CA2091061C - Fragments d'adn codant pour un mecanisme resistance aux bacteriophages - Google Patents
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Abstract
l'invention concerne des fragments d'ADN codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi. Ces fragments sont susceptibles d'ètre obten us par clonage de l'ADN chromosomique ou plasmidique d'une souche de bactéries lactiques résistante aux bactériophages, ainsi que des polypeptides intervenant dans un mécanisme de résistance de type Abi, codé par ces fragments. L'invention englobe également des vecteurs recombinants et des souches bactériennes transformées, comprenant ces fragments d'ADN.
Description
~,\_ ;WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 FRANGhIENTS D'ADN CODANT POUR UN MECANISME DE RESISTANCE AUX BACTÉRIOPHAGES
L'Invention est relative au clonage de séquences d'ADN portant des gènes codant pour des méca-nismes de résistance aux phages chez les bactéries, en particulier les bactéries lactiques.
Certaines des bactéries responsables des fer-mentations sont très sensibles à l'attaque par les bacté-riophages, ce qui, étant donné l'importance des fermenta-tions lactiques en industrie agro-alimentaire, pose un problème économique considérable. De nombreuses tentatives ont en conséquence été faites depuis des années, pour apporter une solution à ce problème.
I1 a dans un premier temps étë proposé
d'utiliser pour la fermentation, des mutants naturels ou obtenus par mutagénèse, et sélectionnés pour leurs pro priétés de résistance aux bactériophages. Cette approche est toutefois considérablement limitée par le fait que, dans la plupart des cas, ces souches possèdent d'autres caractéristiques qui sont défavorables à leur utilisation, et qui sont, par exemple, une croissance très lente, ou bien la production de mêtabolites qui altèrent les quali-tés organoleptiques du produit fini. En outre, il est fré-quent qu'on observe, dans les conditions d'utilisation industrielle de ces souches, une réversion au phénotype sauvage, et donc une perte de résistance, au l'apparition d'une sensibilité à d'autres types de phages (CASSON et RAVIES, dans Advances in the Microbiology and Hiochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds Ravies F.L. & Law 8, 127-151, Elsevier Applied Science Publishers (1984)j. Ceci a pour conséquence le fait qu'un très petit nombre de souches mutantes est effectivement utilisé industrielle-ment.
Toutefois, l'étude de ces souches a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs mécanismes différents de résistance aux phages.
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCI~/FR91 /00722 _ _,.
L'Invention est relative au clonage de séquences d'ADN portant des gènes codant pour des méca-nismes de résistance aux phages chez les bactéries, en particulier les bactéries lactiques.
Certaines des bactéries responsables des fer-mentations sont très sensibles à l'attaque par les bacté-riophages, ce qui, étant donné l'importance des fermenta-tions lactiques en industrie agro-alimentaire, pose un problème économique considérable. De nombreuses tentatives ont en conséquence été faites depuis des années, pour apporter une solution à ce problème.
I1 a dans un premier temps étë proposé
d'utiliser pour la fermentation, des mutants naturels ou obtenus par mutagénèse, et sélectionnés pour leurs pro priétés de résistance aux bactériophages. Cette approche est toutefois considérablement limitée par le fait que, dans la plupart des cas, ces souches possèdent d'autres caractéristiques qui sont défavorables à leur utilisation, et qui sont, par exemple, une croissance très lente, ou bien la production de mêtabolites qui altèrent les quali-tés organoleptiques du produit fini. En outre, il est fré-quent qu'on observe, dans les conditions d'utilisation industrielle de ces souches, une réversion au phénotype sauvage, et donc une perte de résistance, au l'apparition d'une sensibilité à d'autres types de phages (CASSON et RAVIES, dans Advances in the Microbiology and Hiochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds Ravies F.L. & Law 8, 127-151, Elsevier Applied Science Publishers (1984)j. Ceci a pour conséquence le fait qu'un très petit nombre de souches mutantes est effectivement utilisé industrielle-ment.
Toutefois, l'étude de ces souches a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs mécanismes différents de résistance aux phages.
WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCI~/FR91 /00722 _ _,.
2 Trois mécanismes principaux de résistance aux phages ont été ainsi décrits chez la souche résistante Lactococcus lactis ME2 [KLAENHAMMER, J. Dairy Sci., ~, 3429-3443, (1989)].
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme d'interférence. avec l'adsorption", le produit du gène de résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
- Un deuxième mécanisme dénommé °mécanisme de restriction/modification" (R/M), fait intervenir une endo nucléase de restriction qui dégrade l'ADN du phage dès son entrée dans la bactérie. Toutefois, cette endonucléase est associée à une méthylase, dotée de la même spécificité ;
il s'ensuit que certains ADN phagiques modifiés par la mé-thylase peuvent échapper à l'action de l'endonucléase, et donner naissance à des particules infectieuses. Plusieurs systèmes R/M de spécificité différente ont été décrits ;
ces systèmes ont une efficacité variable . la fréquence d'apparition de particules virales renfermant un ADN modi-fié est comprise entre 10-1 et 10"8. Dans les conditions de culture industrielle, où lors d'une infection, appa-raissent de très nombreuses particules virales, l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante. Tou-tefois, lôrsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans une même bactérie, la protection conférée parait plus efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMfER, Plasmid, ~, 71-75 (1989)1.
~.es g~aes codant gour les m~can~,~~es de ty~t3 R/M connus ~usqu' à présent aat Cous une 3,GC~llisat~,on p~,as-midique.
- Le troi~idme tape d~ mécanisme de défense qui a été décrit est dénommé Nmécanisme d'infection abor-tiveN (Abi). Chez les souches bactériennes qui possèdent ce type de mécanisme, l'adsorption des phages est normale, mais la multiplication des phages pour donner naissance â
de nouvelles particules virales ne se produit que dans quelques cellules. En outre, les phages qui en résultent WO 92/05260 ~ ~ ~ ~- ~ ~ ~ PGT/FR91/00722
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme d'interférence. avec l'adsorption", le produit du gène de résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
- Un deuxième mécanisme dénommé °mécanisme de restriction/modification" (R/M), fait intervenir une endo nucléase de restriction qui dégrade l'ADN du phage dès son entrée dans la bactérie. Toutefois, cette endonucléase est associée à une méthylase, dotée de la même spécificité ;
il s'ensuit que certains ADN phagiques modifiés par la mé-thylase peuvent échapper à l'action de l'endonucléase, et donner naissance à des particules infectieuses. Plusieurs systèmes R/M de spécificité différente ont été décrits ;
ces systèmes ont une efficacité variable . la fréquence d'apparition de particules virales renfermant un ADN modi-fié est comprise entre 10-1 et 10"8. Dans les conditions de culture industrielle, où lors d'une infection, appa-raissent de très nombreuses particules virales, l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante. Tou-tefois, lôrsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans une même bactérie, la protection conférée parait plus efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMfER, Plasmid, ~, 71-75 (1989)1.
~.es g~aes codant gour les m~can~,~~es de ty~t3 R/M connus ~usqu' à présent aat Cous une 3,GC~llisat~,on p~,as-midique.
- Le troi~idme tape d~ mécanisme de défense qui a été décrit est dénommé Nmécanisme d'infection abor-tiveN (Abi). Chez les souches bactériennes qui possèdent ce type de mécanisme, l'adsorption des phages est normale, mais la multiplication des phages pour donner naissance â
de nouvelles particules virales ne se produit que dans quelques cellules. En outre, les phages qui en résultent WO 92/05260 ~ ~ ~ ~- ~ ~ ~ PGT/FR91/00722
3 ne sont pas capables d'accomplir un cycle lytique complet lorsqu'ils infectent une nouvelle Cellule.
Tous les mécanismes de type Abi décrits jusqu'à présent sont codés par des gènes portés par des plasmides [McKAY et al, Appl. Environ. Microbiol., ~,7, 68 74 (1984)] ; [KLAENHAMMER et SANOZKY, J. Gen. Microbiol.
1531-1541 (1985)] ; [GRUTIER et CHOPIN, Appl.
Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)] ;
[DALY et FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. &
Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] ;
[LAIBLE et a'1. J. Dairy Sci. ~, 2211-2219 (1987)] ;
[MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. ,~,, 1951-1956 (1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol. ,5,~,, 777-783 (1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. ~, 275-284 (1988)].
Le gène codant pour un mécanisme de résistance de type Abi, dénommé Hsp, qui est porté par le plasmide pTR2030 a été cloné et séquencé [HILL et al., Appl.
Environ. Microbiol., ~, 2255-2258 , (1990)]
Les modes d'action des mécanismes de résis-tance du type Abi n'ont pas encore été élucidés ; il appa-raît toutefois que l'infection abortive peut résulter de plusieurs systèmes ayant des mécanismes d'action diffé-rents, actifs sur différents phages, et à différents niveaux sur la prolifération virale. I1 a par exemple été
montré que le plasmide pTR2030 est plus actif sur les phages appartenant au groupe dit des "petits phages à t8te isométrique" que sur ceux appartenant au groupe des "grands phages à tâte isométrique" ou au groupe'des phages "à tâte allongée".
Des observations du même type, concernant une résistance spécifique à l'attaque par un groupe de phages, ont été faites sur d'autres plasmides portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance de type Abi [DALY
et FITZGERALD, (1987) ; FROSETH et al., ((1988) ; MURPHY
. ~(~~.~~J~1
Tous les mécanismes de type Abi décrits jusqu'à présent sont codés par des gènes portés par des plasmides [McKAY et al, Appl. Environ. Microbiol., ~,7, 68 74 (1984)] ; [KLAENHAMMER et SANOZKY, J. Gen. Microbiol.
1531-1541 (1985)] ; [GRUTIER et CHOPIN, Appl.
Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)] ;
[DALY et FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. &
Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] ;
[LAIBLE et a'1. J. Dairy Sci. ~, 2211-2219 (1987)] ;
[MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. ,~,, 1951-1956 (1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol. ,5,~,, 777-783 (1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. ~, 275-284 (1988)].
Le gène codant pour un mécanisme de résistance de type Abi, dénommé Hsp, qui est porté par le plasmide pTR2030 a été cloné et séquencé [HILL et al., Appl.
Environ. Microbiol., ~, 2255-2258 , (1990)]
Les modes d'action des mécanismes de résis-tance du type Abi n'ont pas encore été élucidés ; il appa-raît toutefois que l'infection abortive peut résulter de plusieurs systèmes ayant des mécanismes d'action diffé-rents, actifs sur différents phages, et à différents niveaux sur la prolifération virale. I1 a par exemple été
montré que le plasmide pTR2030 est plus actif sur les phages appartenant au groupe dit des "petits phages à t8te isométrique" que sur ceux appartenant au groupe des "grands phages à tâte isométrique" ou au groupe'des phages "à tâte allongée".
Des observations du même type, concernant une résistance spécifique à l'attaque par un groupe de phages, ont été faites sur d'autres plasmides portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance de type Abi [DALY
et FITZGERALD, (1987) ; FROSETH et al., ((1988) ; MURPHY
. ~(~~.~~J~1
4 et al., (1988)(publications citêes plus haut)] ; STEELE et McKAY, Plasmid, ~, 32-43 (1989)].
D'autres plasmides, par exemple le plasmide pIL105 [GAUTIER et CHOPIN, App. Environ. Microbiol., 5~, 923-927 (1987)], et pAJ1106 [JARVIS, App. Environ.
Microbiol. ,5~ 77-783 (1988)] codent toutefois pour des mécanismes de résistance Abi qui ont une spécificité dif-férente des précédents et sont efficaces à la fois sur les phages "isométriques" et les phages "à tète allongée".
D'autres observations montrent également qu'il existe plusieurs systèmes de résistance de type Abi ; des expériences d'hybridation entre différents plasmides Abi ont suggéré que des loci différents êtaient impliqués [STEELE et al., Appl. Envirôn. Microbiol., ,5"~, 2410-2413 (1989)]. I1 a également été observé que la résistance aux phages était augmentée lorsque plusieurs séquences d'ADN
codant pour des mécanismes Abi étaient associés.
I1 a été proposé d'utiliser des plasmides codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour transférer cette résistance chez des souches utilisées dans l'industrie. Par exemples, des souches bactériennes contenant le plasmide auto-transférable pTR2030 ont été
utilisées avec succès en fermentation industrielle, et ont montré une bonne résistance à l'attaque par les bactério-phages, ce qui montre l'intérêt réel des gènes de résis-tance du type Abi.
Toutefois, le plasmide PTR2030, comme la plu-part des plasmides de résistance aux phages décrits dans l'art antérieur, et dont l'utilisation a été suggérée, est un plasmide "naturel" présent dans des souches résistantes et transmis à d'autres souches par conjugaison bacté-rienne. L'utilisation de tels plasmides comporte certaines limites ; il faut que ces plasmides soient transférables, ou qu'il puissent être associés à un plasmide mobilisa-teur ; il faut également qu'ils soient stables dans la bactérie-h8te et qu'ils ne portent pas de gènes modifiant ~'~:~ WO 92/05260 '~ ~ ~i~ ~ ~
son phénotype de façon défavorable ; il faut en outre, pour pouvoir associer chez une même bactérie, différents mécanismes de résistance aux phages, que les plasmides concernés soient compatibles entre eux. Enfin, cette tech-
D'autres plasmides, par exemple le plasmide pIL105 [GAUTIER et CHOPIN, App. Environ. Microbiol., 5~, 923-927 (1987)], et pAJ1106 [JARVIS, App. Environ.
Microbiol. ,5~ 77-783 (1988)] codent toutefois pour des mécanismes de résistance Abi qui ont une spécificité dif-férente des précédents et sont efficaces à la fois sur les phages "isométriques" et les phages "à tète allongée".
D'autres observations montrent également qu'il existe plusieurs systèmes de résistance de type Abi ; des expériences d'hybridation entre différents plasmides Abi ont suggéré que des loci différents êtaient impliqués [STEELE et al., Appl. Envirôn. Microbiol., ,5"~, 2410-2413 (1989)]. I1 a également été observé que la résistance aux phages était augmentée lorsque plusieurs séquences d'ADN
codant pour des mécanismes Abi étaient associés.
I1 a été proposé d'utiliser des plasmides codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour transférer cette résistance chez des souches utilisées dans l'industrie. Par exemples, des souches bactériennes contenant le plasmide auto-transférable pTR2030 ont été
utilisées avec succès en fermentation industrielle, et ont montré une bonne résistance à l'attaque par les bactério-phages, ce qui montre l'intérêt réel des gènes de résis-tance du type Abi.
Toutefois, le plasmide PTR2030, comme la plu-part des plasmides de résistance aux phages décrits dans l'art antérieur, et dont l'utilisation a été suggérée, est un plasmide "naturel" présent dans des souches résistantes et transmis à d'autres souches par conjugaison bacté-rienne. L'utilisation de tels plasmides comporte certaines limites ; il faut que ces plasmides soient transférables, ou qu'il puissent être associés à un plasmide mobilisa-teur ; il faut également qu'ils soient stables dans la bactérie-h8te et qu'ils ne portent pas de gènes modifiant ~'~:~ WO 92/05260 '~ ~ ~i~ ~ ~
son phénotype de façon défavorable ; il faut en outre, pour pouvoir associer chez une même bactérie, différents mécanismes de résistance aux phages, que les plasmides concernés soient compatibles entre eux. Enfin, cette tech-
5 nique ne permet pas le transfert de gènes de résistance qui seraient portés, non par l'ADN plasmidique, mais par l'ADN chromosomique. I1 est donc particulièrement souhai-table de cloner les gènes responsables de ces mécanismes de résistance afin de pouvoir les insérer à volonté dans des vecteurs recombinants appropriés, compatibles entre eux et compatibles avec la bactérie hôte que l'on sohaite transformer.
La présente Invention s'est fixé pour but la mise en évidence et le clonage de séquences d'ADN codant pour des mécanismes de résistance à l'attaque par des bac tériophages, et l'obtention de plasmides recombinants, comprenant ces gènes et permettant leur transfert et leur expression dans des souches bactériennes impliquées dans des fermentations industrielles.
La présente Invention a pour objet des frag ments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homo logue de celle de tout ou partie d'au moins un fragment choisi dans le groupe constitué par - le fragment codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 416, dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
Ce fragment représente une portion d'un frag-ment ~I-,EçQRI de 2 kb environ, du plasmide pIL353, lequel fragment est cloné à partir de l'ADN de L. lattis ssp lattis IL416.
- l''insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lattis ssp cremoris IL420, et comprend au ~~~'~.~!31
La présente Invention s'est fixé pour but la mise en évidence et le clonage de séquences d'ADN codant pour des mécanismes de résistance à l'attaque par des bac tériophages, et l'obtention de plasmides recombinants, comprenant ces gènes et permettant leur transfert et leur expression dans des souches bactériennes impliquées dans des fermentations industrielles.
La présente Invention a pour objet des frag ments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homo logue de celle de tout ou partie d'au moins un fragment choisi dans le groupe constitué par - le fragment codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 416, dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
Ce fragment représente une portion d'un frag-ment ~I-,EçQRI de 2 kb environ, du plasmide pIL353, lequel fragment est cloné à partir de l'ADN de L. lattis ssp lattis IL416.
- l''insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lattis ssp cremoris IL420, et comprend au ~~~'~.~!31
6 moins _un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 420.
- le fragment dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences sous le numêro SEQ ID NO . 3 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 4 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . S.
Les séquences SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO .
4, et SEQ ID NO . 5, constituent des cadres ouverts de lecture respectivement dénommés ORF2, ORF3 et ORF1.
L'Invention englobe également l'insert de 5,7 kb environ du plasmide pIL618, dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2, et dont les séquences SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO . 4, et SEQ ID NO . 5, représen-tent des segments. Cet insert de 5,7 kb est cloné à partir de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. lactis spp.
cremoris. IL964, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 105.
Au sens de la présente Invention, on entend comme séquence homologue, toute séquence ne différant des séquences conformes à l'Invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un, petit nombre de bases, à
conditions bien sflr que la séquence ainsi modifiée conserve les propriétés fonctionnelles essentielles des séquences de l'Invention.
Dans ce cadre, on considèrera en particulier comme homologues deux séquences nucléotidiques qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent poux un méme polypeptide.
La présente Invention englobe également tout segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'une "..W0 92/05260 ~ ~ PCT/FR91/00722
- le fragment dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences sous le numêro SEQ ID NO . 3 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 4 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . S.
Les séquences SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO .
4, et SEQ ID NO . 5, constituent des cadres ouverts de lecture respectivement dénommés ORF2, ORF3 et ORF1.
L'Invention englobe également l'insert de 5,7 kb environ du plasmide pIL618, dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2, et dont les séquences SEQ ID NO . 3, SEQ ID NO . 4, et SEQ ID NO . 5, représen-tent des segments. Cet insert de 5,7 kb est cloné à partir de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. lactis spp.
cremoris. IL964, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 105.
Au sens de la présente Invention, on entend comme séquence homologue, toute séquence ne différant des séquences conformes à l'Invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un, petit nombre de bases, à
conditions bien sflr que la séquence ainsi modifiée conserve les propriétés fonctionnelles essentielles des séquences de l'Invention.
Dans ce cadre, on considèrera en particulier comme homologues deux séquences nucléotidiques qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent poux un méme polypeptide.
La présente Invention englobe également tout segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'une "..W0 92/05260 ~ ~ PCT/FR91/00722
7 des séquences codant pour des -mécanismes Abi telles que identifiées ci-dessus, ce qui comprend en particulier des sondes d'acide nucléique obtenues à partir desdites séquences, ainsi que les fragments d'ADN de bactéries lac s tiques clonés en utilisant lesdites sondes.
Les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 ont été comparées avec la séquence codant pour le mécanisme Hsp, décrite par HILL et al. [App. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258 (1990)J.
Aucune similitude n'a été établie entre ces séquences.
D'autre part, aucune hybridation n'a été
observée entre l'insert de 9,4 kb codant pour le mécanisme Abi 420 et un fragment de 456 pb provenant du gène codant pour le mécanisme Hsp.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'il com-prennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini plus haut. Dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier - le plasmide pIL353 . un échantillon de la souche de L. Iactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt I-999 ;
- le plasmide pIL352 . un échantillon de la souche de L, lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1000 ;
- le plasmide pIL618 . un échantillon de la souche de L. lattis ssp lattis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1001.
WO 92/05260 2 ~ ~ PCT/FR91/00722 ~~ :, ~~
a L'Invention a également pour objet les polypeptides suivants .
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture de la séquence SEQ ID NO . 1, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 6.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF.2, et dont la séquence C-terminale figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 7.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 3, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 8.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 1, et dont la séquence figure dans la liste des sêquences sous le numéro SEQ ID NO . 9.
La présente Invention a en outre pour objet des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à
l'Invention codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi.
Lesdits fragments peuvent être portés par des plasmides, ou bien intégrés dans le chromosome bactérien par recombinaison ou transposition.
Selon un mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mëca nisme Abi différent.
Selon un autre mode de réalisation préféré. des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un méca nisme Abi différent.
Selon une disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN
codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur.
.:. WO 92/05260 PCT/FR91 /00722 Selon une autre disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont por-tés par des vecteurs diffêrents.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de ,plasmides recombinants, et de microorganismes transformés conformes à l'Invention.
I1 va de soi, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correpondantes, sont donnés uni-quement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
SEMPLE 1 . CLONAGE D' ON FRAGMENtr D' ADN CODANT POaR Lrr.
MR!C!àNT-SMR DE REST~'''AN~'R ADX PiIlrC,ZEg ,ha La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits par MANIATIS et al. [(Molecular cloni,ng : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.(1982)].
Le séquençage des différents fragments d'ADN a été effectué sur chaque brin, par la méthode des di-désoxynucléotides, à l'aide d'un séquenceur 370 A (Applied Biosystems, San Jose, California), en suivant le protocole préconisé par le fabricant.
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection du laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10 kb sont ligués au site gril du plasmide pIL253 portant un gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253 et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie ~Q", 559-566 (1988)].
La digestion de l'ADN bactérien et la ligation dans le plasmide sont effectués selon les protocoles décrits par SIMON et al. [FEMS. Microbiol. Lett. ;,~, 239-241 (1985)] et LOUREIRO DOS SANTOS et CHOPIN, (FEMS
5 Microbiol Litt., ~, 209-212 (1987)].
Le produit de ligation est utilisé pour trans-former des bactéries de la souche L. Lactis ssp lactis IL1403, qui est une souche dépourvue de plasmides [CHOPIN
et al., Plasmid, j,,,Z, 260-263 (1984)], par transformation 10 de protoplastes selon la technique décrite par SIMON et al., [Appl. Environ. Microbiol., ~,, 394-395 (1986)]. Les bactéries résistantes à l'ézythromycine sont ensuite sélectionnées sur la base de leur résistance aux phages ;
des colonies incluses dans un milieu à l'agar sont 15 dispersées dans une solution saline, à l'aide d'un mélan-geur ULTRA-TURAX""' 'f18/20 (20.000 rpm et 2 ml de la suspen-sion sont utilisées pour inoculer 100 ml de milieu M17 (TERZAGHI et SANDINE, Appl. Microbiol. ~, 807-813 (1975)]
dans lequel le lactose est remplacé par du glucose 20 (Ml7glc), et contenant 5~tg/ml d'érythromycine. Aprés incubation pendant une nuit à 30'C, 100 X11 de différentes dilutions de la culture sont mélangés à 50 [t1 de CaCl2 O, 1 M, et 107 particules phagiques.
Après 5 mn à température de la pièce, 3 ml de 25 milieu Ml7glc agar additionné d'ézythromycine sont ajou tés, et le mélange est versé à la surface d'un milieu de culture solide Ml7glc agar + érythromycine. Des cultures de contrôle sont effectuées, avec une culture de la souche IL1403, en l'absence d'ézythromycine.
30 Les colonies résistantes aux phages sont clonées.
Dans ces conditions un clone résistant à
l'attaque phagique et contenant un plasmide recombinant portant un insert de 5 kb environ a été cloné. Ce plasmide 35 recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit ,<::.,WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCf/FR91/00722 plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt I-999 La figure 1 montre la carte de restriction du ~~
plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restric-tion sont indiquées en kb.
A partir du plasmide pIL353 un fragment ~I-SRI de 2,1 kb contenant la totalité de la séquence codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce fragment a été séquencé, et le gène codant pour le méca-nisme Abi 416 a été identifié.
La séquence de gène est indiquée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 1.
Le séquençage de l'insert de 2,1 kb a égale ment mis en évidence la présence sur celui-ci, immédiate ment en amont du gène de structure du mécanisme Abi 416, d'une séquence d'insertion du type ISS1 ; les séquences promoteur du gène Abi 416 sont situées dans cette séquence d'insertion.
$~,~LE 2 : OIaONàGB D' ûN P'RAGL~NT D8 9 . 5 kb DE L' ADN
TOTlL DE L~ SOOCI;E L . r ~!CTrS SSP LACTIS =Ld ~ n _ GODANT PO1QR L8 MECANI8b18 Abi 420 L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420 (Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) a été digéré par l'endonucléase Sau3A, et cloné
dans le plasmide pTL252 [Simon et Chopin, Biochimie ~,Q,, 559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Aprés transformation,de bactéries de la souche L. lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
Cet insert est porté par le plasmide recombi-nant pIL352, dont la carte de restriction est montrée ~ , figure 2. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp ~r WO 92/05260 ~ ~; S~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 , . .
lactis IL3128, contenant- ledit plasmide, a étë dêposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1000 Des expériences d'hybridation ont été
effectuées entre l'insert de 9,4 kb et un fragment de 456 pb provenant du gène Hsp décrit par HILL et al. Aucune hybridation n'a été observée, non seulement en conditions stringentes (42'C, tampon à 50$ de formamide) mais aussi en conditions non stringentes (42'C, tampon à 25~ de formamide).
CLONAGE D' ON FRArr~nrrrr D ~ ADN DQ PLI s~Tn~
1ZL105, CODANT POUR LR ~~ArJr~ at,t ~ n~
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER .
et CHOPIN (App. Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce plasmide est digéré par ~3A et cloné dans le site ,g,~HI de pIL252, selon la procédure décrite à l'exemple 1.
Un plasmide recombinant portant un insert de 6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été
sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte de restriction est montrée figure 3.~~
Un fragment ~çç$V-~I de 700 pb a étê excisé
de l' insert de 6, 4 kb de pIL305 ; le plasmide résultant, contenant un insert de 5,7 kb, a été dénommé pIL618 , un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1001 t / L'insert de 5,7 kb a été partiellement vséquencê. La fi ure 4 montre ' 9 1 organisation de cet insert . (~1 - Séquences répétées inversées de ISS1 ;
Tnase - Transposase de ISS1 ; .... - séquence non déterminée).
WO 92/05260 ~ fl ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 La séquence SEQ ID NO : 2 représente environ 4,6 kb des 5,7 kb de l'insert (les bases sont numérotées de façon continue, sans tenir compte des parties non séquencées). Cette séquence comprend 4 cadres ouverts de lecture.
L'un d'entre eux, commençant à la base 2289 de la SEQ ID NO : 2, appartient à un élément d'insertion de type ISS1, et correspond à la séquence codant pour la transposase de ISS1.
Les 3 autres cadres ouverts de lecture sont respectivement dénommés ORF 2, ORF 3 et ORF 1.
La séquence partielle (codant pour l'extrémité
C-terminale du polypeptide) de ORF 2 est comprise entre ' les bases 1 et 677 de la séquence SEQ ID NO . 2. Cette même séquence figure séparément dans la liste des séquence sous le numéro SEQ ID NO . 3.
La séquence de ORF 3 est comprise entre les bases 670 et 1140 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 4.
La séquence de ORF 1 est comprise entre les bases 3177 et 4001 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 5.
II. - RE~T_STA_NCE A L'ATTAQUE pus~TnrrR r!n~RER
PAR DES PLASM=DEa pOgT~rrr LES BEOQENCEa D!,~ntJ s~~' 4? 6.~, èbi 420 et Abi 105 F.~i.
L'étude a été effectuée en utilisant comme témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Les souches transformées par les plasmides pIL352 et pIL353 et pIL618 sont respectivement dênommées IL1403/pIL352 et IL403/pIL353, et IL1403/pIL618.
Des e5cpériences d'adsorption effectuées au préalable montrent que l'adsorption des particules pha giques est identique pour la souche témoin IL1403 et pour WO 92/05260 ~ ~ ~ ~' ~N ~ ~ PCT/FR91/00722 les souches transformées (de l'ordre de 97~ en 15 minutes).
Une expérience de croissance en une seule étape, a été effectuée selon le protocole suivant .
Une culture de bactéries lactiques au milieu de la phase de croissance exponentielle est mise en sus-pension dans du milieu frais à une concentration de 107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à
106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Le mélange est incubé pendant 10 minutes pour permettre l'adsorption des phages, puis dilué 10 fois, en présence de sérum antiphage, et incubé pendant 5 minutes à
37'C, -ce qui permet de neutraliser environ 99~ des phages non adsorbés.
Le mélange est ensuite dilué à nouveau dans du milieu M17 pour stopper l'action de l'antisérum, puis incubé à 30'C. Pendant cette incubation, des aliquots de 1 ml sont prélevés, à 5 minutes d'intervalle et étalés sur plaques de milieu solide.
Les plages de lyse obtenues pendant la période de latence donnent le nombre de centres infectieux. Celles obtenues pendant la phase finale stationnaire donnent le nombre de phages résultant de la multiplication des phages utilisés pour l'infection. Le rendement unitaire, qui permet d'évaluer la multiplication des phages, est obtenu ,en divisant le nombre de phages après multiplication, par ~'~le nombre de centres infectieux.
U La figure 5 montre le résultat de cette expé
rience . le nombre de PFU par ml est représenté en fonc tion du temps (en minutes), après l'infection, pour les souches IL1403 (O), IL1403/pIL618 (O), IL1403/pIL353 (~), IL1403/pIL352 (1) La période de latence est similaire pour toutes les souches. Le nombre de centres infectieux obtenus sur les souches IL1403/pIL352, IL1403/pIL353 et IL403/pIL618 représente respectivement 0,2~, 12~ et 3~ des jWO 92!05260 ~ ~ ~1 ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche IL1403/pIL352, à 25 pour la souche IL1403/pIL353, et 50 pour IL1403/pIL618.
5 Les plages de lyse formées par le phage bIL66 sur ces souches transformées, sont très petites, turbides, et à peine visibles, ce qui est observé dans les infec tions virales abortives. En outre, les phages obtenus à
partir de ces plages ne sont plus infectieux pour Les 10 souches bactériennes transformées.
EXEMPLE 5 . C'OMPARAr_gON DES MECANIE~S =Abi 105 .~~ d2n et Abi 416 Différents types de phages attaquant les bac téries lactiques ont été utilisés pour cette expérimenta 15 tion . les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isomé
trique ; les phages bIL188 et bIL67 sont de type à tête allongée.
Le Tableau I montre les résultats obtenus .
TABLBAQ Z
Phage bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188 Plasmide Abi 416 + + + - -Abi 420 + + - - -Abi 105 + + + + +
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5 phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420 sont actifs seulement sur les phages isométriques. Seul le mécanisme Abi 416 est actif sur le phage bIL170.
$~CEMPLE 6 . EggET CON~OTNT DE~MECrA~T~9 Aha ~
Abi 416 et Abi 420 Cet effet est étudié en introduisant les frag-ments d'ADN portant les gènes codant pour ces 3 mécanismes, dans la bactérie IL1403. , WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR9~/00722 ..:-v,, Comme les plasmides pIL252 et pIL253 sont incompatibles, l'insert de 5 kb du plasmide pIL353 a été
transféré au site ~lII du vecteur plasmidique pGKV259 [Van der Vossen et al., appl. Environ. Microbiol. ~, 2452-2457 (1987)J, le plasmide ainsi obtenu, dénommé
pIL377 est compatible à la fois avec le plasmide pIL105 (portant le gène Abi105) et le plasmide pIL353. Ces plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
,,.:,>,;s WO 92/05260 ~ PC7"/FR91/00722 Le tableau II montre les résultats obtenus.
TAHLRATT TT
PFU/ml bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188 Souche IL1403 3.9x108 7.7x109 6.3x108 6.3x108 2.7x107 IL1403 5.Ox102*l.Ox107*<10 1.4x109 9.6x107 (pIL377) IL1403 5.Ox103*l.Ox105*1.2x109 1.5x108 1.2x107 (pIL352) 1 IL1403 5.Ox104*8.Ox107*5.Ox103*<10 <10 (pIL105) (pIL377, <10 <10 <10 5.7x108 5.7x107 pIL352) (pIL377, <10 l.Ox10.4*<10 <10 <10 pIL105) (pIL352, <10 2.Ox105*2.OX103*<10 <10 pIL105) (pIL377, <10 <10 <10 <10 <10 pIL352, pIL105) *Plages turbides peu visibles.
Une synergie de l~efficacité de ces mécanismes est en outre observée. Par exemple, le nombre de plages formées par le phage bIL 38 est divisé par 106 sur la souche IL1403/pIL377, par 106 sur la souche IL1403/pIL4105 et par plus de 108 sur la souche IL1403/pIL105/pIL 377, WO 92/0S260 ~ ~ ~ ~ v, PCT/FR91/00722 ...-.,:.
par rapport au nombre de plages formées sur la souche IL1403.
Des résultats similaires sont observés pour les autres pliages dans la plupart des combinaisons étudiées.
Lorsque les 3 mécanismes Abi sont associés dans une même bactérie, l'infection phagique est pratique-ment inexistante. Ceci a été confirmé par une expérience de croissance en une seule étape effectuée avec bIL66 sur la souche IL1403/pIL352/pIL105/pIL377 ; le nombre de cel-lules infectées et de pliages libérés était en dessous du seuil de sensibilité de la méthode.
Ainsi que cela ressort de ce qui prêcède, l' Invention ne se limite nullemer,.t à ceux de ses modes de . 15 mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s~êcarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention.
a ..., WO 92/0S260 SEQ. ID N' . 1 TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide LONGÜEÜR DE LA SEQûENCE : 960 paires de bases TYPE D8 MOLBCÜLE : ADN génomique ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416 PROPRIETES . Gène codant pour le mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 416 CARACTERISTIQUBS : Les séquences soulignées représentent .
- De 80 à 89 pb : site de liaison aux ribosomes - De 8 à 14 pb, et de 34 à 38 pb : promoteurs -35 et -10 - De 901 à 926 pb : séquence terminateur TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACAGACTTATCAGAA
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAAT~TAAT
GAT
CAG
CCA
AAA
ATT
GAA
AAA
CTA
AAT
ACA
GAA
GAA
ATA
GAG
GGA
AAA
GCT
AAA
ATC
ATTTGA CAAAATTAAATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA
CTAATAAAGTA AT CTT A TT~_rmrAGCTGTTTTTGTGTATACT 941 . A .A
T ..
WO 92/05260 ~ ~ c.~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 r..:,.-,~..
SEp. ID NO : 2 20 TYPE DE SEQUBNCE : Nucléotide >;ONGÜEDR D8 IDA SEQUBNCE : 4, 6 kb environ TYPE DE MOLBCOLE : ADN génomique ORiGINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 PROPRIETES : comprend au moins un gène intervenant dans le mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 105 C~rR,ACTERISTIQQES
- De 1 à 677 pb : cadre ouvert de lecture ORF2 - De 670 à 1140~pb : cadre ouvert de lecture ORF3 - De 2289 à 2777 pb . cadre ouvert de lecture de la transposase de ISS1 (partiellement séquencé) - De 3177 à 4001 pb : cadre ouvert de lecture ORF1 De 2229 à 2246 pb et de 2833 à 2851 . séquences repétées inversées de ISS1 ./
N~AG~TAT~TCG.ATT~ATT~TTG~TAT~CGT~TGG~TTA~TCC~ATG~AAT 38 AAT GTG ACC TAT GAG AAA GTC~AAA AAA GGG CGT TCA ATT 272 II/ II/ II
CAGTTTTGGAAGTGAGGTAATTTATGGCACAAACCTTTGATAGAAAA,ATTT 1332 ,. W0 92/05260 ~ '~ ~ ~ ~a ~ ~ PCT/FR91/00722 S$Q. ID NO : 2 '(suite) 21 TGTGAGGTTGACAAGATGAAAATAATTCA - -TT -TT - A n ~TTTA_n n n 2 2 5 0 CTT CAC. GGT TCG ATG CTC TGT CTT AGT ATA TAA ACC GTT 2531 GAT TTT GAT ATA AGT TTC ATC CAT TTT CCA CGA ATA G/.. 2763 TT~AAA~ATG~ATT~CAT~TACTCTGTCCTCTCTGTCTTTTTTCTCAATTTTACA 2813 CTAAAATAGATTTTTTGG_AAAACTTTGCA_ACAGAACCATAAAAAGCAACAAAAAC 2868 CTTATTAAATAAGTAA'ITTTTCATCTTGTGTTTTTTTTACAAAATTTAAAGTTCT 2923 GGAAATTGGCTGCT'1'TATGGACATAAAATTTAAAAAATAAAAGGCTACTAATTAA 2978 CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC
~$Ç~TATTTAGGATAATATGT 3088 T~gg~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTIGTATGCGCATTATGGCC 3143 AGGCTTTT'I',TTTTATCATTTTG T ATG AAA AAT AAA CAA 3191 AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATT'TGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT 4095 TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTZ"rATTTATAAACT 4150 z~~ ~~~1 SBQ. NO : 3 ID
DB :
Nuclotide LONGBR LA SEQQBNCB : 677pb TYPE i~OLBCOLB
D8 :
ADN
gnomique ORIGINE: plasmide Streptococcus pIL105 cremoris ;
CARACTBRISTIQUBS e RF2 (squence . cadre lecture ouvert O
d partielle> du fragment SEQ NO: 2 code ID ; pour la partie C-terminale du polypeptide .. . .... .. ... . ..
~ .. ./
~ ~
~
~
TAT
TCG
ATT
ATT
TTG
TAT
CGT
TGG
TTA
TCC
ATG
AAT
AAC AGC
GCC TAC
GTG ATA
CAT TTT
AAA AAC
GTG AAA
TCT GAG
GAT GAA
GAT GAA
TTC CCT
GAA GTT
CAA CAG
TAT TTA
AAA GTA
TAT GCG
ATT ACC
AAC
,.,W0 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91 /00722 ' 23 SBQ. ID NO : 4 TYPB D8 SBQUBNCB : Nucléotide LONG08DR DB LA SBQUENC$ : 471 pb TYPE DS MOLBCOI~B : ADN génomique ORIaINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 CliRI~CTBRISTIQOBS : cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment SEQ ID NO: 2 ;
AAA ATA
TAT
AAA
AAG
AAA
TCG
GAA
TTG
CTA
AAG
AAA
AAT
WO 92/05260 ~ ~ j ~ d ~ ~ PCT/FR91/00722 ,.. ~, SBQ. ID NO : 5 TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide LONGOE>?R DE LA SEQüENCB : 1240 pb TYPE DE MOLEC~LE : ADN génomique ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 CARACTERISTIQ~ES . comprend le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment SEQ ID NO: 2 ;
Les séquences soulignées représentent .
- De 133 à 137 pb : site de liaison aux ribosomes De 33 à 38 pb, et de 57 à 62 pb : promoteurs -35 et -10 de CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC~TATTTAGGATAATATGT3088 T~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTTGTATGCGCATTATGGCC3143 AGG ACA
AAA AGA
AAA GAA
AAA AAA
ATT GAT AAA'AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC 3401 GCT ATT
TTT AGT
ACT GTG
ATT AGG
TTC TGG
GAG ACT
TTA GAT
~
ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT
CCA GCA
CCA ATT
AAT ACT
TGG GTT
ATG AAA
. 3947 AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA
TCT GCA
GTT CCT
-:,WO 92/05260 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 1i r.1 SEQ. ID NO : 6 Ti'PB DE SEpDENCE : polypeptide LONGQBDR DE LA SEQUBNCE : 250 acides aminés TYPB DE MOLECOLE : protéine ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416 ; séquence codée par le gène de structure Abi 416 Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Tle Val Leu Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys Thr Leu Ile Glu Asn Thr 80 g5 Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys HisSThr His Ile 130 Tyr Leu As 135 140 p TYr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu L220Tyr Asn Gln Asp Met Cys Lys Val Thr S230Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile WO 92/05260 PCT/FR91/00722 .:-:;
c~ ~~ .~ is r .~
~U~.~ 'v ~~6 SBQ. ID NO : 7 TYPE D8 SEQ>?ENCE : polypeptide ; séquence C-terminale LONGUBQR DE LA SEQÜ8NC8 : 224 acides aminés TYPE DB MOLBCOLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF2 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Tyr~Ser~Ile~Ile~Leu~Tyr~Arg~Trp~Leu~Ser~Met~Asn~Tyr~Asn Gln Tyr Glu His Tyr Ser Val Lys Gly Gly Arg Arg Ala~Asp Gln Val Glu Ala Tyr Arg Pro Prô Ser Ile Lys Val Lys Glu Leu Arg Glu Ile Thr Asp Thr Ile Asn Glu His Gln His Phe Pro His Phe Glu Thr Arg Val Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ala His Thr Ser Phe Asn Val Thr T~r Glu Lys Val Lys Lys Gly Arg Ser Ile Asp Ser Ile Val Phe His Ile Glu Lys Lys Arg Leu Ala Asp Asp Asn Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Lys Val Tyr Gln Glu Asp Lys Ala Arg Lys Ala Glu Thr Glu Lys Asp Leu Val Phe Gln Ala Met Gln Ser Pro Tyr Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asn Met Phe Leu Asn Val Tyr Glu Thr Thr Asp Ser Gln Ile Met Ala Gly Leu Gln Lys Asn Val Tyr Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Lys Glu Leu Arg Gly Leu Asn Gly Val Lys Asp His Leu Ser Tyr Val Ser Ser Lys Gln Glu Ala Tyr Ser Lys Arg Asn Val Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Ile Glu Gln Tyr Leu Pro Thr Val Lys Arg Gln Asp Leu Asn His Glu :W0 92/05260 2 ~ ~ ~. ~A ~ ~ PCT/FR91/00722 SEQ. ID NO : 8 TYPB DE SBQÜENCE : polypeptide LONGQ81?R DE LA SEQ>?ENCE : 156 acides aminés TYPE DE MO1JECQLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Met Ser Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Glu Leu Ala Asp Glu Leu Gly Val Ser Lys Ser Tyr Val Asp Arg Ile Ile Arg Ile Leu Lys Leu His Thr Lys Leu Asp Lys Val Gly Asn Lys Tyr Val Ile Ser Lys Lys Gln Glu Lys Ser Ile Ile Thr Arg Ile Glu Asn Ser Lys Ser Thr Thr Glu Thr His Thr Glu Ser Thr Thr Gln Ser His Thr Lys Val Asp Ala Glu Val Asp Phe Leu Lys Glu Glu Ile Ala Tyr Leu Lys Ser Asn His Asp Lys Gln Leu Thr Asn Lys Asp Lys Gln Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asp Gln Gln Gln Arg Leu Ala Leu Gln Asp Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Glu Ile Asn Asp Leu Lys Ala Leu Lys Met Pro Ser Glu Ala Arg Lys Arg Asn Asn Gln Ile Ile Val His WO 92/05260 ~ ~ C~ ~ (~ ~ PCT/FR91/00722 .
v ~. a~
SBQ. ID NO : 9 TYPE DE SEQÜENCE : polypeptide LONGÜBUR DE LA SÉQUENCE : 274 acides aminés TYPE D8 MOLECOLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Met Lys Asn Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys Arg Thr Ser Met Asn Ile Phe Arg Thr Lys Tyr Arg Arg Ile Ile Ser Ser Ser His Tyr Ile Lys Arg Asp Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asn Gly Leu Leu Ile Lys Glu Asp Leu Lys Asp Phe Tyr Ser Phe Glu Lys Ile Lys Lys Lys Ile Asp Lys Ser Val Arg Ile Glu Glu Ser Glu Leu Ala Ile Leu Lys Glu Phe Ile Asp Lys Thr Gly Tyr Phe Arg Phe Ser Ile Tyr Leu Lys Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Thr Val Ile Asp Ile Ile Lys Thr Cjrs Gln Leu Asp Gly Tyr Ile Arg Asp Asn Leu Phe Ser Phe Thr Thr Arg Leu Glu Met Phe Trp Lys Lys Thr Ile Val Asp Thr Met Cys Leu Asn Tyr Glu Thr Asn Asp Phe Phe His 140 ~ 145 150 Asn Ile Asn,Ser Gi55Cys Tyr Leu Asp Lys Lys Ile Tyr Lys Asn Asp Glu Trp Gly Asn Leu Ile Ile Gln Glu Phe Asn Lys Ser Phe Phe Ser Asn Asn Ser Pro Ala Phe Lys His His Lys Asn Lys Arg Lys Asn Cys Ile Pro Ile Trp Ala Leu Phe Glu Gly Leu Thr Phe Gly Gln Ile Asn ThrOPhe Ile Thr Gln LeuSAsp Ala Ar 210 215 220 g Tyr 225 Asn Ala Trp Val Ser Ser I1e Tyr Aan Asn Pro Ala Tyr Lys Lys 230 235 24,0 Pro Met Lys Ser Trp Ile Thr Val Ile Arg Thr Ser Arg Asn Arg Ser Ala His Asn Ser Arg Ile Tyr Gly Leu Lys Ala Pro Asp Val Pro Met Asp Phe ~''~~~~W092/05260 ~ û ~ ~ ~ ~ 1 PCT/FR91/00722 MICRO-ORGANISMES
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DE MICROORGANISMES
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une hYNle ellefel 11t 111na poYr 11 1Y111 a1 ou fefllolpnomlnts 0 En ce qui concerne les dsignations dans lesquelles un brevet europen est demand, un chantillon du micro-organisme dpo-s ne sera accessible, jusqu' la publication de la mention de la dlivrance du brevet europen ou jusqu' la date laquelle la demande sera rejete, retire o rpute retire, que par la remise d'un chantillon un expert dsign par le requrant (rgle 28.4 de la CBE).
C. ITAT DllONI 01i1! Leiille~i Ni INDICAT1011 10NT D0111111 t1 Ne IM111N1n1 ne lonl NI donn11 poYr IoY N1 ltltl dINpM1) BREVET EUROPEENf FINLANDE, NORVEGEf MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
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DE L'INSTITUT PASTEUR
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laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant (règle 28.4 de la CBE).
C. h'ATS otil~tlt~ toult u~p11161 X11 IIIOICATIOIIf iollT Deit11111~ a <H lao IMNallono na aont pas ~onnla pour tWa 111 ltlla NNIMa) BREVET EUROPEEN, FINLANDE, NORVEGE, MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
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DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Adralaa do l'InHltuflon da dlplt (p Cempna le eeda postal at la paya) ~ _ ._ _ r_ 28, rue du Dcoteur Toux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE) Data da dlplt N d'ordre 1. IN01CAT10Nti 11IL~1b111TAi1tli r (1 no rampllr puo al nleaaual.
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BREVET EUROPEN, FINLANDE, NORVEGE, MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
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Les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 ont été comparées avec la séquence codant pour le mécanisme Hsp, décrite par HILL et al. [App. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258 (1990)J.
Aucune similitude n'a été établie entre ces séquences.
D'autre part, aucune hybridation n'a été
observée entre l'insert de 9,4 kb codant pour le mécanisme Abi 420 et un fragment de 456 pb provenant du gène codant pour le mécanisme Hsp.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'il com-prennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini plus haut. Dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier - le plasmide pIL353 . un échantillon de la souche de L. Iactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt I-999 ;
- le plasmide pIL352 . un échantillon de la souche de L, lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1000 ;
- le plasmide pIL618 . un échantillon de la souche de L. lattis ssp lattis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1001.
WO 92/05260 2 ~ ~ PCT/FR91/00722 ~~ :, ~~
a L'Invention a également pour objet les polypeptides suivants .
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture de la séquence SEQ ID NO . 1, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 6.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF.2, et dont la séquence C-terminale figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 7.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 3, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 8.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 1, et dont la séquence figure dans la liste des sêquences sous le numéro SEQ ID NO . 9.
La présente Invention a en outre pour objet des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à
l'Invention codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi.
Lesdits fragments peuvent être portés par des plasmides, ou bien intégrés dans le chromosome bactérien par recombinaison ou transposition.
Selon un mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mëca nisme Abi différent.
Selon un autre mode de réalisation préféré. des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un méca nisme Abi différent.
Selon une disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN
codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur.
.:. WO 92/05260 PCT/FR91 /00722 Selon une autre disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont por-tés par des vecteurs diffêrents.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de ,plasmides recombinants, et de microorganismes transformés conformes à l'Invention.
I1 va de soi, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correpondantes, sont donnés uni-quement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
SEMPLE 1 . CLONAGE D' ON FRAGMENtr D' ADN CODANT POaR Lrr.
MR!C!àNT-SMR DE REST~'''AN~'R ADX PiIlrC,ZEg ,ha La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits par MANIATIS et al. [(Molecular cloni,ng : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.(1982)].
Le séquençage des différents fragments d'ADN a été effectué sur chaque brin, par la méthode des di-désoxynucléotides, à l'aide d'un séquenceur 370 A (Applied Biosystems, San Jose, California), en suivant le protocole préconisé par le fabricant.
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection du laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10 kb sont ligués au site gril du plasmide pIL253 portant un gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253 et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie ~Q", 559-566 (1988)].
La digestion de l'ADN bactérien et la ligation dans le plasmide sont effectués selon les protocoles décrits par SIMON et al. [FEMS. Microbiol. Lett. ;,~, 239-241 (1985)] et LOUREIRO DOS SANTOS et CHOPIN, (FEMS
5 Microbiol Litt., ~, 209-212 (1987)].
Le produit de ligation est utilisé pour trans-former des bactéries de la souche L. Lactis ssp lactis IL1403, qui est une souche dépourvue de plasmides [CHOPIN
et al., Plasmid, j,,,Z, 260-263 (1984)], par transformation 10 de protoplastes selon la technique décrite par SIMON et al., [Appl. Environ. Microbiol., ~,, 394-395 (1986)]. Les bactéries résistantes à l'ézythromycine sont ensuite sélectionnées sur la base de leur résistance aux phages ;
des colonies incluses dans un milieu à l'agar sont 15 dispersées dans une solution saline, à l'aide d'un mélan-geur ULTRA-TURAX""' 'f18/20 (20.000 rpm et 2 ml de la suspen-sion sont utilisées pour inoculer 100 ml de milieu M17 (TERZAGHI et SANDINE, Appl. Microbiol. ~, 807-813 (1975)]
dans lequel le lactose est remplacé par du glucose 20 (Ml7glc), et contenant 5~tg/ml d'érythromycine. Aprés incubation pendant une nuit à 30'C, 100 X11 de différentes dilutions de la culture sont mélangés à 50 [t1 de CaCl2 O, 1 M, et 107 particules phagiques.
Après 5 mn à température de la pièce, 3 ml de 25 milieu Ml7glc agar additionné d'ézythromycine sont ajou tés, et le mélange est versé à la surface d'un milieu de culture solide Ml7glc agar + érythromycine. Des cultures de contrôle sont effectuées, avec une culture de la souche IL1403, en l'absence d'ézythromycine.
30 Les colonies résistantes aux phages sont clonées.
Dans ces conditions un clone résistant à
l'attaque phagique et contenant un plasmide recombinant portant un insert de 5 kb environ a été cloné. Ce plasmide 35 recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit ,<::.,WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCf/FR91/00722 plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt I-999 La figure 1 montre la carte de restriction du ~~
plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restric-tion sont indiquées en kb.
A partir du plasmide pIL353 un fragment ~I-SRI de 2,1 kb contenant la totalité de la séquence codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce fragment a été séquencé, et le gène codant pour le méca-nisme Abi 416 a été identifié.
La séquence de gène est indiquée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO . 1.
Le séquençage de l'insert de 2,1 kb a égale ment mis en évidence la présence sur celui-ci, immédiate ment en amont du gène de structure du mécanisme Abi 416, d'une séquence d'insertion du type ISS1 ; les séquences promoteur du gène Abi 416 sont situées dans cette séquence d'insertion.
$~,~LE 2 : OIaONàGB D' ûN P'RAGL~NT D8 9 . 5 kb DE L' ADN
TOTlL DE L~ SOOCI;E L . r ~!CTrS SSP LACTIS =Ld ~ n _ GODANT PO1QR L8 MECANI8b18 Abi 420 L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420 (Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) a été digéré par l'endonucléase Sau3A, et cloné
dans le plasmide pTL252 [Simon et Chopin, Biochimie ~,Q,, 559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Aprés transformation,de bactéries de la souche L. lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
Cet insert est porté par le plasmide recombi-nant pIL352, dont la carte de restriction est montrée ~ , figure 2. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp ~r WO 92/05260 ~ ~; S~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 , . .
lactis IL3128, contenant- ledit plasmide, a étë dêposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1000 Des expériences d'hybridation ont été
effectuées entre l'insert de 9,4 kb et un fragment de 456 pb provenant du gène Hsp décrit par HILL et al. Aucune hybridation n'a été observée, non seulement en conditions stringentes (42'C, tampon à 50$ de formamide) mais aussi en conditions non stringentes (42'C, tampon à 25~ de formamide).
CLONAGE D' ON FRArr~nrrrr D ~ ADN DQ PLI s~Tn~
1ZL105, CODANT POUR LR ~~ArJr~ at,t ~ n~
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER .
et CHOPIN (App. Environ. Microbiol. ~, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce plasmide est digéré par ~3A et cloné dans le site ,g,~HI de pIL252, selon la procédure décrite à l'exemple 1.
Un plasmide recombinant portant un insert de 6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été
sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte de restriction est montrée figure 3.~~
Un fragment ~çç$V-~I de 700 pb a étê excisé
de l' insert de 6, 4 kb de pIL305 ; le plasmide résultant, contenant un insert de 5,7 kb, a été dénommé pIL618 , un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dép8t I-1001 t / L'insert de 5,7 kb a été partiellement vséquencê. La fi ure 4 montre ' 9 1 organisation de cet insert . (~1 - Séquences répétées inversées de ISS1 ;
Tnase - Transposase de ISS1 ; .... - séquence non déterminée).
WO 92/05260 ~ fl ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 La séquence SEQ ID NO : 2 représente environ 4,6 kb des 5,7 kb de l'insert (les bases sont numérotées de façon continue, sans tenir compte des parties non séquencées). Cette séquence comprend 4 cadres ouverts de lecture.
L'un d'entre eux, commençant à la base 2289 de la SEQ ID NO : 2, appartient à un élément d'insertion de type ISS1, et correspond à la séquence codant pour la transposase de ISS1.
Les 3 autres cadres ouverts de lecture sont respectivement dénommés ORF 2, ORF 3 et ORF 1.
La séquence partielle (codant pour l'extrémité
C-terminale du polypeptide) de ORF 2 est comprise entre ' les bases 1 et 677 de la séquence SEQ ID NO . 2. Cette même séquence figure séparément dans la liste des séquence sous le numéro SEQ ID NO . 3.
La séquence de ORF 3 est comprise entre les bases 670 et 1140 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 4.
La séquence de ORF 1 est comprise entre les bases 3177 et 4001 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 5.
II. - RE~T_STA_NCE A L'ATTAQUE pus~TnrrR r!n~RER
PAR DES PLASM=DEa pOgT~rrr LES BEOQENCEa D!,~ntJ s~~' 4? 6.~, èbi 420 et Abi 105 F.~i.
L'étude a été effectuée en utilisant comme témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Les souches transformées par les plasmides pIL352 et pIL353 et pIL618 sont respectivement dênommées IL1403/pIL352 et IL403/pIL353, et IL1403/pIL618.
Des e5cpériences d'adsorption effectuées au préalable montrent que l'adsorption des particules pha giques est identique pour la souche témoin IL1403 et pour WO 92/05260 ~ ~ ~ ~' ~N ~ ~ PCT/FR91/00722 les souches transformées (de l'ordre de 97~ en 15 minutes).
Une expérience de croissance en une seule étape, a été effectuée selon le protocole suivant .
Une culture de bactéries lactiques au milieu de la phase de croissance exponentielle est mise en sus-pension dans du milieu frais à une concentration de 107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à
106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Le mélange est incubé pendant 10 minutes pour permettre l'adsorption des phages, puis dilué 10 fois, en présence de sérum antiphage, et incubé pendant 5 minutes à
37'C, -ce qui permet de neutraliser environ 99~ des phages non adsorbés.
Le mélange est ensuite dilué à nouveau dans du milieu M17 pour stopper l'action de l'antisérum, puis incubé à 30'C. Pendant cette incubation, des aliquots de 1 ml sont prélevés, à 5 minutes d'intervalle et étalés sur plaques de milieu solide.
Les plages de lyse obtenues pendant la période de latence donnent le nombre de centres infectieux. Celles obtenues pendant la phase finale stationnaire donnent le nombre de phages résultant de la multiplication des phages utilisés pour l'infection. Le rendement unitaire, qui permet d'évaluer la multiplication des phages, est obtenu ,en divisant le nombre de phages après multiplication, par ~'~le nombre de centres infectieux.
U La figure 5 montre le résultat de cette expé
rience . le nombre de PFU par ml est représenté en fonc tion du temps (en minutes), après l'infection, pour les souches IL1403 (O), IL1403/pIL618 (O), IL1403/pIL353 (~), IL1403/pIL352 (1) La période de latence est similaire pour toutes les souches. Le nombre de centres infectieux obtenus sur les souches IL1403/pIL352, IL1403/pIL353 et IL403/pIL618 représente respectivement 0,2~, 12~ et 3~ des jWO 92!05260 ~ ~ ~1 ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche IL1403/pIL352, à 25 pour la souche IL1403/pIL353, et 50 pour IL1403/pIL618.
5 Les plages de lyse formées par le phage bIL66 sur ces souches transformées, sont très petites, turbides, et à peine visibles, ce qui est observé dans les infec tions virales abortives. En outre, les phages obtenus à
partir de ces plages ne sont plus infectieux pour Les 10 souches bactériennes transformées.
EXEMPLE 5 . C'OMPARAr_gON DES MECANIE~S =Abi 105 .~~ d2n et Abi 416 Différents types de phages attaquant les bac téries lactiques ont été utilisés pour cette expérimenta 15 tion . les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isomé
trique ; les phages bIL188 et bIL67 sont de type à tête allongée.
Le Tableau I montre les résultats obtenus .
TABLBAQ Z
Phage bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188 Plasmide Abi 416 + + + - -Abi 420 + + - - -Abi 105 + + + + +
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5 phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420 sont actifs seulement sur les phages isométriques. Seul le mécanisme Abi 416 est actif sur le phage bIL170.
$~CEMPLE 6 . EggET CON~OTNT DE~MECrA~T~9 Aha ~
Abi 416 et Abi 420 Cet effet est étudié en introduisant les frag-ments d'ADN portant les gènes codant pour ces 3 mécanismes, dans la bactérie IL1403. , WO 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR9~/00722 ..:-v,, Comme les plasmides pIL252 et pIL253 sont incompatibles, l'insert de 5 kb du plasmide pIL353 a été
transféré au site ~lII du vecteur plasmidique pGKV259 [Van der Vossen et al., appl. Environ. Microbiol. ~, 2452-2457 (1987)J, le plasmide ainsi obtenu, dénommé
pIL377 est compatible à la fois avec le plasmide pIL105 (portant le gène Abi105) et le plasmide pIL353. Ces plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
,,.:,>,;s WO 92/05260 ~ PC7"/FR91/00722 Le tableau II montre les résultats obtenus.
TAHLRATT TT
PFU/ml bIL38 bIL66 bIL170 bIL67 bIL188 Souche IL1403 3.9x108 7.7x109 6.3x108 6.3x108 2.7x107 IL1403 5.Ox102*l.Ox107*<10 1.4x109 9.6x107 (pIL377) IL1403 5.Ox103*l.Ox105*1.2x109 1.5x108 1.2x107 (pIL352) 1 IL1403 5.Ox104*8.Ox107*5.Ox103*<10 <10 (pIL105) (pIL377, <10 <10 <10 5.7x108 5.7x107 pIL352) (pIL377, <10 l.Ox10.4*<10 <10 <10 pIL105) (pIL352, <10 2.Ox105*2.OX103*<10 <10 pIL105) (pIL377, <10 <10 <10 <10 <10 pIL352, pIL105) *Plages turbides peu visibles.
Une synergie de l~efficacité de ces mécanismes est en outre observée. Par exemple, le nombre de plages formées par le phage bIL 38 est divisé par 106 sur la souche IL1403/pIL377, par 106 sur la souche IL1403/pIL4105 et par plus de 108 sur la souche IL1403/pIL105/pIL 377, WO 92/0S260 ~ ~ ~ ~ v, PCT/FR91/00722 ...-.,:.
par rapport au nombre de plages formées sur la souche IL1403.
Des résultats similaires sont observés pour les autres pliages dans la plupart des combinaisons étudiées.
Lorsque les 3 mécanismes Abi sont associés dans une même bactérie, l'infection phagique est pratique-ment inexistante. Ceci a été confirmé par une expérience de croissance en une seule étape effectuée avec bIL66 sur la souche IL1403/pIL352/pIL105/pIL377 ; le nombre de cel-lules infectées et de pliages libérés était en dessous du seuil de sensibilité de la méthode.
Ainsi que cela ressort de ce qui prêcède, l' Invention ne se limite nullemer,.t à ceux de ses modes de . 15 mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s~êcarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention.
a ..., WO 92/0S260 SEQ. ID N' . 1 TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide LONGÜEÜR DE LA SEQûENCE : 960 paires de bases TYPE D8 MOLBCÜLE : ADN génomique ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416 PROPRIETES . Gène codant pour le mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 416 CARACTERISTIQUBS : Les séquences soulignées représentent .
- De 80 à 89 pb : site de liaison aux ribosomes - De 8 à 14 pb, et de 34 à 38 pb : promoteurs -35 et -10 - De 901 à 926 pb : séquence terminateur TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACAGACTTATCAGAA
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAAT~TAAT
GAT
CAG
CCA
AAA
ATT
GAA
AAA
CTA
AAT
ACA
GAA
GAA
ATA
GAG
GGA
AAA
GCT
AAA
ATC
ATTTGA CAAAATTAAATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA
CTAATAAAGTA AT CTT A TT~_rmrAGCTGTTTTTGTGTATACT 941 . A .A
T ..
WO 92/05260 ~ ~ c.~ ~ ~~ ~ ~ PCT/FR91/00722 r..:,.-,~..
SEp. ID NO : 2 20 TYPE DE SEQUBNCE : Nucléotide >;ONGÜEDR D8 IDA SEQUBNCE : 4, 6 kb environ TYPE DE MOLBCOLE : ADN génomique ORiGINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 PROPRIETES : comprend au moins un gène intervenant dans le mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 105 C~rR,ACTERISTIQQES
- De 1 à 677 pb : cadre ouvert de lecture ORF2 - De 670 à 1140~pb : cadre ouvert de lecture ORF3 - De 2289 à 2777 pb . cadre ouvert de lecture de la transposase de ISS1 (partiellement séquencé) - De 3177 à 4001 pb : cadre ouvert de lecture ORF1 De 2229 à 2246 pb et de 2833 à 2851 . séquences repétées inversées de ISS1 ./
N~AG~TAT~TCG.ATT~ATT~TTG~TAT~CGT~TGG~TTA~TCC~ATG~AAT 38 AAT GTG ACC TAT GAG AAA GTC~AAA AAA GGG CGT TCA ATT 272 II/ II/ II
CAGTTTTGGAAGTGAGGTAATTTATGGCACAAACCTTTGATAGAAAA,ATTT 1332 ,. W0 92/05260 ~ '~ ~ ~ ~a ~ ~ PCT/FR91/00722 S$Q. ID NO : 2 '(suite) 21 TGTGAGGTTGACAAGATGAAAATAATTCA - -TT -TT - A n ~TTTA_n n n 2 2 5 0 CTT CAC. GGT TCG ATG CTC TGT CTT AGT ATA TAA ACC GTT 2531 GAT TTT GAT ATA AGT TTC ATC CAT TTT CCA CGA ATA G/.. 2763 TT~AAA~ATG~ATT~CAT~TACTCTGTCCTCTCTGTCTTTTTTCTCAATTTTACA 2813 CTAAAATAGATTTTTTGG_AAAACTTTGCA_ACAGAACCATAAAAAGCAACAAAAAC 2868 CTTATTAAATAAGTAA'ITTTTCATCTTGTGTTTTTTTTACAAAATTTAAAGTTCT 2923 GGAAATTGGCTGCT'1'TATGGACATAAAATTTAAAAAATAAAAGGCTACTAATTAA 2978 CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC
~$Ç~TATTTAGGATAATATGT 3088 T~gg~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTIGTATGCGCATTATGGCC 3143 AGGCTTTT'I',TTTTATCATTTTG T ATG AAA AAT AAA CAA 3191 AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATT'TGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT 4095 TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTZ"rATTTATAAACT 4150 z~~ ~~~1 SBQ. NO : 3 ID
DB :
Nuclotide LONGBR LA SEQQBNCB : 677pb TYPE i~OLBCOLB
D8 :
ADN
gnomique ORIGINE: plasmide Streptococcus pIL105 cremoris ;
CARACTBRISTIQUBS e RF2 (squence . cadre lecture ouvert O
d partielle> du fragment SEQ NO: 2 code ID ; pour la partie C-terminale du polypeptide .. . .... .. ... . ..
~ .. ./
~ ~
~
~
TAT
TCG
ATT
ATT
TTG
TAT
CGT
TGG
TTA
TCC
ATG
AAT
AAC AGC
GCC TAC
GTG ATA
CAT TTT
AAA AAC
GTG AAA
TCT GAG
GAT GAA
GAT GAA
TTC CCT
GAA GTT
CAA CAG
TAT TTA
AAA GTA
TAT GCG
ATT ACC
AAC
,.,W0 92/05260 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91 /00722 ' 23 SBQ. ID NO : 4 TYPB D8 SBQUBNCB : Nucléotide LONG08DR DB LA SBQUENC$ : 471 pb TYPE DS MOLBCOI~B : ADN génomique ORIaINB : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 CliRI~CTBRISTIQOBS : cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment SEQ ID NO: 2 ;
AAA ATA
TAT
AAA
AAG
AAA
TCG
GAA
TTG
CTA
AAG
AAA
AAT
WO 92/05260 ~ ~ j ~ d ~ ~ PCT/FR91/00722 ,.. ~, SBQ. ID NO : 5 TYPE DE SEQüENCE : Nucléotide LONGOE>?R DE LA SEQüENCB : 1240 pb TYPE DE MOLEC~LE : ADN génomique ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105 CARACTERISTIQ~ES . comprend le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment SEQ ID NO: 2 ;
Les séquences soulignées représentent .
- De 133 à 137 pb : site de liaison aux ribosomes De 33 à 38 pb, et de 57 à 62 pb : promoteurs -35 et -10 de CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTC~TATTTAGGATAATATGT3088 T~TATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTTGTATGCGCATTATGGCC3143 AGG ACA
AAA AGA
AAA GAA
AAA AAA
ATT GAT AAA'AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC 3401 GCT ATT
TTT AGT
ACT GTG
ATT AGG
TTC TGG
GAG ACT
TTA GAT
~
ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT
CCA GCA
CCA ATT
AAT ACT
TGG GTT
ATG AAA
. 3947 AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA
TCT GCA
GTT CCT
-:,WO 92/05260 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ PCT/FR91/00722 1i r.1 SEQ. ID NO : 6 Ti'PB DE SEpDENCE : polypeptide LONGQBDR DE LA SEQUBNCE : 250 acides aminés TYPB DE MOLECOLE : protéine ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416 ; séquence codée par le gène de structure Abi 416 Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Tle Val Leu Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys Thr Leu Ile Glu Asn Thr 80 g5 Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys HisSThr His Ile 130 Tyr Leu As 135 140 p TYr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu L220Tyr Asn Gln Asp Met Cys Lys Val Thr S230Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile WO 92/05260 PCT/FR91/00722 .:-:;
c~ ~~ .~ is r .~
~U~.~ 'v ~~6 SBQ. ID NO : 7 TYPE D8 SEQ>?ENCE : polypeptide ; séquence C-terminale LONGUBQR DE LA SEQÜ8NC8 : 224 acides aminés TYPE DB MOLBCOLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF2 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Tyr~Ser~Ile~Ile~Leu~Tyr~Arg~Trp~Leu~Ser~Met~Asn~Tyr~Asn Gln Tyr Glu His Tyr Ser Val Lys Gly Gly Arg Arg Ala~Asp Gln Val Glu Ala Tyr Arg Pro Prô Ser Ile Lys Val Lys Glu Leu Arg Glu Ile Thr Asp Thr Ile Asn Glu His Gln His Phe Pro His Phe Glu Thr Arg Val Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ala His Thr Ser Phe Asn Val Thr T~r Glu Lys Val Lys Lys Gly Arg Ser Ile Asp Ser Ile Val Phe His Ile Glu Lys Lys Arg Leu Ala Asp Asp Asn Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Lys Val Tyr Gln Glu Asp Lys Ala Arg Lys Ala Glu Thr Glu Lys Asp Leu Val Phe Gln Ala Met Gln Ser Pro Tyr Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asn Met Phe Leu Asn Val Tyr Glu Thr Thr Asp Ser Gln Ile Met Ala Gly Leu Gln Lys Asn Val Tyr Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Lys Glu Leu Arg Gly Leu Asn Gly Val Lys Asp His Leu Ser Tyr Val Ser Ser Lys Gln Glu Ala Tyr Ser Lys Arg Asn Val Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Ile Glu Gln Tyr Leu Pro Thr Val Lys Arg Gln Asp Leu Asn His Glu :W0 92/05260 2 ~ ~ ~. ~A ~ ~ PCT/FR91/00722 SEQ. ID NO : 8 TYPB DE SBQÜENCE : polypeptide LONGQ81?R DE LA SEQ>?ENCE : 156 acides aminés TYPE DE MO1JECQLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Met Ser Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Glu Leu Ala Asp Glu Leu Gly Val Ser Lys Ser Tyr Val Asp Arg Ile Ile Arg Ile Leu Lys Leu His Thr Lys Leu Asp Lys Val Gly Asn Lys Tyr Val Ile Ser Lys Lys Gln Glu Lys Ser Ile Ile Thr Arg Ile Glu Asn Ser Lys Ser Thr Thr Glu Thr His Thr Glu Ser Thr Thr Gln Ser His Thr Lys Val Asp Ala Glu Val Asp Phe Leu Lys Glu Glu Ile Ala Tyr Leu Lys Ser Asn His Asp Lys Gln Leu Thr Asn Lys Asp Lys Gln Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asp Gln Gln Gln Arg Leu Ala Leu Gln Asp Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Glu Ile Asn Asp Leu Lys Ala Leu Lys Met Pro Ser Glu Ala Arg Lys Arg Asn Asn Gln Ile Ile Val His WO 92/05260 ~ ~ C~ ~ (~ ~ PCT/FR91/00722 .
v ~. a~
SBQ. ID NO : 9 TYPE DE SEQÜENCE : polypeptide LONGÜBUR DE LA SÉQUENCE : 274 acides aminés TYPE D8 MOLECOLE : protéine ORIGINE . Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105 Met Lys Asn Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys Arg Thr Ser Met Asn Ile Phe Arg Thr Lys Tyr Arg Arg Ile Ile Ser Ser Ser His Tyr Ile Lys Arg Asp Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asn Gly Leu Leu Ile Lys Glu Asp Leu Lys Asp Phe Tyr Ser Phe Glu Lys Ile Lys Lys Lys Ile Asp Lys Ser Val Arg Ile Glu Glu Ser Glu Leu Ala Ile Leu Lys Glu Phe Ile Asp Lys Thr Gly Tyr Phe Arg Phe Ser Ile Tyr Leu Lys Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Thr Val Ile Asp Ile Ile Lys Thr Cjrs Gln Leu Asp Gly Tyr Ile Arg Asp Asn Leu Phe Ser Phe Thr Thr Arg Leu Glu Met Phe Trp Lys Lys Thr Ile Val Asp Thr Met Cys Leu Asn Tyr Glu Thr Asn Asp Phe Phe His 140 ~ 145 150 Asn Ile Asn,Ser Gi55Cys Tyr Leu Asp Lys Lys Ile Tyr Lys Asn Asp Glu Trp Gly Asn Leu Ile Ile Gln Glu Phe Asn Lys Ser Phe Phe Ser Asn Asn Ser Pro Ala Phe Lys His His Lys Asn Lys Arg Lys Asn Cys Ile Pro Ile Trp Ala Leu Phe Glu Gly Leu Thr Phe Gly Gln Ile Asn ThrOPhe Ile Thr Gln LeuSAsp Ala Ar 210 215 220 g Tyr 225 Asn Ala Trp Val Ser Ser I1e Tyr Aan Asn Pro Ala Tyr Lys Lys 230 235 24,0 Pro Met Lys Ser Trp Ile Thr Val Ile Arg Thr Ser Arg Asn Arg Ser Ala His Asn Ser Arg Ile Tyr Gly Leu Lys Ala Pro Asp Val Pro Met Asp Phe ~''~~~~W092/05260 ~ û ~ ~ ~ ~ 1 PCT/FR91/00722 MICRO-ORGANISMES
foull feultaYw nlvtiw aY mferoarpamlmo monuonne n pp1 7 . upnl 2 0 i~ 2 5 do I euenouon ~
A. IDlNTIfICATION DII 0110T
o~sutn. dlpetl sont Idlnnflel wr Yno 11Y1111 wpplmlntNre s Nom do rlnlYluaon a1 aeoet COLLECTION NATIONALE DE CULTURES
DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Adflleo d1 IvnanYaon o eeoet pr eontonl a seel wllal 1111 wr1! -. _ .. _ ___ 28, rue du Dcoteur Toux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE) 0111 do eeoel rr d~eroh . IIIDICAT1011 su'IrLt11111TAlltla t a n1 nmpYr aw 11 nleelaln).
une hYNle ellefel 11t 111na poYr 11 1Y111 a1 ou fefllolpnomlnts 0 En ce qui concerne les dsignations dans lesquelles un brevet europen est demand, un chantillon du micro-organisme dpo-s ne sera accessible, jusqu' la publication de la mention de la dlivrance du brevet europen ou jusqu' la date laquelle la demande sera rejete, retire o rpute retire, que par la remise d'un chantillon un expert dsign par le requrant (rgle 28.4 de la CBE).
C. ITAT DllONI 01i1! Leiille~i Ni INDICAT1011 10NT D0111111 t1 Ne IM111N1n1 ne lonl NI donn11 poYr IoY N1 ltltl dINpM1) BREVET EUROPEENf FINLANDE, NORVEGEf MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
0. INDICATION- P01111N111 llAItIMINT N n1 rlmpllf <t~ I nlaladl) L1 Indlfll~pnl lnYmlfl1 CLplll 11f1111 1YIIIII1 YIIef11Yf1mM1 IY eYfY 'Ifl1ff1111II1 (11e11111f 11 1111Yf1 111111111 d1 Indl~
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In11rn1nnal "
tfonIlonnaln vtenN) fofmYleln PCTfll01171 lJanrlu 1111) W0 92/05260 PCT/FR91/00722 '~~~ ' ' 30 MICRO.ORGANISMES
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b d..enoaon t A. IoINTII1CAT10N DU Dtt~0T ~
D'autr.. d~pAt..onl Id.ntlfl~1 ~ur un. f.ulll. ~uppNmvm.v. t Nom e. l4nratltutlon e. d~oot ~ ' ---COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Ade"o do i~Inwwaon do e~pet tr eontpno a ad~ po.al oe 1. pop.! . -. _ ..
28, rue du Dcoteur Toux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE) oaa de dloet ~ ( r~~ d~eroe s. IwolcATlow~ su~~u~lIwTAmâa ~ c~ n. r.m.u. qtr. .r M.....al. un. rrut, aa,..a. .,t mm. p,er a .~n. d....
en..lan.rn.rtta a En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un échantillon du micro-organisme dépo-sé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à
laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant (règle 28.4 de la CBE).
C. h'ATS otil~tlt~ toult u~p11161 X11 IIIOICATIOIIf iollT Deit11111~ a <H lao IMNallono na aont pas ~onnla pour tWa 111 ltlla NNIMa) BREVET EUROPEEN, FINLANDE, NORVEGE, MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
0. IN01CAT10N~ 10UIIN11~ ~llAIt~M111T ~ (1 n. emplir qy ~1 n1~~..nU.) ~~~ maieauon~ W umyr~~1 1CI~apr~. ..roof ~oulnl.~~ ult~n.ur~m.nl au ,~ur.au Inl.lnallanal ~ ~(apNlfl.r (a noue O~n~lal. d~~ Ina,~~., eauon. p, u" . Ho d orle du d~pet.) L. a W pN~anta lauilla a ~t~ ePu1 awd N dantanda lnt.rnaUOnal.lor.qw e.ll.~el a ~t1 dlpoalo (1 v1r10~r par l'oRla. Ha~oeur) . .~ ~~~.._, (fonellonndr. avtorlN) a D.11 d. eclpu0n (~n prov.nanC. du d~pol.nl) ou b Bur..u Int.rn.tlonal n' (fonetlonnde autorlM) ._ iormulalr. PCTIR011i1 tJanvl.r 1111) ~~~~ ~I~~
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Fwllla taeultatlva ralatlva au mleroeroanlama ntanuonnl an papa 7 , Hpna 3 ~ 3 3da la daaenptlon 1 A. 101NTIitCATION Dtl 010T
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DE MICROORGANISMES
DE L'INSTITUT PASTEUR
Adralaa do l'InHltuflon da dlplt (p Cempna le eeda postal at la paya) ~ _ ._ _ r_ 28, rue du Dcoteur Toux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE) Data da dlplt N d'ordre 1. IN01CAT10Nti 11IL~1b111TAi1tli r (1 no rampllr puo al nleaaual.
Nrte hWlle olpeNW t lolnH
pour b aulto dv eoa ranHlonamants a En ce qui concerne les dsignations dans lesquelles un brevet europen est demand, un chantillon du micro-organisme dpo-s ne sera accessible, jusqu' la publication de la mention de la dlivrance du brevet europen ou jusqu' la date laquelle la demande sera rejete, retire ou rpute retire, que par la remise d'un chantillon un expert dsign par le requrant (rgle 28.4 de la CBE).
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001111f11 a (N 111 Indlt1t11na ne vont pas donnlaa pour tow No Luta dlaloMa!
BREVET EUROPEN, FINLANDE, NORVEGE, MONACO, CANADA, USA, AUSTRALIE, JAPON
D. INOtCATIONf p0U11N11 t1AIIt1M111T
(1 w ramplU que al nloaaalra) Laa IndiaaUOn1 Mumlrlaa alaorla aaont aoumlaaa u111rlauramanl au unw inlnnallonal (Iplalllar 11 nllura OlnlrNo dm Indi y oallona p, a11., a No d oron du d1p11 a!
1. Q W prlaonta Hullla a 1t1 raiuo avec b domando InurnaUonala lonaw eallaol a HI dlPoala (1 vlHllar pu l'orna rleapaur) (tonetlonndn autonN) ... .
. .,.._.. .. ... ..
O
l O
ne da r eaptlon (an provenance du dlpsaant) par l0 9uraau Intarnatlonal n~
(fonellonnalra autenN) Fermuldre PCT~Ilenlr r.1-w-i-.
r~
Claims (12)
1) Fragments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence substantiellement identique de celle d'au moins un fragment choisi dans le groupe constitué par:
le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1;
l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1000, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lattis ssp cremoris IL420; et un insert de 5,7 kb environ, du plasmide pIL618, déposé le 13 Septembre auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépot I - 1001, lequel insert est cloné à partir de l'ADN
total de la souche L. cremoris IL965.
le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1;
l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1000, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lattis ssp cremoris IL420; et un insert de 5,7 kb environ, du plasmide pIL618, déposé le 13 Septembre auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépot I - 1001, lequel insert est cloné à partir de l'ADN
total de la souche L. cremoris IL965.
2) Fragments d'ADN de plus de 20 pb, d'un fragment d'ADN selon le revendication 1, ou de son complémentaire.
3) Vecteurs recombinants, caractérises en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2.
4. Vecteur recombinant selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué
par le plasmide pIL353, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-999.
par le plasmide pIL353, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-999.
5. Vecteur recombinant selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué
par le plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M.
sous le numéro de dépôt I-1000.
par le plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M.
sous le numéro de dépôt I-1000.
6) Vecteur recombinant selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL618, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-1001.
7) Polypeptide intervenant dans un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi et caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- Le polypeptide dont 1a séquence figure dans 1a liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 6.
- Le polypeptide dont 1a séquence figure dans 1a liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 6.
8) Souches de microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'elles sont transformés par au moins un fragment d'ADN, selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2.
9) Souche de microorganismes selon la Reven-dication 8, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
10) Souche de microorganismes selon la Reven-dication 8, caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois fragments d'ADN brodant chacun pour un mécanisme Abi différent.
11) Souches de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur.
12) Souche de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par des vecteurs différents.
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