WO1992005260A1 - Fragments d'adn codant pour un mecanisme de resistance aux bacteriophages - Google Patents

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WO1992005260A1
WO1992005260A1 PCT/FR1991/000722 FR9100722W WO9205260A1 WO 1992005260 A1 WO1992005260 A1 WO 1992005260A1 FR 9100722 W FR9100722 W FR 9100722W WO 9205260 A1 WO9205260 A1 WO 9205260A1
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abi
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plasmid
gaa
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PCT/FR1991/000722
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Marie-Christine Chopin
Pierre-Jean +Di Cluzel
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
CLUZEL, Hélène +hf
Cluzel, Jean +Hm
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

Definitions

  • the invention relates to the cloning of DNA sequences carrying genes encoding phage resistance mechanisms in bacteria, in particular lactic acid bacteria.
  • the product of the resistance gene delays the absorption of phage on the bacteria.
  • R / M A second mechanism called "restriction / modification mechanism" (R / M), involves a restriction endonuclease which degrades the phage DNA as soon as it enters the bacteria.
  • this endonuclease is associated with a methylase, endowed with the same specificity; it follows that certain phage DNAs modified by methylase can escape the action of the endonuclease, and give rise to infectious particles.
  • R / M systems of different specificity have been described; these systems have a variable effectiveness: the frequency of appearance of viral particles containing a modified DNA is between 10 -1 and 10 -8 . Under industrial culture conditions, where very numerous viral particles appear during an infection, the efficiency of this system is therefore not sufficient. However, when several R / M systems are present in the same bacteria, the protection conferred seems more effective [JOSEPHSEN and KLAENHAMMER, Plasmid, 23, 71-75 (1989)].
  • abortive infection mechanism (Abi).
  • phage adsorption is normal, but the multiplication of phages to give birth to new viral particles occurs only in a few cells.
  • the resulting phages are not able to complete a complete lytic cycle when they infect a new cell.
  • Hsp Abi-type resistance mechanism
  • plasmids for example the plasmid PIL105 [GAUTIER and CHOPIN, App. About. Microbiol., 53, 923-927 (1987)], and pAJH06 [JARVIS, App. About. Microbiol. 54 77-783 (1988)], however, code for Abi resistance mechanisms which have a specificity different from the previous ones and are effective both on "isometric" phages and "elongated head” phages.
  • plasmids encoding phage resistance mechanisms have been proposed to transfer this resistance to strains used in industry.
  • bacterial strains containing the self-transferable plasmid pTR2030 have been used successfully in industrial fermentation, and have shown good resistance to attack by bacteriophages, which shows the real advantage of resistance genes of the Abi type. .
  • the plasmid PTR2030 like most of the phage resistance plasmids described in the prior art, and the use of which has been suggested, is a "natural" plasmid present in resistant strains and transmitted to other strains by bacterial conjugation.
  • the use of such plasmids has certain limitations; these plasmids must be transferable, or they must be able to be combined with a mobilizing plasmid; they must also be stable in the host bacteria and not carry genes which modify its phenotype unfavorably; in order to be able to combine different phage resistance mechanisms in the same bacterium, the plasmids concerned must be compatible with one another.
  • this technique does not allow the transfer of resistance genes which would be carried, not by plasmid DNA, but by chromosomal DNA. It is therefore particularly desirable to clone the genes responsible for these resistance mechanisms in order to be able to insert them at will into suitable recombinant vectors, compatible with each other and compatible with the host bacterium which it is desired to transform.
  • the aim of the present invention is to demonstrate and clone DNA sequences coding for mechanisms of resistance to attack by bacteriophages, and to obtain recombinant plasmids comprising these genes and allowing their transfer. and their expression in bacterial strains involved in industrial fermentations.
  • the subject of the present invention is DNA fragments comprising at least one gene coding for a mechanism of resistance to bacteriophages, of the Abi type, characterized in that they comprise a sequence homologous to that of all or part of at least one fragment chosen from the group consisting of:
  • This fragment represents a portion of a Sphl-EcoRI fragment of approximately 2 kb, of the plasmid pIL353, which fragment is cloned from the DNA of L. lactis ssp lactis IL416.
  • SEQ ID NO: 5 constitute open reading frames respectively designated ORF2, ORF3 and ORF1.
  • the invention also encompasses the insert of approximately 5.7 kb of the plasmid pIL618, the partial sequence of which appears in the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID NO: 2, and the sequences of which SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, represent segments.
  • This 5.7 kb insert is cloned from the DNA of the plasmid pIL105 of the strain L. lactis spp. cremoris IL964, and comprises at least one gene coding for the resistance mechanism called Abi 105.
  • homologous sequence means any sequence which differs from the sequences in accordance with the invention only by substitution, deletion or the addition of a small number of bases, provided of course that the sequence thus modified retains the essential functional properties of the sequences of the invention.
  • the present invention also encompasses any DNA segment larger than 20 bp, hybridizing with one sequences encoding Abi mechanisms as identified above, which includes in particular nucleic acid probes obtained from said sequences, as well as the DNA fragments of lactic acid bacteria cloned using said probes.
  • sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 were compared with the sequence coding for the Hsp mechanism, described by HILL et al. [App. About. Microbiol., 56, 2255-2258 (1990)]. No similarity was established between these sequences.
  • the present invention also relates to recombinant vectors, characterized in that they comprise at least one nucleic acid fragment as defined above.
  • the present invention includes in particular:
  • the plasmid pIL353 a sample of the strain of L. lactis ssp lactis IL3127, containing said plasmid, was deposited on September 13, 1990, with the National Collection of Microorganisms (CNCM), held by the Pasteur Institute, 28, rue du Dondel Roux, 75724 Paris, under deposit number 1-999;
  • plasmid pIL352 a sample of the strain of L. lactis ssp lactis IL3128, containing the said plasmid, was deposited on September 13, 1990, with the C.N.C.M. under deposit number 1-1000;
  • the plasmid pIL618 a sample of the strain of L. lactis ssp lactis IL3365, containing the said plasmid, was deposited on September 13, 1990, with the CNCM under the deposit number 1-1001.
  • the invention also relates to the following polypeptides:
  • the present invention furthermore has for its object and transformed microorganisms, characterized in that they contain at least one DNA fragment in accordance with the invention coding for a mechanism of resistance to bacteriophages of the Abi type.
  • Said fragments can be carried by plasmids, or else integrated into the bacterial chromosome by recombination or transposition.
  • microorganisms in accordance with the invention, they contain at least two DNA fragments each coding for a different Abi mechanism.
  • microorganisms in accordance with the invention, they contain at least three DNA fragments each coding for a different Abi mechanism.
  • the DNA fragments coding for different Abi mechanisms are carried by the same vector. According to another preferred arrangement of one or other of these embodiments, the DNA fragments coding for different Abi mechanisms are carried by different vectors.
  • the sequencing of the different DNA fragments was carried out on each strand, by the dideoxynucleotide method, using a 370 A sequencer (Applied Biosystems, San Jose, California), following the protocol recommended by the manufacturer.
  • the total DNA of L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection of the Microbial Genetics laboratory, National Institute of Agronomic Research - 78350 JOUY EN JOSAS) is partially digested by the endonuclease Sau3A, and fragments of an average size of approximately 10 kb are ligated to the BamHI site of the plasmid pIL253 carrying a gene for resistance to erythromycin.
  • the plasmids pIL253 and pIL252 have been described by SIMON and CHOPIN, Biochemistry 70, 559-566 (1988)].
  • the digestion of the bacterial DNA and the ligation in the plasmid are carried out according to the protocols described by SIMON et al. [WOMEN. Microbiol. Lett. 23.,
  • the ligation product is used to transform bacteria of the strain L. Lactis ssp lactis IL1403, which is a strain devoid of plasmids [CHOPIN et al., Plasmid, 11, 260-263 (1984)], by transformation of protoplasts according to the technique described by SIMON et al., [Appl. About. Microbiol., 52, 394-395 (1986)].
  • the bacteria resistant to erythromycin are then selected on the basis of their resistance to phages; colonies included in an agar medium are dispersed in a saline solution, using an ULTRA-TURAX T18 / 20 mixer (20,000 rpm and 2 ml of the suspension are used to inoculate 100 ml of M17 medium [ TERZAGHI and SANDINE, Appl Microbiol. 29, 807-813 (1975)] in which the lactose is replaced by glucose (M17glc), and containing 5 ⁇ g / ml of erythromycin. After incubation overnight at 30 ° C., 100 ⁇ l different dilutions of the culture are mixed with 50 ⁇ l of 0.1 M CaCl 2 , and 10 7 phage particles.
  • Phage-resistant colonies are cloned.
  • Figure 1 shows the restriction map of plasmid pIL353. The distances between the restriction sites are indicated in kb.
  • the gene sequence is indicated in the sequence list under the number SEQ ID NO: 1.
  • the sequencing of the 2.1 kb insert also revealed the presence thereon, immediately upstream of the structural gene of the Abi 416 mechanism, of an insertion sequence of the ISS1 type; the promoter sequences of the Abi 416 gene are located in this insertion sequence.
  • L. lactis ssp lactis IL420 (Collection of the Laboratory of Microbial Genetics, National Institute of Agronomic Research - 78350 JOUY EN JOSAS) was digested with the e'donuclease Sau3A, and cloned in the plasmid pIL252 [Simon and Chopin, Biochemistry 70, 559-566, (1988)], according to the protocol described in Example 1.
  • This insert is carried by the recombinant plasmid pIL352, the restriction map of which is shown in FIG. 2.
  • Hybridization experiments were carried out between the 9.4 kb insert and a 456 bp fragment from the Hsp gene described by HILL et al. No hybridization was observed, not only under stringent conditions (42oC, 50% formamide buffer) but also under non-stringent conditions (42oC, 25% formamide buffer).
  • the plasmid pIL 105 has been described by GAUTIER and CHOPIN [App. About. Microbiol. 53, 923-927 (1987)]
  • DNA of this plasmid is digested with Sau3A and cloned into the BamHI site of pIL252, according to the procedure described in Example 1.
  • a recombinant plasmid carrying a 6.4 kb insert, coding for the Abi 105 mechanism was selected.
  • This plasmid is called pIL 305, and its restriction map is shown in FIG. 3.
  • pIL618 a sample of the strain of L. lactis ssp lactis IL3365, containing said plasmid, was deposited on September 13, 1990, with the C.N.C.M. under deposit number 1-1001
  • This sequence includes 4 open reading frames.
  • One of them belongs to an insertion element of type ISS1, and corresponds to the sequence coding for the transposase of ISS1.
  • ORF 2 ORF 3 and ORF 1.
  • ORF 2 C-terminal polypeptide is between bases 1 and 677 of the sequence SEQ ID NO: 2. This same sequence appears separately in the list of sequences under the number SEQ ID NO: 3.
  • ORF 3 is between bases 670 and 1140 of the sequence SEQ ID NO: 2; it appears separately in the sequence list under the number SEQ ID NO: 4.
  • ORF 1 is between the bases 3177 and 4001 of the sequence SEQ ID NO: 2; it appears separately in the list of sequences under the number SEQ ID NO: 5.
  • strains transformed by the plasmids pIL352 and pIL353 and pIL618 are respectively named IL1403 / pIL352 and IL403 / pIL353, and ILl403 / pIL618.
  • a culture of lactic acid bacteria in the middle of the exponential growth phase is suspended in fresh medium at a concentration of 10 7 CFU / ml, and mixed with a phage suspension at 10 6 PFU / ml (phage bIL66, of the type isometric).
  • the mixture is incubated for 10 minutes to allow adsorption of the phages, then diluted 10 times, in the presence of antiphage serum, and incubated for 5 minutes at 37oC, which allows to neutralize approximately 99% of the phages not adsorbed.
  • the mixture is then diluted again in M17 medium to stop the action of the antiserum, then incubated at 30oC. During this incubation, 1 ml aliquots are taken, 5 minutes apart and spread on plates of solid medium.
  • the lysis ranges obtained during the latency period give the number of infectious centers. Those obtained during the stationary final phase give the number of phages resulting from the multiplication of phages used for the infection.
  • the unit yield which makes it possible to evaluate the multiplication of phages, is obtained by dividing the number of phages after multiplication, by the number of infectious centers.
  • Figure 5 shows the result of this experiment: the number of PFUs per ml is represented as a function of time (in minutes), after infection, for the strains IL1403 (O), IL1403 / pIL618 ( ⁇ ), IL1403 / pIL353 ( ⁇ ), ILl403 / pIL352 ( ⁇ )
  • the latency period is similar for all strains.
  • the number of infectious centers obtained on the IL1403 / pIL352, IL1403 / pIL353 and IL403 / pIL618 strains represents 0.2%, 12% and 3% respectively of the phages adsorbed.
  • the unit yield on the IL1403 strain is 190, and decreases to 60 for the IL1403 / pIL352 strain, to 25 for the IL1403 / pIL353 strain, and 50 for IL1403 / pIL618.
  • the lysis plaques formed by the phage bIL66 on these transformed strains are very small, turbid, and barely visible, which is observed in abortive viral infections.
  • the phages obtained from these ranges are no longer infectious for the transformed bacterial strains.
  • phages bIL38, bIL66, bIL70 are of the isometric type
  • phages bIL188 and bIL67 are of the elongated head type.
  • the Abi 105 mechanism is active on the 5 phages tested, while the Abi 416 and Abi 420 mechanisms are active only on isometric phages. Only the Abi 416 mechanism is active on the phage bILl70.
  • pIL377 is compatible with both the plasmid pIL105
  • the number of plaques formed by the phage bIL 38 is divided by 10 6 on the IL1403 / pIL377 strain, by 10 6 on the IL1403 / pIL4105 strain and by more than 10 8 on the IL1403 / pIL105 / pIL 377 strain, relative to the number of plaques formed on the IL1403 strain.
  • PROPERTIES Gene coding for the mechanism of resistance to bacteriophages Abi 416
  • GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
  • PROPERTIES includes at least one gene involved in the
  • AAG TAT GTA ATT TCT AAA AAG CAA GAA AAA 819
  • CHARACTERISTICS includes the open reading frame ORF1 of the fragment SEQ ID NO: 2;
  • Lys Lys Gln Glu Lys Ser Ile Ile Thr Arg Ile Glu Asn Ser Lys

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Abstract

L'invention concerne des fragments d'ADN codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi, lesquels fragments sont susceptibles d'être obtenus par clonage de l'ADN chromosomique ou plasmidique d'une souche de bactéries lactiques résistante aux bactériophages, ainsi que des polypeptides intervenant dans un mécanisme de résistance de type Abi, codé par lesdits fragments. L'invention englobe également des vecteurs recombinants et des souches bactériennes transformées, comprenant lesdits fragments d'ADN.

Description

FRANGMENTS D'ADN CODANT POUR UN MECANISME DE RESISTANCE AUX BACTERIOPHAGES
L'Invention est relative au clonage de séquences d'ADN portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance aux phages chez les bactéries, en particulier les bactéries lactiques.
Certaines des bactéries responsables des fermentations sont très sensibles à l'attaque par les bactériophages, ce qui, étant donné l'importance des fermentations lactiques en industrie agro-alimentaire, pose un problème économique considérable. De nombreuses tentatives ont en conséquence été faites depuis des années, pour apporter une solution à ce problème.
Il a dans un premier temps été proposé d'utiliser pour la fermentation, des mutants naturels ou obtenus par mutagénèse, et sélectionnés pour leurs propriétés de résistance aux bactériophages. Cette approche est toutefois considérablement limitée par le fait que, dans la plupart des cas, ces souches possèdent d'autres caractéristiques qui sont défavorables à leur utilisation, et qui sont, par exemple, une croissance très lente, ou bien la production de métabolites qui altèrent les qualités organoleptiques du produit fini. En outre, il est fréquent qu'on observe, dans les conditions d'utilisation industrielle de ces souches, une réversion au phénotype sauvage, et donc une perte de résistance, ou l'apparition d'une sensibilité à d'autres types de phages [GASSON et DAVIES, dans Advances in the Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds Davies F.L. & Law B. 127-151, Elsevier Applied Science Publishers (1984)]. Ceci a pour conséquence le fait qu'un très petit nombre de souches mutantes est effectivement utilisé industriellement.
Toutefois, l'étude de ces souches a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs mécanismes différents de résistance aux phages. Trois mécanismes principaux de résistance aux phages ont été ainsi décrits chez la souche résistante Lactococcus lactis ME2 [KLAENHAMMER, J. Dairy Sci., 22., 3429-3443, (1989)].
- Dans l'un d'entre eux, dénommé "mécanisme d'interférence, avec l'adsorption", le produit du gène de résistance retarde l'absorption du phage sur la bactérie.
- Un deuxième mécanisme dénommé "mécanisme de restriction/modification" (R/M), fait intervenir une endo- nuclease de restriction qui dégrade l'ADN du phage dès son entrée dans la bactérie. Toutefois, cette endonucléase est associée à une méthylase, dotée de la même spécificité ; il s'ensuit que certains ADN phagiques modifiés par la méthylase peuvent échapper à l'action de l'endonucléase, et donner naissance à des particules infectieuses . Plusieurs systèmes R/M de spécificité différente ont été décrits ; ces systèmes ont une efficacité variable : la fréquence d'apparition de particules virales renfermant un ADN modifié est comprise entre 10-1 et 10-8. Dans les conditions de culture industrielle, où lors d ' une infection, apparaissent de très nombreuses particules virales, l'efficacité de ce système n'est donc pas suffisante. Toutefois, lorsque plusieurs systèmes R/M sont présents dans une même bactérie, la protection conférée parait plus efficace [JOSEPHSEN et KLAENHAMMER, Plasmid, 23, 71-75 (1989)].
Les gènes codant pour les mécanismes de type R/M connus jusqu'à présent ont tous une localisation plasmidique.
- Le troisième type de mécanisme de défense qui a été décrit est dénommé "mécanisme d'infection abortive" (Abi). Chez les souches bactériennes qui possèdent ce type de mécanisme, l'adsorption des phages est normale, mais la multiplication des phages pour donner naissance à de nouvelles particules virales ne se produit que dans quelques cellules. En outre, les phages qui en résultent ne sont pas capables d'accomplir un cycle lytique complet lorsqu'ils infectent une nouvelle Cellule.
Tous les mécanismes de type Abi décrits jusqu'à présent sont codés par des gènes portés par des plasmides [McKAY et al, Appl. Environ. Microbiol., 47, 68- 74 (1984)] ; [KLAENHAMMER et SANOZKY, J. Gen. Microbiol. 131, 1531-1541 (1985)] ; [GAUTIER et CHOPIN, Appl. Environ. Microbiol. 53., 923-927 (1987)] ; [DALY et FITZGERALD dans Streptococcal Genetics, eds Ferretti, J. & Curtiss R. III ; 259-268 ASM, Washington D.C. (1987)] ; [LAIBLE et al. J. Dairy Sci. 70, 2211-2219 (1987)] [MURPHY et al., Appl. Environ. Microbiol. 54, 1951-1956 (1988)] ; [JARVIS, Appl. Environ. Microbiol.54, 777-783 (1988)] ; [FROSETH et al., J. Dairy Sci. 71, 275-284 (1988)].
Le gène codant pour un mécanisme de résistance de type Abi, dénommé Hsp, qui est porté par le plasmide pTR2030 a été clone et séquence [HILL et al., Appl. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258, (1990)]
Les modes d'action des mécanismes de résistance du type Abi n'ont pas encore été élucidés ; il apparaît toutefois que l'infection abortive peut résulter de plusieurs systèmes ayant des mécanismes d'action différents, actifs sur différents phages, et à différents niveaux sur la prolifération virale. Il a par exemple été montré que le plasmide pTR2030 est plus actif sur les phages appartenant au groupe dit des "petits phages à tête isométrique" que sur ceux appartenant au groupe des "grands phages à tête isométrique" ou au groupe des phages "à tête allongée".
Des observations du même type, concernant une résistance spécifique à l'attaque par un groupe de phages, ont été faites sur d'autres plasmides portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance de type Abi [DALY et FITZGERALD, (1987) ; FROSETH et al., ((1988) ; MURPHY et al., (1988) (publications citées plus haut)] ; STEELE et McKAY, Plasmid, 22 , 32-43 (1989)].
D'autres plasmides, par exemple le plasmide PIL105 [GAUTIER et CHOPIN, App. Environ. Microbiol., 53, 923-927 (1987)], et pAJH06 [JARVIS, App. Environ. Microbiol. 54 77-783 (1988)] codent toutefois pour des mécanismes de résistance Abi qui ont une spécificité différente des précédents et sont efficaces à la fois sur les phages "isométriques" et les phages "à tète allongée".
D'autres observations montrent également qu'il existe plusieurs systèmes de résistance de type Abi ; des expériences d'hybridation entre différents plasmides Abi ont suggéré que des loci différents étaient impliqués [STEELE et al., Appl. Environ. Microbiol., 55, 2410-2413 (1989)]. Il a également été observé que la résistance aux phages était augmentée lorsque plusieurs séquences d'ADN codant pour des mécanismes Abi étaient associés.
Il a été proposé d'utiliser des plasmides codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour transférer cette résistance chez des souches utilisées dans l'industrie. Par exemples, des souches bactériennes contenant le plasmide auto-transférable pTR2030 ont été utilisées avec succès en fermentation industrielle, et ont montré une bonne résistance à l'attaque par les bactériophages, ce qui montre l'intérêt réel des gènes de résistance du type Abi.
Toutefois, le plasmide PTR2030, comme la plupart des plasmides de résistance aux phages décrits dans l'art antérieur, et dont l'utilisation a été suggérée, est un plasmide "naturel" présent dans des souches résistantes et transmis à d'autres souches par conjugaison bactérienne. L'utilisation de tels plasmides comporte certaines limites ; il faut que ces plasmides soient transférables, ou qu'il puissent être associés à un plasmide mobilisa- teur ; il faut également qu ' ils soient stables dans la bactérie-hôte et qu'ils ne portent pas de gènes modifiant son phénotype de façon défavorable ; il faut en outre, pour pouvoir associer chez une même bactérie, différents mécanismes de résistance aux phages, que les plasmides concernés soient compatibles entre eux. Enfin, cette tech- nique ne permet pas le transfert de gènes de résistance qui seraient portés, non par l'ADN plasmidique, mais par l'ADN chromosomique. Il est donc particulièrement souhaitable de cloner les gènes responsables de ces mécanismes de résistance afin de pouvoir les insérer à volonté dans des vecteurs recombinants appropriés, compatibles entre eux et compatibles avec la bactérie hôte que l'on sohaite transformer.
La présente Invention s'est fixé pour but la mise en évidence et le clonage de séquences d'ADN codant pour des mécanismes de résistance à l'attaque par des bactériophages, et l'obtention de plasmides recombinants, comprenant ces gènes et permettant leur transfert et leur expression dans des souches bactériennes impliquées dans des fermentations industrielles.
La présente Invention a pour objet des fragments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homologue de celle de tout ou partie d'au moins un fragment choisi dans le groupe constitué par :
- le fragment codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 416, dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
Ce fragment représente une portion d'un fragment Sphl-EcoRI de 2 kb environ, du plasmide pIL353, lequel fragment est clone à partir de l'ADN de L. lactis ssp lactis IL416.
- l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est clone à partir de l'ADN total de la souche L . lactis ssp cremoris IL420, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 420.
le fragment dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 3 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 4 ;
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 5.
Les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO :
4, et SEQ ID NO : 5, constituent des cadres ouverts de lecture respectivement dénommés ORF2, ORF3 et ORF1.
L'Invention englobe également l'insert de 5,7 kb environ du plasmide pIL618, dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2, et dont les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et SEQ ID NO : 5, représentent des segments. Cet insert de 5,7 kb est clone à partir de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. lactis spp. cremoris IL964, et comprend au moins un gène codant pour le mécanisme de résistance dénommé Abi 105.
Au sens de la présente Invention, on entend comme séquence homologue, toute séquence ne différant des séquences conformes à l'Invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases, à conditions bien sûr que la séquence ainsi modifiée conserve les propriétés fonctionnelles essentielles des séquences de l'Invention.
Dans ce cadre, on considérera en particulier comme homologues deux séquences nucleotidiques qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour un même polypeptide.
La présente Invention englobe également tout segment d'ADN de plus de 20 pb, s'hybridant avec l'une des séquences codant pour des mécanismes Abi telles que identifiées ci-dessus, ce qui comprend en particulier des sondes d'acide nucléique obtenues à partir desdites séquences, ainsi que les fragments d'ADN de bactéries lactiques clones en utilisant lesdites sondes.
Les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 ont été comparées avec la séquence codant pour le mécanisme Hsp, décrite par HILL et al. [App. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258 (1990)]. Aucune similitude n'a été établie entre ces séquences.
D'autre part, aucune hybridation n'a été observée entre l'insert de 9,4 kb codant pour le mécanisme Abi 420 et un fragment de 456 pb provenant du gène codant pour le mécanisme Hsp.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'il comprennent au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini plus haut. Dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier :
- le plasmide pIL353 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt 1-999 ;
- le plasmide pIL352 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt 1-1000 ;
- le plasmide pIL618 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt 1-1001. L'Invention a également pour objet les polypeptides suivants :
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture de la séquence SEQ ID NO : 1, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 6.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 2, et dont la séquence C-terminale figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 7.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 3, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 8.
- Le polypeptide codé par le cadre ouvert de lecture ORF 1, et dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 9.
La présente Invention a en outre pour obj et des microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'ADN conforme à l'Invention codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi.
Lesdits fragments peuvent être portés par des plasmides, ou bien intégrés dans le chromosome bactérien par recombinaison ou transposition.
Selon un mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
Selon un autre mode de réalisation préféré des microorganismes conformes à l'Invention, ils contiennent au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
Selon une disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur. Selon une autre disposition préférée de l'un ou l'autre de ces modes de réalisation, les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par des vecteurs différents.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de plasmides recombinants, et de microorganismes transformés conformes à l'Invention.
II va de soi, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correpondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : CLONAGE D'UN FRAGMENT D'ADN CODANT POUR LE
MECANISME DE RESISTANCE AUX PHAGES Abi 416
La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits par MANIATIS et al. [(Molecular cloning : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. (1982)].
Le séquençage des différents fragments d'ADN a été effectué sur chaque brin, par la méthode des didésoxynucléotides, à l'aide d'un séquenceur 370 A (Applied Biosystems, San José, California), en suivant le protocole préconisé par le fabricant.
L'ADN total de L. Lactis spp cremoris IL416 (Collection du laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY EN JOSAS) est digéré partiellement par l'endonucléase Sau3A, et des fragments d'une taille moyenne d'environ 10 kb sont ligués au site BamHI du plasmide pIL253 portant un gène de résistance à l'érythromycine. Les plasmides pIL253 et pIL252 ont été décrits par SIMON et CHOPIN, Biochimie 70, 559-566 (1988)]. La digestion de l'ADN bactérien et la ligation dans le plasmide sont effectués selon les protocoles décrits par SIMON et al. [FEMS. Microbiol. Lett. 23.,
239-241 (1985)] et LOUREIRO DOS SANTOS et CHOPIN, [FEMS Microbiol Litt., 42 , 209-212 (1987)].
Le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries de la souche L. Lactis ssp lactis IL1403, qui est une souche dépourvue de plasmides [CHOPIN et al., Plasmid, 11 , 260-263 (1984)], par transformation de protoplastes selon la technique décrite par SIMON et al., [Appl. Environ. Microbiol., 52 , 394-395 (1986)]. Les bactéries résistantes à l'érythromycine sont ensuite sélectionnées sur la base de leur résistance aux phages ; des colonies incluses dans un milieu à l'agar sont dispersées dans une solution saline, à l'aide d'un mélangeur ULTRA-TURAX T18/20 (20.000 rpm et 2 ml de la suspension sont utilisées pour inoculer 100 ml de milieu M17 [TERZAGHI et SANDINE, Appl. Microbiol. 29, 807-813 (1975)] dans lequel le lactose est remplacé par du glucose (M17glc), et contenant 5 μg/ml d'érythromycine. Après incubation pendant une nuit à 30ºC, 100 μl de différentes dilutions de la culture sont mélangés à 50 μl de CaCl2 0,1 M, et 107 particules phagiques.
Après 5 mn à température de la pièce, 3 ml de milieu M17glc agar additionné d'érythromycine sont ajoutés, et le mélange est versé à la surface d'un milieu de culture solide M17glc agar + érythromycine. Des cultures de contrôle sont effectuées, avec une culture de la souche IL1403, en l'absence d'érythromycine.
Les colonies résistantes aux phages sont clonées.
Dans ces conditions un clone résistant à l'attaque phagique et contenant un plasmide recombinant portant un insert de 5 kb environ a été clone. Ce plasmide recombinant a été dénommé pIL353. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3127, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C.N.C.M), tenue par l'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sous le numéro de dépôt I-999
La figure 1 montre la carte de restriction du plasmide pIL353. Les distances entre les sites de restriction sont indiquées en kb.
A partir du plasmide pIL353 un fragment Sphl-EcoRI de 2,1 kb contenant la totalité de la séquence codant pour le mécanisme Abi 416 a été sous-cloné. Ce fragment a été séquence, et le gène codant pour le mécanisme Abi 416 a été identifié.
La séquence de gène est indiquée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 1.
Le séquençage de l'insert de 2,1 kb a également mis en évidence la présence sur celui-ci, immédiatement en amont du gène de structure du mécanisme Abi 416, d'une séquence d'insertion du type ISS1 ; les séquences promoteur du gène Abi 416 sont situées dans cette séquence d'insertion.
EXEMPLE 2 : CLONAGE D'PN FRAGMENT DE 9.5 kb DE L'ADN
TOTAL DE LA SOUCHE L. LACTIS SSP LACTIS IL420,
CODANT POUR LE MECANISME Abi 420
L'ADN total de L. lactis ssp lactis IL420 (Collection du Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique - 78350 JOUY EN JOSAS) a été digéré par l'e'donucléase Sau3A, et clone dans le plasmide pIL252 [Simon et Chopin, Biochimie 70, 559-566, (1988)], selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Après transformation de bactéries de la souche
L . lactis ssp lactis IL1403, et sélection des bactéries résistantes aux phages, comme décrit à l'exemple 1, un clone contenant un insert de 9,4 kb environ a été isolé.
Cet insert est porté par le plasmide recombinant pIL352, dont la carte de restriction est montrée figure 2. Un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3128, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M, sous le numéro de dépôt I-1000
Des expériences d'hybridation ont été effectuées entre l'insert de 9,4 kb et un fragment de 456 pb provenant du gène Hsp décrit par HILL et al. Aucune hybridation n'a été observée, non seulement en conditions stringentes (42ºC, tampon à 50% de formamide) mais aussi en conditions non stringentes (42ºC, tampon à 25% de formamide).
EXEMPLE 3 : CLONAGE D'UN FRAGMENT D'ADN DU PLASMIDE
PL105. CODANT POUR LE MECANISME Abi 105
Le plasmide pIL 105 a été décrit par GAUTIER et CHOPIN [App. Environ. Microbiol. 53, 923-927 (1987)]
L'ADN de ce plasmide est digéré par Sau3A et clone dans le site BamHI de pIL252, selon la procédure décrite à l'exemple 1.
Un plasmide recombinant portant un insert de 6,4 kb, codant pour le mécanisme Abi 105 a été sélectionné. Ce plasmide est dénommé pIL 305, et sa carte de restriction est montrée figure 3.
Un fragment EcoRV-Xbal de 700 pb a été excisé de l'insert de 6,4 kb de pIL305 ; le plasmide résultant, contenant un insert de 5,7 kb, a été dénommé pIL618 : un échantillon de la souche de L. lactis ssp lactis IL3365, contenant ledit plasmide, a été déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M. sous le numéro de dépôt 1-1001
L'insert de 5,7 kb a été partiellement séquence. La figure 4 montre l'organisation de cet insert : (◀▶ = Séquences répétées inversées de ISS1 ; Tnase = Transposase de ISS1 ; .... = séquence non déterminée). La séquence SEQ ID NO : 2 représente environ
4,6 kb des 5,7 kb de l'insert (les bases sont numérotées de façon continue, sans tenir compte des parties non séquencées). Cette séquence comprend 4 cadres ouverts de lecture.
L'un d'entre eux, commençant à la base 2289 de la SEQ ID NO : 2, appartient à un élément d'insertion de type ISS1, et correspond à la séquence codant pour la transposase de ISS1.
Les 3 autres cadres ouverts de lecture sont respectivement dénommés ORF 2 , ORF 3 et ORF 1.
La séquence partielle (codant pour l'extrémité
C-terminale du polypeptide) de ORF 2 est comprise entre les bases 1 et 677 de la séquence SEQ ID NO : 2. Cette même séquence figure séparément dans la liste des séquence sous le numéro SEQ ID NO : 3.
La séquence de ORF 3 est comprise entre les bases 670 et 1140 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 4.
La séquence de ORF 1 est comprise entre les bases 3177 et 4001 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; elle figure séparément dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 5.
II. - RESISTANCE A L'ATTAQUE PHAGIOUE CONFEREE
PAR DES PLASMIDES PORTANT LES SEQUENCES D'ADN Abi 416. Abi 420 et Abi 105
EXEMPLE 4 : EXPERIENCE DE CROISSANCE EN UNE SEULE ETAPE
L'étude a été effectuée en utilisant comme témoin la souche IL1403, dépourvue de plasmides.
Les souches transformées par les plasmides pIL352 et pIL353 et pIL618 sont respectivement dénommées IL1403/pIL352 et IL403/pIL353, et ILl403/pIL618.
Des expériences d'adsorption effectuées au préalable montrent que l'adsorption des particules phagiques est identique pour la souche témoin IL1403 et pour les souches transformées (de l'ordre de 97% en 15 minutes).
Une expérience de croissance en une seule étape, a été effectuée selon le protocole suivant :
Une culture de bactéries lactiques au milieu de la phase de croissance exponentielle est mise en suspension dans du milieu frais à une concentration de 107 CFU/ml, et mélangée à une suspension de phages à 106 PFU/ml (phage bIL66, de type isométrique).
Le mélange est incubé pendant 10 minutes pour permettre l'adsorption des phages, puis dilué 10 fois, en présence de sérum antiphage, et incubé pendant 5 minutes à 37ºC, ce qui permet de neutraliser environ 99% des phages non adsorbés.
Le mélange est ensuite dilué à nouveau dans du milieu M17 pour stopper l'action de l'antisérum, puis incubé à 30ºC. Pendant cette incubation, des aliquots de 1 ml sont prélevés, à 5 minutes d' intervalle et étalés sur plaques de milieu solide.
Les plages de lyse obtenues pendant la période de latence donnent le nombre de centres infectieux. Celles obtenues pendant la phase finale stationnaire donnent le nombre de phages résultant de la multiplication des phages utilisés pour l'infection. Le rendement unitaire, qui permet d'évaluer la multiplication des phages, est obtenu en divisant le nombre de phages après multiplication, par le nombre de centres infectieux.
La figure 5 montre le résultat de cette expérience : le nombre de PFU par ml est représenté en fonc- tion du temps (en minutes), après l'infection, pour les souches IL1403 (O), IL1403/pIL618 (☐), IL1403/pIL353 (●), ILl403/pIL352 (▲)
La période de latence est similaire pour toutes les souches. Le nombre de centres infectieux obtenus sur les souches ILl403/pIL352, IL1403/pIL353 et IL403/pIL618 représente respectivement 0,2%, 12% et 3% des phages adsorbés. Le rendement unitaire sur la souche IL1403 est de 190, et décroît à 60 pour la souche ILl403/pIL352, à 25 pour la souche ILl403/pIL353, et 50 pour IL1403/pIL618.
Les plages de lyse formées par le phage bIL66 sur ces souches transformées, sont très petites, turbides, et à peine visibles, ce qui est observé dans les infections virales abortives. En outre, les phages obtenus à partir de ces plages ne sont plus infectieux pour les souches bactériennes transformées.
EXEMPLE 5 : COMPARAISON DES MECANISMES Abi 105, Abi 420 et Abi 416
Différents types de phages attaquant les bactéries lactiques ont été utilisés pour cette expérimentation : les phages bIL38, bIL66, bIL70 sont de type isométrique ; les phages bIL188 et bIL67 sont de type à tête allongée.
Le Tableau I montre les résultats obtenus :
Figure imgf000017_0001
Le mécanisme Abi 105 est actif sur les 5 phages testés, alors que les mécanismes Abi 416 et Abi 420 sont actifs seulement sur les phages isométriques. Seul le mécanisme Abi 416 est actif sur le phage bILl70.
EXEMPLE 6 : EFFET CONJOINT DES MECANISMES Abi 105.
Abi 416 et Abi 420
Cet effet est étudié en introduisant les fragments d'ADN portant les gènes codant pour ces 3 mécanismes, dans la bactérie IL1403. Comme les plasmides pIL252 et pIL253 sont incompatibles , l ' insert de 5 kb du plasmide pIL353 a été transféré au site SalII du vecteur plasmidique pGKV259
[Van der Vossen et al., appl. Environ. Microbiol. 53 ,
2452-2457 (1987)], le plasmide ainsi obtenu, dénommé pIL377 est compatible à la fois avec le plasmide pIL105
(portant le gène Abi105) et le plasmide pIL353. Ces plasmides sont transférés séparément, deux à deux, ou tous les trois ensemble, dans la bactérie IL 1403.
Le tableau II montre les résultats obtenus
Figure imgf000019_0001
*Plages turbides peu visibles.
Une synergie de l'efficacité de ces mécanismes est en outre observée. Par exemple, le nombre de plages formées par le phage bIL 38 est divisé par 106 sur la souche IL1403/pIL377, par 106 sur la souche IL1403/pIL4105 et par plus de 108 sur la souche IL1403/pIL105/pIL 377, par rapport au nombre de plages formées sur la souche IL1403.
Des résultats similaires sont observés pour les autres phages dans la plupart des combinaisons étudiées.
Lorsque les 3 mécanismes Abi sont associés dans une même bactérie, l'infection phagique est pratiquement inexistante. Ceci a été confirmé par une expérience de croissance en une seule étape effectuée avec bIL66 sur la souche IL1403/pIL352/pIL105/pIL377 ; le nombre de cellules infectées et de phages libérés était en dessous du seuil de sensibilité de la méthode.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention.
LISTE DES SEQUENCES
SEQ. ID Nº : 1
TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 960 paires de bases
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL416
PROPRIETES : Gène codant pour le mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 416
CARACTERISTIQUES : Les séquences soulignées représentent :
- De 80 à 89 pb : site de liaison aux ribosomes
- De 8 à 14 pb, et de 34 à 38 pb : promoteurs -35 et -10
- De 901 à 926 pb : séquence terminateur
TATCCTCGCTGTCATTTTTATTCATTTTACACTAAAATAGACTTATCAGAA 51
AACTTTGCAACAGAACCAGAAAAAGAATAAAAATGGAGATAAT ATG GAT 100
ATT GAA GTT GAT ACT TTT GAG CAA GTT GAT AGC TTT ATG 139
AAG CAA CAA CAG AAA AAA ATA GAT AGT TGG CTT TCT TTT 178
GAT AAC ATG CCA ATT CCA ACT GGA ATC ATG AAG CAA CAA 217
GAG CAG AAG AAA GTA AAC ACG TTG AGA ATG ATT TTA AAA 256
ATG TTG CTA ATT AAT ACG AGA GAT GTA TTA AAT GGC TTA 295
ATT GTT TTA GAA GCT ACG AAT AAC ATG ACT TCT TCT ATG 334
ATT TTG CAT AAA ACC TTG ATA GAA AAT ACA ATA AAT ATT 373
GGA TAT GCT CTA AAA TTT TAT AAA ACT AAA GAT TAT CAT 412
TCT TTT TGT AAT TTG ATA AAA GAA GAT AAG AAG CTT TTT 451
GGT AAT GAA ACA GTA AAT CAA AAA GCC AAT ATC TCT TTC 490
GTG AAA TCA GAA GGT GAA AAA CAT ACA CAT ATA TAT CTT 529
GAT TAT CAA GAA ACA TGT AAA GTA GCA CAT CCT AAC TTT 568
CTT CAA TTG ATA AAT TTA TTA AAA AAC TAC TAC CCT GAA 607
TTT TCT GAG GAG AAA TTA CTA ACA TTT GAC CTT AAT GAT 646
AAA ATA TTT GGA GAA GAC GAA ATA AAA GTA ATA CCG ATT 685
TCA AAA CCT AAA ATA GTC AAT ACG ATT GAT GAA GTT ATG 724
AAT GAA ATA GCT AAA GAA ATT GTT TTA AAA TAC AAT CAG 763
GAC ATG TGT AAA GTT ACA TCA AAA TTA GGA GAA ATT TCA 802
CTT ACC CCT ATC CAA GAA AAA TTT GAT AAG CTA AAA GAC 841
ATT TGA CAAAATTAAATTAGCATTCGGGGTTATCACCCTTTTTGATAAA 890
CTAATAAAGTAGCTCATAACTTAACAGTTTTGAGCTGTTTTTGTGTATACT 941
ATAAATAAAGAGTTTTCAA 960 SEQ. ID NO : 2
TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 4,6 kb environ
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
PROPRIETES : comprend au moins un gène intervenant dans le
mécanisme de résistance aux bactériophages Abi 105
CARACTERISTIQUES :
- De 1 à 677 pb : cadre ouvert de lecture ORF2
- De 670 à 1140 pb : cadre ouvert de lecture ORF3
- De 2289 à 2777 pb : cadre ouvert de lecture de la
transposase de ISS1 (partiellement séquence)
- De 3177 à 4001 pb : cadre ouvert de lecture ORF1
- De 2229 à 2246 pb et de 2833 à 2851 : séquences repétées
inversées de ISS1
........................................................................................................................./
N AG TAT TCG ATT ATT TTG TAT CGT TGG TTA TCC ATG AAT 38
TAT AAC CAA TAC GAA CAT TAC AGC GTG AAA GGG GGA CGG 77
AGA GCC GAC CAA GTG GAA GCC TAC CGC CCC CCC TCA ATA 116
AAA GTG AAA GAA TTG CGA GAA ATA ACT GAT ACA ATA AAT 155
GAA CAT CAA CAT TTC CCC CAT TTT GAA ACT AGA GTA TTA 194
AAA AAA GCA ATT GAA GAA ATC AAC GCT CAC ACC TCT TTT 233
AAT GTG ACC TAT GAG AAA GTC AAA AAA GGG CGT TCA ATT 272
GAT TCT ATT GTC TTT CAT ATT GAG AAG AAA CGC TTG GCA 311
GAC GAT AAC AGC TAC AAG TTG GAA GAT AAA GTC TAC CAA 350
GAA GAT AAA GCA CGT AAA GCA GAA ACA GAA AAA GAC CTT 389
GTT TTC CAA GCT ATG CAA AGC CCT TAT ACA CGG CTG TTG 428
ATT GAA AAT ATG TTT TTA AAT GTT TAT GAA ACA ACG GAC 467
AGT CAA ATA ATG GCA GGC TTA CAG AAA AAC GTT TAT CCA 506
CTT TAT GAC GAG TTA AAG GAA TTA AGA GGG CTA AAT GGT 545
GTC AAA GAC CAC TTG TCT TAT GTA TCT AGC AAA CAA GAA 584
GCC TAT TCT AAA CGC AAT GTA GCG AAG TAT TTG AAG AAA 623
GCC ATT GAA CAA TAC CTA CCA ACC GTT AAA AGG CAG GAC 662
TTA AAC CAT GAG TGA 677
| | / | | / | |
ATG AGT GAA GAC TTA AAA ACC ATA AAA GAG TTG 702
GCG GAC GAG TTA GGG GTA AGT AAA TCA TAT GTT GAT AGG 741
ATA ATA CGC ATA CTC AAA TTG CAT ACT AAA TTA GAT AAA 780
GTA GGT AAT. AAG TAT GTA ATT TCT AAA AAG CAA GAA AAA 819
TCT ATA ATA ACA AGG ATT GAA AAT TCT AAA TCA ACA ACT 858
GAA ACG CAT ACT GAA TCA ACA ACT CAA TCG CAC ACT AAA 897
GTT GAT GCA GAA GTT GAT TTT TTG AAA GAA GAA ATC GCA 936
TAT CTT AAA AGT AAT CAC GAT AAA CAA TTG ACC AAC AAA 975
GAC AAA CAG ATA GAA ACC TTA AGC AAT CTA TTA GAC CAG 1014
CAA CAG CGA TTA GCT TTG CAA GAT AAA AAG TGG CTA GAA 1053
GAA TAC AAG GCA GAA ATA AAC GAC TTA AAA GCC CTA AAA 1092
ATG CCC TCA GAG GCA CGA AAG AGG AAC AAT CAA ATT ATC 1131
GTT CAC TAG AAAAAGAAAAGGGACTTTGTACAAACCATACAAGAATCT 1179
TATGAATCTGAAATCAAAGTCTTAAATCAAAAACTAGCTGAACAAGAAGAA 1230
CAAATACAGGAGATACAAAAAGAAAAAGAAACCAAAGAAAAAAAATGGTTT 1281
CAGTTTTGGAAGTGAGGTAATTTTTATGGCACAAACCTTTGATAGAAAAATTT 1332
TAAGAGCCTTACAAGATAATGGTGTAAGAGAAATCAGAGCTTATGAAGTCG 1383
TTTCAAAACGTTTGACAATCTTTCAAACAGACAGAGGAACGTTTAAATATA 1434
GCGATAGTTTATATCGGCTAGTTGCCCCAAGACAAGAATTATGGAGGAATT 1485
GCACGACTGGTTTTATTTCAGAAGAAAAATACCATTTCTACAAAAAATAAA 1536
ATATCTAAGTTTGAAAGAATAAATAAAAGCCCTTAAAAATGATTTTAGGGC 1587
TTATTATTATTCAAGTGGCATAATTCTACTCAAAACCATTTAAAAGGGCTT 1638 SEQ. ID NO : 2 ( suite)
AAAAGGCAAAATATGAGCTTATAGGACGATTCAAGCATTAAAGGGAGTGAA 1689
AAATTTATTTTTCAATTTCTTTAGTGCTTTTTCGTTGGTTTGCTCAACGAC 1740
AGGAGCAGTCAGATTGAAAATCTGAAATATATTCAAATTATTTTCCTAAGG 1791
GCGCACTTATATACCATGAAAAATCATGGTATAAAATGCCAATATTTTAGA 1842
TTAAACGTGTTGGAAAAACTCGCTTTGCTCATGTAAATAAAAACGTTATAA 1893
AGTATTATAGCGAGCTTAGTAAGTGGATATACACTTACGGTAAAAAGGGTT 1944
CTGTTGCGAAGTCAAAGATTTATACGAAAATGTCTTAAAAGAATTTGAAAT 1995
TAAGCTCTAATTTTTTTCAAAAAGGGGGATTGGGGGACACCACCAAAAATA 2046
AAAAGATTCGTCTGAAACGAACAAAAATAAAATTGGAAATTTTAGGTTTTG 2097
TGAGTGAAAGATGAATACTTTTTACTGTACTTGGGTACCCAAGTGCTAAGT 2148
TCACTAAAGACACTAACCCCCTATTTTGAGCTTTCAGAGTTGACAGATATT 2199
TGTGAGGTTGACAAGATGAAAATAATTCAGGTTCTGTTGCAAAGTTTAAAA 2250
ATCAAAATCAAATACAAGGTTTATAATCCTTCTTGTTC TTA AGC TAA 2297
TAT TCC CAT TAA GAC CTT AAT CTC AGT AGA TAC CGA AAA 2336
TCC GAA GAG CGT TCC ATT TCT CGG GTC TTT TTT GTA TAT 2375
TCC TCG AAT TGT TTC CAA TGC CCT TAA TCG TGG TTG AGG 2414
CAA GTT CGT AAG ACT TCG ATA AAA TTT ATT GCG TCG TTT 2453
GAT TGG TCG ATG GTC TTG CTC AAT GAG GTT ATT GAG ATA 2492
CTT CAC GGT TCG ATG CTC TGT CTT AGT ATA TAA ACC GTT 2531
ACT CTG TAA CTT TCT AAA TGC AGA ACC AAT AGA GGG CGC 2570
TTT ATC CGT GAC AAT TAC TCT TGG TTG ACC AAA CTG TTT 2609
ATG TAG TCG TTT CAA GAA CGC ATA AGC AGC TTG AGT ATC 2648
CCG TTT CTT GCG TAG CCA GAT GTC TAA AGT CAA TCC ATC 2687
CTC ATC AAT TGC ACG ATA GAG ATA ATG CCA ACG ACC TTT 2726
GAT TTT GAT ATA AGT TTC ATC CAT TTT CCA CGA ATA G/ .. 2763
................................................................................................................................./N
TT AAA ATG ATT CAT TACTCTGTCCTCTCTGTCTTTTTTCTCAATTTTACA 2813
CTAAAATAGATTTTTTGGAAAACTTTGCAACAGAACCATAAAAAGCAACAAAAAC 2868
CTTATTAAATAAGTAATTTTTCATCTTGTG'ITITITΓTACAAAATTTAAAGTTCT 2923
GGAAATTGGCTGCTTTATGGACATAAAATTTAAAAAATAAAAGGCTACTAATTAA 2978
TTATAAAAGATTCAAGAAATCAAATTAATAGATAACATATTAATCTTAGGGTTAG 3033
CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTCTTGACATATTTAGGATAATATGT 3088
TTAAATATATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTTGTATGCGCATTATGGCC 3143
AGGCTTTTTTTTTATCATTTTGAAGGAAAAAAT ATG AAA AAT AAA CAA 3191
TTA CAA AAA TAC AAA AGA ACC TCT ATG AAT ATT TTT AGG ACA 3233
AAA TAT CGT AGA ATT ATT TCT TCA AGT CAT TAT ATA AAA AGA 3275
GAT AAG ATT CCA AAG ATA AAC AAT GGA CTA CTA ATC AAA GAA 3317
GAC TTA AAA GAT TTT TAT TCC TTT GAA AAA ATA AAA AAA AAA 3359
ATT GAT AAA AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC GCT ATT 3401
CTA AAA GAG TTT ATA GAT AAG ACA GGA TAT TTT AGA TTT AGT 3443
ATC TAT TTA AAG TTG ATG AAG GAT ATT GAG GGA GTA ACT GTG 3485
ATT GAT ATT ATT AAA ACT TGT CAA CTA GAT GGG TAC ATT AGG 3527
GAT AAT TTG TTT AGT TTT ACA ACC AGA TTA GAA ATG TTC TGG 3569
AAA AAA ACT ATC GTG GAT ACT ATG TGT TTA AAC TAT GAG ACT 3611
AAC GAT TTT TTT CAT AAT ATC AAT AGT CAA TGT TAC TTA GAT 3653
AAA AAA ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT 3695
CAA GAG TTT AAT AAG AGC TTT TTT TCG AAT AAT AGT CCA GCA 3737
TTT AAG CAT CAT AAA AAT AAA AGG AAA AAC TGT ATT CCA ATT 3779
TGG GCA TTA TTT GAG GGA TTA ACG TTT GGA CAA ATA AAT ACT 3821
TTC ATT ACC CAA TTG GAT GCA AGA TAT TAT AAT GCT TGG GTT 3863
TCA TCT ATA TAT AAT AAT CCT GCA TAT AAA AAG CCT ATG AAA 3905
AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA TCT GCA 3947
CAT AAT TCA AGA ATT TAT GGT TTG AAA GCA CCC GAT GTT CCT 3989
ATG GAT TTT TAA AAAAGACATCACGGTAACTATTTTTCTGATAACAAATCA 4040
AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATTTGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT 4095
TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTTTATTTATAAACT 4150
CAATGATAAACTATTAGAAATAAAAAAAATAGAAAAAAGTCAGTATGGTTTTTCT 4205
GAGGATTGGGTTAAACAGTTAGAAATAATAGATTAAATTTTAAGGAGCAATAGTC 4260
TCCCTTTTAGTGT 4273 SEQ. ID NO : 3
TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 677pb
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
CARACTERISTIQUES : cadre ouvert de lecture ORF2 (séquence
partielle) du fragment SEQ ID NO: 2 ; code pour la partie
C-terminale du polypeptide
................................................................................................................... /
N AG TAT TCG ATT ATT TTG TAT CGT TGG TTA TCC ATG AAT 38
TAT AAC CAA TAC GAA CAT TAC AGC GTG AAA GGG GGA CGG 77
AGA GCC GAC CAA GTG GAA GCC TAC CGC CCC CCC TCA ATA 116
AAA GTG AAA GAA TTG CGA GAA ATA ACT GAT ACA ATA AAT 155
GAA CAT CAA CAT TTC CCC CAT TTT GAA ACT AGA GTA TTA 194
AAA AAA GCA ATT GAA GAA ATC AAC GCT CAC ACC TCT TTT 233
AAT GTG ACC TAT GAG AAA GTC AAA AAA GGG CGT TCA ATT 272
GAT TCT ATT GTC TTT CAT ATT GAG AAG AAA CGC TTG GCA 311
GAC GAT AAC AGC TAC AAG TTG GAA GAT AAA GTC TAC CAA 350
GAA GAT AAA GCA CGT AAA GCA GAA ACA GAA AAA GAC CTT 389
GTT TTC CAA GCT ATG CAA AGC CCT TAT ACA CGG CTG TTG 428
ATT GAA AAT ATG TTT TTA AAT GTT TAT GAA ACA ACG GAC 467
AGT CAA ATA ATG GCA GGC TTA CAG AAA AAC GTT TAT CCA 506
CTT TAT GAC GAG TTA AAG GAA TTA AGA GGG CTA AAT GGT 545
GTC AAA GAC CAC TTG TCT TAT GTA TCT AGC AAA CAA GAA 584
GCC TAT TCT AAA CGC AAT GTA GCG AAG TAT TTG AAG AAA 623
GCC ATT GAA CAA TAC CTA CCA ACC GTT AAA AGG CAG GAC 662
TTA AAC CAT GAG TGA 677
SEQ. ID NO : 4
TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 471 pb
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
CARACTERISTIQUES : cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment
SEQ ID NO: 2 ;
ATG AGT GAA GAC TTA AAA ACC ATA AAA GAG TTG 702
GCG GAC GAG TTA GGG GTA AGT AAA TCA TAT GTT GAT AGG 741
ATA ATA CGC ATA CTC AAA TTG CAT ACT AAA TTA GAT AAA 780
GTA GGT AAT AAG TAT GTA ATT TCT AAA AAG CAA GAA AAA 819
TCT ATA ATA ACA AGG ATT GAA AAT TCT AAA TCA ACA ACT 858
GAA ACG CAT ACT GAA TCA ACA ACT CAA TCG CAC ACT AAA 897
GTT GAT GCA GAA GTT GAT TTT TTG AAA GAA GAA ATC GCA 936
TAT CTT AAA AGT AAT CAC GAT AAA CAA TTG ACC AAC AAA 975
GAC AAA CAG ATA GAA ACC TTA AGC AAT CTA TTA GAC CAG 1014
CAA CAG CGA TTA GCT TTG CAA GAT AAA AAG TGG CTA GAA 1053
GAA TAC AAG GCA GAA ATA AAC GAC TTA AAA GCC CTA AAA 1092
ATG CCC TCA GAG GCA CGA AAG AGG AAC AAT CAA ATT ATC 1131
GTT CAC TAG 1179
SEQ. ID NO : 5
TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 1240 pb
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; plasmide pIL105
CARACTERISTIQUES : comprend le cadre ouvert de lecture ORF1 du fragment SEQ ID NO: 2 ;
Les séquences soulignées représentent :
- De 133 à 137 pb : site de liaison aux ribosomes
- De 33 à 38 pb, et de 57 à 62 pb : promoteurs -35 et -10 de ORF1
CTCATTTATTGAAAATAAACTTTTGCTCCTTCTTGACATATTTAGGATAATATGT 3088 TTAAATATATATATCAGTACTTGCCACGCCTCTGCTTTGTATGCGCATTATGGCC 3143
AGGCTTTTTTTTTATCATTTTGAAGGAAAAAAT ATG AAA AAT AAA CAA 3191
TTA CAA AAA TAC AAA AGA ACC TCT ATG AAT ATT TTT AGG ACA 3233
AAA TAT CGT AGA ATT ATT TCT TCA AGT CAT TAT ATA AAA AGA 3275
GAT AAG ATT CCA AAG ATA AAC AAT GGA CTA CTA ATC AAA GAA 3317
GAC TTA AAA GAT TTT TAT TCC TTT GAA AAA ATA AAA AAA AAA 3359
ATT GAT AAA AGT GTT CGT ATT GAA GAA AGT GAG CTC GCT ATT 3401
CTA AAA GAG TTT ATA GAT AAG ACA GGA TAT TTT AGA TTT AGT 3443
ATC TAT TTA AAG TTG ATG AAG GAT ATT GAG GGA GTA ACT GTG 3485
ATT GAT ATT ATT AAA ACT TGT CAA CTA GAT GGG TAC ATT AGG 3527
GAT AAT TTG TTT AGT TTT ACA ACC AGA TTA GAA ATG TTC TGG 3569
AAA AAA ACT ATC GTG GAT ACT ATG TGT TTA AAC TAT GAG ACT 3611
AAC GAT TTT TTT CAT AAT ATC AAT AGT CAA TGT TAC TTA GAT 3653
AAA AAA ATA TAT AAG AAT GAT GAA TGG GGT AAT CTA ATT ATT 3695
CAA GAG TTT AAT AAG AGC TTT TTT TCG AAT AAT AGT CCA GCA 3737
TTT AAG CAT CAT AAA AAT AAA AGG AAA AAC TGT ATT CCA ATT 3779
TGG GCA TTA TTT GAG GGA TTA ACG TTT GGA CAA ATA AAT ACT 3821
TTC ATT ACC CAA TTG GAT GCA AGA TAT TAT AAT GCT TGG GTT 3863
TCA TCT ATA TAT AAT AAT CCT GCA TAT AAA AAG CCT ATG AAA 3905
AGC TGG ATA ACC GTA ATA CGT ACA TCA AGA AAT AGA TCT GCA 3947
CAT AAT TCA AGA ATT TAT GGT TTG AAA GCA CCC GAT GTT CCT 3989
ATG GAT TTT TAA AAAAGACATCACGGTAACTATTTTTCTGATAACAAATCA 4040
AAAAATATAGATTCTACTTTGTTATTTGGAACTCTTTATGTCATTAAGCACTTAT 4095
TCATGTATGAGAATGATCATATAAAAGAGAATTGGAATAATTTTATTTATAAACT 4150
CAATGATAAACTATTAGAAATAAAAAAAATAGAAAAAAGTCAGTATGGTTTTTCT 4205
GAGGATTGGGTTAAACAGTTAGAAATAATAGATTAAATTTTAAGGAGCAATAGTC 4260
TCCCTTTTAGTGT 4273 SEQ. ID NO : 6
TYPE DE SEQUENCE : polypeptide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 250 acides aminés
TYPE DE MOLECULE : protéine
ORIGINE : Streptococcus creimoris IL416 ; séquence codée par le gène de structure Abi 416
Met Asp Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Gln Val Asp Ser Phe Met
05 10 15
Lys Gln Gln Gln Lys Lys Ile Asp Ser Trp Leu Ser Phe Asp Asn
20 25 30
Met Pro Ile Pro Thr Gly Ile Met Lys Gln Gln Glu Gln Lys Lys
35 40 45
Val Asn Thr Leu Arg Met Ile Leu Lys Met Leu Leu Ile Asn Thr
50 55 60
Arg Asp Val Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu Glu Ala Thr Asn Asn
65 70 75
Met Thr Ser Ser Met Ile Leu His Lys Thr Leu Ile Glu Asn Thr
80 85 90
Ile Asn Ile Gly Tyr Ala Leu Lys Phe Tyr Lys Thr Lys Asp Tyr
95 100 105
His Ser Phe Cys Asn Leu Ile Lys Glu Asp Lys Lys Leu Phe Gly
110 115 120
Asn Glu Thr Val Asn Gln Lys Ala Asn Ile Ser Phe Val Lys Ser
125 130 135
Glu Gly Glu Lys His Thr His Ile Tyr Leu Asp Tyr Gln Glu Thr
140 145 150
Cys Lys Val Ala His Pro Asn Phe Leu Gln Leu Ile Asn Leu Leu
155 160 165
Lys Asn Tyr Tyr Pro Glu Phe Ser Glu Glu Lys Leu Leu Thr Phe
170 175 180
Asp Leu Asn Asp Lys Ile Phe Gly Glu Asp Glu Ile Lys Val Ile
185 190 195
Pro Ile Ser Lys Pro Lys Ile Val Asn Thr Ile Asp Glu Val Met
200 205 210
Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Val Leu Lys Tyr Asn Gln Asp Met
215 220 225
Cys Lys Val Thr Ser Lys Leu Gly Glu Ile Ser Leu Thr Pro Ile
230 235 240 Gln Glu Lys Phe Asp Lys Leu Lys Asp Ile
245 250 SEQ. ID NO : 7
TYPE DE SEQUENCE : polypeptide ; séquence C-terminaie
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 224 acides aminés
TYPE DE MOLECULE : protéine
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par
le cadre ouvert de lecture ORF2 du fragment d'ADN portant le
mécanisme de résistance Abi 105
................................................................................................................................./
Tyr Ser Ile Ile Leu Tyr Arg Trp Leu Ser Met Asn Tyr Asn Gln
05 10 15
Tyr Glu His Tyr Ser Val Lys Gly Gly Arg Arg Ala Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ala Tyr Arg Pro Pro Ser Ile Lys Val Lys Glu Leu Arg Glu
35 40 45
Ile Thr Asp Thr Ile Asn Glu His Gln His Phe Pro His Phe Glu
50 55 60
Thr Arg Val Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ala His Thr
65 70 75
Ser Phe Asn Val Thr Tyr Glu Lys Val Lys Lys Gly Arg Ser Ile
80 85 90
Asp Ser Ile Val Phe His Ile Glu Lys Lys Arg Leu Ala Asp Asp
95 100 105
Asn Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Lys Val Tyr Gln Glu Asp Lys Ala
110 115 120
Arg Lys Ala Glu Thr Glu Lys Asp Leu Val Phe Gln Ala Met Gln
125 130 135
Ser Pro Tyr Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asn Met Phe Leu Asn Val
140 145 150
Tyr Glu Thr Thr Asp Ser Gln Ile Met Ala Gly Leu Gln Lys Asn
155 160 165
Val Tyr Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Lys Glu Leu Arg Gly Leu Asn
170 175 180
Gly Val Lys Asp His Leu Ser Tyr Val Ser Ser Lys Gln Glu Ala
185 190 195
Tyr Ser Lys Arg Asn Val Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Ile Glu
200 205 210
Gln Tyr Leu Pro Thr Val Lys Arg Gln Asp Leu Asn His Glu
215 220
SEQ. ID NO : 8
TYPE DE SEQUENCE : polypeptide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 156 acides aminés
TYPE DE MOLECULE : protéine
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORF3 du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105
Met Ser Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Glu Leu Ala Asp Glu Leu
05 10 15 Gly Val Ser Lys Ser Tyr Val Asp Arg Ile Ile Arg Ile Leu Lys
20 25 30 Leu His Thr Lys Leu Asp Lys Val Gly Asn Lys Tyr Val Ile Ser
35 40 45
Lys Lys Gln Glu Lys Ser Ile Ile Thr Arg Ile Glu Asn Ser Lys
50 55 60
Ser Thr Thr Glu Thr His Thr Glu Ser Thr Thr Gln Ser His Thr
65 70 75
Lys Val Asp Ala Glu Val Asp Phe Leu Lys Glu Glu Ile Ala Tyr
80 85 90
Leu Lys Ser Asn His Asp Lys Gln Leu Thr Asn Lys Asp Lys Gln
95 100 105
Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asp Gln Gln Gln Arg Leu Ala
110 115 120
Leu Gln Asp Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Glu Ile Asn
125 130 135
Asp Leu Lys Ala Leu Lys Met Pro Ser Glu Ala Arg Lys Arg Asn
140 145 150 Asn Gln Ile Ile Val His
155
SEQ. ID NO : 9
TYPE DE SEQUENCE : polypeptide
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 274 acides aminés
TYPE DE MOLECULE : protéine
ORIGINE : Streptococcus cremoris IL964 ; séquence codée par le cadre ouvert de lecture ORFl du fragment d'ADN portant le mécanisme de résistance Abi 105
Met Lys Asn Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys Arg Thr Ser Met Asn
05 10 15
Ile Phe Arg Thr Lys Tyr Arg Arg Ile Ile Ser Ser Ser His Tyr
20 25 30
Ile Lys Arg Asp Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asn Gly Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Glu Asp Leu Lys Asp Phe Tyr Ser Phe Glu Lys Ile Lys Lys
50 55 60
Lys Ile Asp Lys Ser Val Arg Ile Glu Glu Ser Glu Leu Ala Ile
65 70 75
Leu Lys Glu Phe Ile Asp Lys Thr Gly Tyr Phe Arg Phe Ser Ile
80 85 90
Tyr Leu Lys Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Thr Val Ile Asp
95 100 105
Ile Ile Lys Thr Cys Gln Leu Asp Gly Tyr Ile Arg Asp Asn Leu
110 115 120
Phe Ser Phe Thr Thr Arg Leu Glu Met Phe Trp Lys Lys Thr Ile
125 130 135
Val Asp Thr Met Cys Leu Asn Tyr Glu Thr Asn Asp Phe Phe His
140 145 150
Asn Ile Asn Ser Gln Cys Tyr Leu Asp Lys Lys Ile Tyr Lys Asn
155 160 165
ASP Glu Trp Gly Asn Leu Ile Ile Gln Glu Phe Asn Lys Ser Phe
170 175 180
Phe Ser Asn Asn Ser Pro Ala Phe Lys His His Lys Asn Lys Arg
185 190 195
Lys Asn Cys Ile Pro Ile Trp Ala Leu Phe Glu Gly Leu Thr Phe
200 205 210
Gly Gln Ile Asn Thr Phe Ile Thr Gln Leu Asp Ala Arg Tyr Tyr
215 220 225
Asn Ala Trp Val Ser Ser Ile Tyr Asn Asn Pro Ala Tyr Lys Lys
230 235 240
Pro Met Lys Ser Trp Ile Thr Val Ile Arg Thr Ser Arg Asn Arg
245 250 255
Ser Ala His Asn Ser Arg Ile Tyr Gly Leu Lys Ala Pro Asp Val
260 265 270
Pro Met Asp Phe
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001

Claims

REVENDICATIONS
1) Fragments d'ADN comprenant au moins un gène codant pour un mécanisme de résistance aux bactériophages, de type Abi, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence homologue de celle de tout ou partie d'au moins un fragment choisi dans le groupe constitué par :
- le fragment dont la séquence figure dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
- l'insert de 9,4 kb environ, du plasmide pIL352, lequel insert est clone à partir de l'ADN total de la souche L. lactis ssp cremoris IL420.
le fragment dont la séquence partielle figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 3 ;
- le fragment dont la séquence partielle figiire dans la liste des séquences sous le numéro
SEQ ID NO : 4 7
- le fragment dont la séquence partielle ffiigguurree ddaannss llaa liste des séquences sous le numéro
SEQ ID NO : 5.
- un insert de 5,7 kb environ, du plasmide pIL618, lequel insert est clone à partir de l'ADN du plasmide pIL105 de la souche L. cremoris IL965.
2) Fragments d'ADN de plus de 20 pb, caractérisés en ce qu'ils s'hybrident avec l'un des fragments codant pour un mécanisme Abi selon la Revendication 1.
3) Vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2.
4) Vecteur recombinant selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL353, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-999.
5) Vecteur recombinant selon la Revendication
3, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL352, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-1000.
6) Vecteur recombinant selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide pIL618, déposé le 13 Septembre 1990, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro de dépôt I-1001.
7) Polypeptide intervenant dans un mécanisme de résistance aux bactériophages de type Abi et caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- Le polypeptide dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 6 ;
- Le polypeptide dont la séquence C-terminale figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 7 ;
- Le polypeptide dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 8 ;
- Le polypeptide dont la séquence figure dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO : 9.
8) Souches de microorganismes transformés, caractérisés en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'ADN, selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2.
9) Souche de microorganismes selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
10) Souche de microorganismes selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois fragments d'ADN codant chacun pour un mécanisme Abi différent.
11) Souche de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par un même vecteur. 12) Souche de microorganismes selon l'une quelconque des Revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les fragments d'ADN codant pour des mécanismes Abi différents sont portés par des vecteurs différents.
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