum trägt der Tatsache Rechnung, daß bei verschiedenen Organismen, d. h. beispielsweise verschiedenen Tierarten, die für das Vorliegen einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie sprechende Grenzkonzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 allein aufgrund der allgemeinen Zusammensetzung des Blutserums in gewissen Grenzen schwankt.
Bei Menschen liegt eine sinnvolle Grenzkonzentration zwischen 180 und 260 pg/ml Blutserum und vorzugsweise bei 220 pg/ml Blutserum, d. h. zwischen 200 und 240 pg/ml Blutserum. Die Grenzkonzentration von 220 pg/ml Blutserum hat bei einer Erprobung des neuen Verfahrens eine Sensitivität von etwa 76 % aller definitiven und wahrscheinlichen Fälle von Creutzfeldt- Jakob-Erkrankungen und eine Spezifizität von über 82 % ergeben. Dabei lag der positive Vorhersagewert bei 86 % und der negative Vorhersagewert bei 70 %.
Bei Menschen liegt eine sinnvolle Grenzkonzentration bei 500 pg/ml Blutserum, d. h. zwischen 400 und 600 pg/ml Blutserum.
Die Sensitivität und vor allem die Spezifizität des neuen Verfahrens können noch deutlich gesteigert werden, wenn die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins S100 in zu verschiedenen Zeiten dem Organismus entnommenen Blutseren bestimmt, wobei nur ein anhaltendes Überschreiten der Grenzkonzentration als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet wird. Ein rasches Abfallen der Konzentration des Proteins SlOO deutet auf eine zeitlich begrenzte schädigende Einwirkung auf das Gehirn hin. Bei einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie schreitet die Schädigung des Gehirns mit den bekannten fatalen Folgen jedoch fort. Dies steht in Einklang mit anhaltenden hohen Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO in zu verschiedenen Zeiten dem Organismus entnommenen Blutseren. Durch eine größere Anzahl von Blutseren aus demselben Organismus können auch zufällig niedrige Einzelwerte leichter erkannt und ausgesondert werden, was sich bei der Sensitivität des neuen Verfahrens positiv bemerkbar macht.
Um das neue Verfahren sinnvoll durchführen zu können, muß die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO in dem Blutserum mit einer Nachweisgrenze und einer Auflösung von jeweils besser als 100 pg/ml Blutserum bestimmt werden. Um eine gute Sensitivität und Spezifizität zu erreichen, sollte mit einer Nachweisgrenze und einer Auflösung von jeweils besser als 50 pg/ml Blutserum vorzugsweise von jeweils mindestens 20 pg/ml Blutserum gearbeitet werden.
Bei der Durchführung des neuen Verfahrens kann der bekannte quantitative Immun-Lumineszenz-Serumtest auf das Protein SlOO mit Antikörpern zu der ß-Untereinheit des Proteins SlOO verwendet werden.
Bei diesem Serumtest werden die ß-Untereinheiten des Proteins SlOO in einem ersten Inkubationsschritt an ihrerseits fixierten Antikörpern fixiert und in einem zweiten Inkubationsschritt mit ihrerseits markierten Antikörpern markiert, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper SMST 12, SMSK 25 und SMSK 28 sind.
Die Erfindung wird im folgenden anhand einer konkreten Erprobung des neuen Verfahrens zur Erkennung einer Creutzfeldt-Jakob- Erkrankung beim Menschen näher beschrieben. Die dabei gewonnenen Ergebnisse sind aufgrund der übereinstimmenden Eigenschaften anderer transmissiblen spongiformen Enzephalopathien grundsätzlich auf den Nachweis dieser Erkrankungen übertragbar. Insbesondere ist diese Übertragung bezüglich der Erkennung einer BSE-Erkrankung bei Rindern möglich, da die bovine spongiforme Enzephalopathie bekanntermaßen eine besonders große Nähe zu der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aufweist. Zudem besteht eine ausgeprägte Homologie und eine ausgeprägte Kreuzreaktivität zwischen menschlichem und tierischem SlOO Protein.
Es wurde das Blutserum von 224 Patienten untersucht, bei denen ein Verdacht auf das Vorliegen einer Creutzfeldt-Jakob- Erkrankung bestand. In 65 Fällen wurde die Diagnose auf die Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung neuropathologisch bestätigt, 43 Fälle waren wahrscheinliche Erkrankungen, 36 Fälle mögliche Erkrankungen, 6 Fälle waren genetisch bedingte Erkrankungen und 74 Patienten wiesen andere mit einer Demenz einhergehende Erkrankungen auf. Zusätzlich zu diesen 224 Fällen wurde das Blutserum von 35 Patienten mit nicht-Demenz-Erkrankungen untersucht, die als Kontrollstichprobe anzusehen sind.
Eine Einstufung als wahrscheinliche Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung wurde vorgenommen, wenn eine progressive Demenz von weniger als zwei Jahren Dauer vorlag und wenn typische EEG-Veränderungen [periodische Sharp-Wave-Komplexe (PSWC)] vorlagen und wenn mindestens zwei von den folgenden vier klinischen Kriterien erfüllt waren:
1. Myoklonus,
2. visuelle oder cerebelläre Symptome,
3. pyramidale/extrapyramidale Störungen
4. akinetischer Mutismus .
Von einer möglichen Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung wurde ausgegangen, wenn eine progressive Demenz von weniger als zwei Jahren Dauer vorlag und wenn von den oben genannten vier klinischen Erscheinungsformen 1 bis 4 mindestens zwei gegeben waren, jedoch kein untypisches EEG oder überhaupt kein EEG vorlag. Alle anderen Fälle wurden als andere Erkrankungen eingestuft. Blutserumproben wurden von den Patienten abgenommen und binnen 24 Stunden auf -80° C abgekühlt. Die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO in den Blutseren wurde unter Verwendung eines quantitativen Immun-Lumineszenz-Serumtests (LIA-mat Sangtec 100 der Firma AB Sangtec Medical, Bromma, Schweden) durchgeführt. Dieser Serumtest ist kommerziell verfügbar. Es handelt sich um einen zweiseitigen Antikörpertest (Sandwichprinzip) mit mono- klonalen Antikörpern. Die verwendeten monoklonalen Antikörper SMST 12, SMSK 25 und SMSK 28 reagieren in der Immunreaktion nur mit den ß-Untereinheiten des Proteins SlOO. In einem ersten Schritt werden die ß-Untereinheiten des Proteins SlOO an ein Substrat angebunden und im zweiten Schritt mit einem Tracer markiert, hierbei handelt es sich um einen Lumineszenz-Tracer. Die Auswertung des Serumtests erfolgt mit einem LIA mat Lumineszenzanalysator der Firma Byk Sangtec unter Verwendung von mit dem Serumtest LIA-mat Sangtec 100 gelieferten Standards. Der Serumtest wurde genau nach der diesem beigefügten Gebrauchsanweisung durchgeführt, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Alle im folgenden gemachten Angaben über die Sensitivität und die Spezifizität des durchgeführten Tests beruhen auf einem 95%- Vertrauensintervall .
In dem beigefügten Boxplot-Diagramm sind die Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO im Blutserum für die definitiven und wahrscheinlichen CJD-Fälle, die möglichen CJD-Fälle, die anderen Demenz- und die nicht-Demenz-Fälle wiedergegeben. In den Boxplots der ßSlOO Konzentrationen sind die 10er, 25er, 50er, 75er und 90er Perzentilen angegeben, außerdem die Einzelwerte, die außerhalb dieser Bereiche liegen, im einzelnen lagen die Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO bei den definitiven und wahrscheinlichen CJD-Fällen, die graphisch zusammengefaßt wurden, zwischen 95 pg/ml Blutserum und 2016 pg/ml Blutserum. Der Mittelwert lag bei 493 pg/ml Blutserum und die Standardabweichung bei 386 pg/ml Blutserum. Bei den Fällen einer definitiven Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung lagen die Konzentrationen zwischen 120 pg/ml Blutserum und 2016 pg/ml Blutserum bei einem Mittelwert von 552 pg/ml Blutserum und einer Standardabweichung von 440 pg/ml Blutserum. Bei den Patienten mit einer wahrscheinlichen Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung lagen die ßSlOO Konzentrationen zwischen 95 pg/ml Blutserum und 1199 pg/ml Blutserum bei einem Mittelwert von 405 pg/ml Blutserum und einer Standardabweichung von 269 pg/ml Blutserum. Bei den möglichen Fällen einer Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung lag die ßSlOO Konzentration zwischen 0 pg/ml Blutserum und 742 pg/ml Blutserum, wobei der Mittelwert bei 194 pg/ml Blutserum und die Standardabweichung bei 178 pg/ml Blutserum lag. In der Gruppe der anderen Krankheiten lagen Konzentrationen von 0 pg/ml Blutserum bis 1198 pg/ml Blutserum vor, wobei der Mittelwert bei 151 pg/ml Blutserum und die Standardabweichung bei 177 pg/ml Blutserum lag. Bei den nicht-Demenz-Fällen (Kontrollstichprobe) lagen die Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO zwischen 0 pg/ml Blutserum und 657 pg/ml Blutserum bei einem Mittelwert von 117 pg/ml Blutserum und einer Standardabweichung von 127 pg/ml Blutserum. Die nähere Aufschlüsselung der Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO im Blutserum bei den anderen Demenz-Fällen und den nicht-Demenz-Fällen ist in den Tabellen l und 2 aufgeschlüsselt.
Es trat kein signifikanter Unterschied in den Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO zwischen den Fällen der möglichen CJD-Erkrankungen, der anderen Demenz-Erkrankungen und der nicht-Demenz-Erkrankungen auf. Es war jedoch ein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe der definitiven und wahrscheinlichen Creutzfeldt-Jakob-Erkrankungen und den Fällen der anderen Demenz-Erkrankungen festzustellen. Innerhalb der Gruppe der definitiven und der wahrscheinlichen Creutzfeldt- Jakob-Erkrankungen konnten keine signifikanten Unterschiede in der Konzentration des Proteins SlOO festgestellt werden. Es wurden auch keine geschlechtsspezifischen Unterschiede bei der ßSlOO Konzentration festgestellt.
In dem Boxplot-Diagramm sind die genetischen Fälle nicht aufgelistet . Hierbei handelte es sich um zwei Fälle von tödlicher familiärer Schlaflosigkeit (FFI) , bei denen ßSlOO Konzentrationen von 0 pg/ml Blutserum und 22 pg/ml Blutserum festgestellt wurden. Ein Patient mit Insertmutation wies eine Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO von 178 pg/ml Blutserum auf. Ein am Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) erkrankter Patient und zwei Patienten mit einer V 2001-Mutation wiesen ßSlOO Konzentrationen von 1434 pg/ml, 296 pg/ml bzw. 757 pg/ml Blutserum auf.
Aus den einzelnen Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO ergaben sich bei einer Grenzkonzentration von 220 pg/ml die besten Ergebnisse bezüglich der Sensitivität und der Spezifizität bei der Erkennung einer Creutzfeldt-Jakob- Erkrankung durch die Bestimmung der Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO im Blutserum. Bei Berücksichtigung der Gruppen definitiver und wahrscheinlicher CJD-Erkrankungen einerseits und der Fälle anderer Demenz-Erkrankungen andererseits betrug die Sensitivität 75,9 % und die Spezifizität 82,4 %. Der positive Vorhersagewert lag bei 86,3 % und der negative Vorhersagewert bei 70,1 %. Bei Anwendung derselben Grenzkonzentration auf die Gruppe der nicht-Demenz-Fälle beträgt die Spezifizität 85,7 %.
Zwischen der ßSlOO Konzentration im Blutserum und dem Zeitraum zwischen der Entnahme des Blutserums bis zum Tod des Patienten zeichnete sich ein Zusammenhang ab, nach dem eine niedrigere ßSlOO Konzentration auf eine höhere verbleibende Lebenserwartung hinweist als eine höhere ßSlOO Konzentration. Im einzelnen wurde bei 13 von 16 Patienten, die klinisch zunächst als mögliche Fälle eingestuft wurden und die später neuropathologisch bestätigt wurden, Konzentrationen der ß-Untereinheit des Proteins SlOO oberhalb von 220 pg/ml gefunden. Zwei Patienten, die anfänglich als andere Fälle eingestuft wurden und dann in die Gruppe der wahrscheinlichen und definitiven Fälle umklassifiziert wurden, wiesen ßSlOO Konzentrationen von oberhalb 220 pg/ml auf.
Die beigefügten Kaplan-Meier-Kurven zeigen die Überlebensraten von CJD-Erkrankten, die nach der anfangs nachweisbaren Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO im Blutserum in drei verschiedene Gruppen eingeordnet wurden. Aus dem Verlauf der Kaplan-Meier-Kurven ergibt sich eine Wechselwirkung zwischen der Konzentration von ßSlOO und der mittelfristigen Mortalität. Die Mittelfristige Mortalität ist umso höher je höher die anfängliche Konzentration an ßSlOO ist. Anders gesagt weist eine höhere Konzentration an ßSlOO tendenziell auf einen bereits vorliegenden Krankheitsfortschritt hin; bzw. umgekehrt steigt die Konzentration an ßSlOO mit dem Fortschritt der CJD- Erkrankung an.
Die Tabelle III dokumentiert die Anwendbarkeit der quantitativen Untersuchung des Blutserums auf die ß-Untereinheit des Proteins SlOO zur Erkennung einer Scrapie-Erkrankung (einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie) bei Hamstern. Die Stichprobe umßaßte fünf Blutseren von fünf erkrankten Tieren, die teilweise intrazerebral und teilweise abdominal infiziert waren, und fünf Blutseren von gesunden Tieren als Kontrolle. Ein Grenzwert von 500 pg/ml ergibt eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 100 %. Ein Unterschied zwischen den intrazerebral und den abdominal infizierten Tieren ist dabei nicht zu erkennen.

Claims

P A T E NT AN S P RÜ C H E ;
1. Verfahren zum Erkennen einer Erkrankung eines menschlichen Organismus an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, insbesondere an der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) , wobei in vitro die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO
(ßSlOO) in einer Körperflüssigkeit des Organismus bestimmt wird und wobei das Überschreiten einer Grenzkonzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ein Blutserum des Organismus ist.
2. Verfahren zum Erkennen einer Erkrankung eines tierischen Organismus an einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, insbesondere an einer bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) , wobei in vitro die Konzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO (ßSlOO) in einer Körperflüssigkeit des Organismus bestimmt wird und wobei das Überschreiten einer Grenzkonzentration der ß-Untereinheit des Proteins SlOO als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ein Blutserum des Organismus ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Grenzkonzentration zwischen 150 und 600 pg/ml Blutserum beträgt .
4. Verfahren nach Anspruch 3 rückbezogen auf Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Grenzkonzentration zwischen 180 und 260 pg/ml Blutserum festgelegt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 rückbezogen auf Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß 500 pg/ml Blutserum, d.h. zwischen 400 und 600 pg/ml Blutserum, beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Proteins SlOO in zu verschiedenen Zeiten dem Organismus entnommenen Blutseren bestimmt wird und daß nur ein anhaltendes Überschreiten der Grenzkonzentration als Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung gewertet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Proteins SlOO in dem Blutserum mit einer Nachweisgrenze und einer Auflösung von jeweils besser als 100 pg/ml Blutserum bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Konzentration des Proteins SlOO in dem Blutserum mit einer Nachweisgrenze und einer Auflösung von jeweils besser als 50 pg/ml Blutserum und vorzugsweise von jeweils mindestens 20 pg/ml Blutserum bestimmt wird.
9. Verwendung eines quantitativen Immun-Lumineszenz-Serumtests auf das Protein SlOO mit Antikörpern zu der ß-Untereinheit des Proteins SlOO bei der Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche l bis 8.
10. Verwendung des Serumtests nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Serumtest die ß-Untereinheiten des Proteins SlOO in einem ersten Inkubationsschritt an ihrerseits fixierten Antikörpern fixiert und in einem zweiten Inkubationsschritt mit ihrerseits markierten Antikörpern markiert, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper SMST 12, SMSK 25 und SMSK 28 sind.
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