WO1998028428A1 - Clonage d'un gene de lactococcus inductible par le froid et de son promoteur, et leurs utilisations - Google Patents

Clonage d'un gene de lactococcus inductible par le froid et de son promoteur, et leurs utilisations Download PDF

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WO1998028428A1
WO1998028428A1 PCT/FR1997/002359 FR9702359W WO9828428A1 WO 1998028428 A1 WO1998028428 A1 WO 1998028428A1 FR 9702359 W FR9702359 W FR 9702359W WO 9828428 A1 WO9828428 A1 WO 9828428A1
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WO
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gene
promoter
sequence
cold
seq
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Application number
PCT/FR1997/002359
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Inventor
Marie-Pierre Chapot-Chartier
Catherine Schouler
Marie-Christine Chopin
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

Definitions

  • the present invention relates to a gene for adaptation to cold of Lactococcus lacti ⁇ , and to its regulatory sequences.
  • Lactococci and in particular Lactococcus lactis are widely used for cheese making. These bacteria have been the subject of numerous researches in genetic engineering, with the aim of modifying the expression of their endogenous genes, and / or allowing the expression of heterologous genes.
  • INTERNATIONAL BV thus proposes to use a complex promoter derived from the temperate laugh phage.
  • This promoter having the disadvantage of being naturally inducible by mitomycin C which is toxic, it is proposed in PCT Application WO 95/31563 to replace the region responsible for induction by mitomycin by a region responding to another stressor.
  • PCT Application WO 95/31563 proposes to use for this purpose a control sequence responding to a thermal shock.
  • CspA Cold-inducible promoters are known in other bacterial species.
  • CspA a drop in temperature from 37 ° C to 10 ° C induces the synthesis of at least 14 proteins, the most important of which was called CspA [GOLDSTEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 283-287, (1990)].
  • CspB CspG
  • CspA have also been discovered in E. coli, and constitute the CspA family. These proteins have a great sequence similarity with one of the domains of eukaryotic DNA binding proteins called Y-box factors [LEE et al., Molecular Microbiology, 11 (5), p. 833-839, (1994)]. However, only some of the proteins of the CspA family (CspA, CspB and CspG) are inducible by cold.
  • the inventors have now demonstrated a family of Lactococcus lactis proteins homologous to the CspA family of Escherichia coli. They have also demonstrated and characterized a cold-inducible promoter of one of the genes of this family, hereinafter called cspB.
  • the invention relates to these cold shock response genes and their regulation.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid molecule chosen from the group consisting of: - a lactic acid gene coding for a protein expressed in said bacterium in response to cold shock,
  • a nucleic acid molecule according to the present Invention, it is chosen from the group consisting of a gene coding for the protein CspB of Lactococcus lactis, the promoter of said gene, and the homologous genes and promoters.
  • promoter means an isolated nucleic acid sequence essentially consisting of the elements necessary for controlling the initiation of transcription of a gene.
  • the sequence of a gene coding for the cspB protein of Lactococcus lactis, cloned by the inventors, and the polypeptide sequence of this protein are represented in FIG.
  • the term “homolog of the cspB gene of Lactococcus lactis” is understood to mean any bacterial gene, and in particular any lactococcus gene, the translation product of which has more than 72%, preferably more than 75% and advantageously more than 80% of similarity to the amino acid sequence of the protein CspB encoded by this gene;
  • the expression “promoter homologous to the promoter of the cactB gene of Lactococcus lactis” is understood to mean any sequence constituting a cold-inducible bacterial promoter which can be obtained by screening, by conventional techniques of molecular biology, a library of Bacterial DNA, in particular lactococcal DNA, using one or more fragments of more than 20 bp of the sequence SEQ ID NO: 3. Fragments of more than 20 bp of sequences
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 which make it possible to obtain the homologs of the cspB gene of Lactococcus lactis or of its promoter are also part of the subject of the invention.
  • the object of the present invention also encompasses recombinant nucleic acid molecules comprising at least one DNA sequence according to the invention linked to at least one heterologous sequence.
  • the term “a” for the purposes of the present invention, the term “a”
  • heterologous in relation to a given sequence, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said sequence.
  • Recombinant nucleic acid molecules in accordance with the invention comprise in particular:
  • - expression cassettes for expressing cold shock response genes in accordance with the invention such as for example the gene coding for the protein CspB; these genes can be placed under the control of heterologous promoters, inducible or not, or under the control of its own promoter, associated with heterologous regulatory sequences;
  • cassettes for expressing a gene of interest under the control of a cold-inducible promoter according to the invention comprise at least said promoter and a heterologous sequence comprising a gene of interest placed under transcriptional control of said promoter, or a restriction site making it possible to insert said gene of interest under transcriptional control of said promoter.
  • the promoter is advantageously associated with other regulatory sequences, active in lactococci; it is for example associated, in a conventional manner, with a terminator sequence placed downstream of the gene to transcribe.
  • terminator sequences which can be used for this purpose, the terminator of the prtP gene of L. lactis, described by LEENHOUTS KJ and VENEMA G., [Lactococcal plasmid vectors In: KG HARDY (ed) Plasmids. A pratical approach. Second Edition, IRL Press, Oxford, p.
  • the promoter conforms to The invention is further associated with an additional transcription terminator, placed between the promoter and the gene.
  • Terminators which are naturally located upstream of the abi genes may be used in this context, for example: - the terminator naturally located upstream of the aJbiDl gene, described by ANBA et al. [J. Bacteriol. 177, p. 3818-3823, (1995)].
  • This terminator consists of nucleotides 152-210 of the 2369 bp fragment shown in Figure 1 of this publication.
  • the sequence of this terminator is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 4.
  • the terminator naturally located upstream of the abi420 gene and whose nucleotide sequence is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 5.
  • the inventors have observed that when one of these terminators is placed between the inducible promoter and the gene to be transcribed, it makes it possible to suppress the basal transcription capable of occurring without any induction of the promoter. On the other hand, when the promoter is induced, transcription can pass through the terminator and the gene is transcribed at a suitable level.
  • Recombinant nucleic acid molecules according to the invention also comprise recombinant vectors comprising an insert consisting of a nucleic acid sequence, in particular a promoter, or an expression cassette according to the invention.
  • a vector capable of replicating and of maintaining itself in the host bacterium in the form of a plasmid such as for example the plasmids pIL252 and pIL253 described by SIMON and CHOPIN, [Biochemistry, 70, p . 559-566,
  • plasmid vectors as well as integration vectors usable in lactococci are described in the review by: LEENHOUTS K.J. and VENEMA G. (1993). Lactococal plasmid vectors, In: K.G. HARDY (ed) Plasmids. A practical approach. Second Edition. IRL Press, Oxford, p. 65-94. ,
  • An expression vector in accordance with the invention is represented by the plasmid called pTIL65 which comprises a PstI insert of 3315 bp in which the ⁇ -galactosidase gene is placed under the control of the promoter of the cspB gene of L. lactis.
  • TIL146 This plasmid, hosted by the L. lactis strain called TIL146, has been deposited with the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM), 28, rue du Dondel Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, December 6, 1996 under n ° 1-1793.
  • the invention further relates to bacteria transformed with at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • these bacteria are lactococci.
  • cold shock response genes in accordance with the invention in particular the cspB gene or genes homologous to lactococci, in host bacteria, in particular lactococci transformed by one or more copies of this gene can for example to increase the resistance of these bacteria to cold.
  • a cold-inducible promoter in accordance with the invention for controlling the expression of a gene of interest in lactococci has in particular the advantage of making it possible to induce the expression of this gene in a way simple, requiring no addition of any substance to the culture, and compatible with cheese technology.
  • the expression of a gene of interest placed under the control of a cold-inducible promoter according to the invention is obtained by placing the cells comprising this construction at a temperature below 20 ° C., preferably at a temperature of around 15 ° C.
  • a promoter in accordance with the invention can in particular be used for the expression of lysis genes, for example, for the expression of a bacteriophage lysine, such as for example that of the bacteriophage ⁇ j> vML3, described by SHEARMAN et al., [Mol.
  • the cold-inducible promoters in accordance with the invention can also be used to control the expression of a gene coding for a lactococcal autolysin, such as for example that described by BUIST et al. [Journal of Bacteriology, 177, n ° 6, p. 1554-1563, (1995)].
  • the cold-inducible promoters in accordance with the invention can also be used for the expression of enzymes involved in the manufacture of cheeses, and in particular in the development of the flavor, such as for example peptidases, esterases, lipases, enzymes involved in the catabolism of amino acids, etc.
  • Degenerate primers were constructed from 2 conserved sequences of different proteins belonging to the cspA family.
  • primer PI 5 '-GTNAARTGGTTYAA-3' This primer comprises 14 nucleotides and is degenerated 16 times;
  • This primer comprises 17 nucleotides and is degenerated 256 times.
  • the sequences of the primers PI and P2 are represented in the sequence list in the appendix under the respective numbers SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • the reaction mixture (100 ⁇ l) comprises 150 ng of DNA, 1 unit of Taq DNA polymerase (APPLIGENE) used with the buffer supplied by the manufacturer, 250 pmol of each primer, 200 ⁇ M of each dNTP.
  • the reaction is carried out in 30 cycles comprising 1 minute of denaturation at 95 ° C, 2 minutes of hybridization at 30 ° C and 2 minutes of elongation at 75 ° C in a DNA Thermal Cycler 480 (PERKIN ELMER).
  • a 75 bp amplification product having the size expected according to the choice of the two primers, was purified by elution from a NUSIEVE 3% agarose gel (FMC BIOPRODUCTS).
  • the ends were made blunt by treatment with the enzyme Pfu DNA polymerase (PCR Polishing Kit, STRATAGENE), and the fragment thus obtained cloned in a plasmid pBluescript SK + (STRATAGENE) previously linearized by Smal.
  • the plasmid thus loaded was used to transform E. coli TG1 cells (supE hsd ⁇ 5 thi ⁇ (lac-proAB) F ' " traD36 proAB + lacl q lacZAM15].
  • the transformed cells comprising the loaded plasmid were isolated and the nucleotide sequence of the insert has been determined.
  • FIG. 1 shows the alignment of the sequences of the three different fragments amplified by PCR from Lactococcus lactis, with the central region (amino acid 9-34) of the CspA of Escherichia coli, and with the partial sequence of Lactococcus lactis CspA. Identical residues are indicated by dashes and missing residues are indicated by dots.
  • the entire cspB gene was obtained by reverse PCR.
  • a pair of divergent primers the sequences of which are as follows:
  • Primer P3 5 '-GCCAAATCCTTTATCTGGATT-3'
  • Primer P4 5 '-CACTTCAGAAGATGGTCAAGA-3' and which correspond to internal sequences of the 75 bp fragment amplified from the cspB gene, as indicated in example 1, was used .
  • primers P3 and P4 are represented in the sequence list in the appendix under the respective numbers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the total chromosomal DNA of Lactococcus lactis was digested with Xmni and the fragments generated were religated on themselves. The resulting mixture was used as a template for PCR amplification using the pair of divergent primers.
  • a 1.6 b DNA fragment was thus amplified, and the nucleotide sequence of a 488 bp subfrag was determined.
  • This sequence contains an open reading frame of 198 nucleotides, which codes for a protein of 66 amino acids (7268 Da) which corresponds to the expected size of a CspA protein.
  • Lactococcus lactis and the deduced polypeptide sequence are represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID N0: 1, as well as in FIG. 2.
  • the potential ribosome binding site is underlined in dotted lines and the potential transcription termination site, located downstream of the open reading frame is underlined.
  • the consensus sequences -10 and -35 are underlined by a double line.
  • the transcription initiation site is framed.
  • Lactococcus lactis subs. cremoris AM2 were grown on M17 medium in the presence of lactose at 30 ° C to an optical density (650 nm) of 1. The culture was then divided into three different portions which were incubated at 15 ° C, 10 ° C or 5 ° C. The total RNAs of these cultures were isolated after 30 minutes, or 60 minutes according to the protocol described by ANBA et al. [J. Bact. 177, p. 3818-3823,
  • transcript 236-254 (sequence 236-254, Figure 2).
  • sequence 236-254 At each temperature, only one transcript was detected, the size of which is approximately 0.28 kb. This transcript is present at 30 ° C, and its quantity increases when the temperature decreases, indicating that cspB is inducible by cold. After 1 hour at 15 ° C, a 10-fold increase in transcription is observed, while for lower temperatures (10 ° C or 5 ° C), the induction after one hour is less important.
  • a 200 bp fragment, comprising 182 bp upstream of the open reading frame, and the 18 bp coding for the first 6 residues of the CspB protein was amplified by PCR using the following primers:
  • Primer P5 It is an oligonucleotide of 28 nucleotides in length, the sequence of which is as follows:
  • Primer P6 It is an oligonucleotide of 27 nucleotides in length, the sequence of which is as follows:
  • sequences of the primers P5 and P6 are represented in the sequence list in the annex under the respective numbers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • the primer P5 corresponds to the sequence 1-19 of the nucleotide sequence represented on the FIG. 2 and the primer P6 corresponds to the complement of the sequence 182-200 of the same sequence of FIG. 2.
  • the amplification product was treated with SmaI, and ligated into the plasmid pMC1871 linearized with SmaI.
  • the ligation mixture was used to transform E. coli HB101 bacteria (supE44 sdS20 recA13 ara-14 proA2 lacYl galK2 rpsL20 xyl -5 mtl- 1).
  • the transformants were selected on an LB agar plate, containing 10 ⁇ g / ml of tetracycline, and of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactoside (X-gal). Clones containing the construct in the correct orientation give colonies colored in light blue.
  • the fusion product of the cspB promoter and of the sequence coding for ⁇ -galactosidase, called cspB-lacZ is a fragment of 3315 bp. This fragment was excised by PstI digestion, and cloned into the PstI site of a lactococcal plasmid called pILnew. This plasmid was converted into a low copy number plasmid by removing a 22 bp KpnI fragment inserted inside the copF gene, regulating the copy number of the plasmid. The resulting plasmid, called pTIL65, was introduced by electroporation into the strain devoid of plasmids L. lactis subsp.
  • TIL146 was cultured in M17 medium comprising 0.5% glucose and 10 ⁇ g / ml of erythromycin at a temperature of 30 ° C., to an optical density (650 nm) of 1. The culture was then distributed into 3 portions which were transferred respectively to temperatures of 15 ° C, 10 ° C or 5 ° C as described in Example 3 above.
  • the specific activity of ⁇ -galactosidase was determined according to the protocol described by MILLER [Experiments in Molecular Genetics, p. 352-355. Cold Spring Harbor Laboratory. Press, Cold Spring Harbor, NY].
  • FIG. 3 shows l evolution of bacterial growth and ⁇ -gal activity as a function of the time elapsed after the cold shock. ⁇ -gal activity is expressed in "units
  • Basal activity was detected at 30 ° C. This activity is constant during the culture at 30 ° C.
  • the specific activity of ⁇ -galactosidase is increased; it is thus multiplied by 5 after 4 h at 15 ° C.
  • a 98 bp fragment was amplified by PCR using the following primers:
  • Primer T1 this is an oligonucleotide 19 nucleotides long, the sequence of which is as follows:
  • Primer T2 this is an oligonucleotide 23 nucleotides long, the sequence of which is as follows:
  • the sequences of the primers P5 and P6 are represented in the sequence list in the appendix under the respective numbers SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • the primer Tl corresponds to the sequence 1-19 of the nucleotide sequence abiDl represented in figure 4 and the primer T2 corresponds to the complement of the sequence 77-99 of the same sequence whose base 78 (A) has been replaced by a (C) in order to introduce an NdeI restriction site at the level of the initiation codon of the transcript.
  • the amplification product was ligated into the plasmid pBSKII + linearized with EcoRV.
  • the ligation mixture was used to transform the bacteria E. coli NM522 supE thi -IA ⁇ lac-proAB) A (mcrB-hsdSM) 5 (r k -m k -) [F 'proAB lacI q ZAM15] (STRATAGENE) .
  • Transformants have been selected on Agar LB plate containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • pTIL58 a recombinant clone whose insert is in the opposite direction to the ⁇ -galactosidase gene from the plasmid pBSK + was selected and named pTIL58. 2 - Cloning of the cspB promoter
  • a 167 bp fragment was amplified by PCR using the following primers:
  • Primers P7 this is an oligonucleotide of 27 nucleotides in length, the sequence of which is as follows:
  • Primer P8 it is an oligonucleotide of
  • primers P7 and P8 are represented in the sequence list in the appendix under the respective numbers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15.
  • Primer P7 represents the sequence 1-18 of the nucleotide sequence of Figure 2 and primer P8 represents the complement of the sequence 135-155 of the same sequence.
  • the amplification product was ligated into the plasmid pBSKII + linearized with EcoRV.
  • the ligation mixture was used to transform the E. coli NM522 supE thi -I ⁇ (lac-proAB) ⁇ (mcrB-hsdSM) 5 (r k -m k ) bacteria [f'proABlacl q Z ⁇ M15]
  • the transformants were selected on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin. After verification of the sequence, a recombinant clone was selected and the insert excised by digestion with the restriction enzymes Xhol and ClaI, then inserted upstream of the abil05 transcription terminator in the plasmid pTIL58.
  • the cassette was excised by digestion of the plasmid pTIL58 with the restriction enzymes Xhol and Sacl and cloned into the plasmid of L. lactis pILnew linearized by double digestion with these same two restriction enzymes.
  • the plasmid thus obtained was named pTIL89.
  • Plasmid pTIL89 was converted to a low copy number plasmid by removing a 22pb KpnI fragment inserted inside the copF gene, regulating the copy number of the plasmid.
  • the resulting plasmid called pTIL92 was introduced by electroporation into the strain devoid of plasmid L. lactis subsp. cremoris MG1363, to produce the strain TIL172.
  • the purified plasmid pTIL92 was linearized by double digestion with the restriction enzymes NdeI and
  • L. lactis IL1403 is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 16. This autolysin is close to that described by BUIST et al.
  • the autolysin gene was excised between the NdeI sites located at the codon ATG and BamHI located after the terminator sequence of said gene and reintroduced between the same sites of the plasmid pTIL92.
  • the ligation mixture was used to transform the electrocompetent bacteria L. lactis subsp. cremoris MG1363 to produce the strain TIL173. 5 - Cold shock of the recombinant bacteria containing the construct.
  • the TIL173 strain and the TIL172 strain (used as a control) were cultured in M17 medium comprising 0.5% glucose and 10 ⁇ g / ml of erythromycin, at a temperature of 30 ° C., to an optical density ( 650 nm) of 1.0.
  • the culture was then divided into 2 portions: one remaining at 30 ° C and the other transferred at a temperature of 15 ° C for 4 hours, then replaced at 30 ° C to allow the induced enzyme to express itself.
  • the optical density of the 2 cultures was monitored for 80 hours ( Figure 4).
  • Cell growth and lysis are evaluated by measuring the optical density at 650 nm. The measurements are carried out on the cultures maintained at 30 ° C (A), and on the cultures having undergone the cold shock for 4 h at 15 ° C (B), for the strain TIL172 () and for the strain TIL173 (O). In the cultures maintained at 30 ° C., a reduction in the OD is observed, reflecting the lysis of the cells, which is equivalent for the strains TIL172 and TIL173. In the case of cultures having undergone the cold shock, it is observed that the strain TIL173 lyses approximately 1.7 times faster than the control strain TIL172.
  • SEQ ID NO: 16 AAACATTAAA TAAAAAACGT TTACAAACCG CCACATAATT GTCATCTTTT TCTTCCATTA 60 ACCGTGGTAA AATAGGGTAG TACTTATTTT ATTCTGTATT TTCAGGAAAG GAATTATTTA 120

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Abstract

L'invention est relative à un gène de bactérie lactique inductible par le froid et à son promoteur. Il s'agit en particulier du gène cspB d'un lactocoque, et du promoteur dudit gène. Le gène est utilisable en particulier pour rendre des bactéries lactiques plus résistantes au froid, et le promoteur est utilisable en particulier pour l'expression inductible de gènes d'intérêt chez les lactocoques, par exemple pour l'expression inductible de gènes provoquant la lyse bactérienne.

Description

CLONAGE D'UN GENE DE LACTOCOCCUS INDUCTIBLE PAR LE FROID ET DE SON PROMOTEUR, ET LEURS UTILISATIONS
La présente Invention est relative à un gène d'adaptation au froid de Lactococcus lactiε, et à ses séquences de régulation.
Les lactocoques, et en particulier Lactococcus lactis sont largement utilisés pour la fabrication fromagère. Ces bactéries ont fait l'objet de nombreuses recherches en génie génétique, ayant pour but de modifier l'expression de leurs gènes endogènes, et/ou de permettre 1 ' expression de gènes hétérologues .
Parmi ces travaux, on mentionnera plus particulièrement ici ceux visant à exprimer un gène d'intérêt de manière inductible. Il est connu que les organismes vivants répondent aux variations environnementales (pH, concentration en sel, température, présence de certaines substances dans le milieu, etc...), par 1 ' expression transitoire de protéines qui permettent leur adaptation à ces nouvelles conditions d ' environnement .
Il a ainsi été proposé d'introduire chez les lactocoques des promoteurs inductibles, permettant d'exprimer une protéine d'intérêt à un stade choisi du processus de fermentation. Il peut s'agir, par exemple de protéines impliquées dans le processus de fermentation, de protéines intervenant dans le développement des arômes, ou bien de protéines (holine, lysine, autolysine) induisant la lyse des bactéries et permettant le relarguage de leur contenu cellulaire. La Demande PCT WO 95/31563 au nom de QUEST
INTERNATIONAL BV propose ainsi d'utiliser un promoteur complexe dérivé du phage tempéré rit . Ce promoteur présentant l'inconvénient d'être naturellement inductible par la mitomycine C qui est toxique, il est proposé dans la Demande PCT WO 95/31563 de remplacer la région responsable de 1 ' induction par la mitomycine par une région répondant à un autre facteur de stress . La Demande PCT WO 95/31563 propose d'utiliser dans ce but une séquence de contrôle répondant à un choc thermique .
D'autres promoteurs inductibles fonctionnels chez les lactocoques qui sont connus à l'heure actuelle sont des promoteurs inductibles par le pH acide
[ISRAELSEN et al., Appl . Environ. Microbiol . , 61, p. 2540-2547, (1996)], la nisine, [DERUYTER et al., Appl.
Environ. Microbiol., 62, p. 3662-3667, (1996)], les ions chlorure [SANDERS et al., Poster H22 Congrès Fifth Symposium on Lactic Acid Bacteria, Genetics, Metabolism and Applications, Veldhoven, The Netherlands, (1996)], ou le lactose [VAN ROOIJNEN et al., J. Bact . , 1174, p. 2273- 2280, (1992)]. Il s'agit pour la plupart de promoteurs d'origine virale et/ou de promoteurs inductibles par l'addition de différentes substances, ce qui peut poser des problèmes pour certaines applications comme la fabrication fromagère .
On connaît, chez d'autres espèces bactériennes des promoteurs inductibles par le froid. C'est ainsi, que chez Escherichia coli , une baisse de température de 37°C à 10 °C induit la synthèse d'au moins 14 protéines, dont la plus importante a été dénommée CspA [GOLDSTEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 283-287, (1990)]. 6 autres protéines (CspB à CspG) similaires à
CspA ont également été découvertes chez E. coli , et constituent la famille CspA. Ces protéines ont une grande similitude de séquence avec l'un des domaines de protéines eucaryotes de liaison à l'ADN dénommées facteurs Y-box [LEE et al., Molecular Microbiology, 11(5), p. 833-839, (1994)]. Cependant seules certaines des protéines de la famille CspA (CspA, CspB et CspG) sont inductibles par le froid.
Des protéines apparentées à la famille CspA ont également été identifiées chez d'autres bactéries telles que Bacillus subtilis [WILLIMSKY et al., J. Bact., 174, 6326-6335 (1992)], chez d'autres espèces de Bacillus [SCHRODER et al., Gène, 136, p. 277-280, (1993)] et chez Listeria monocytogenes [Francis et al. EMBL accession number X91789 (1995)]. Chez les lactocoques, les travaux effectués jusqu'à présent ont montré que L. lactis peut s'adapter au froid, et répond au choc par le froid par l'induction d'une douzaine de protéines [PANOFF et al. Cryobiology, 32, p. 516-520, (1995)], et [PANOFF et al. Curr. Microbiol. 29, p. 213-216, (1994)]. Cependant, alors que plusieurs gènes impliqués dans la réponse au choc thermique tels que par exemple dnaK, dnaJ , grrosESL ont été mis en évidence chez L . lactis, aucun gène impliqué dans la réponse au choc par le froid n'a jusqu'à présent été identifié. Récemment, un gène homologue au gène cspA de E. coli a été partiellement clone et séquence [FRANCIS et STEWART, EMBL accession number U60041, (1996)]; cependant aucune indication concernant son inductibilité potentielle par le froid n'a été donnée. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une famille de protéines de Lactococcus lactis homologue à la famille CspA de Escherichia coli . Ils ont en outre mis en évidence et caractérisé un promoteur inductible par le froid de l'un des gènes de cette famille, dénommé ci-après cspB . L'invention concerne ces gènes de réponse au choc par le froid, et leur régulation.
La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué par : - un gène de bactérie lactique codant pour une protéine exprimée chez ladite bactérie en réponse à un choc par le froid,
- le promoteur, inductible par le froid, dudit gène . Selon un mode de réalisation préféré d'une molécule d'acide nucléique conforme à la présente Invention, elle est choisie dans le groupe constitué par un gène codant pour la protéine CspB de Lactococcus lactis, le promoteur dudit gène, et les gènes et promoteurs homologues. Au sens de la présente invention, on entend par : "promoteur", une séquence d'acide nucléique isolée essentiellement constituée par les éléments nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription d'un gène . La séquence d'un gène codant pour la protéine cspB de Lactococcus lactis, clone par les Inventeurs, et la séquence polypeptidique de cette protéine sont représentées sur la Figure 2, et dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO: 2. Les éléments nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription de ce gène sont situés dans la région 1-182 de la séquence représentée sur la Figure 2. Cette région est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3. Au sens de la présente Invention :
- on entend par : « homologue du gène cspB de Lactococcus lactis » tout gène bactérien, et en particulier tout gène de lactocoque, dont le produit de traduction présente plus de 72%, de préférence plus de 75% et avantageusement plus de 80% de similitude avec la séquence en acides aminés de la protéine CspB codée par ce gène ; on entend par : « promoteur homologue du promoteur du gène cspB de Lactococcus lactis » toute séquence constituant un promoteur bactérien inductible par le froid, et pouvant être obtenue en procédant au criblage, par des techniques classiques de biologie moléculaire, d'une banque d'ADN bactérien, en particulier d'ADN de lactocoque, à l'aide d'un ou plusieurs fragments de plus de 20pb de la séquence SEQ ID NO : 3. Les fragments de plus de 20pb des séquences
SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, qui permettent d'obtenir les homologues du gène cspB de Lactococcus lactis ou de son promoteur font également partie de l'objet de 1 ' invention.
L'objet de la présente Invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinant comprenant au moins une séquence d'ADN conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue. Au sens de la présente Invention on entend par
"hétérologue" relativement à une séquence donnée, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence.
Des molécules d'acide nucléique recombinant conformes à l'invention comprennent en particulier :
- des cassettes d'expression pour exprimer des gènes de réponse au choc par le froid conformes à 1 ' invention, tel que par exemple le gène codant pour la protéine CspB ; ces gènes peuvent être placés sous contrôle de promoteurs hétérologues , inductibles ou non, ou sous contrôle de son propre promoteur, associé à des séquences de régulation hétérologues ;
- des cassettes d'expression pour exprimer un gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur inductible par le froid conforme à l'invention, en particulier du promoteur du gène cspB. Ces cassettes comprennent au moins ledit promoteur et une séquence hétérologue comprenant un gène d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site de restriction permettant d'insérer ledit gène d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
Dans les cassettes d'expression conformes à 1 ' invention, le promoteur est avantageusement associé à d'autres séquences de régulation, actives chez les lactocoques ; il est par exemple associé, de manière classique, à une séquence terminateur placée en aval du gène à transcrire. On citera, à titre d'exemple non limitatif de séquences terminateur utilisables dans ce but, le terminateur du gène prtP de L. lactis, décrit par LEENHOUTS K.J. and VENEMA G., [Lactococcal plasmid vectors In: K.G. HARDY (ed) Plasmids . A pratical approach. Second Edition, IRL Press, Oxford, p. 65- 94(1993)], ou le terminateur de 1 ' opéron histidine, décrit par DELORME et al. [J. Bacteriol . 174, p. 6571- 6579, (1992) ] . Très avantageusement, et en particulier dans le cas de gènes dont l'expression est potentiellement néfaste pour la bactérie (il s'agit par exemple de gènes de protéines de lyse telles que des lysines, des holines, des autolysines) , le promoteur conforme à 1 ' invention est en outre associé à un terminateur de transcription supplémentaire, placé entre le promoteur et le gène.
On pourra utiliser dans ce cadre des terminateurs qui sont naturellement localisés en amont des gènes abi, par exemple : - le terminateur naturellement localisé en amont du gène aJbiDl, décrit par ANBA et al. [J. Bacteriol. 177, p. 3818-3823, (1995)]. Ce terminateur est constitué par les nucléotides 152-210 du fragment de 2369 pb représenté sur la figure 1 de cette publication. La séquence de ce terminateur est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. le terminateur naturellement localisé en amont du gène abi420 , et dont la séquence nucléotidique est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 5.
Les Inventeurs ont observé que lorsque 1 ' un de ces terminateurs est placé entre le promoteur inductible et le gène à transcrire, il permet de supprimer la transcription basale susceptible d'intervenir en dehors de toute induction du promoteur. En revanche, lorsque le promoteur est induit, la transcription peut passer au travers du terminateur et le gène est transcrit à un niveau convenable.
Des molécules d'acide nucléique recombinant conformes à 1 ' invention comprennent également des vecteurs recombinants comprenant un insert constitué par une séquence d'acide nucléique, en particulier un promoteur, ou par une cassette d'expression conformes à l'invention. Selon l'utilisation envisagée, on peut choisir soit un vecteur capable de se répliquer et de se maintenir dans la bactérie hôte sous forme de plasmide, tel que par exemple les plasmides pIL252 et pIL253 décrits par SIMON et CHOPIN, [Biochimie, 70, p. 559-566,
(1988)], soit un vecteur permettant l'intégration de l' insert qu'il porte dans 1 'ADN chromosomique de la bactérie-hôte, tels que par exemple les vecteurs décrits dans la Demande PCT WO 94/16086 au nom de BIOTEKNOLOGISK INSTITUT et CHR. HASSEN'S LABORATORIUM DANMARK A/S, ou bien le plasmide pG+host5 décrit par BISWAS et al. [J. Bact., 175, p. 3628-3635, (1995)].
De manière plus générale, des vecteurs plasmidiques ainsi que des vecteurs d'intégration utilisables chez les lactocoques sont décrits dans la revue de : LEENHOUTS K.J. and VENEMA G. (1993) . Lactococal plasmid vectors, In : K.G. HARDY (ed) Plasmids. A practical approach. Second Edition. IRL Press, Oxford, p. 65-94. ,
Un vecteur d'expression conforme à l'invention est représenté par le plasmide dénommé pTIL65 qui comprend un insert PstI de 3315 bp dans lequel le gène de la β-galactosidase est placé sous contrôle du promoteur du gène cspB de L. lactis .
Ce plasmide, hébergé par la souche de L. lactis dénommée TIL146, a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, le 6 Décembre 1996 sous le n° 1-1793.
L'Invention a en outre pour objet des bactéries transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. De préférence, ces bactéries sont des lactocoques .
L'expression de gènes de réponse au choc par le froid conformes à l'invention, en particulier le gène cspB ou des gènes homologues de lactocoques, dans des bactéries-hôte, en particulier des lactocoques transformées par une ou plusieurs copies de ce gène peut par exemple permettre d'accroître la résistance de ces bactéries au froid.
L'utilisation d'un promoteur inductible par le froid conforme à l'invention pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans des lactocoques présente en particulier l'avantage de permettre d'induire l'expression de ce gène de manière simple, ne nécessitant l'addition, d'aucune substance à la culture, et compatible avec la technologie fromagère.
L'expression d'un gène d'intérêt placé sous contrôle d'un promoteur inductible par le froid conforme à l'invention est obtenue en plaçant les cellules comprenant cette construction à une température inférieure à 20 °C, de préférence à une température de l'ordre de 15 °C. Un promoteur conforme à l'invention peut en particulier être utilisé pour l'expression de gènes de lyse, par exemple, pour l'expression d'une lysine de bactériophage, telle que par exemple celle du bactériophage <j>vML3 , décrite par SHEARMAN et al., [Mol.
Gen. Genêt. 218, p. 214-221 (1989)], ou pour l'expression de la lysine et de la holine du phage bIL67 [SCHOULER et al. Microbiology, 140, p. 3061-3069, (1994)]
Les promoteurs inductibles par le froid conformes à l'Invention peuvent aussi être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène codant pour une autolysine de lactocoque, telle par exemple celle décrite par BUIST et al. [Journal of Bacteriology, 177, n° 6, p. 1554-1563, (1995) ] .
Les promoteurs inductibles par le froid conformes à l'Invention peuvent également être utilisés pour l'expression d'enzymes impliquées dans la fabrication des fromages, et en particulier dans le développement de la flaveur, telles par exemple que des peptidases, des estérases, des lipases, des enzymes participant au catabolisme des acides aminés, etc....
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de clonage d'un gène conforme à l'Invention et de son promoteur, et de l'utilisation dudit promoteur pour obtenir l'expression induite par le froid, d'un gène hétérologue.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 - AMPLIFICATION PAR PCR DES GENES DE LA FAMILLE cspA A PARTIR DE LACTOCOCCUS LACTIS .
Des amorces dégénérées ont été construites à partir de 2 séquences conservées de différentes protéines appartenant à la famille cspA.
Ces deux séquences correspondent aux acides aminés 9-13 et 29-34 de la protéine CspA de E. coli .
Les séquences des amorces sont les suivantes : Amorce PI : 5 ' -GTNAARTGGTTYAA-3 ' Cette amorce comprend 14 nucléotides et est dégénérée 16 fois ;
Amorce P2 : 5 ' -AARTGNACRAANACRTC-3 '
Cette amorce comprend 17 nucléotides et est dégénérée 256 fois. Les séquences des amorces PI et P2 sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7.
Ces amorces ont été utilisées pour l'amplification par PCR à partir d'ADN total isolé de Lactococcus lactis subsp . cremori s .
Le mélange réactionnel (100 μl) comprend 150 ng d'ADN, 1 unité d'ADN polymérase Taq (APPLIGENE) utilisé avec le tampon fourni par le fabricant, 250 pmol de chaque amorce, 200 μM de chaque dNTP. La réaction est effectuée en 30 cycles comprenant 1 minute de dénaturation à 95°C, 2 minutes d'hybridation à 30°C et 2 minutes d'élongation à 75 °C dans un DNA Thermal Cycler 480 (PERKIN ELMER) . Un produit d'amplification de 75 pb, possédant la taille attendue d'après le choix des deux amorces, a été purifié par élution à partir d'un gel d'agarose NUSIEVE 3% (FMC BIOPRODUCTS) . Les extrémités ont été rendues franches par traitement avec l'enzyme Pfu DNA polymérase (PCR Polishing Kit, STRATAGENE) , et le fragment ainsi obtenu clone dans un plasmide pBluescript SK+ (STRATAGENE) préalablement linéarisé par Smal . Le plasmide ainsi chargé a été utilisé pour transformer des cellules E. coli TG1 ( supE hsdΔ5 thi Δ (lac-proAB) F' "traD36 proAB+ laclq lacZAM15] . Les cellules transformées comprenant le plasmide chargé ont été isolées et la séquence nucléotidique de 1 ' insert a été déterminée .
Parmi les 15 clones obtenus, 3 séquences d'ADN différentes ont été identifiées. Les séquences en acides aminés déduites sont représentées sur la figure 1 qui montre l'alignement des séquences des trois fragments différents amplifiés par PCR à partir de Lactococcus lactis, avec la région centrale (acide aminé 9-34) de la CspA de Escherichia coli , et avec la séquence partielle de la CspA de Lactococcus lactis . Les résidus identiques sont indiqués par des tirets et les résidus manquants sont indiqués par des points.
Ces séquences présentent des similitudes avec la région centrale de la protéine CspA de E. coli . Ces trois séquences sont différentes de la séquence partielle précédemment déterminée de la protéine CspA de Lactococcus lactis . Ces résultats montrent que plusieurs protéines (au moins 4) de la famille CspA sont présentes chez Lactococcus lactis . EXEMPLE 2 : CLONAGE ET SEQUENÇAGE DU GENE CSPB
Le gène cspB entier a été obtenu par PCR inverse. Une paire d'amorces divergentes, dont les séquences sont les suivantes :
Amorce P3 : 5 ' -GCCAAATCCTTTATCTGGATT-3 ' Amorce P4 : 5 ' -CACTTCAGAAGATGGTCAAGA-3 ' et qui correspondent à des séquences internes du fragment de 75 pb amplifié à partir du gène cspB, comme indiqué à l'exemple 1, a été utilisée.
Les séquences des amorces P3 et P4 sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9.
L 'ADN chromosomique total de Lactococcus lactis a été digéré par Xmnï et les fragments générés ont été religaturés sur eux-mêmes. Le mélange résultant a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR en utilisant la paire d'amorces divergentes.
Un fragment d'ADN de 1,6 b a ainsi été amplifié, et la séquence nucléotidique d'un sous-fragment de 488 pb a été déterminée. Cette séquence contient un cadre ouvert de lecture de 198 nucléotides, qui code pour une protéine de 66 acides aminés (7268 Da) ce qui correspond à la taille attendue d'une protéine CspA.
L'analyse des séquences en amont du cadre ouvert de lecture révèle la présence d'un site de liaison des ribosomes (RBS) potentiel, ainsi que la présence de deux régions -10 et -35 correspondant aux séquences consensus établies pour Lactococcus lactis . Une séquence potentielle de terminaison de la transcription a également été identifiée en aval du gène. La séquence complète du gène cspB de
Lactococcus lactis et la séquence polypeptidique déduite sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0:1, ainsi que sur la Figure 2.
Dans la séquence représentée Figure 2, le site potentiel de fixation des ribosomes est souligné en pointillés et le site potentiel de terminaison de la transcription, situé en aval du cadre ouvert de lecture est souligné. Les séquences consensus -10 et -35 sont soulignées par un double trait. Le site d'initiation de la transcription est encadré.
La comparaison de la séquence en acides aminés de la protéine CspB avec des séquences disponibles dans les banques de données révèle une similitude avec les protéines connues de la famille CspA. La similitude la plus importante a été relevée avec, dans l'ordre : la protéine CspL de Listeria monocytogenes (72%) , les protéines CspB et CspC de Bacillus subtilis (60 et 69%) et les protéines CspA et CspC de Escherichia coli (60 et 62% respectivement) . EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA TRANSCRIPTION DU GENE CSPB.
On sait que chez Escherichia coli , seulement certains des gènes de la famille CspA sont inductibles par le froid. Pour déterminer si le gène cspB de L. lactis appartenait à cette catégorie, le niveau de transcription de cspB à la suite d'un choc par le froid, ainsi que la taille du transcrit ont été étudiés.
Des bactéries Lactococcus lactis subs . cremoris AM2 ont été cultivées sur du milieu M17 en présence de lactose à 30°C jusqu'à une densité optique (650 nm) de 1. La culture a alors été répartie en trois portions différentes qui ont été incubées à 15°C, 10°C ou 5°C. Les ARN totaux de ces cultures ont été isolés au bout de 30 minutes, ou de 60 minutes selon le protocole décrit par ANBA et al. [J. Bact. 177, p. 3818-3823,
(1995)] . Un transfert de Northern a été effectué, et la détection a été faite en utilisant une sonde oligonucléotidique complémentaire d'une région non- conservée de la séquence nucléotidique du gène cspB
(séquence 236-254, figure 2). A chaque température, un seul transcrit a été détecté, dont la taille est d'environ 0,28 kb. Ce transcrit est présent à 30°C, et sa quantité augmente quand la température décroît, indiquant que cspB est inductible par le froid. Après 1 heure à 15°C, on observe une multiplication par 10 de la transcription, tandis que pour les températures plus basses (10°C ou 5°C) , l'induction après une heure est moins importante.
L'extrémité 5' des ARNm de cspB produits après le choc thermique à 15°C a été cartographiée, et comparée à celle de l'ARNm de cspB produit à 30°C. Deux sites d'initiation de la transcription, localisés à 86 pb et 85 pb en amont du codon d'initiation ont été trouvés dans les deux cas. Il apparaît donc que les régions -35 et -10 les plus en amont sont fonctionnelles dans les deux cas. EXEMPLE 4 : EXPRESSION D'UN GENE RAPPORTEUR SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR DU GENE CSPB.
Un fragment de 200 pb, comprenant 182 pb en amont du cadre ouvert de lecture, et les 18 pb codant pour les 6 premiers résidus de la protéine CspB a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes :
Amorce P5 : Il s'agit d'un oligonucléotide de 28 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -TCCCÇÇGGGATAGTTGCTTTCCTAACAG-3 ' (la séquence soulignée correspond à un site
Smal ) Amorce P6 : Il s'agit d'un oligonucléotide de 27 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -TCC£ÇÇ£GGTACAGTTCCTTTTGTCAT-3 ' (la séquence soulignée représente un site
Smal) .
Les séquences des amorces P5 et P6 sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 11. L'amorce P5 correspond à la séquence 1-19 de la séquence nucléotidique représentée sur la figure 2 et l'amorce P6 correspond au complémentaire de la séquence 182-200 de la même séquence de la figure 2.
Le produit d'amplification a été traité par Smal, et ligaturé dans le plasmide pMC1871 linéarisé avec Smal .
Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli HB101 (supE44 sdS20 recA13 ara-14 proA2 lacYl galK2 rpsL20 xyl -5 mtl- 1) . Les transformants ont été sélectionnés sur plaque d ' agar LB, contenant 10 μg/ml de tétracycline, et de 5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal) . Les clones contenant la construction dans la bonne orientation donnent des colonies colorées en bleu clair. Le produit de fusion du promoteur cspB et de la séquence codant pour la β-galactosidase, dénommé cspB- lacZ est un fragment de 3315 bp . Ce fragment a été excisé par digestion PstI, et clone dans le site PstI d'un plasmide de lactocoque dénommé pILnew. Ce plasmide a été converti en plasmide à faible nombre de copies en retirant un fragment Kpnl de 22 pb inséré à l'intérieur du gène copF, régulateur du nombre de copies du plasmide. Le plasmide résultant, dénommé pTIL65, a été introduit par électroporation dans la souche dépourvue de plasmides L . lactis subsp. cremoris MG1363, pour produire la souche TIL146. TIL146 a été cultivée en milieu M17 comprenant 0,5% de glucose et 10 μg/ml d ' érythromycine à une température de 30°C, jusqu'à une densité optique (650 nm) de 1. La culture a alors été répartie en 3 portions qui ont été transférées respectivement à des températures de 15°C, 10°C ou 5°C comme décrit à l'exemple 3 ci-dessus. L'activité spécifique de la β-galactosidase a été déterminée selon le protocole décrit par MILLER [Experiments in Molecular Genetics, p. 352-355. Cold Spring Harbor Laboratory. Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] .
Des aliquots de 1 ml des cultures bactériennes sont collectés à différents intervalles de temps, les cellules sont récupérées par centrifugation, lavées avec du tampon phosphate 100 mM, pH 7,4, préalablement porté à la même température que celle à laquelle les cellules ont subi le choc par le froid. Les cellules de la culture conservées à 30°C ont été utilisées comme contrôle. L'activité spécifique β-galactosidase a été déterminée sur des cellules entières, traitées avec du NP40 à 0,2% en présence du substrat chromogène ONPG (ortho- nitrophényl-β-D-galactoside) .
Légende de la Figure 3 :
La croissance cellulaire est évaluée par mesure de la densité optique à 650 nm à 30°C (--x--), et à 15°C (--0--).Les résultats sont illustrés par la figure 3 qui montre l'évolution de la croissance bactérienne et de l'activité β-gal en fonction du temps écoulé après le choc par le froid. L'activité β-gal est exprimée en "unités
Miller" (c'est-à-dire en variation de DO (420 nm) par minute, par ml de culture, et par unité de DO à 650 nm) , également à 30°C (— D —) et à 15°C (—O—) .
Une activité basale a été détectée à 30°C. Cette activité est constante au cours de la culture à 30°C. Lorsque les bactéries sont transférées à 15°C, l'activité spécifique de la β-galactosidase est augmentée ; elle est ainsi multipliée par 5 après 4 h à 15°C.
Ces résultats confirment le caractère inductible par le froid de cspB . En outre, ils indiquent que la région de 182 pb en amont du gène cspB est suffisante pour conférer l'induction par le froid. EXEMPLE 5 : CLONAGE DU GENE DE L' AUTOLYSINE DE L. LACTIS IL1403 EN AVAL DU PROMOTEUR INDUCTIBLE PAR LE FROID CSPB ET DU TERMINATEUR DE TRANSCRIPTION ABI105.
1. Clonage du terminateur de transcription abi!05.
Un fragment de 98 pb a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes :
Amorce Tl : il s'agit d'un oligonucléotide de 19 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -CGCGTCACAGTACTTGCCA-3 '
Amorce T2 : il s'agit d'un oligonucléotide de 23 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -GCTTGATAAACTGCAGCATATGT-3 ' .
Les séquences des amorces P5 et P6 sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. L'amorce Tl correspond à la séquence 1-19 de la séquence nucléotidique abiDl représentée figure 4 et l'amorce T2 correspond au complément de la séquence 77-99 de la même séquence dont la base 78 (A) a été remplacée par un (C) afin d'introduire un site de restriction Ndel au niveau du codon d'initiation de la transcription.
Après le polissage des extrémités, le produit d'amplification a été ligaturé dans le plasmide pBSKII+linéarisé avec EcoRV. Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer les bactéries E. coli NM522 supE thi -I A { lac-proAB) A (mcrB-hsdSM) 5 (rk-mk- ) [F' proAB lacIqZAM15 ] (STRATAGENE) . Les transformants ont été sélectionnés sur plaque d'Agar LB contenant 50μg/ml d' ampicilline . Après vérification de la séquence, un clone recombinant dont l' insert se trouve en sens inverse du gène de la β-galactosidase du plasmide pBSK+ a été sélectionné et nommé pTIL58. 2 - Clonage du promoteur cspB
Un fragment de 167 pb a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes :
Amorces P7 : il s'agit d'un oligonucléotide de 27 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -CCCTCGAGATAGTTGCTTTCCTAACAG-3 ' (La séquence soulignée correspond à un site Xhol) . Amorce P8 : il s'agit d'un oligonucléotide de
29 nucléotides de long, dont la séquence est la suivante :
5 ' -CCATCGATGTAAACCTTATTTTGTGAAAA-3 ' (La séquence soulignée correspond à un site Clal) .
Les séquences des amorces P7 et P8 sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15.
L'amorce P7 représente la séquence 1-18 de la séquence nucleotidique de la figure 2 et l'amorce P8 représente le complément de la séquence 135-155 de la même séquence .
Après le polissage des extrémités, le produit d'amplification a été ligaturé dans le plasmide pBSKII+ linéarisé avec EcoRV. Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer les bactéries E. coli NM522 supE thi -I Δ (lac-proAB) Δ (mcrB-hsdSM) 5 (rk-mk) [F'proABlaclqZΔM15]
(STRATAGENE) . Les transformants ont été sélectionnés sur plaque d'agar LB contenant 50μg/ml d' ampicilline . Après vérification de la séquence, un clone recombinant a été sélectionné et l' insert excisé par digestion avec les enzymes de restriction Xhol et Clal, puis inséré en amont du terminateur de transcription abil05 dans le plasmide pTIL58.
3 - Transfert de la cassette promoteur-terminateur dans le plasmide pILnew.
La cassette a été excisée par digestion du plasmide pTIL58 avec les enzymes de restriction Xhol et Sacl et clone dans le plasmide de L. lactis pILnew linéarisé par double digestion avec ces deux mêmes enzymes de restriction. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pTIL89.
Le plasmide pTIL89 a été converti en plasmide à faible nombre de copies en retirant un fragment Kpnl de 22pb inséré à l'intérieur du gène copF, régulateur du nombre de copies du plasmide. Le plasmide résultant dénommé pTIL92 a été introduit par électroporation dans la souche dépourvue de plasmide L. lactis subsp. cremoris MG1363, pour produire la souche TIL172.
4 - Addition du gène de 1 ' autolysine . Le plasmide purifié pTIL92 a été linéarisé par double digestion avec les enzymes de restriction Ndel et
BamHI.
La séquence du gène de l' autolysine majeure de
L. lactis IL1403 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 16. Cette autolysine est proche de celle décrite par BUIST et al.
[Journal of Bacteriology, 177, n° 6, p. 1554-1563,
(1995) ]
Le gène de l' autolysine a été excisé entre les sites Ndel situé au niveau du codon ATG et BamHI situé après la séquence terminatrice dudit gène et réintroduit entre les mêmes sites du plasmide pTIL92.
Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer les bactéries électrocompétentes L. lactis subsp. cremoris MG1363 pour produire la souche TIL173. 5 - Choc froid des bactéries recombinantes contenant la construction.
La souche TIL173 et la souche TIL172 (utilisée à titre de témoin) ont été cultivées en milieu M17 comprenant 0,5% de glucose et lOμg/ml d' érythromycine, à une température de 30°C, jusqu'à une densité optique (650 nm) de 1,0. La culture a alors été répartie en 2 portions : une restant à 30°C et l'autre transférée à une température de 15 °C pendant 4 heures, puis replacée à 30°C pour permettre à l'enzyme induite de s'exprimer. La densité optique des 2 cultures a été suivie pendant 80 heures (Figure 4) .
Légende de la figure 4 :
La croissance et la lyse cellulaires sont évaluées par mesure de la densité optique à 650 nm. Les mesures sont effectuées sur les cultures maintenues à 30°C (A) , et sur les cultures ayant subi le choc froid de 4h à 15°C (B) , pour la souche TIL172 ( ) et pour la souche TIL173 (O). Dans les cultures maintenues à 30°C, on observe une diminution de la DO, reflétant la lyse des cellules, qui est équivalente pour les souches TIL172 et TIL173. Dans le cas des cultures ayant subi le choc froid, on observe que la souche TIL173 se lyse environ 1,7 fois plus vite que la souche TIL172 témoin.
Ces résultats montrent que l'expression d'un gène de lyse placé sous contrôle du promoteur cspB peut être induite efficacement par un choc froid.
LISTE DE SEQUENCES
( 1 ) INFORMATIONS GENERALES :
( i ) DEPOSANT :
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
- I.N.R.A.
(B) RUE: 147, RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS CEDEX 07
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75341
(A NOM: CHAPOT-CHARTIER Marie Pierre (B RUE: 45 Boulevard Dubreuil - Bâtiment C (C VILLE: ORSAY (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 91400
(A NOM: SCHOULER Catherine (B RUE: 1 ter, rue Henri Barbusse (C VILLE: BOIS-D'ARCY (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 78390
(A NOM: CHOPIN Marie Christine (B RUE: 89 bis rue Blomet (C VILLE: PARIS (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L'INVENTION: CLONAGE D'UN GENE DE BACTERIE LACTIQUE
INDUCTIBLE PAR LE FROID ET DE SON PROMOTEUR, ET LEURS UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9615731
(B) DATE DE DEPOT: 20-DEC-1996
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire Iii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: -35_signal
(B) EMPLACEMENT : 62..68
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: -35_signal
(B) EMPLACEMENT: 104..110
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: -10_signal
(B ) EMPLACEMENT : 85..91
( ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE: -10_signal
(B) EMPLACEMENT: 121..127
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: RBS
(B) EMPLACEMENT: 167..173
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 183..384
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1:
ATAGTTGCTT TCCTAACAGT TTATCAAGAC TACCTTCATT ATTGAGGTGG TTTTTTATAG 60
GTTGACATGT AGCCTATATA ATGATATTAT AGACGAGTAG ATTTTGTCAT GAGTTAAATG 120
TATATTATAT TCACTTTTCA CAAAATAAGG TTTACAATTT TTGTTGAAAG GAAATAATTA 180
AT ATG ACA AAA GGA ACT GTA AAA TGG TTT AAT CCA GAT AAA GGA TTT 227 Met Thr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Pro Asp Lys Gly Phe 1 5 10 15
GGC TTT ATC ACT TCA GAA GAT GGT CAA GAT GTG TTC GCA CAC TTT TCA 275 Gly Phe Ile Thr Ser Glu Asp Gly Gin Asp Val Phe Ala His Phe Ser 20 25 30
CAA ATT CAA ACT TCA GGT TTT AAA ACA CTT GAT GAA GGC CAA AAA GTA 323 Gin Ile Gin Thr Ser Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gin Lys Val 35 40 45
ACT TTT GAT GTT GAA GCT GGT CAA CGT GGC CCT CAA GCT GTT AAT ATC 371 Thr Phe Asp Val Glu Ala Gly Gin Arg Gly Pro Gin Ala Val Asn Ile 50 55 60 GAA AAA GCA TAA A AGTAATTAAT GAAAAACGGA GCAATTTGCT TCGTTTTTTT 424
Glu Lys Ala * 65
TATTAAAACT TGTAATTATA AAATCTTATG ATATACTTAG CGCGGCAAGA GGAAACTCAC 484
CACT 488
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 67 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 2:
Met Thr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Pro Asp Lys Gly Phe Gly 1 5 10 15
Phe Ile Thr Ser Glu Asp Gly Gin Asp Val Phe Ala His Phe Ser Gin 20 25 30
Ile Gin Thr Ser Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gin Lys Val Thr 35 40 45
Phe Asp Val Glu Ala Gly Gin Arg Gly Pro Gin Ala Val Asn Ile Glu 50 55 60
Lys Ala * 65
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 182 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ii ) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique )
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 3 :
ATAGTTGCTT TCCTAACAGT TTATCAAGAC TACCTTCATT ATTGAGGTGG TTTTTTATAG 60
GTTGACATGT AGCCTATATA ATGATATTAT AGACGAGTAG ATTTTGTCAT GAGTTAAATG 120
TATATTATAT TCACTTTTCA CAAAATAAGG TTTACAATTT TTGTTGAAAG GAAATAATTA 180 AT 182
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 99 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 4: CGCGTCACAG TACTTGCCAC GCCTCTGCTT TGTATGCGCA TTATGGCCAG GCTTTTTTTT 60 TATCATTTTG AAGGAAAAAT ATGCTGCAGT TTATCAAGC 99
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 5: GCCCCTAAGA TCTAACCTTT ATATCTTAGG GGCTATTTTT TT 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 6: GTNAARTGGT TYAA 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 7: AARTGNACRA ANACRTC 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 8: GCCAAATCCT TTATCTGGAT T 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 9: CACTTCAGAA GATGGTCAAG A 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TCCCCCGGGA TAGTTGCTTT CCTAACAG 28
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: TCCCCCGGGT ACAGTTCCTT TTGTCAT 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CGCGTCACAG TACTTGCCA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GCTTGATAAA CTGCAGCATA TGT 3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: CCCTCGAGAT AGTTGCTTTC CTAACAG 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CCATCGATGT AAACCTTATT TTGTGAAAA 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1543 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AAACATTAAA TAAAAAACGT TTACAAACCG CCACATAATT GTCATCTTTT TCTTCCATTA 60 ACCGTGGTAA AATAGGGTAG TACTTATTTT ATTCTGTATT TTCAGGAAAG GAATTATTTA 120
TGCCAGTTTC TCGTATTAAA GTTAAAAATA GACATTTAAA AAAGAAAGCC AAAAAACCAC 180
TGGCTTTTTA TAAACCAGCG ACCAAATTTG CTGGCGCTGT TCTCATTGCA GGAACTTTGA 240
CGACCACTCA TGAGCTTTTG CTCCAACAAA CAAGCCCAAT GGTTCAGGCT GCAACCAATT 300
CCACAGAAGC TTTTATTGAA AGTATTGCTG CATCAGCAAA ACCAGTTGCC GATAGTAATG 360
GTCTTTATCC TTCAGTTATG ATTGCTCAAG CTATTTTGGA AAGTAACTGG GGTTCAAGCC 420
AACTTTCTCG TGCCCCCTAT TATAATTTAT TCGGTATTCA AGGAACTTAT CAAGGAAAAA 480
GCGTTGTTTT TAAAACTCAA GAATATCTCA ATGGTAAATG GGTCACAAAA GATATGCCAT 540
TTAGGGTTTA TCCTTCCTTT AATCAAAGTT TCCAAGACAA TGCTTATGTT TTAAAAACTA 600
CAAACTTTGG AAATGGTCCT TATTATGCTA AAGCTTGGCG AGCAAACGCG GCAACCTATC 660
AAGCTGCAAC CGCAGCCTTA ACAGGAAAAT ATGCAACTGA CCCTAATTAT GGTGCTTCCC 720
TGAATCGAAT TATTTCTCAA TATAATTTGA CTCGTTTTGA CGGTGCTTCT TCTGCTGGTA 780
CTTCTAATTC CGGTGGTTCA ACAGCTACAA ATACCAATAA TAATTCAAAT ACAAGCTCAA 840
CCACTTATAC AGTTAAATCT GGCGATACAC TTTGGGGAAT TTCGCAAAAA TATGGAATTA 900
GTGTTGCTCA AATTCAAAGC GCAAACAATC TTAAAAGTAC AGTCATCTAT ATTGGGCAAA 960
AGCTTGTATT GACAACTTCA AGTTCTTCGT CTAATACAAA TAGTTCAACT TCTTCAGGAA 1020
ATTCTGCCGG AACTACAACG CCTACTACTT CGGTCACTCC TGCCAAACCA GCTTCACAGA 1080
CGACGATTAA GGTTAAATCT GGTGATACGC TTTGGGGACT CTCTGTCAAA TATAAAACGA 1140
CGATTGCTCA ACTCAAGAGT TGGAATCATT TGAATTCTGA TACAATTTTC ATTGGACAAA 1200
ACTTGATTGT TTCACAATCT GCCGGTTCTT CAAGTTCTTC AACAGGTTCA AGCTCAGCCT 1260
CTACGAGTTC AACTTCTAAC TCTTCTGCAG CTTCAAATAC CTCTATCCAT AAGGTTGTTA 1320
AAGGAGATAC GCTTTGGGGA CTTTCACAAA AATCTGGTAG CCCAATTGCT TCAATTAAGG 1380
CTTGGAATCA TTTATCAAGT GATACCATTT TAATTGGTCA ATATCTTCGT ATTAAATAAT 1440
AAATTGTAAT TTATAAAATA TAAAAAGAAT GAAAGTTAAT TCATTCTTTT TTTAATTCTT 1500
TTAAAACAGA CTGAAGATGA ATCGATTGAG TCGGTTCAGA CAT 1543

Claims

REVENDICATIONS
1) Molécule d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué par :
- un gène de bactérie lactique codant pour une protéine exprimée chez ladite bactérie en réponse à un choc par le froid,
- le promoteur inductible par le froid, dudit gène .
2) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par un gène codant pour la protéine CspB de Lactococcus lactis, le promoteur dudit gène, et les gènes et promoteurs homologues.
3) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par :
- le gène cspB de Lactococcus lactis dont la séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1. - le promoteur dudit gène, situé dans la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3.
4) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 à 3, associé à un gène d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur ou un à un site de restriction permettant d'insérer ledit gène d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. 5) Vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, ou une cassette d'expression selon la revendication 4.
6) Bactéries transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3. 7) Utilisation d'un promoteur selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour contrôler l'expression d'au moins un gène d'intérêt dans des lactocoques . 8) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour une protéine induisant la lyse de la bactérie hôte.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite protéine induisant la lyse de la bactérie-hôte est choisie parmi les lysines et/ou les holines de bactériophage, et les autolysines bactériennes .
10) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour une enzyme impliquée dans la fabrication et l'affinage des fromages .
11) Utilisation d'un gène de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour augmenter la résistance au froid d'une bactérie transformée par ledit gène.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995031563A1 (fr) * 1994-05-12 1995-11-23 Quest International B.V. Systeme promoteur inductible complexe pouvant etre derive d'un phage d'une bacterie lactique, et son application a la production d'une proteine voulue dans une bacterie d'acide lactique

Patent Citations (1)

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WO1995031563A1 (fr) * 1994-05-12 1995-11-23 Quest International B.V. Systeme promoteur inductible complexe pouvant etre derive d'un phage d'une bacterie lactique, et son application a la production d'une proteine voulue dans une bacterie d'acide lactique

Non-Patent Citations (8)

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Title
CHAPOT-CHARTIER M.-P. ET AL.: "Characterization of cspB, a cold-shock-inducible gene from Lactococcus lactis, and evidence for a family of genes homologous to Escherichia coli cspA major cold-shock gene.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 179, no. 17, September 1997 (1997-09-01), pages 5589 - 5593, XP002060771 *
EMBL Database entry LLU60041; Accession no.U60041; 7 juillet 1996; Francis K.P. and Stewart G.S.A.B.: 'Detection and speciation of bacteria through PCR using universal major cold- shock protein amplimers.' *
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PANOFF J. M. ET AL.: "The cold shock response in Lactococcus lactis subsp. lactis.", CURRENT MICROBIOLOGY, vol. 29, no. 4, 1994, pages 213 - 216, XP002038662 *
VAN DE GUCHTE M. ET AL.: "Gene expression in Lactococcus lactis.", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, vol. 88, no. 2, 1992, pages 73 - 92, XP002038663 *

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FR2757523B1 (fr) 1999-02-19
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FR2757523A1 (fr) 1998-06-26

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