FR2666814A1 - Clonage de fragments d'adn codant pour un mecanisme de resistance aux bacteriophages. - Google Patents
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Abstract
L'Invention concerne des fragments d'ADN codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi, lesquels fragments sont susceptibles d'être obtenus par clonage de l'ADN chromosomique ou plasmidique d'une souche de bactéries lactiques résistante aux bactériophages, ainsi qu'un polypeptide intervenant dans un mécanisme de résistance de type Abi, codé par l'une desdits fragments. L'Invention englobe également des vecteurs recombinants, et des souches bactériennes transformée, comprenant lesdits fragments d'ADN.
Description
L'Invention est relative au clonage de séquences d'ADN portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance aux phages chez les bactéries, en particulier les bactéries lactiques.
Certaines des bactéries responsables des fermentations sont très sensibles à l'attaque par les bactériophages, ce qui, étant donné l'importance des fermentations en industrie agro-alimentaire, pose un problème économique considérable.
De nombreuses tentatives ont en conséquence été faites depuis de longues années, pour apporter une solution à ce problème.
I1 a dans un premier temps été proposé d'utiliser pour la fermentation, des mutants naturels ou obtenus par mutagénèse, et sélectionnés pour leurs propriétés de résistance aux bactériophages. Cette approche est toutefois considérablement limitée par le fait que, dans la plupart des cas, ces souches possèdent d'autres caractéristiques qui sont défavorables à leur utilisation, et qui sont, par exemple, une croissance très lente, ou bien la production de métabolites qui altèrent les qualités organoleptiques du produit fini.En outre, il est fréquent qu'on observe, dans les conditions d'utilisation industrielle de ces souches, une réversion au phénotype sauvage, et donc une perte de résistance, ou l'apparition d'une sensibilité à d'autres types de phages [GASSON et
DAVIES, dans Advances in the Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds Davies F.L. & Law B.
DAVIES, dans Advances in the Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds Davies F.L. & Law B.
127-151, Elsevier Applied Science Publishers (1984)]. Ceci a pour conséquence le fait; qu'un très petit nombre de souches mutantes est effectivement utilisé industriellement.
Toutefois, l'étude de ces souches a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs mécanismes différents de résistance aux phages.
Trois mécanismes principaux de résistance aux phages ont été ainsi décrits chez la souche résistante
Lactococcus lactis ME2 [KLAENHAMMER, J. Dairy Sci., 72, 3429-3443, (1989)]
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme d'interférence avec l'adsorption", le produit du gène de résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
Lactococcus lactis ME2 [KLAENHAMMER, J. Dairy Sci., 72, 3429-3443, (1989)]
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme d'interférence avec l'adsorption", le produit du gène de résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
- Un deuxième mécanisme dénommé "mécanisme de restriction/modification" (R/M), fait intervenir une endonucléase de restriction qui dégrade 1'ADN du phage dès son entrée dans la bactérie. Toutefois, cette endonucléase est associée à une méthylase, dotée de la même spécificité; il s'ensuit que certains ADN phagiques modifiés par la méthylase peuvent échapper à l'action de l'endonucléase, et donner naissance à des particules infectieuses. Plusieurs systèmes R/M de spécificité différente ont été décrits ; ces systèmes ont une efficacité variable : la fréquence d'apparition de particules virales renfermant un
ADN modifié est comprise entre 10-1 et 10-8. Dans les conditions de culture industrielle, où lors d'une infection, apparaissent de très nombreuses particules virales, l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante.Toutefois, lorsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans une même bactérie, la protection conférée parait plus efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMER, Plasmid, 23, 71-75 (1989)].
ADN modifié est comprise entre 10-1 et 10-8. Dans les conditions de culture industrielle, où lors d'une infection, apparaissent de très nombreuses particules virales, l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante.Toutefois, lorsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans une même bactérie, la protection conférée parait plus efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMER, Plasmid, 23, 71-75 (1989)].
Les gènes codant pour les mécanismes de type
R/M connus jusqu'à présent ont tous une localisation plasmidique.
R/M connus jusqu'à présent ont tous une localisation plasmidique.
- Le troisième type de mécanisme de défense qui a été décrit est dénommé "mécanisme d'infection abortive" (Abi). Chez les souches bactériennes qui possèdent ce type de mécanisme, l'adsorption des phages est normale, mais la multiplication des phages pour donner naissance à de nouvelles particules virales ne se produit que dans quelques cellules. En outre, les phages qui en résultent ne sont pas capables d'accomplir un cycle lytique complet lorsqu'ils infectent une nouvelle Cellule.
Tous les mécanismes de type Abi décrits jusqu a présent sont codés par des gènes portés par des plasmides [McKAY et al, Appl. Environ. Microbiol., 47, 6874 (1984)] ; [KLAENHAMMER et SANOZKY, J. Gen. Microbiol.
131, 1531-1541 (1985)] ; [GAUTIER et CHOPIN, Appl.
Environ. Microbiol. 53, 923-927 (1987)] ; [DALY et
FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. & BR<
Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] [LAIBLE et al. J. Dairy Sci. 70, 2211-2219 (1987)] [MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. 54, 1951-1956 (1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol. 54, 777-783 (1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. 71, 275-284 (1988)].
FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. & BR<
Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] [LAIBLE et al. J. Dairy Sci. 70, 2211-2219 (1987)] [MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. 54, 1951-1956 (1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol. 54, 777-783 (1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. 71, 275-284 (1988)].
Les modes d'action des mécanismes de résistance du type Abi n'ont pas encore été élucidés ; il appa ravît toutefois que l'infection abortive peut résulter de plusieurs systèmes ayant des mécanismes d'action différents, actifs sur différents phages, et à différents niveaux sur la prolifération virale. Il a par exemple été montré que le plasmide pTR2030 est plus actif sur les phages appartenant au groupe dit des "petits phages à tête isométrique" que sur ceux appartenant au groupe des "grands phages à tête isométrique" ou au groupe des phages "à tête allongée" [KLAENHAMMER, publication citée plus haut].
Des observations du même type, concernant une résistance spécifique à l'attaque par un groupe de phages, ont été faites sur d'autres; plasmides portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance de type Abi [DALY et FITZGERALD, (1987) ; FROSETH et al., ((1988) ; MURPHY et al., (1988) (publications citées plus haut)] ; STEELE et
McKAY, Plasmid, 22, 32-43 (1989)].
McKAY, Plasmid, 22, 32-43 (1989)].
D'autres plasmides, par exemple le plasmide pIL1OS [GAUTIER et CHOPIN, App. Environ. Microbiol., 53, 923-927 (1987)], et pAJ1106 [JARVIS, App. Environ.
Microbiol. 54 77-783 (1988)] codent toutefois pour des mécanismes de résistance Abi qui ont une spécificité différente des précédents et sont efficaces à la fois sur les phages "isométriques" et les phages "à tète allongée".
D'autres observations montrent également qu'il existe plusieurs systèmes de résistance de type Abi ; des expériences d'hybridation entre différents plasmides Abi ont suggéré que des loci différents étaient impliqués [STEELE et al., Appl. Environ. Microbiol., 55, 2410-2413 (1989)]. I1 a également été observé que la résistance aux phages était augmentée lorsque plusieurs séquences d'ADN codant pour des mécanismes Abi étaient associés.
Il a été proposé d'utiliser des plasmides codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour transférer cette résistance chez des souches utilisées dans l'industrie. Par exemples, des souches bactériennes contenant le plasmide auto-transférable pTR2030 ont été utilisées avec succès en fermentation industrielle, et ont montré une bonne résistance à l'attaque par les bactériophages, ce qui montre l'intérêt réel des gènes de résistance du type Abi.
Toutefois, le plasmide PTR2030, comme la plupart des plasmides de résistance aux phages décrits dans l'art antérieur, et dont l'utilisation a été suggérée, est un plasmide "naturel" présent dans des souches résistantes et transmis à d'autres souches par conjugaison bactérienne. L'utilisation de tels plasmides comporte certaines limites ; il faut que ces plasmides soient transférables, ou qu'il puissent être 1 associés à un plasmide mobilisateur ; il faut également qu'ils soient stables dans la bactérie-hôte et qu'ils ne portent pas de gènes modifiant son phénotype de façon défavorable ; il faut en outre, pour pouvoir associer chez une même bactérie, différents mécanismes de résistance aux phages, que les plasmides concernés soient compatibles entre eux.Enfin, cette technique ne permet pas le transfert de gènes de résistance qui seraient portés, non par l'ADN plasmidique, mais par l'ADN chromosomique. Il est donc particulièrement souhaitable de cloner les gènes responsables de ces mécanismes de résistance afin de pouvoir les insérer à volonté dans des vecteurs recombinants appropriés, compatibles entre eux et compatibles avec la bactérie hôte que l'on sohaite transformer.
La présente Invention s'est fixé pour but la mise en évidence et le clonage de séquences d'ADN codant pour des mécanismes de résistance à l'attaque par des bactériophages, et l'obtention de plasmides recombinants, comprenant ces gènes et permettant leur transfert et leur expression dans des souches bactériennes impliquées dans des fermentations industrielles.
La présente Invention a pour objet des fragments d'ADN comprenant une ou plusieurs séquences codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, lesquels fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par clonage de l'ADN chromosomique ou plasmidique d'une souche de bactéries lactiques résistante aux bactériophages.
Selon un mode de réalisation préféré des fragments d'ADN conformes à l'invention, ils comprennent une séquence homologue ou complémentaire de celle de tout ou partie d'un fragment choisi dans le groupe constitué par
- un fragment SphI-EcoRI de 2W4kb environ, du plasmide pIL353, lequel fragment est cloné à partir de 1'ADN d'un plasmide de 14 kb de L. lactis ssp lactis IL416, et comprend la séquence (I) suivante, qui est celle d'un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé
Abi 416
(I) TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51 AACTTTGCAACAGAACCAGAAARAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT GAA CTT GAT ACT TTT GAG CAA CTT GAT AGC TTT ATG 139
AAC CAA CAA CAG AAA AAA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT AAC ATC CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAA CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTG AGA ATC ATT TTA AAA 256
ATG TTC CTA ATT AAT ACG AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT CTT TTA GAA CCT ACG AAT AAC ATC ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTG CAT AAA ACC TTG ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373 GGA TAT GCT CTA AAA TTT TAT AAA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TGT AAT TTC ATA AAA GAA GAT AAC AAG CTT TTT 451 GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA GAA GGT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAA GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTG ATA AAT TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT GAA 607
TTT TCT GAG GAG ARA TTA CTA ACA TTT GAC CTT AAT GAT 646
AAA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA AAA GTA ATA CGG ATT 685
TCA ARA CCT AAA ATA GTC AAT ACG ATT GAT GAA CTT ATG 724
AAT GAA ATA CCT AAA GAA ATT GTT TTA AAA TAC AAT CAG 763
GAC ATG TGT AAA CTT ACA TCA AAA TTA GGA GAA ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA GAA AAA TTT GAT AAG CTA AAA GAC 841
ATT TGA CAAAATTABATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890
CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
- l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lactis ssp cremoris IL420, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 420.
- un fragment SphI-EcoRI de 2W4kb environ, du plasmide pIL353, lequel fragment est cloné à partir de 1'ADN d'un plasmide de 14 kb de L. lactis ssp lactis IL416, et comprend la séquence (I) suivante, qui est celle d'un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé
Abi 416
(I) TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51 AACTTTGCAACAGAACCAGAAARAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT GAA CTT GAT ACT TTT GAG CAA CTT GAT AGC TTT ATG 139
AAC CAA CAA CAG AAA AAA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT AAC ATC CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAA CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTG AGA ATC ATT TTA AAA 256
ATG TTC CTA ATT AAT ACG AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT CTT TTA GAA CCT ACG AAT AAC ATC ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTG CAT AAA ACC TTG ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373 GGA TAT GCT CTA AAA TTT TAT AAA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TGT AAT TTC ATA AAA GAA GAT AAC AAG CTT TTT 451 GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA GAA GGT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAA GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTG ATA AAT TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT GAA 607
TTT TCT GAG GAG ARA TTA CTA ACA TTT GAC CTT AAT GAT 646
AAA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA AAA GTA ATA CGG ATT 685
TCA ARA CCT AAA ATA GTC AAT ACG ATT GAT GAA CTT ATG 724
AAT GAA ATA CCT AAA GAA ATT GTT TTA AAA TAC AAT CAG 763
GAC ATG TGT AAA CTT ACA TCA AAA TTA GGA GAA ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA GAA AAA TTT GAT AAG CTA AAA GAC 841
ATT TGA CAAAATTABATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890
CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
- l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est cloné à partir de l'ADN total de la souche L. lactis ssp cremoris IL420, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 420.
- un fragment EcoRV-EcoRI de 5,7 kb environ, du plasmide pIL618, lequel fragment est cloné à partir de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. cremoris IL965, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 105
La présente Invention englobe tout segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'un des fragments de 2,1 kb, 9,4 kb et 5,7 kb définis ci-dessus, ce qui comprend en particulier des sondes d'acide nucléique obtenues à partir desdits fragments, ainsi que les fragments d'ADN de bactéries lactiques clonés en utilisant lesdites sondes.
La présente Invention englobe tout segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'un des fragments de 2,1 kb, 9,4 kb et 5,7 kb définis ci-dessus, ce qui comprend en particulier des sondes d'acide nucléique obtenues à partir desdits fragments, ainsi que les fragments d'ADN de bactéries lactiques clonés en utilisant lesdites sondes.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'il comprennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini plus haut. Dans ce cadre, la présente Invention englobe
- le plasmide pIL353 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999
- le plasmide pIL352 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1000 ;
- le plasmide pIL618 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1001 ;
- le plasmide pIL377, obtenu par insertion d'un fragment PstI-EcoRI de 5kb environ du plasmide pIL353, portant le gène codant pour le mécanisme Abi 416, dans le plasmide pGKV259. Le;plasmide pGKV259 a été décrit par VAN DER VOSSEIN et al., [Appl. Environ.Microbiol. 53, 2452-2557]
L'Invention a également pour objet un polypeptide intervenant dans le mécanisme de résistance Abi 416, et caractérisé en ce que sa séquence d'acides aminés (II), déduite du cadre de lecture ouverte de la séquence de bases (I) définie plus haut, est la suivante
(II)
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe
Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe
Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu
Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu
Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys
Thr Leu Ile Glu Asn Thr Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys
Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile
Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln
Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys His
Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala
His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr
Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu
Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro
Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp
Met Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr
Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
La présente Invention a en outre pour objet des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à l'invention, et codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi, en particulier un fragment codant pour l'un des mécanismes Abi 105, Abi 416, ou
Abi 420.
- le plasmide pIL353 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999
- le plasmide pIL352 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1000 ;
- le plasmide pIL618 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1001 ;
- le plasmide pIL377, obtenu par insertion d'un fragment PstI-EcoRI de 5kb environ du plasmide pIL353, portant le gène codant pour le mécanisme Abi 416, dans le plasmide pGKV259. Le;plasmide pGKV259 a été décrit par VAN DER VOSSEIN et al., [Appl. Environ.Microbiol. 53, 2452-2557]
L'Invention a également pour objet un polypeptide intervenant dans le mécanisme de résistance Abi 416, et caractérisé en ce que sa séquence d'acides aminés (II), déduite du cadre de lecture ouverte de la séquence de bases (I) définie plus haut, est la suivante
(II)
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe
Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe
Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu
Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu
Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys
Thr Leu Ile Glu Asn Thr Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys
Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile
Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln
Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys His
Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala
His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr
Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu
Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro
Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp
Met Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr
Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
La présente Invention a en outre pour objet des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à l'invention, et codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi, en particulier un fragment codant pour l'un des mécanismes Abi 105, Abi 416, ou
Abi 420.
Selon un mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
Selon un autre mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'invention, ils contiennent au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
Selon une disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur.
Selon une autre disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par des vecteurs différents.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de plasmides recombinants, et de microorganismes transformés conformes à l'invention.
il va de soi, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correpondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : CLONAGE DUN FRAGMENT D'ADN CODANT POUR LE
MECANISME DE RESISTANCE AUX PHAGES Abi 416
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection du laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase
Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10 kb sont ligués au site BamHI du plasmide pIL253 portant un gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253 et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie 70, 559-566 (1988)].
MECANISME DE RESISTANCE AUX PHAGES Abi 416
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection du laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase
Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10 kb sont ligués au site BamHI du plasmide pIL253 portant un gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253 et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie 70, 559-566 (1988)].
La digestion de 1'ADN bactérien et la ligation dans le plasmide sont effectuées selon les protocoles décrits par SIMON et al. [FEMS. Microbiol. Lett. 26, 239-241 (1985)] et LOUREIRO DOS SANTOS et CHOPIN, [FEMS
Microbiol Litt., 42, 209-212 (1987)].
Microbiol Litt., 42, 209-212 (1987)].
Le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries de la souche L. Lactis ssp lactis IL1403, qui est une souche dépourvue de plasmides [CHOPIN et al., Plasmid, 11, 260-263 (1984)], par électroporation selon la technique décrite par SIMON et al., [Appl.
Environ. Microbiol., 52, 394-395 (1986)]. Les bactéries résistantes à l'érythromycine sont ensuite sélectionnées sur la base de leur résistance aux phages ; des colonies incluses dans un milieu à l'agar sont dispersées dans une solution saline, à laide d'un mélangeur ULTRA-TURAX T18/20 (20.000 rpm et 2 ml de la suspension sont utilisées pour inoculer 100 ml de milieu M17 [TERZAGHI et SANDINE,
Appl. Microbiol. 29, 807-813 (1975)] dans lequel le lactose est remplacé par du glucose (M17glc), et contenant 5 Ag/ml d'érythromycine. Après incubation pendant une nuit à 30"C, 100 1 de différentes dilutions de la culture sont mélangés à 50 l de CaCl2 0,1 M, et 10 7 particules phagiques.
Appl. Microbiol. 29, 807-813 (1975)] dans lequel le lactose est remplacé par du glucose (M17glc), et contenant 5 Ag/ml d'érythromycine. Après incubation pendant une nuit à 30"C, 100 1 de différentes dilutions de la culture sont mélangés à 50 l de CaCl2 0,1 M, et 10 7 particules phagiques.
Après 5 mn à température de la pièce, 3 ml de milieu M17glc agar additionné d'érythromycine sont ajoutés, et le mélange est versé à la surface d'un milieu de culture solide M17glc agar + érythromycine. Des cultures de contrôle sont effectuées, avec une culture de la souche IL1403, en l'absence d'érythromycine.
Les colonies résistantes aux phages sont clonées.
Dans ces conditions un clone résistant à l'attaque phagique et contenant un plasmide recombinant portant un insert de 5 kb environ a été cloné. Ce plasmide recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999
La figure 1 montre la carte de restriction du plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restriction sont indiquées en kb.
Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724
Paris, sous le numéro de dépôt I-999
La figure 1 montre la carte de restriction du plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restriction sont indiquées en kb.
Des hybridations en Southern Blot, en utilisant des sondes marquées, dérivées de l'insert de 5 kb et préparées par nick-translation, ont montré que 1'ADN cloné provenait d'un plasmide de 14 kb présent dans la souche IL416.
A partir du plasmide pIL353 un fragment
SphI-EcoRI contenant la totalité de la séquence codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce fragment a été séquencé, et le gène codant pour le mécanisme Abi 416 a été identifié.
SphI-EcoRI contenant la totalité de la séquence codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce fragment a été séquencé, et le gène codant pour le mécanisme Abi 416 a été identifié.
La séquence de ce gène est la suivante
(I) TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT GAA GTT GAT ACT TTT GAG CAA GTT GAT AGC TTT ATG 139
AAG CAA CAA CAG AAA AAA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT ARC ATG CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAA CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTC AGA ATG ATT TTA AAA 256
ATG TTG CTA ATT AAT ACG AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT GTT TTA GAA GCT ACG AAT AAC ATG ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTG CAT ARA ACC TTG ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373 GGA TAT CCT CTA AAA TTT TAT ARA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TCT AAT TTG ATA AAA GAA GAT AAG AAG CTT TTT 451
GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA GAA GGTT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAR GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTC ATA ART TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT GAA 607
TTT TCT GAG GAG AAA TTA CTA ACA TTT GAC CTT AAT GAT 646
AAA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA ARA GTA ATA CCG ATT 685
TCA AAA CCT AAA ATA GTC AAT ACG ATT GAT GAA GTT ATC 724
AAT GAA ATA GCT ARA GAA ATT CTT TTA ARA TAC AAT CAG 763
GAC ATC TCT ARA GTT ACA TCA AAA TTA GGA GAA ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA GAA ARA TTT GAT AAG CTA AAA GAC 841
ATT TGA CAAAATTARATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890 CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
Les séquences soulignées représentent
- de la base 8 à la base 14, et de la base 34 à la base 38, des séquences promoteur ;
- de la base 86 à la base 90, le site de liaison aux ribosomes ;
- de la base 901 à la base 926, la séquence terminateur.
(I) TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT GAA GTT GAT ACT TTT GAG CAA GTT GAT AGC TTT ATG 139
AAG CAA CAA CAG AAA AAA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT ARC ATG CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAA CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTC AGA ATG ATT TTA AAA 256
ATG TTG CTA ATT AAT ACG AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT GTT TTA GAA GCT ACG AAT AAC ATG ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTG CAT ARA ACC TTG ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373 GGA TAT CCT CTA AAA TTT TAT ARA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TCT AAT TTG ATA AAA GAA GAT AAG AAG CTT TTT 451
GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA GAA GGTT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAR GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTC ATA ART TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT GAA 607
TTT TCT GAG GAG AAA TTA CTA ACA TTT GAC CTT AAT GAT 646
AAA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA ARA GTA ATA CCG ATT 685
TCA AAA CCT AAA ATA GTC AAT ACG ATT GAT GAA GTT ATC 724
AAT GAA ATA GCT ARA GAA ATT CTT TTA ARA TAC AAT CAG 763
GAC ATC TCT ARA GTT ACA TCA AAA TTA GGA GAA ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA GAA ARA TTT GAT AAG CTA AAA GAC 841
ATT TGA CAAAATTARATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890 CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
Les séquences soulignées représentent
- de la base 8 à la base 14, et de la base 34 à la base 38, des séquences promoteur ;
- de la base 86 à la base 90, le site de liaison aux ribosomes ;
- de la base 901 à la base 926, la séquence terminateur.
Cette séquence (I) contient un cadre de lecture ouverte de 750 bases, codant pour un polypeptide de 250 acides aminés dont la séquence est la suivante
(II)
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe
Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe
Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu
Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu
Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu
Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys
Thr Leu Ile Glu Asn Thr Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys
Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile
Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln
Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys His
Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala
His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr
Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu
Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro
Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp
Met Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr
Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
EXEMPLE 2 : CLONAGE D'UN FRAGMENT DE 9,5 kb DE L'ADN
CHROMOSOMIQUE DE LA SOUCHE L.LACTIS SSP
LACTIS IL420 CODANT POUR LE MECANISME
Abi 420
L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420 (Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré par l'endonucléase Sau3A, et cloné dans le plasmide pIL252 [Simon et Chopin, Biochimie 70, 559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
(II)
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe
Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe
Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu
Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu
Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu
Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys
Thr Leu Ile Glu Asn Thr Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys
Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile
Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln
Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys His
Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala
His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr
Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu
Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro
Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp
Met Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr
Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
EXEMPLE 2 : CLONAGE D'UN FRAGMENT DE 9,5 kb DE L'ADN
CHROMOSOMIQUE DE LA SOUCHE L.LACTIS SSP
LACTIS IL420 CODANT POUR LE MECANISME
Abi 420
L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420 (Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY
EN JOSAS) est digéré par l'endonucléase Sau3A, et cloné dans le plasmide pIL252 [Simon et Chopin, Biochimie 70, 559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Après transformation de bactéries de la souche
L. lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
L. lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
Cet insert est porté par le plasmide recombinant pIL352, dont la carte de restriction est montrée figure 2. Ce plasmide recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1000
Des hybridations en Southern Blot en utilisant des sondes dérivées de l'insert de 9,4 kb permettent de supposer que 1'ADN de cet insert provient du chromosome bactérien de la souche IL420.
Des hybridations en Southern Blot en utilisant des sondes dérivées de l'insert de 9,4 kb permettent de supposer que 1'ADN de cet insert provient du chromosome bactérien de la souche IL420.
EXEMPLE 3 : CLONAGE D'UN FRAGMENT D'ADN DU PLASMIDE
pL105, CODANT POUR LE MECANISME Abi 105
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER et CHOPIN [App. Environ. Microbiol. 53, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce plasmide est digéré par Sau3A et cloné dans le site BamHI de pIL252, selon la procédure décrite à l'exemple 1.
pL105, CODANT POUR LE MECANISME Abi 105
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER et CHOPIN [App. Environ. Microbiol. 53, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce plasmide est digéré par Sau3A et cloné dans le site BamHI de pIL252, selon la procédure décrite à l'exemple 1.
Un plasmide recombinant portant un insert
PstI-EcoRI de 6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte de restriction est montrée figure 3.
PstI-EcoRI de 6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte de restriction est montrée figure 3.
Un fragment EcoRV-XbaI de 700 pb a été excisé de l'insert de 6,4 kb de pIL305 ; le plasmide résultant, contenant un insert de 5,7 kb, a été dénommé pIL618 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt I-1001
Il. - RESISTANCE A L'ATTAQUE PHAGIQUE CONFEREE
PAR DES PLASMIDES PORTANT LES SEQUENCES D'ADN Abi 416,
Abi 420 et Abi 105
EXEMPLE 4 : EXPERIENCE DE CROISSANCE EN UNE SEULE ETAPE
L'étude a été effectuée en utilisant comme témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Il. - RESISTANCE A L'ATTAQUE PHAGIQUE CONFEREE
PAR DES PLASMIDES PORTANT LES SEQUENCES D'ADN Abi 416,
Abi 420 et Abi 105
EXEMPLE 4 : EXPERIENCE DE CROISSANCE EN UNE SEULE ETAPE
L'étude a été effectuée en utilisant comme témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Les souches transformées par les plasmides pIL352 et pIL353 sont respectivement dénommées
IL1403/pIL352 et IL403/pIL353.
IL1403/pIL352 et IL403/pIL353.
Des expériences d'adsorption effectuées au préalable montrent que l'adsorption des particules phagiques est identique pour la souche témoin IL1403 et pour les souches transformées (de l'ordre de 97% en 15 minutes)
Une expérience de croissance en une seule étape, a été effectuée selon le protocole suivant
Une culture de bactéries lactiques au milieu de la phase de croissance exponentielle est mise en suspension dans du milieu frais à une concentration de 107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à 106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Une expérience de croissance en une seule étape, a été effectuée selon le protocole suivant
Une culture de bactéries lactiques au milieu de la phase de croissance exponentielle est mise en suspension dans du milieu frais à une concentration de 107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à 106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Le mélange est incubé pendant 10 minutes pour permettre l'adsorption des phages, puis dilué 10 fois, en présence de sérum antiphage, et incubé pendant 5 minutes à 37"C, ce qui permet de neutraliser environ 99% des phages non adsorbés.
Le mélange est ensuite dilué à nouveau dans du milieu M17 pour stopper l'action de l'antisérum, puis incubé à 30"C. Pendant cette incubation, des aliquots de 1 ml sont prélevés, à 5 minutes d'intervalle et étalés sur plaques de milieu solide.
Les plages de lyse obtenues pendant la période de latence donnent le nombre de centres infectieux. Celles obtenues pendant la phase finale stationnaire donnent le nombre de phages résultant de la multiplication des phages utilisés pour l'infection. Le rendement unitaire, qui permet d'évaluer la multiplication des phages, est obtenu en divisant le nombre de phages après multiplication, par le nombre de centres infectieux.
La figure 4 montre le résultat de cette expérience : le nombre de PFU par ml est représenté en fonction du temps (en minutes), après l'infection, pour les souches IL1403
IL3127
IL3128
IL3365
IL3127
IL3128
IL3365
La période de latence est similaire pour toutes les souches. Le nombre de centres infectieux
Obtenus sur les souches IL3128 (IL1403/pIL352), IL3127 (IL1403/pIL353) et IL3365 (IL403/pIL618) représente 2 à 3% des phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche
IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche IL3128, à 25 pour la souche IL3127, et 50 pour IL3365.
Obtenus sur les souches IL3128 (IL1403/pIL352), IL3127 (IL1403/pIL353) et IL3365 (IL403/pIL618) représente 2 à 3% des phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche
IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche IL3128, à 25 pour la souche IL3127, et 50 pour IL3365.
Les plages de lyse formées par le phage bIL66 sur ces souches transformées, sont très petites, turbides, et à peine visibles, ce qui est observé dans les infections virales abortives. En outre, les phages obtenus à partir de ces plages ne sont plus infectieux pour les souches bactériennes transformées.
EXEMPLE 5 : COMPARAISON DES MECANISMES Abi 105, Abi 420
et Abi 416
Différents types de phages attaquant les bactéries lactiques ont été utilisés pour cette expérimentation : les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isométrique ; les phages bIL88 et bIL67 sont de type à tète allongée.
et Abi 416
Différents types de phages attaquant les bactéries lactiques ont été utilisés pour cette expérimentation : les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isométrique ; les phages bIL88 et bIL67 sont de type à tète allongée.
Le Tableau I montre les résultats obtenus
TABLEAU I
TABLEAU I
<SEP> Phage <SEP> bIL38 <SEP> bIL66 <SEP> bIL10 <SEP> bIL67 <SEP> bIL88
<tb> plasmide
<tb> Abi <SEP> 416 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> Abi <SEP> 420 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>
<tb> Abi105 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5 phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420 sont actifs seulement sur les phages isométriques, et n'ont pas la même action, sur le phage bIL170, sur lequel seul le mécanisme Abi 420 est actif.
<tb> plasmide
<tb> Abi <SEP> 416 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> Abi <SEP> 420 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>
<tb> Abi105 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5 phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420 sont actifs seulement sur les phages isométriques, et n'ont pas la même action, sur le phage bIL170, sur lequel seul le mécanisme Abi 420 est actif.
EXEMPLE 6 : EFFET CONJOINT DES MECANISMES Abi 105,
Abi 416 et Abi 420
Cet effet est étudié en introduisant les fragments d'ADN portant les gènes codant pour ces 3 mécanismes, dans la bactérie IL1403.
Abi 416 et Abi 420
Cet effet est étudié en introduisant les fragments d'ADN portant les gènes codant pour ces 3 mécanismes, dans la bactérie IL1403.
Comme les plasmides pIL252 et pIL253 sont incompatibles, l'insert de 5 kb du plasmide pIL353 a été transféré au site SaII du vecteur plasmidique pGKV259 [Van der Vossen et al., appl. Environ. Microbiol. 53, 2452-2457 (1987)], le plasmide ainsi obtenu, dénommé pIL377 est compatible à la fois avec le plasmide pIL105 (portant le gène
AbilOS) et le plasmide pIL353. Ces plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
AbilOS) et le plasmide pIL353. Ces plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
Le tableau II montre les résultats obtenus.
TABLEAU FUI
<tb> <SEP> PFU/ml <SEP> #bIL38 <SEP> # <SEP> <SEP> bIL66 <SEP> # <SEP> <SEP> bIL170 <SEP> # <SEP> <SEP> bIL67 <SEP> # <SEP> <SEP> bIL188
<tb> Souche
<tb> IL403 <SEP> 3.9x108 <SEP> 7.7x109 <SEP> 6.3x1O8 <SEP> 6.3x108 <SEP> 2.7x107
<tb> IL1403 <SEP> 5.0x102* <SEP> 1.0x107* <SEP> < 10 <SEP> 1.4x109 <SEP> 9.6x107
<tb> (pIL377)
<tb> <SEP> IL1403 <SEP> 5.0x103* <SEP> 1.0x105* <SEP> 1.2x109 <SEP> 1.5x108 <SEP> 1.2x107
<tb> (pIL352)
<tb> IL1403 <SEP> 5.0x104* <SEP> 8.0x107* <SEP> 5.0x103* <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> (pILlO5) <SEP>
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> 5.7x108 <SEP> 5.7x107
<tb> pIL352)
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> 1.0x10.4* <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL105
<tb> IL1403
<tb> (PIL352, <SEP> < 10 <SEP> 2.0x105* <SEP> 2.0x103* <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL105)
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL352,
<tb> pIL105)
<tb>
*Plages turbides peu visibles.
<tb> Souche
<tb> IL403 <SEP> 3.9x108 <SEP> 7.7x109 <SEP> 6.3x1O8 <SEP> 6.3x108 <SEP> 2.7x107
<tb> IL1403 <SEP> 5.0x102* <SEP> 1.0x107* <SEP> < 10 <SEP> 1.4x109 <SEP> 9.6x107
<tb> (pIL377)
<tb> <SEP> IL1403 <SEP> 5.0x103* <SEP> 1.0x105* <SEP> 1.2x109 <SEP> 1.5x108 <SEP> 1.2x107
<tb> (pIL352)
<tb> IL1403 <SEP> 5.0x104* <SEP> 8.0x107* <SEP> 5.0x103* <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> (pILlO5) <SEP>
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> 5.7x108 <SEP> 5.7x107
<tb> pIL352)
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> 1.0x10.4* <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL105
<tb> IL1403
<tb> (PIL352, <SEP> < 10 <SEP> 2.0x105* <SEP> 2.0x103* <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL105)
<tb> IL1403
<tb> (pIL377, <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10 <SEP> < 10
<tb> pIL352,
<tb> pIL105)
<tb>
*Plages turbides peu visibles.
Une synergie de l'efficacité de ces mécanismes est en outre observée. Par exemple, le nombre de plages formées par le phage bIL 38 est divisé par 106 sur la souche IL1403/pIL377, par 106 sur la souche IL1403/pIL4105 et par plus de 108 sur la souche IL1403/pIL105/pIL 377, par rapport au nombre de plages formées sur la souche IL1403.
Des résultats similaires sont observés pour les autres phages dans la plupart des combinaisons étudiées.
Lorsque les 3 mécanismes Abi sont associés dans une même bactérie, l'infection phagique est pratiquement inexistante. Ceci a été confirmé par une expérience de croissance en une seule étape effectuée avec bIL66 sur la souche IL1403/pIL352/pIL105/pIL377 ; le nombre de cellules infectées et de phages libérés était en dessous du seuil de sensibilité de la méthode.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente
Invention.
Invention.
Claims (14)
1) Fragments d'ADN comprenant une ou plusieurs séquences codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, lesquels fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles dtêtre obtenus par clonage de 1'ADN chromosomique ou plasmidique d'une souche de bactéries lactiques résistante aux bactériophages.
2) Fragments d'ADN selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homologue ou complémentaire de celle de tout ou partie d'un fragment choisi dans le groupe constitué par
- un fragment SphI-EcoRI de 2,1 kb environ, du plasmide (pIL353), lequel fragment est cloné à partir de l'ADN d'un plasmide de 14 kb de L. lactis ssp lactis IL416, et comprend la séquence (I) suivante, qui est celle d'un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé
Abi 416
(I)
TATCCTCGCTGTCTTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT CAR CTT GAT ACT TTT GAG CAA GTT GAT AGC TTT ATG 139
AAG CAA CAA CAG AAA ARA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT AAC ATC CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAR CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTC AGA ATC ATT TTA AAA 256
ATC TTG CTA ATT AAT ACC AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT GTT TTA GAA CCT ACC AAT AAC ATC ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTC CAT ARA ACC TTC ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373
GGA TAT CCT CTA ARA TTT TAT AAA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TGT AAT TTC ATA ARA GAA GAT AAG AAG CTT TTT 451
GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA CAR GGT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAA GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTC ATA AAT TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT CAR 607
TTT TCT GAG GAG ARA TTA CTA ACA TTT GAC CTT ART GAT 646
ARA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA AAA GTA ATA CCG ATT 685
TCA ARA CCT AAA ATA GTC AAT ACC ATT GAT GAA CTT ATC 724
AAT GAA ATA CCT ARA GAA ATT CTT TTA AAA TAC AAT CAG 763
GAC ATG TCT ARA CTT ACA TCA AAA TTA GGA CAR ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA CAR AAA TTT GAT AAG CTA ARA GAC 841
ATT TGA CAAAATTARATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890 CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960
- un insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est cloné à partir de 1'ADN total de la souche L. lactis ssp cremoris IL420, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 420 ; :
- un fragment EcoRV-EcoRI de 5,7 kb environ, du plasmide pIL618, lequel fragment est cloné à partir de 1'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. cremoris IL965, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 105
3) Fragments d'ADN de plus de 20 pb, caractérisés en ce qu'ils s'hybrident avec l'un des fragments de 2,1 kb,- 9,4 kb et 5,7 kb selon la Revendication 2.
4) Vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3.
5) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL353, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-999
6) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-1000
7) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL618, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la
C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-1001
8) Vecteur recombinant selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il estt constitué par le plasmide pIL377, obtenu par insertion d'un fragment PstI-EcoRI de 5kb environ du plasmide pIL353, portant le gène codant pour le mécanisme Abi 416, dans le plasmide pGKV259
9) Polypeptide intervenant dans le mécanisme de résistance Abi 416, et caractérisé en ce que sa séquence (II) d'acides aminés, déduite de la séquence de bases du fragment de 2,1 kb défini plus haut, est la suivante
(ll)
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe
Met Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe
Asp Asn Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu
Leu Ile Asn Thr Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu
Glu Ala Thr Asn Asn Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys
Thr Leu Ile Glu Asn Thr Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys
Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr His Ser Phe Cys Asn Leu Ile
Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly Asn Glu Thr Val Asn Gln
Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser Glu Gly Glu Lys His
Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Lys Val Ala
His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu Lys Asn Tyr
Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu
Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile Pro
Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp
Met Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr
Pro Ile Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
10) Souches de microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'ADN, selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3.
11) Souche de microorganismes selon la Revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
12) Souche de microorganismes selon la Revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois fragments d'ADN codant; chacun pour un mécanisme Abi différent.
13) Souche de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur.
14) Souche de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par des vecteurs différents.
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