糸田 β 遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法 発明の背景
発明の属する技術分野:
本発明は遺伝子治療に利用する高力価のレトロウイルスベクタ一の作製法に関 するものである。 従来の技術:
近年のめざましい遺伝子工学の進歩によって、 多くの遺伝病の原因遺伝子が同 定され、 病態の分子機構が明らかになつてきた。 それに伴い病態を改善させるこ とができると考えられる遺伝子を細胞に導入する遺伝子治療の研究が行われ、 実 際に実施されるに至っている。 また、 癌、 AIDS等の疾患においても遺伝子治療が 応用されつつある。 遺伝子治療において外来遺伝子を導入する方法はいくつかあ るが、 現在もっとも広く用いられている方法はレトロウイルスベクターを用いる ものである (M i l l er, A. D. , B l ood, 76, 271 -278, 1990) 。 このべクタ一の利 点として、 導入された遺伝子が確実に染色体に組み込まれるため長期間安定した 発現が期待できる点、 細胞障害性が少なく安全性も高いという点が挙げられる。 一方、 欠点としては、 ウィルスのエンベロープ蛋白質のレセプ夕一が導入細胞に 存在しないことにより遺伝子導入できない細胞が少なくないこと、 サイズの大き な DNAを挿入することができないこと、 分裂している細胞にしか導入できないこ と、 などが挙げられる。 これらの欠点によりレトロウイルスを用いた遺伝子治療
はもつとも繁用されていながら十分な治療効果を上げるに至っていない (Marsha 11, E. Science, 269, 1050-1055, 1995)。
いずれの方法を用いるにしろ遺伝子治療を行うためには、 1)標的細胞に目的の 遺伝子を効率よく導入できること、 2)導入された遺伝子が形質発現し、 かつ持続 すること、 3)患者を含め公共に対して安全であることの 3条件を最低限クリアし なければならない。
これまでのレトロウイルスベクタ一の作製法は、 レトロウイルスの gag、 poU envを安定に発現しているパッケージング細胞と呼ばれる細胞へ、 目的の外来遺 伝子を含むレトロウイルスゲノムを導入することで外来遺伝子をそのゲノムに含 むレトロウイルスを作製する方法を用いていた。 しかしながら、 臨床の使用に耐 える高品質ベクターの作製は難しく、 これまでに自己複製可能なレトロウイルス (Replication Competent Retrovirus: RCR) の出現を防ぐ方法、 力価の高いレ トロウィルスを産生させる方法、 ベクタ一ゲノムの構造を改良したり、 濃縮方法 や遺伝子導入の条件などを検討することによってレトロウイルスベクタ一の力価 を高める方法など多くの研究がなされているが (Vile, R. G. , Gene Therapy, Churchill Livingstone, 12-30, 1995)、 未だ感染範囲が広く力価の高いベクタ —を大量に安定に調製することができる技術は確立されていない。 このことが遺 伝子治療の大きな障害の一つとなっている。
一方、 レトロウイルスと他のウィルスの研究の接点として、 古くから水疱性口 内炎ウィルス (VSV) を用いたシユードタイプウィルスの研究が精力的になされ てきた (Zavada, J. , Arch. Virol. , 50, 1, 1976) 。 シユードタイプとは一つ のウィルスゲノムが別種のウィルスの外皮蛋白質に囲まれて発芽してくる現象を いう。 VSVはラブドウィルス科に属するネガティブ 1本鎖 RNAゲノムをもつウィル スであり、 その外皮蛋白質 (G蛋白質) の細胞側のレセプ夕一はホスファチジル
セリンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられ極めて広い宿主域を有する ことが知られている。 したがって、 この VSV-G遺伝子産物を外皮に持つシュ一ド タイプレトロウイルスを作製することにより、 本来の外皮蛋白質を持つレトロゥ ィルスでは感染効率が低かったり、 感染させることができなかった細胞に効率よ く遺伝子を導入することが可能になると考えられる。 実際に Emiら (Emi, N. , et al. , J. Virol. , 65, 1202-1207, 1991) 及び Yeeら (Yee, J. K. , et al. , Pro atl. Acad. Sci. USA, 91, 9564-9568, 1994) は VSV- G遺伝子産物を外皮 にもつレトロウイルスベクタ一の作製法を報告するとともに、 そのシユードタイ プウィルスが、 本来の外皮蛋白質を持つレトロウイルスでは感染効率が低かった 細胞に効率よく遺伝子を導入できることを示した。
VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクタ一を臨床応用するためには、 高力価のゥ ィルスを再現性よく得る方法を確立する必要がある。 しかし、 VSV- G遺伝子産物 自体が細胞障害性を有しているため、 パッケージング細胞において再現性よく VS V-G遺伝子産物を高レベルに産生させることが困難である。 このことが広い応用 が期待されるシユードタイプべクタ一を開発する上で大きな問題となっている。 最近、 テトラサイクリンを用いて VSV-G遺伝子産物の発現を制御することにより VSV-Gシユードタイプウィルスベクターの産生細胞を作製できることが報告され ているが (Yang, Y. , et al. Hum. Gene. Ther. 6, 1203-1213, 1995、 Chen, S. T. , et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10057-10062, 1996、 Ory, D. S. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11400-11406, 1996) 、 テトラサイ クリンによる VSV-G遺伝子産物の発現制御が完全ではなく常に産生細胞に再感染 可能な 102から 104i. u. /ml程度の VSV-Gシユードタイプウィルスベクターを産生し ていること、 VSV- G発現 DNAと薬剤耐性遺伝子発現 DNAとのコ · トランスフエクシ ョンを用いていることからパッケージング細胞としての長期安定性に疑問が残る、
などの問題を残している。
またレトロウイルスによる標的細胞への外来遺伝子導入の際に、 外来遺伝子が 細胞に対して影響の強いものである場合に、 ウィルス産生細胞 (ウィルスゲノム を含むパッケージング細胞) 自体の中で外来遺伝子産物が影響を与えることによ りその外来遺伝子をウィルスゲノムにもつウィルスを安定に回収できないことが 知られている (Pear, W, S. e t al. , Pro at l. Acad. Sc i. USA, 90, 8392-8 396, 1993) 。
なお、 本明細書においては VSV-G遺伝子産物を外皮に持つレトロウイルスべク 夕一を 「シユードタイプウィルスベクター」 と表記する。 また、 本来の外皮蛋白 質を持つレトロウイルスベクターと、 「シユードタイプウィルスベクター」 を合 わせて 「レトロウイルスベクター」 とする。
またレトロウイルスの gag、 po lを発現し、 通常は発現しないもののリコンビナ ーゼにより envが発現できる細胞を 「プレパッケージング細胞」 と標記する。 ま たそこにウィルスゲノムを導入した細胞を 「ウィルスゲノムを含むプレパッケ一 ジング細胞」 と表記する。 さらに、 リコンビナ一ゼの導入によりウィルスを産生 する細胞を 「ウィルスゲノムを含むパッケージング細胞」 とする。
さらに低効率薬剤耐性遺伝子又は、 薬剤耐性遺伝子の mRNAを短寿命化した塩基 配列を有する転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子および従来型の薬剤耐性遺伝子を 総称して 「薬剤耐性遺伝子」 とする。 発明の開示 上記現状を鑑み、 本発明の目的は細胞毒性作用をもつウィルス構成蛋白質を従 来のものより厳密に制御することで、 細胞に影響を与えるものを含む外来遺伝子
を、 幅広い標的細胞に特異的に導入 ·発現させるためのレトロウイルスベクター を安定して高力価で作製しえる方法を確立すること、 及びシユードタイプレトロ ウィルスベクタ一が産生細胞に再感染することを抑制することによるレトロウイ ルスベクターの回収量増大方法を確立すること、 及びリコンビナ一ゼにより二つ の遺伝子を同一プロモーターで転写させる際に低効率あるいは転写産物短寿命化 薬剤耐性遺伝子を用いることで効率よく高発現細胞クローンの選択を行うことに ある。
そこで、 本発明者らは上記問題を解決するために鋭意検討した。
強力なプロモータ一の下流に 1 oxP配列、 薬剤耐性遺伝子、 po 1 yA付加シダナル、 1 oxP配列、 VSV-G遺伝子および po 1 yA付加シグナルをこの順に配向させた DNAを、 レトロウイルスの gag、 po l遺伝子が導入されている細胞に導入し、 薬剤で選択す ることによりプレパッケージング細胞を作製する。 このようにして作製したプレ パッケージング細胞に、 目的とする遺伝子を挿入したレトロウイルスベクタ一を 感染させて遺伝子を導入するとともに、 リコンビナーゼを作用させることにより、 薬剤耐性マーカ一の発現に用いたものと同一の強力なプロモ一夕一で、 VSV- G遺 伝子産物を短時間に高発現させることが可能となる。 この結果、 VSV- G遺伝子産 物の細胞障害性が現れる前に高力価のシュ一ドタイプウィルスベクタ一を大量に 作製することに成功し、 本発明を完成させるに至った。
さらにシユードタイプレトロウイルスべク夕一が産生細胞に再感染することを 見いだし、 培養液に陰性荷電高分子物質を添加することにより再感染を抑制し、 回収量を増大することができることを発見した。
また、 上記のプレパッケージング細胞を作製する際に用いる薬剤耐性マーカー 遺伝子として、 そのコ一ティング領域内の塩基配列に置換、 挿入、 欠失を加える ことにより機能を低下させたものや、 非翻訳領域の塩基配列に置換、 挿入、 欠失
等を導入することにより翻訳効率を低下させたり (低効率薬剤耐性遺伝子) 、 そ の遺伝子から産生される mRNAの安定性を低下させたものを用いることにより (転 写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子) 、 より高い耐性マーカーの発現を必要とする細 胞を効率よく選択することができることを利用した。 本発明ではこれらの工夫を 加えた転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子を使用した。 また、 この細胞に目的とす る遺伝子を挿入したレトロウイルスベクターあるいはその DNAを導入するととも に、 リコンビナ一ゼを作用させることで、 さらに高い VSV- G遺伝子産物の発現を 得ることが可能となり、 高力価のシュ一ドタイプべクタ一を大量に作製すること に成功した。 発明の詳細な説明:
本発明は、 リコンビナーゼとその認識配列を用いてウィルスの構造蛋白質の発 現を制御する DNA構築物 (以下、 DNA構築物(A)と記す) 、 及びリコンビナ一ゼと その認識配列を用いて、 ウィルスゲノムにコードされる外来遺伝子の発現を制御 する DN'A構築物 (以下、 DNA構築物(B)と記す) をレトロウイルスの gag- po l産生細 胞に導入した後、 リコンピナ一ゼ発現 DNAを導入することを含む、 遺伝子治療用 レトロウイルスベクターの作製法に関するものであって、 1) プロモー夕一、 リ コンビナーゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 po l yA付加シグナル、 リコンビナーゼ 認識配列、 ウィルスの構造蛋白質遺伝子、 po lyA付加シグナルの順に配向した DN'A 構築物(A)、 及びレトロウイルスゲノムの LTR、 パッケージングシグナルに続き、 リコンビナーゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 po l yA付加シグナル、 リコンビナ一 ゼ認識配列、 外来遺伝子、 LTRの順に配向した DN'A構築物(B)をレトロウイルスの g ag - po l産生細胞に導入した後、 リコンピナ一ゼ発現 DNAを導入することを含む、 遺伝子治療用レトロウイルスベクタ一の作製法、 2) レトロウイルスの gag-po卜 e
nv産生細胞に、 レトロウイルスゲノムの LTR、 パッケージングシグナルに続き、 リコンビナ一ゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 po lyA付加シグナル、 リコンビナー ゼ認識配列、 外来遺伝子、 LTRの順に配向した DNA構築物 (B)を導入した後、 リコ ンビナーゼ発現 DNAを導入することを含む、 遺伝子治療用レトロウイルスベクタ —の作製法、 3) プロモータ一、 リコンビナーゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 po l yA付加シグナル、 リコンビナーゼ認識配列、 ウィルスの構造蛋白質遺伝子、 po ly A付加シグナルの順に配向した DNA構築物(A)および外来遺伝子をコードするレト ロウィルスゲノムをレトロウイルスの gag- po 1産生細胞に導入した後、 リコンビ ナ一ゼ発現 DNAを導入することを含む、 遺伝子治療用レトロウイルスベクターの 作製法、 4) プロモー夕一、 リコンビナーゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 polyA付 加シグナル、 リコンビナーゼ認識配列、 ウィルスの構造蛋白質遺伝子、 po A付 加シグナルの順に配向した DNA構築物(A)、 5) レトロウイルスゲノムの LTR、 パッ ケージングシグナルに続き、 リコンビナーゼ認識配列、 薬剤耐性遺伝子、 po lyA 付加シグナル、 リコンビナーゼ認識配列、 外来遺伝子、 LTRの順に配向した DNA構 築物(B)、 6) プロモーターが CAGである DNA構築物(A)、 7) リコンビナーゼとその 認識配列が Creリコンビナーゼと Ι οχΡ配列である DNA構築物(A)又は DNA構築物(B)、 8) 薬剤耐性遺伝子が、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子 法又はハイグロマイシン耐性遺伝子である DM構築物(A)又は DNA構築物(B)、 9) 薬剤耐性遺伝子が、 低効率薬剤耐性遺伝子又は、 薬剤耐性遺伝子の mRNAを短寿命 化した塩基配列を有する転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子である DNA構築物 (A)又 は DNA構築物(B)、 10) 低効率薬剤耐性遺伝子又は転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝 子が、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイ シン耐性遺伝子由来である DNA構築物(A)又は DNA構築物(B)、 1 1) ネオマイシン耐 性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子の mRNA
を短寿命化した塩基配列を有することを特徴とする転写産物短寿命化薬剤耐性遺 伝子、 12) mRNAの短寿命化が c- fos由来の mRNA不安定化シグナルによるものであ る転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子、 13) polyA付加シグナルが SV40由来又は /3 一グロビン由来である DNA構築物(A)又は DNA構築物(B)、 14) ウィルスの構造蛋白 質遺伝子が水疱性口内炎ウィルス (Vesicular stomatitis virusゝ VSV) の G蛋白 質 (VSV- G) をコードする DNAである DNA構築物(A)、 15) レトロウイルスゲノムが モロニ——マ'ノス白血病ウイ レス (Moloney murine leukemia virus, MoMLV)由来 である請求項 2に記載の DNA構築物(B)、 16) レトロウイルスゲノムがレンチウイ ルス由来である DNA構築物(B)、 17) 外来遺伝子が遺伝遺伝子治療のために細胞導 入を目的とする遺伝子である DNA構築物 (B)、 18) 外来遺伝子が、 細胞毒性を有す る蛋白質の遺伝子である DNA構築物(B)、 19) CAGプロモーター、 ΙοχΡ配列、 薬剤 耐性遺伝子、 polyA付加シグナル、 ΙοχΡ配列、 VSV- G遺伝子、 polyA付加シグナル の順に配向した DNA構築物(A)、 20) レトロウイルスゲノムの LTR、 パッケージン グシグナルに続き、 ΙοχΡ配列、 薬剤耐性遺伝子、 polyA付加シグナル、 ΙοχΡ配列、 外来遺伝子、 LTRの順に配向した DNA構築物(B)、 21) レトロウイルスの gag- pol 産生細胞に DNA構築物(A)を導入した、 レトロウイルスベクタ一産生用プレパッケ —ジング細胞、 22) レトロウイルスの gag-po卜 env産生細胞に DNA構築物(B)を導 入した、 レトロウイルスベクター産生用の、 ウィルスゲノムを含むプレパッケー ジング細胞、 23) レトロウイルスの gag- pol産生細胞に DNA構築物(A)及び DNA構築 物(B)を導入した、 レトロウイルスベクタ一産生用の、 ウィルスゲノムを含むプ レパッケージング細胞、 24) レトロウイルスの gag- pol産生細胞に DNA構築物(A) および外来遺伝子をコ一ドするウィルスゲノムを導入した、 レトロウイルスべク 夕一産生用の、 ウィルスゲノムを含むプレパッケージング細胞、 25) レトロウイ ルスがマウス白血病ウィルス (murine leukeimia virus, MLV)であるレトロウイ
ルスベクター産生用プレパッケージング細胞、 26)シユードタイプレトロウィル スを作製する方法において、 培養液中に陰性荷電高分子物質を共存させる方法、 27)陰性荷電高分子物質がへパリン、 へパラン硫酸、 コンドロイチン硫酸から選 ばれるシユードタイプレトロウイルスの作製方法、 に関する。 図面の簡単な説明:
図 1はプレパッケージング細胞によるシユードタイプレトロウイルス産生系の 概略図を示す。
図 2は pCALNLG及び pCALNdLGの構築図を示す。
図 3は pBabe, pBabe l oxpuroの構築図を示す。
図 4はウェスタンプロットによる VSV-Gの検出を示す。
図 5は P t G-L 1のプレパッケージング細胞としての安定性を示す。
図 6は P t G-L lのウィルス産生量の経時変化を示す。
図 7は P t G- S2からのシュ一ドタイプレトロウイルス産生量の経時変化を示す。 図 8は P t G- L 1からのシユードタイプレトロウイルス産生量の経時変化を示す。 図 9はウエスタンブロット法による Cr eリコンビナーゼ導入前後におけるタン パク合成変化の解析を示す。
は図 1 0はサザンブロット法による Creリコンビナ一ゼ導入前後のおける染色 体の変化の解析を示す。
図 1 1はウィルス感染に及ぼすへパリンの効果を示す。 本発明の方法により作製された遺伝子治療用レトロウイルスベクタ一に関する 発明の概要を図 1に示した。
リコンビナ一ゼは DNA部位特異的組換え酵素であって、 特定の塩基配列を認識
して切断 ·結合という部位特異的組換えに必要な一連の反応を単独で行う酵素で ある。 具体的には酵母の 2 プラスミド由来の FLP遺伝子がコードするリコンビ ナ一ゼ、 シゾサッカロマイセス ·ルーイイの pSRlプラスミド由来のもの、 大腸菌 の P1ファージにコードされている Creリコンビナーゼ (Cre recomb i nase) などと それらに対応する認識配列の組み合わせのいずれも使用できるが、 好ましくは Creリコンビナーゼが挙げられる。 Creリコンビナーゼは 34塩基対の Ι οχΡ配列を特 異的に認識する酵素であるが (Fukush ige, S. , e t al. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 89, 6232-6236, 1992) 、 この l oxP配列を同じ向きに 2コピーもつ組換えべ クタ一を作製し、 Creリコンビナ一ゼを作用させることにより 2つの l oxP間の再 構成が起き、 挟まれた部分が環状分子として切り出される。 これを Cre/l oxPシス リコンビナーゼとその認識配列を用いてウィルスの構造蛋白質遺伝子の発現を 制御する DNA構築物 (A)は、 プロモータ一、 リコンビナ一ゼ認識配列、 薬剤耐性遺 伝子、 po l yA付加シグナル、 リコンビナーゼ認識配列、 ウィルスの構造蛋白質遺 伝子、 po l yA付加シグナルの順に配向したものであり、 リコンビナ一ゼとその認 識配列を用いて外来遺伝子の発現を制御する DNA構築物(B)は、 レトロウイルスゲ ノムの LTR、 パッケージングシグナルに続き、 リコンビナーゼ認識配列、 薬剤耐 性遺伝子、 po l yA付加シグナル、 リコンビナーゼ認識配列、 外来遺伝子、 LTRの順 に配向したものである。 この場合、 プロモータ一 (又は、 DNA構築物(B)における LTR) は薬剤耐性遺伝子のみを発現させていることから、 これら構築物を細胞に 導入した際に、 薬剤による細胞の選択をすることができる。 選択された細胞に Creリコンビナーゼを作用させると、 これら構築物の 2つの l oxP間の再構成が起 き、 挟まれた部分が環状分子として切り出されることにより、 初めてウィルス構 造蛋白質遺伝子 (又は外来遺伝子) が発現されることになる。 本発明はこの Cre/
1 oxPシステムを用いることによって、 一つのプロモーターで薬剤耐性マ一カー遺 伝子の発現および Creリコンビナーゼ作用後のウィルス構造蛋白質 (例えば、 VSV - G) の発現の 2つの機能を持たせたことに大きな特徴を有している。 目的とする 外来遺伝子又はウィルス構造蛋白質が細胞障害性を持つ等の理由により、 再現性 良く高力価のレトロウィルスベクタ一を作製することが困難である場合にも、 Cre/l oxPシステムを応用することで臨床応用できる高力価べクタ一を作製するこ とを可能としたものである。
DNA構築物(A)および (B)中で、 リコンビナ一ゼ認識配列は順方向に挿入してあ るが、 逆方向に挿入したものも本発明に含まれる。 DNA構築物(B)の場合、 パッケ —ジングシグナルに続きプロモー夕一を挿入しても、 あるいは薬剤耐性遺伝子に 続く P 01 yA配列を削除しても差し支えない。 これら両者の有無に関わらず DNA構築 物(B)の順に配向したものを含む DNA構築物は本発明に含まれる。 ここで po lyAシ グナルを含まないものは Creリコンビナ一ゼを作用させなくともウィルスゲノム となることができ、 目的細胞に感染してから Creリコンビナーゼを導入すること で外来遺伝子の発現を開始させることができるものである。 また特異的プロモ一 夕一を使用することで感染後の外来遺伝子の発現を特異的に制御することが可能 となる。 これら DNA構築物(A)及び (B)の構成は、 上記の遺伝子 (DNA構築物) の間 に別の DNAを挿入することは差し支えないが、 本発明の趣旨と同一目的の DNA構築 物、 上記の順に配向したものを含む DNA構築物は本発明に含まれる。
薬剤耐性遺伝子としては通常使用されているネオマイシン耐性遺伝子、 ピュー 口マイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子などを使用することができ るが、 好ましくは、 薬剤耐性遺伝子のコーディング領域内の塩基配列に置換、 挿 入、 欠失を加えることにより機能を低下させたもの、 非翻訳領域の塩基配列に置 換、 挿入、 欠失等を導入することにより翻訳効率を低下させた薬剤耐性遺伝子
(低効率薬剤耐性遺伝子) 、 mRNAの安定性を低下させた薬剤耐性遺伝子 (転写産 物短寿命化薬剤耐性遺伝子) が挙げられる。 さらに好ましくは、 c-f os遺伝子の 3 '非翻訳領域にみられる mRNA不安定化配列 (ARE: AU - r i ch e l emem O (Chen, C. A. , Shyu, A. , Mo l. Ce l l. Bi o l. , H, 8471-8482, 1994) を公知の耐性遺伝子 の 3'非翻訳領域に導入することによる転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子である mR NA短寿命ネォマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
本発明のもう一つの大きな特徴は、 これら工夫した薬剤耐性遺伝子を用いるこ とにより、 染色体に正常に挿入され導入したプロモーターからの発現が特に高い 細胞を効率よくに選択することを可能にし、 高力価べクタ一作製のためのプレパ ッケ一ジング細胞の選択効率をさらに高くしたことにある。 本発明では G418 (シ エーりング社製) で選択できるネオマイシン耐性遺伝子を用いた。
シユードタイプレトロウィルス回収量増大のための再感染抑制物質としての陰 性家電高分子物質は特に限定はされず、 へパリン、 へパラン硫酸、 コンドロイチ ン硫酸などが挙げられ、 好ましくはへパリンが挙 げられる。
ウィルス構造蛋白質としては、 いずれのウィルスであれ特に限定されないが、 シユードタイプウィルスを産生するためのエンベロープとしては全長翻訳領域を 含む VSV - G ( i nd i ana)種の配列 (Gal l i one, C. J. , 46, 162-169, 1983)である VSV-G遺伝子が好ましい。
外来遺伝子としては、 遺伝子治療のための細胞導入を目的とする遺伝子であれ ば特に限定はされないが、 本発明の Cre/l oxPシステムを用いる方法においては、 細胞毒性を有する蛋白質の場合に特に有効である。 リコンビナーゼを作用させる 前では該蛋白質の発現は起こらず、 リコンビナ一ゼを作用させることにより初め て同一プロモーターにより短時間に該蛋白質の発現がもたらされ、 細胞毒性を発 揮する前にレトロウイルスベクタ一の作製を可能することができるためである。
ず使用することができるが、 好ましい例として、 モロニ一マウス白血病ウィルス
(Moloney murine leukeimia virus, MoMLV) 、 ヒト後天性免疫不全症候群ウイ ルス(Human immunodeficiency virus, HIV)などのレンチウィルス由来のものが 挙げられる。
DNA構築物(A)のプロモーターとしては通常使用されているプロモーターであれ ば使用可能であるが、 短時間にウィルス蛋白質を発現しえる高力価プロモーター が好ましく、 例えば Niwaらが報告している CAGプロモーターが挙げられる (N'iwa, H. , Yamamura, k. , Miyazaki, J. , Gene, _108, 193-200, 1991) 。
polyA付加配列は特に限定されないが、 ゥサギ 3グロビン遺伝子または SV40ゥ ィルス由来のものが望ましい。
DNA構築物(A)及び (B)を導入する細胞は、 構造タンパク質をコードする gagおよ び pol遺伝子が発現するものであればよい。 好ましい細胞として FLY細胞 (Cosset, et al. , J. Viol. , 69, 7430-7436, 1995) が挙げられる。
上記の、 レトロウイルスの gag、 pol産生細胞に DNA構築物(A)、 '特に VSV- G遺伝 子を含む DNA構築物(A)はウィルスベクタ一、 特にシユードタイプウィルスベクタ 一産生用プレパッケージング細胞作製用に有用であり、 本発明に含まれる。 レト ロウィルスの gag、 po 1産生細胞に DNA構築物(A)及び DNA構築物(B)又は従来型の外 来遺伝子をコードするレトロウイルスゲノムを導入した細胞は、 レトロウイルス ベクタ一 (特にシユードタイプ) 産生の、 ウィルスゲノムを含むプレパッケージ ング細胞として有用であり、 本発明に含まれる。 齧歯類細胞のみに感染可能なェ コトロピック又はヒトを含めて多くの種の細胞に感染可能にアンフォトロピック envをもつレトロウィルス産生用プレパッケージング細胞、 すなわちレトロウイ ルスの gag-po卜 env産生細胞に DNA構築物(B)を導入した細胞は、 導入目的外来遺
伝子を含む通常のレトロウイルスベクター産生用の、 ウィルスゲノムを含むプレ パッケ一ジング細胞として有用であり、 特に導入目的外来遺伝子蛋白質が細胞毒 性を有する場合に有用である。 これら細胞も本発明に含まれる。
Creリコンビナ一ゼを細胞内で作用させるための Creリコンビナ一ゼ発現系を 細胞に導入するためには、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター等 が利用可能であるが、 好ましい例としてアデノウイルスベクター (J P—A— 8 - 84589) が挙げられる。
本発明はこの Cre/loxPシステムを用いることによって、 一つのプロモーターで 薬剤耐性マ一カー遺伝子の発現および Creリコンビナ一ゼ作用後の VSV-G遺伝子 (又は外来遺伝子) の発現の 2つの機能を持たせたこと、 転写産物短寿命化薬剤 耐性遺伝子を用いることにより、 高力価べクタ一作製のためのプレパッケージン グ細胞の選択効率をさらに高くしたことに大きな特徴を有するものである。 目的 とする外来遺伝子が細胞障害性を持つ等の理由により、 再現性良く高力価のレト ロウィルスべクタ一を作製することが困難である場合に特に有効であると期待さ れる。 発明の実施の形態:
各 DNA構築物の作製方法、 ウィルス ·細胞の取り扱い操作などは、 通常行われ る公知の方法により実施することができ、 例えば、 新生化学実験講座 18 細胞培 養技術 (1990) ·東京化学同人、 遺伝子治療の基礎技術 ·羊土社 (1996)、 遺伝 子治療の基礎技術 (1996) ·羊土社、 および Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , T. Manitis ら編 (1989) · Cold Spring Harbor Laboratoryに記載の 方法に準じて行うことができる。
C r eリコンビナーゼにより VS V- G遺伝子産物の発現を誘導させるのための薬剤耐
性遺伝子をもった DNA構築物 (pCALNLG) 、 およびその中の薬剤耐性遺伝子の転写 産物を短寿命化させるための配列 (以下転写産物短寿命化配列と略する) を導入 した DNA構築物 (pCALNdLG) の作製法を以下に説明する。
pCALNLGを作製するために、 VSV (Indiana:血清型) : (Rose, I. K. Cell, 30, 753-762, 1982) の Gタンパク質のコード配列を、 pCALNLw [ (Kanegae, Y, , et al. , Nucl. Acids, Res. , 23, 3816-3821, 1995) に報告されている pCALNZから lacZ遺伝子を除き Swal切断部位を導入したもの、 ΙοχΡ配列はネオマイシン耐性遺 伝子の両側に順方向に並んでいる] の Swal切断部位に挿入した (図 2) 。
また mRNA短寿命化配列を pCALNLG中の薬剤耐性遺伝子の 3'-非翻訳領域へ導入す るために、 ネオマイシン耐性遺伝子の 3'-非翻訳領域部分を NspV、 Clal (Clalサ イトは klenow fill inによる blunt化により Nrulサイトを創出後 Nrulで切断する ことで平滑末端化) で切断した部分へ chicken c- iosの mRNA短寿命配列 (AU Rich Element : ARE) である 414bpsの配列を Clal、 Bglll (Bgl 11サイトは klenow fill inによる blunt化) で切断したものを、 両者の NspVと Clalが付着することを利用 して挿入し、 pCALNdLGを構築した (図 2) 。
外来遺伝子を導入するためのモロニ一マウス白血病ウィルス (Moloney murine leukemia virus> oMLV) 由来のレトロゥ リレスケノムとしては pBabe (Morgens tenm, J. , P. and Hartmut, L. , Nucleic Acids Res. , 18, 3587-3596, 1990) 等を用いた。 レトロウイルスゲノムとして使用 ·作製したものを図 3に示す。
Creリコンビナーゼを作用させて薬剤耐性遺伝子を環状分子として切り出され ることにより外来遺伝子の発現を開始させるレトロウィルスゲノム pBabe loxpur oは以下のように構築した。 外来遺伝子挿入のためのマルチクローニングサイト として次に示すオリゴ DNAを設計 ·発注しグライナ一ジャパンより購入した。 下 線部に制限酵素の認識サイトを示す。
5' -tcgac gc agate t cacgtg at t taaat at - 3'
Sail Bglll Pmll Swal Clal
3' - g eg tctaga glgcac taaat t ta tagc -5'
ピュ一ロマイシン耐性遺伝子と SV40 polyAシグナルを含む DNAは pPUR (GIBC0) より HindIII、 BamHIで切り出し、 ΙοχΡ配列を組み込むためのプラスミドである pB S246 (GIBC0) の HindIII、 BamHIサイトに揷入した。 そこから ΙοχΡ-ピュ一口マイ シン耐性遺伝子- SV40 polyA- ΙοχΡ配列を EcoRI、 Sealで切り出し、 Klenow fragmentにより平滑末端としたものを loxpuroィンサ一トとした。 別に pBabeより S a 11、 C 1 a Iを用いて SV40プロモータ一と薬剤耐性遺伝子を除き前述のマルチクロ —ニングサイ ト導入用オリゴ DNAを挿入した後、 SnaBIで切断した部分に loxpuro インサートを挿入して pBAbe loxpuroを作製した。 また SV40 polyAシグナルを含 まないために Creリコンピナーゼを作用させなくともウィルスゲノムとなること ができ、 目的細胞に感染してから Creリコンビナーゼを導入することで外来遺伝 子の発現を開始させるもの(pBabe loxpuroDpA)も同時に作製した。
pCAL Z (Kanegae, Y. , et al. , Nucl. Acids, Res. , 23, 3816-3821, 1995)よ り切り出した nlslacZを pBabe又は pBabe loxpuroに挿入し、 ウィルス力価測定の ための核移行シグナルの付いた i3- galactosidase (nlslacZ) をもつレトロウイ ルスゲノム作製に用いた。
ウィルス力価の測定は以下のように行った。 感染一日前に 1.5 X 103/96wellと なるようにラッ卜の線維芽細胞 3Y1を 96穴プレートに用意した。 解凍したサンプ ルは種々の段階に培養液で希釈し、 0.5mg/96wellのボリブレンとともにラッ卜の 線維芽細胞 3Y1に感染させた。 3日後、 感染細胞を 1.25%ダルタルアルデヒドにて 固定し、 前記に記載の方法に従って X- galを用いて lacZ感染細胞の染色を行った。 青く染まったコロニー数を数え希釈に応じたコロニー数の変化があることを確認
して力価を算出した。 力価は lmlあたりに含まれる感染粒子 (Infectious units, 以下 i. u.と略する) を単位 (i. u./ml) として表記した。
VSV- G遺伝子産物および MLV gagpl2の免疫染色は VECTASTAIN (VECTOR) を用い て以下のように行った。 細胞を 3 %パラフオルムアルデヒド + 0.1% Triton X - 10 0を含む PBSで室温 15分間固定した。 PBSで 2回洗浄した後、 1/1000から 1/3000に希 釈した各々の一次抗体液をャギ血清を含む Hank's平衡塩溶液 (HBSS) で調製して、 室温 2時間結合させた。 PBSで 2回洗浄した後、 一次抗体の産生動物であるマウス に対する二次抗体に biot inを標識したものをャギ血清を含む HBSSで 1/1000希釈し て室温 30分間結合させた。 以後は VECTASTAINの取り扱い説明書に従って染色を行 つた。 実施例 次に実施例をもって本発明を説明するが、 本発明はこれらに限定されるもので はない。
実施例 1 PCALNLGの FLY細胞への導入と VSV- G遺伝子産物を発現誘導するプレパ ッケージング細胞株の一次選択
Creリコンビナーゼにより VSV-G遺伝子産物の発現を誘導させるためのネオマイ シン薬剤耐性遺伝子をもった DNA構築物 pCALNLG (図 2) を、 MoMLVの gagおよび pol遺伝子産物を安定に発現する FLY細胞 (Cosset, et al. , I. Virol. , 69, 743 0-7436, 1995) へ以下のようにトランスフエクシヨンを行った。
前日に 5 X105cells/10cm dishとなるように継代した FLY細胞に 10- 30 igの pCA LNLGをリン酸カルシウム法 (Chen, C. and Okayama, H. , Mol. Cell. Biol. , 7, 2745-2752, 1987) によってトランスフエクトした。 翌日リン酸カルシウムを除
き、 その 1あるいは 2日後に培養細胞を分割した。 さらにその翌日、 安定株を選 択するために lmg/mlのネオマイシン誘導体である G418 (GIBC0) を加え 14日間 程度選択を行った。 G418に抵抗性のあるコロニーがつり上げ可能な大きさになつ た時点で、 クローニングシリンダーを用いて各コロニーを別々に 96穴プレー卜へ 移して培養を続けた。
各コロニーは 2つに分割し、 一方には Creリコンピナ一ゼ発現のためのアデノ ウィルス (AxCANCre) (Kanegae, et al. , ucleic Acids Res. , 23, 3816-3821, 1995) を感染多重度 (以下 m.o. i.) 30の割合で感染させ、 Creリコンビナーゼを 導入するとともに培養液から G418を除去した。 他方は無処置のまま細胞を液体窒 素に保存するために培養を続けた。 AxCANCreを感染したものは感染 3日後に、 VSV- G抗体 (P5D4、 Sigma V5504) を用い上述した免疫染色法により VSV-G遺伝子 産物の発現を検出した。 ここで得られた 11クローンのうち 2クローン(PtG- Ll、 PtG- L2)が、 AxCANCreを作用させて VSV-G遺伝子産物の発現がみられた。 両者を比 較すると PtG-Llは PtG- L2よりもかなり強い染色がみられた。 一方 AxCANCreを感染 させなかったものは、 全てのクローンで VSV- G遺伝子産物の発現はみられなかつ た。 実施例 2 G- L1細胞の産生する VSV- G遺伝子産物のウエスタンプロ卜法による 検出
実施例 1で強い染色がみられたプレパッケ一ジング細胞である P t G- L 1の産生す る VSV-G遺伝子産物をその C末端部分を認識する抗 VSV-G抗体 (P5D4) により以下 のように検出した。
?(6-し1細胞を5 10 6113/10(;111 dishとなるように継代したものを 2つ用意し、 翌日に一方は AxCANCreを ra. 0. i. =30で感染し、 他方は感染を行わなかった。 その
4日後にサンプルバッファ一 (61.2mM Tris/HCl pH=6.8 1.6% SDS、 2.5% β -mercaptoethanoU 9.8% glycerol) 500 1で細胞成分を可溶化後 100°C 5分間 の処理を行い一 20°Cに保存した。 その後得られたサンプルの夕ンパク量を protein assay溶液 (BI0RAD) を用いて定量し、 1レーンあたり 20 gとなるよう にして SDS- PAGEを行った。 泳動ゲルをエレクトロトランスファ一により
I讓 obi Ion (Millipore) にトランスファーし、 一次抗体として 1/3000希釈した VSV- G抗体 (P5D4、 Sigma V5504) を、 二次抗体として 1/1000希釈した biot inをラ ベルした一次抗体免疫動物であるマウス IgGに対する抗体を結合させ、 ECL キッ 卜 (Amersham) により検出を行った。 AxCANCreを作用させたものは 70kDa付近に VSV- G遺伝子産物と思われるバンドがみられるのに対して、 感染を行わないもの にはバンドがみられなかった。 この結果は免疫染色の結果と一致し、 AxCANCreを 作用させないものでは全く VSV- G遺伝子産物の発現がみられないのに対して、 AxC ANCreにより Creリコンビナーゼを導入することで VSV- G遺伝子産物の発現が開始 されることを示している。 結果を図 4に示す。 実施例 3 PtG-Llへのウィルスゲノム導入と Creリコンビナーゼによるウィルス 産生の測定
実施例 1で記述した無処置のまま培養を続けていた 11クローンを液体窒素中に 保存すると共に、 その一部に対して j3-galactosidase (lacZ) をコードするレト ロウィルスゲノムをウィルス感染により導入した。 X-galによる染色でほとんど の細胞に 1 ac Zをコードするレトロウイルスゲノムが導入されたことを確認した後 2つに分割し、 一方はそのまま感染を行わず、 他方は AxCANCreを感染させ VSV - G 遺伝子産物の発現を誘導した。 以後、 3日間程度の間隔で、 ウィルス回収前日に 培養液を交換しその翌日培養上清を回収した。 3000rpmで 30分間遠心した上清を
ウィルスストツクとして一 80°Cに保存した。 前述した方法でラット線維芽細胞 3Y 1を用い lacZ遺伝子の発現を指標として各クローンの力価を測定したところ、 AxC ANCreを感染したものから前述の PtG-Ll、 PtG- L2を含む 4クローンでウィルスを 検出した。 一方、 AxCANCreを作用させないものはいずれも全くウィルスの産生が みられなかった。 VSV-G遺伝子産物の発現が確認できなかった 2クロ一ンはカ価 が低く、 またそのウィルス産生が AxCANCre依存的であることから、 それらは VSV - Gを遺伝子産物を発現するものの少量であり免疫染色の感度ではとらえられなか つたものと考えられる。 このうち Creリコンビナーゼを導入した PtG- L1は最大で 4 X103 i. u. /mlのウィルスを産生した。 PtG- L1以外の 3クローンのウィルス産 生量は 100 i. u. /ml以下であったため以後 PtG-Llに絞りその性質を解析した。 実施例 4 PtG- L1より産生されたウィルスベクターの外皮蛋白質の性質
PtG-Llが産生するウィルスのェンペロープは、 ゥィルスが AxCANCre依存的な産 生であることから pCALNLGに由来する VSV-G (Indiana型) であることが期待され るが、 それを確かめるために抗 VSV- G抗体 (Indiana型 ATCC VR-1238AF) を ATCC より購入し、 感染抑制の実験を以下のように行った。
PtG- L1に AxCANCreを作用させて産生させたウィルスサンプルと、 その 1/10量 (v/v) の抗体を混合し 4°Cで 1時間反応させた。 その後、 前述した方法で 3Y1を 用い lacZ遺伝子の発現を指標として感染に対する影響を調べた (表 1) 。 陰性対 象としては Indiana型 VSV- Gとは結合しない抗 VSV - G抗体 (New jersey型 ATCC VR- 1238AF) を用いた。 抗 VSV- G抗体 (Indiana型) を用いたものは 1/10では感染が完 全に抑制され、 その効果は 1/1000でも観察された。 一方陰性対象である抗 VSV - G 抗体 (New Jersey型) では希釈度に関わらず感染に影響はみられなかった。 これ らのことから PtG- L1が産生するウィルスのエンベロープは期待通り VSV-G
(Ind i ana型) であることが示された。 表 1
P tG- L1が産生するウィルスの抗 VSV-G抗体処理後の感染力価(i. u. /ml)
実施例 5 Creリコンビナーゼ導入後のネオマイシン耐性遺伝子の染色体からの 脱落
P tG-Llを AxCANCr e感染による Creリコンピナーゼの導入直後、 培養液から G418 を加えたものと除いたものを用いて両者の生存細胞数を比較した。 G418を加えた ものの細胞数は 9日後に、 除いたものの 5 %以下に減少した。 ネオマイシン耐性 遺伝子は染色体に存在していれば発現を続けるが、 環状 DNAとなって染色体から 除かれると発現はなくなると考えられる。 したがって、 AxCANCreを感染させた P t G - L 1でネオマイシン耐性がなくなつたことは、 C r eリコンビナ一ゼによってネ ォマイシン耐性遺伝子が染色体から除かれたためと思われた。 実施例 6 pCALNLG遺伝子の P tG- L1における安定性
PtG-Llでの pCALNLG遺伝子が安定に保持されているかをみるために、 P t G-L 1に 実施例 3で使用した 1 ac Zゲノムを導入した P t G-L 11 ac Zを液体窒素に保存したもの を用いて以下の実験を行った。 新たに液体窒素より解凍した PtG- LllacZ- 1と Cre リコンビナーゼを導入せずに 1力月間継続して培養した P t G-L 11 ac Z- 2とに対して m. 0. i = 30で AxCANCreにより Creリコンビナーゼを導入した。 PtG- LI lacZ- 2は 2力月 の間継続培養により当初の 8.7X1013倍となったものである。 以下実施例 1と同 様に培養液をウィルスストックとし、 前述した方法で 3Y1を用い lacZ遺伝子の発 現を指標としてウィルス産生量を調べた。 AxCANCre感染後 3日目から 37°Cの培養 を継続したものの結果を図 5aに、 32°Cに移したものからの結果を図 5bに示す。 Ax CANCre感染 3日目の産生量はやや低いものの、 その後の産生量はほぼ同等であり PtG-Ll中で pCALNLGおよび gag、 pol遺伝子は安定に保持されていると考えられた。 実施例 7 G-L1からのウィルス産生条件の検討
実施例 2から 4までの結果より PtG- L1は当初期待した性質をもつものと思われ た。 そこで、 ウィルス産生の至適条件を見いだすために以下の実験を行った。
PtG- LUacZからのウィルス産生条件を以下の点 (a〜c) から検討し、 その際に 産生されるウィルスの力価の経時的変化を測定した。
(a) AxCANCreの感染 m.0. i (m. o. i = 0、 3、 10、 30、 100、 300、 1000、 3000) 3、 10、 1000、 3000は一部のみ、
(b)感染時の細胞数(1.5Χ1(Τ、 4.5X10\ 1.5X103) 48wellあたり、
(c) AxCANCre感染 3日後からの培養温度(32°C、 37°C)。
前述した方法で 3Y1を用い lacZ遺伝子の発現を指標として、 各条件におけるゥ ィルスの力価に対する影響を調べたところ以下のような結果が得られた。
(a) AxCANCreの感染 m. o. i.は 300以上は毒性が強く、 生存細胞が再び増えてくる
までウィルス力価は低かった。 m.0. i=30から 100程度が最も産生量が多かった。 AxCANCre感染させないもの (m. o. i == 0 ) では、 すべての条件でウィルスの産生 はみられなかった。
(b)感染時の細胞数は細胞一個あたりのウィルス産生量に大きな影響を与えな い。 初期細胞が少ないと初期にはウィルス産生量は少ないが、 培養を続けて細胞 が増えることで初期細胞が多かつたものと同等のウィルス産生がみられた。
(c)細胞増殖にとって好ましい 37°Cとウィルス粒子がより安定であるとされる 3 2°C (Kotani, H. , et. al. , Hum. Gene. Ther. , 5, 19-28, 1994) とでは、 最高 力価を指標とすると大きな差はみられなかった。 32°Cのほうが比較的安定したゥ ィルス産生がみられた。
最高ウィルス産生は 2 X104 し u./mlであった (初期細胞 4.5xl03cells/48well、 m. o. i=3000、 感染後 22日目、 37°C) 。 この条件のウィルス産生量の経時的変化 を図 6aに、 同条件で温度を 32 としたもののそれを図 6bに示す。 最高産生をした ものは当初 AxCANCreを高 m. o. i.で感染させたためアデノウイルスによる細胞障害 性の影響を受けて細胞数が減少していたが、 22日目には細胞はコンフルェントに
実施例 8 PtG- L1の genotypeの詳細な解析
これまで示したように pCALN'LGを FLY細胞にトランスフエクトして、 安定な細胞 株 PtG- L1を樹立することができた。 そのウィルス産生は完全に Creリコンビナ一 ゼの導入に依存的であり、 産生されるウィルスのエンベロープは VSV-G (indiana 型) であった。 しかし、 質的には当初予想した性質を示すとはいえ、 量的にはそ のウィルス産生量は最大で 2X104 i. u. /mlと十分なものではなかった。
前述したように P t G- L 1からのウイルス産生量が十分でなかつた。 そこでこの
原因がどこにあるかを調べる目的で以下の実験 (a〜c) を行った。
(a) Creリコンビナーゼ導入による VSV-G遺伝子産物の発現がない細胞が PtG - L1 の一部にあるのか、 または、 アデノウイルスによる Creリコンビナーゼの導入効 率に問題があるのか、
(b) X-ga 1染色による 1 ac Zの安定保持の確認、
(c)免疫染色による MLVgagの安定保持の確認。
PtG- LllacZとそのもととなっている FLY細胞および陰性対象として 3Y1細胞を 48 穴プレートに 1.5X104 (PtG-LK FLY), 5X103 (3Y1) ずつ用意したものを 3枚 準備した。 翌日 AxCA'Creを m.0. i= 0あるいは 30で感染し、 5日後固定し、 以下 の結果を得た。
(a)前述した方法で VSV-Gの免疫染色を行った。 AxCANCreの感染の有無にかかわ らず FLY、 3Y1は全く染色されなかったのに対して、 PtG-LUacZでは AxCANCreを感 染させたもののみほぼ全ての細胞で VSV-Gの染色がみられた。 このことは、 PtG - L 1は均一な細胞クローンであり、 VS V- G遺伝子産物を発現しないものの混入がゥ ィルス産生に影響しているのではないと考えられた。 また、 アデノウイルスべク 夕一による遺伝子導入はほとんど全ての細胞に Creリコンビナーゼを導入するこ とが可能であり、 その導入に引き続いて Creリコンビナーゼによる組換えが起き たことが示された。
(b) lacZをコードするウィルスゲノムが安定に保持されていることを調べるた めに、 PtG- LllacZを前述した方法で lacZによる染色を行った。 全ての細胞で lacZ による染色がみられ lacZをコードするウィルスゲノムは PtG-LllacZ中で安定に保 持されておりウィルス産生に影響しているのではないと考えられた。
(c) MLVgagpl2に対する抗体を産生するハイブリ ドーマ (CRL- 1890) を ATCCより 購入し、 マウス腹水よりモノクローナル抗体を調製したものを用いて前述した方
法により MLVgagpl 2の検出を行った。 3Y1は全く染色されなかったのに対して FLY、 P tG-L l l acZは全ての細胞で MLVgagpl 2の染色がみられた。 このことより MLVgagは P tG - L l l acZ中で安定に保持されておりウィルス産生に影響しているのではないと 考えられた。 また gag、 po lは同一の転写開始点をもつことから po lも安定に保持 されていると考えられた。
以上の結果よりウィルスを構成する gag、 o K env (VSV-G) および l acZをコー ドするウィルスゲノムは安定に P tG-Llに保持されていると考えられ、 これらのこ とがウィルス産生に影響しているのではないと考えられた。
一方、 実施例 1で記述した P t G-L 1以外のウイルス産生が少ない細胞株と P t G - L 1 とを Creリコンピナ一ゼ導入後の VSV-G免疫染色で比較すると P tG- L1の方がかなり 強く染色され VSV-G遺伝子産物の発現量とウィルス力価との間に相関がみられた。 これらのことより実施例 6で記述された P tG-L lのウィルス産生量が少ない原因 は、 VSV-G遺伝子産物の発現量がまだ高力価ウィルス産生には十分ではないこと によるものと考えられた。
そのためより効率よく VSV-G遺伝子産物の高発現安定細胞株を選択することを 目的として、 以下の DNA構築物を考案、 作製した。
薬剤耐性遺伝子の 3' -非翻訳領域に c-f os由来の mRNA短寿命配列を導入し、 耐性 遺伝子の産生量を減少させることで、 相対的に導入した CAGプロモーターからの 発現の高い細胞株を効率よく選択できることを目的とした。 Creリコンビナーゼ 導入後 VSV-G遺伝子は耐性遺伝子と同一のプロモータ一で転写されるため、 この DNA構築物によって選択された細胞株は VSV-G遺伝子産物産生量が高いことが期待 される。 前述したように薬剤耐性遺伝子の 3' -非翻訳領域に c-ios由来の mRNA短寿 命配列を導入した DNA構築物 (pCALNdLG) を作製し、 これと前述している pCALNLG とを比較しながら以下のような実験を行った。
実施例 9 mRNA短寿命配列を含む pCALNdLGの効果と VSV- G遺伝子産物を発現する プレパッケージング細胞株の一次選択
実施例 1に記述した方法で pCALNLGあるいは pCALNdLG 10- 30 gを FLY細胞へト ランスフエクトし、 G418を用いて安定発現株を 96穴プレートへ移した。
各コロニーは 2つに分割し、 一方には AxCANCreを m. o. i. = 10の割合で感染させ、 Creリコンビナーゼを導入するとともに培養液から G41 8を除去した。 他方は無処 置のまま細胞ストックをとるために培養を続けた。 アデノウイルスを感染したも のは感染 3日後に、 上述した方法に従って VSV-G抗体 (P5D4、 S i gma V5504) を使 用した免疫染色により産生した VSV-G遺伝子産物を検出した。 3回の独立したト ランスフエクション実験から、 pCALNLGをトランスフエクトしたものの G41 8によ る選択クローン数と比較して pCALNdLGをトランスフエクトしたもののそれは 1/3 程度であり、 薬剤耐性遺伝子の mRNAを短寿命したことで、 より厳しい選択が行わ れていることが示唆された。 別の独立した 2回のトランスフエクション実験から、 P t G- L 1と同等以上の VSV- Gの発現がみられたクロ一ンは pCALNLGをトランスフエク 卜したものが 25クローン中 1クローンであつたのに対して、 mRNA短寿命ネオマイ シン耐性遺伝子をもつ pCALNdLGをトランスフエクトしたものでは 1 1クローン中 3 クロ一ンであった。 また、 全てのクローンで Creリコンビナ一ゼ発現のためのァ デノウィルスを感染させなかったものは、 VS V-G遺伝子産物は検出されなかった。 これらのことから、 薬剤耐性遺伝子の mRNAを短寿命化したことで、 より厳しい選 択を行うことが可能となり、 リコンビナーゼにより誘導される VSV-G遺伝子産物 の発現量の高いクローンを効率よく選択できることが示された。 そのため pCALNd LGに絞って同様のトランスフエクションと VSV- G遺伝子産物の検出を行い、 合計 225クローンから 25クローンの Creリコンビナ一ゼ依存的 VSV-G遺伝子産物高発現
クロ一ンを得た。 今回 pCALNLGをトランスフエクトしたものでは、 P tG- L1を越え る VSV-G遺伝子産物の発現がみられたものがなかったため、 以後 pCALNLGの安定細 胞株の代表として P tG- L1を用いることとした。 実施例 1 0 プレパッケージング細胞株へのレトロウイルスゲノムの導入と Creリコンビナ一ゼによる各クローンのシュ一ドタイプウィルス産生の測定
Creリコンビナ一ゼ依存的に VSV-G遺伝子産物を高発現するクローンとしてこれ までに得られた pCALNLGをトランスフエクトしたもの 1クローン (P tG- L1) と pCAL NdLGをトランスフエクトしたもの 25クローンを液体窒素中に保存すると共に、 そ の一部に対してウィルス産生活性を調べるために 3— gal ac t os i dase ( l acZ) 遺 伝子をゲノムにもつウィルスの感染により、 それぞれ 26クローンをウィルスゲノ ムを含むプレパッケージング細胞とした。 ベクターの各クロ一ンへの導入効率は、 上述した方法に従って染色するとほぼ 100%であった。 その後、 各クローンを 2 つに分け、 AxCA 'Creを m. 0. i. = 10の割合で各クローンに感染させた。 以後この日 を第 0日として定義し両者ともに第 2日まで 37°Cで培養を続けリコンビナーゼを 作用させた。 第 3日以降一方は 37°Cで培養を続け、 他方はウィルス粒子がより安 定であると言われる 32°Cで培養した。 ウィルスの力価は採取一日前に培養液を交 換してほぼ 3日間隔で測定した。 採取したウィルスサンプルは遠心分離 (3000 rpm、 30分) し、 上清を分析の直前まで一 80°Cで保存した。 これらウィルスサン プルの力価は上述した方法に従って 3Y1を用い l acZ遺伝子の発現を指標として測 定した。
測定した 26クローンの最高タイ夕一で分類すると、 10R i. u. /ml以上のものが 1 クローン、 106 i. u. /ml未満から 105 i. u. /ml以上のものが 8クローン、 105 i. u. /ml未満から 104 i. u. /ml以上のものが 14クローン、 1 (T i. u. /ml未満から 103 i. u.
/ml以上のものが 3クローンであった。 Creリコンビナーゼを導入しないものは、 いずれも全くウィルスを産生しなかった。 そのなかで夕イタ一の高かった pCALNd LG 1クローン (PtG- S2) と pCALNLG 1クローン (PtG-Ll) のウィルス産生量の 時間的変遷を図 7及び図 8に示す。 実施例 1 1 PtG- Ll、 PtG-S2、 PtG-Slより産生されたウィルスベクタ一の外皮蛋 白質の性質
生成したウィルスベクタ一の外皮蛋白を確認するために、 実施例 9で選択され た 3クローンが産生するウィルスサンプルの感染が抗 VSV-G抗体 (Indiana型) で 中和されるかどうか調べた。 実施例 2で記述した方法で抗体と反応させた後、 前 述した方法に従って 3Y1を用い lacZ遺伝子の発現を指標として感染に対する影響 を調べた。 その結果を (表 2) に示した。
いずれのクローンから産生されたウィルスに対しても抗 VSV-G (Indiana型) 抗 体は完全にウィルスの感染を抑制したが、 抗 VSV- G (New Jersey型) では変化は なかった。 したがって、 Creリコンビナーゼの導入によって誘導されたウィルス は pCALI\TLG、 pCALNdLGに由来する VSV- G (Indiana型) を外皮蛋白質として有する シュ一ドタイプウィルスであることが示された。
表 2 抗体とのィンキュベ一トによるウィルスサンプルの感染に対する影響(i. u. /ml) (抗体は 1/10量でウィルスサンプルとィンキュベート)
実施例 1 2 プレパッケージング細胞の産生するネオマイシン耐性遺伝子産物と VSV-G遺伝子産物のウエスタンブロット法による解析、 及びその際に mRNA短寿命 配列が両者の量に及ぼす影響
プレパッケージング細胞への C r eリコンビナーゼ導入前後で、 合成されるネオ マイシン耐性遺伝子産物と VSV-G遺伝子産物の量的変化を調べるために以下の実 験を行った。
lacZをコードする MLVベクタ一を含む PtG- Ll、 PtG- S2細胞を用い、 実施例 2と 同様に Creリコンビナ一ゼ導入したもの (導入後) としないもの (導入前に相 当) からタンパクサンプルを調製しウエスタンブロッテイングを行った (図 9) 。 ネオマイシン耐性遺伝子産物を検出するためには抗ネオマイシン耐性遺伝子産物 (5Prime to 3Pr ime社/フナコシ) を 1/1000に希釈し、 二次抗体として biotinを
:ー次抗体免疫動物であるゥサギ IgGに対する抗体を 1/1000希釈して用 いた。
ネオマイシン耐性遺伝子産物を検出したもの (図 9 a) では、 PtG-Ll、 PtG-S2 共に Creリコンビナーゼ導入しないものでバンドが見られた (1レーンあたり 20 g) 。 PtG-S2でのバンドは PtG- L1でのそれより少なく、 PtG- L1のサンプルを 1/2 ずつ希釈したもの (PtG- LI Cre (-)と記載のもの、 右から 1レーンあたり 10、 5、 2.5、 1.25 gとなる) と比較すると PtG- S2でのネオマイシン耐性遺伝子産物量は PtG-Llの 1/3程度であると考えられた。
VSV-G遺伝子産物を検出したもの (図 9 b) では、 PtG- Ll、 PtG-S2共に Creリコ ンビナーゼを導入したもののみでバンドが見られた (1レーンあたり 20 g) 。 C r eリコンビナ一ゼを導入しないものでバンドが全く見られないことは、 実施例 10で Creリコンビナ一ゼを導入しないものからは全くウィルスが検出されなか つたことと符号する。 PtG- S2のサンプルを 1/2ずつ希釈したもの (PtG- S2 Cre (+) と記載のもの、 右から 1レーンあたり 10、 5、 2.5、 1.25 gとなる) と比較する と PtG- S2での VSV-G耐性遺伝子産物量は PtG - L1の 20倍程度であると考えられた。 以上の結果より PtG-Ll、 PtG- S2共に期待されたとおり Creリコンビナーゼ導入 により、 ネオマイシン耐性遺伝子産物から VSV-G遺伝子産物に発現が切り替わる ことが示された。 PtG- Ll、 PtG-S2はそれぞれ図 2に示される pCALNLG、 pCALNdLG を持ち、 両者の差は mRN'A短寿命配列の有無のみである。 ネオマイシン耐性遺伝子 産物および VSV-G遺伝子産物は同一のプロモー夕一より転写される (図 1矢印) ことを考えると、 PtG- S2が PtG- L1より約 30倍効率よくネオマイシン耐性遺伝子産 物より VSV-G遺伝子産物を産生することは、 PtG- S2では転写されたネオマイシン 耐性遺伝子 mRNAが mRNA短寿命配列により速やかに分解されることによるものと考 えられた。 このことは実施例 9で G418を用いて VSV-G高発現クローンの効率の良
い選択を行うことができたことを説明するものである。 実施例 1 3 サザンブロット法による Creリコンビナーゼ導入前後の VSV- G発現ュ ニットの変化の解析
プレパッケージング細胞への Creリコンビナ一ゼ導入前後で、 トランスフエク シヨンにより導入された VSV-G発現ユニット (pCALNLG、 pCAL dLG) の変化を調べ るために、 発明の実施の形態の項に記載の方法でサザンブロティングを行った。 lacZをコードする MLVベクターを含む PtG- Ll、 PtG- S2細胞を用い、 実施例 2と 同様に Creリコンビナ一ゼ導入したもの (導入後) としないもの (導入前に相 当) を用意した。 Creリコンビナーゼ導入 4日後に DNA抽出溶液により細胞を可溶 化し、 プロティナ一ゼ K消化、 フエノール抽出を行ってゲノム DNAを調製した。 ゲノム DNAを Nc 01消化した後にァガロース電気泳動し、 キヤビラリートランスフ ァ一により陽荷電ナイロンメンブレン (HybondN+ Amesham) にトランスファ一し た。 検出は図 1 0に示すように VSV- G翻訳領域中の 0.7kbの Mlul- Ncol断片を 32Pで ラベルしたものをプローブとして行った。 その結果、 期待されたように Creリコ ンビナーゼ導入により VSV - G発現ュニットは PtG- L1では 1.2kbから 2.0kb、 PtG-S2 では 1.5kbから 2. Okbへと変化した。 PtG- L1と PtG- S2は Creリコンビナ一ゼ導入前 は mRNA短寿命配列の有無により 0.3kbの差があり、 導入後は同じ構造をもつこと となる。 このことは図 1 0での想定と一致し、 プレパッケージング細胞では Cre リコンビナ一ゼにより効率よく loxP配列間に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子及 び poly A付加シグナルが切り出され、 実施例 1 2に示したような転写産物の切り 替えが行われていることが示された。 バンドの濃度より PtG- S2が含む VSV- G発現 ュニットは PtG- L1のそれより多く、 PtG- S2が多量の VSV- G遺伝子産物を産生する ことの一因となっていると考えられる。
実施例 14 プレパッケージング細胞から産生されるシユードタイプレトロウイ ルス中に自己増殖可能なレトロウイルス (replication competent retrovirus: RCR) が含まれないことの証明
常法 (遺伝子治療の基礎技術 羊土社、 1996)に従い、 lacZをコードする MLVベ クタ一を含む G- S2細胞から調製された 5X106i. u. /mlのシュ一ドタイプレトロ ウィルスを m 0. i = 5で M. dunni細胞に感染させ、 4日毎に 1/10の継代を 3回繰り 返した後の培養液を採取し、 DEAE- dextran存在下で PG- 4 S+L-細胞に加えた。 同 時に行った RCRを含む Mink4070A細胞からの培養液を PG- 4 S+L-細胞に加えたもの では 4日後からファーカスが観察されたのに対して、 P t G- S 2細胞から調製された シュ一ドタイプレトロウイルス中に含まれている可能性のある RCRを M. dunniで増 幅したものでは 8日後でも非感染のものと同様にフォーカスがみられなかつた。 このことは PtG- S2細胞から調製された 5X106i. u. /mlのシユードタイプレトロゥ ィルス中には RCRが含まれていないことを示している。 実施例 1 5 プレパッケージング細胞から産生されるシユードタイプレトロウイ ルス中にアデノウイルスが含まれないことの証明
本特許で記述しているプレパッケージング細胞への C r eリコンビナーゼ導入の ための方法としては、 前述したようにアデノウイルスに限定されるものではない 力^ 高い導入効率で再現性の良い導入法としてはアデノウイルスを用いる方法は 極めて有効である。 反面、 プレパッケージング細胞から産生されるシユードタイ プレトロウイルス中にアデノウイルスが含まれることは、 臨床応用上避けなけれ ばならないことであり以下の方法によりシユードタイプレトロウイルス中にアデ ノウィルスが含まれているか否かを検討した。
l acZをコードする MLVベクターを含む P tG- S2へ、 実施例 2に記述した方法でァ デノウィルス (AxCANCre) により Creリコンビナ一ゼを導入した。 培養液は毎日 交換すると共に、 交換時に培養液で入念に 3回ずつ細胞を洗い残存している可能 性のあるアデノウイルスを除いた。 導入 4日後 (洗浄回数 9回) のサンプルから 調製された 5 X 104 i. u. /mlのシュ一ドタイプレトロウイルス中に含まれる可能性 のあるアデノウイルスを常法(バイオマニュアルシリーズ 4遺伝子導入と発現 - 解析法、 羊土社、 1994)により 293細胞を用いて検出した。 AxCANCreを感染させた ものでは、 感染 1 2日後までに一つのアデノウイルスが存在する条件でも 293細胞 の 50 %以上の変性が見られたのに対して、 5 X 104 i . u. /m lのシユードタイプレ トロウィルス中を感染させたものでは 293細胞の変性は見られず、 この中にアデ ノウィルスは存在しないことが示された。
洗浄を行わない条件でアデノウイルスによる Creリコンビナーゼ導入 2日後の サンプルを含むものから 293細胞を用いて同様にアデノウイルスを検出したとこ ろ、 293細胞の変性が見られたが、 同時に抗アデノウイルス抗体を Pro t e i n G Sep harose (Pharmac i a) に結合させたものでサンプル中のアデノウイルスを除去す ることで変性は減弱した。 完全な除去にはさらなる至適化が必要であるものの、 抗体処理によりアデノウイルスは除去することが可能と考えられた。 実施例 1 6 VSV- Gシユードタイプレトロウイルスは VSV- G遺伝子産物を表面に発 現しているパッケージング細胞に対して干渉作用が成立せず、 自己感染しうるこ と(1 )
VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクタ一が遺伝子導入時に用いるレセプ夕一は、 一般のレトロウイルスとは異なりタンパク質ではなく、 細胞表面に豊富に存在す リンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられている。
そのため一般のレトロウイルスとは異なり、 パッケージング細胞表面のレセプ夕
—は VSV-G遺伝子産物で飽和されておらず、 産生された VSV- Gシュ一ドタイプウイ ルスべクターが、 再度パッケ一ジング細胞に感染する可能性があると考えて以下 の実験を行った。
I acZをコードする MLVベクターを含まない P tG- S2細胞を、 24穴プレ一卜に 3 X 104ce l l s/we l lとなるようにしたものを 5枚用意し、 翌日 1枚のプレートの半 分に AxCANCreを m. 0. i = 10で感染させた。 感染しないもの及び感染後 4日まで毎 日 10及び 100 i. u. /we l lの I acZをコードする VSV-Gシュ一ドタイプレトロウイルス を Creリコンビナーゼ導入したものしないもの双方に感染させた。 その後、 上述 の方法に従って固定、 X- gal染色を行った。 いずれのプレートでも Creリコンピナ —ゼを導入し VSV- Gを発現している P tG- S2は、 Creリコンビナーゼを導入せず VSV - Gを発現していない細胞と同等以上の i acZ遺伝子導入による X- gal染色が見られた。 このことは VSV-G遺伝子産物のパッケージング細胞上の有無によらず、 I acZをコ ―ドする VSV- Gシユードタイプレトロウイルスはパッケージング細胞に感染する ことが示唆された。 そこで大量の VSV- Gシユードタイプレトロウイルスが存在し ている条件下でのものとして実施例 1 7に示す実験を行った。 実施例 1 7 VSV-Gシユードタイプレトロウイルスは VSV- G遺伝子産物を表面に発 現しているパッケージング細胞に対して干渉作用が成立せず、 自己感染しうるこ と(2)
I acZをコ一ドする MLVベクターを含まない P tG- S2細胞へ、 実施例 2と同様に Cre リコンビナーゼ導入したもの (導入後) としないもの (導入前に相当) を 2枚ず つ用意した。 Creリコンビナーゼ導入 3日後に細胞を継代し、 その翌日に別に調 製した I acZをコ一ドする MLVベクタ一を含む VSV-Gシユード:
—を、 in. ο· i = 3で感染させた。 継代はコンフルェントになることを避けるために 行つたが、 このことにより VSV- G発現細胞に大きく影響することが確かめられて いる。 l acZをコードする MLVベクタ一の感染 2日後に各 1枚は上述の方法に従って 固定、 X- ga l染色を行い、 各 1枚は前記に記載の方法で VSV-G遺伝子産物に対する 免疫染色を行った。 その結果、 Creリコンビナーゼの導入の有無によらず、 VSV - G シユードタイプウィルスベクターにより l acZ遺伝子が、 l acZをコードする MLVベ クタ一を含まなかった P tG-S2へ導入され、 X- ga lによる染色がみられた。 このと き免疫染色の結果より、 Creリコンビナーゼを導入した細胞のみから VSV-G遺伝子 産物が産生されていることが示されている。 以上の結果は VSV-Gシユードタイプ ウィルスベクタ一は一般のレトロウイルスとは異なり、 干渉作用が成立すること なく産生細胞自体に感染しうることを示している。
前述したように、 これまでにテトラサイクリンを用いて VSV-G遺伝子産物の発 現を制御することにより VSV-Gシユードタイプウィルスベクタ一の産生細胞を作 製できることが報告されているが、 それらでは、 テトラサイクリンによる VSV - G 遺伝子産物の発現制御が完全ではなく、 常に産生細胞に再感染可能な 102から 104 i . u. /m l程度の VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクターを産生していることが報 告されている。 前述した結果は、 このようにパッケージング細胞維持時に産生さ れる少量の VSV-Gシユードタイプウイルスベクタ一が、 パッケ一ジング細胞自体 に再感染しうる可能性を示唆するものであり、 その結果、 パッケージング細胞中 の染色体は、 常に VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクタ一による遺伝子導入によ つて不安定な状態にある可能性が考えられる。 一方、 プレパッケージング細胞で ある P tG- S2は、 実施例 1 0で示したように、 Creリコンビナーゼ作用前には全く V SV-Gシユードタイプウィルスベクタ一を産生せず、 安定した VSV- Gシユードタイ プウィルスベクタ一を調製することが可能である。
実施例 1 8 へパリンによる VSV-Gシュ一ドタイプウィルスベクターの感染抑制 前述したように VSV- Gシユードタイプウィルスベクターはパッケージング細胞 に再感染することが示されたため、 この再感染を抑制することにより VSV-Gシュ 一ドタイプウィルスベクターの回収量を増大することができないかと考えた。 再 感染を抑制するためには、 培養液を環流することで VSV-Gシユードタイプウィル スベクターとパッケージング細胞を分離すること、 再感染抑制物質を見いだして 回収時に添加することが考えられる。 そこで陰荷電高分子であるへパリンに再感 染抑制効果を見レ ^だし、 以下の実験でその効果を確かめた。
前記に記載した方法で 3 -ga l ac t os i dase ( l acZ) をコードする VSV-Gシユード タイプウィルスベクタ一及びアンフォロトロピック MLVエンベロープをもつレト ロウィルスベクターについてポリプレン (8 g/m l ) を加えず、 へパリン (ノボ - ノルディスク) 0、 1 、 3 U/mlの条件下での力価測定を行った。 結果を図 1 1 に示す。 VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクタ一はアンフォロトロピック MLVェン ベロープをもつレトロウイルスベクタ一に比べへパリンにより著しく力価が減少 した。 このことはへパリンに VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクタ一の感染抑制 効果があるためと考えられた。 実施例 1 9 へパリンによる VSV-Gシユードタイプウィルスベクターの回収量増 大
前述したようにへパリンによる VSV- Gシユードタイプウィルスベクタ一の感染 抑制効果が示されたため、 パッケージング細胞から VSV- Gシユードタイプウィル スベクターを回収する際にへパリンを添加することにより、 再感染を抑制し回収 量が増大できるか検討した。
cZをコードする MLVベクターを含む P tG- S2細胞へ実施例 2と同様に Creリコン ピナーゼ導入し、 へパリンを Creリコンビナーゼ導入後 2あるいは 4日後に l li/mlあるいは 3 U/ml培養液に加えた。 産生されてくる VSV-Gシュ一ドタイプゥ ィルスベクターの力価を測定したところ、 へパリンを加えないものに比べ 2から 4倍の回収量の増大が見られた。
へパリンは抗凝血剤として臨床に用いられている薬剤であり安全性については 問題がないと考えられる。 また、 へパリンを希釈すると VSV-Gシユードタイプゥ ィルスべクタ一の感染性は回復することより、 両者の作用は可逆的であり、 超操 作時にへパリンを除くことが可能である。 実施例 2 0 プレパッケージング細胞 P tG- S2の安定性
P t G-S 2についてプレパッケージング細胞としての安定性を調べた。
3ヶ月間継続培養したもの及び新たに液体窒素より解凍した 1 acZをコードする MLVベクタ一を含む PtG- S2細胞へ実施例 1 6と同様に Creリコンビナ一ゼ導入した ものとしないものを用意した。 産生されてくる VSV-Gシュ一ドタイプウィルスべ クタ一の力価を前記に記載の方法でしたところ両者ともに Creリコンビナ一ゼ導 入しないものでは全く VSV-Gシユード夕ィプウィルスべクタ一が検出されなかつ たのに対して、 Creリコンビナ一ゼを導入したものでは同等の VSV-Gシュ一ドタイ プウィルスベクタ一の産生が見られた。 以上のことは P tG- S2のプレパッケージン グ細胞としての安定性は高いことを示している。 実施例 2 1
超遠心による VSV-Gシユードタイプウィルスベクタ一の濃縮
超遠心装置(Beckman L-60E)を使って VSV- Gシュ一ドタイプウィルスベクターの
濃縮を行った。
2.2X108 i. u. Ζ480Π11の VSV - Gシユードタイプウィルスベクターを滅菌した超 遠心チューブ (Beckman No.344058) 1 2本に 4 0 m 1ずつ分注し、 2回に分け て 6本ずつを SW28ロー夕一で 19500卬 ml時間 40分間、 濃縮を行った。 濃縮後の チューブから上清を除いた後に FCSを含まない DMEMを 0. 2m l加え、 氷上 1時間 静置したのちに時々軽く揺らしながら懸濁してさらに氷上 1時間放置した。 この 濃縮により 4 X107 i. u/mlの VSV-Gシユードタイプウィルスベクタ一が 1.5m 1 得られた (回収率 6 9 %) 。 さらにこの濃縮 VSV-Gシユードタイプウィルスべク 夕一を超遠心チューブ (Beckman 358650) に入れ SW41ロー夕一を用い 19500rpm 1 時間 4 0分間、 濃縮を行った。 上清を注射筒で除き FCSを含まない DMEM 0.05m 1 を加え、 氷上で懸濁した。 この遠心により 1 X109Zm 1まで濃縮された VSV- Gシ ユードタイプウィルスベクターが 0.08m 1得られた。 2回目の超遠心の回収率は 5 3 %であり、 当初の VSV-Gシユードタイプウィルスベクターの 3 7 %カ 1 X109 /m 1までに濃縮された。 実施例 2 2
VSV-Gシユードタイプウィルスベクタ一による導入遺伝子発現の持続
FLY (ヒト線維芽細胞) 、 3Y1 (ラット線維芽細胞) に対して、 いずれも核移行 シグナルをもつ lacZ (beta-galactosidase) をべクタ一 RNAにもつ以下のレトロ ウィルスベクタ一を m.0. i. = 1で感染させ、 lacZの発現の持続をしらべた。 1. 濃縮した VSV - Gシュ一ドタイプレトロウイルスベクタ一
2. 濃縮していない VSV- Gシュ一ドタイプレトロウイルスベクター
3. アンフォトロピックエンベロープをもつレトロウイルスベクタ一
感染後 3日毎に細胞をまきなおし、 その一部について X- galを用いて核に局在
している lacZによる染色をしらべた。 感染後 1 3日までに 3者のレトロウイルス ベクターによる lacZの発現の持続に差は見られず、 VSV- Gシユードタイプレトロ ウィルスベクタ一はアンフォトロピックエンベロープをもつレトロウイルスべク 夕一と同様に安定した導入遺伝子の発現を行うと考えられた。 実施例 23
mRNA短寿命配列を耐性遺伝子中に含む pBabe loxpuro- dの作成
前記の方法で作製した pBabe 〖 oxpuro中のピュ一ロマイシン耐性遺伝子とポリ A付加シグナルの間に存在する Ncolサイトを同制限酵素で切断し、 klenow fragmentによる平滑末端化を行った。 ここへ前記で述べた chicken c-fosの mRNA 短寿命配列 (AU Rich Element: ARE) である 414bpsの配列を klenow fragmentによ る平滑末端化したものを挿入し pBabe 1 oxpuro-dを作成した。 実施例 24
Creリコンビナ一ゼにより完全長のベクター RNAの遺伝子発現を開始させる VSV-G シユードタイプレトロウイルスベクタ一の作成
pBabe loxpuroのマルチクローニングサイトに lacZを挿入した pBabe loxpurola cZをリボフェクシヨンにより PtG-S2へ導入した。 導入細胞をピュー口マイシンに 対する耐性を利用して選択し、 選択された細胞をクロ一ニングせずに増やした。 その細胞に対して AxCANCreにより Creリコンビナーゼを導入し、 産生されてくる V SV - Gシュードタイプレトロウイルスベクタ一の力価を lacZを指標に測定した。 Creリコンビナ一ゼを導入したものは VSV-Gシュ一ド夕ィプレトロウイルスベクタ 一の産生を始め、 導入 5から 8日後には 2 X 104 i . u. /m 1の産生が見られた。 X - galを用いて lacZの染色を行ったところ、 導入 8日後の細胞では染色がみられ
た細胞が存在したのに対して、 導入しない細胞では 1 acZの発現が全く見られなか つた。 このことはベクター RNAにコードされる遺伝子も Creリコンビナーゼにより 発現を厳密に制御することで VSV-Gシユードタイプレトロウイルスベクタ一を産 生させることができることを示しており、 細胞に対して毒性を示すものなど影響 の大きい遺伝子をコードするベクター RNAをもつレトロウイルスベクタ一の安定 した大量調製法を可能とするものである。 実施例 2 5
プレパッケージング細胞から産生されるシユードタイプレトロウイルス中に自己 増殖可能なレトロウイルス (replication competent retrovirus: RCR) が含ま れないことの証明 (2)
実施例 1 4で記述した内容を改善し以下の結果を得た。 常法 (遺伝子治療の基 礎技術、 羊土社 1996) に従い、 lacZをコードする MLVベクターを含む PtG-S2細 胞から調製された 1 X107 i . u. /m 1のシユードタイプレトロウイルスを m.0. i = 5で M. dunni細胞に感染させ、 4日毎に 1ノ1 0の継代を 3回繰り返した 後の培養液を採取し、 DEAE- dextran存在下で PG- 4 S+L-細胞に加えた。 同時に行 つた RCRを含む Mink4070A細胞からの培養液を PG-4 S+L-細胞に加えたものでは 4 日後からフォ一カスが観察されたのに対して、 P tG-S2細胞から調製されたシュ ―ドタイプレトロウイルス中に含まれている可能性のある RCRを M. dunniで増幅し たものでは 8日後でも非感染のものと同様にフォーカスがみられなかった。 この ことは PtG- S2細胞から調製された 1 X107 i . u. /m 1のシュ一ドタイプレ卜 ロウィルス中には RCRが含まれていないことを示している。 実施例 2 6
プレパッケージング細胞から産生されるシユードタイプレトロウイルス中にアデ ノウィルスが含まれないことの証明 (2)
実施例 1 5で記述した内容をさらに改善し以下の結果を得た。 lacZをコードす る MLVベクタ一を含む PtG-S2へ実施例 2で記述した方法でアデノウイルス (AxCAN Cre)により Creリコンビナ一ゼを導入した。 培養液は毎日交換すると共に、 交換 時に培養液で入念に 3回ずつ細胞を洗い、 洗った際の培養液はピへッ卜で完全に 吸い取ることで残存している可能性のあるアデノウイルスできる限り除いた。 導 入 3から 5日後 (洗浄回数 6回以上) のサンプルから調製された 2 X106 i. u. /m 1のシユードタイプレトロウイルス中に含まれる可能性のあるアデノウィル スを常法 (バイオマニュアルシリーズ 4遺伝子導入と発現 ·解析法、 羊土社、 199 4) により 293細胞を用いて検出した。 AxCANCreを感染させたものでは、 一つのァ デノウィルス感染粒子が存在する条件でも感染 1 2日後までには 293細胞の 5 0 %以上の変性が見られたのに対して、 2 X106 i . u. Zm 1のシユードタイプ レトロウイルス中を感染させたものでは 293細胞の変性は一切見られず、 この中 にアデノウイルスは存在しないことが示された。
またこのアデノウイルスベクタ一を 1 X106 i. u./m l含む培養液をゥサ ギポリクローナル抗アデノウイルス抗体 (東京大学医科学研究所ウィルス研究部 白木先生より譲渡) と Protein G Sepharose (Pharmacia) とを結合させたもの で 4度 1時間処理後に遠心しその上清を回収して上記と同様に 293細胞による検 出を試みた。 感染 1 2日後までに一切 293細胞の変性は見られず、 この抗体によ り培養液中に含まれるアデノウイルスベクターは完全に除去されることが示され た。