WO1998006822A1 - Culture medium and use of the same - Google Patents

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WO1998006822A1
WO1998006822A1 PCT/JP1997/002749 JP9702749W WO9806822A1 WO 1998006822 A1 WO1998006822 A1 WO 1998006822A1 JP 9702749 W JP9702749 W JP 9702749W WO 9806822 A1 WO9806822 A1 WO 9806822A1
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cells
culture
medium
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physiologically active
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PCT/JP1997/002749
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Inventor
Yasuo Amatsuji
Hiroshi Tamashima
Kaoru Kobayashi
Takao Ohmura
Original Assignee
Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Definitions

  • the present invention provides a culture medium containing human serum albumin (hereinafter, also referred to as rHSA) obtained by genetic manipulation, a method for culturing animal cells using the medium, or producing a physiologically active substance. Regarding the method of collecting.
  • rHSA human serum albumin
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • F12 Natl. Acad. Sci. USA 53, 288 F12 Natl. Acad. Sci. USA 53, 288
  • RPMI 164 medium Goding, JW (1980) J. Immunol. Methods 39, 285, JAMA 199 (1957) 519]
  • serum must be added to the media. Serum from fetuses, pomas or humans had to be used at concentrations of 1 to 15%.
  • Serum itself is expensive, resulting in high costs.
  • ⁇ ⁇ ⁇ May be a source of virus and mycoplasma contamination.
  • plasma-derived human serum albumin (hereinafter, also referred to as HSA) is used as an additive for maintaining cell proliferation.
  • HSA plasma-derived human serum albumin
  • the quality of plasma-derived HSA is not always constant.
  • contaminating plasma-derived components such as lipoproteins, proteolytic enzyme inhibitors such as 1-antitrypsin, and metal or heme carrier proteins such as transflurin, cell-mouth plasmin, haptoglobin, etc.
  • the degree of contamination of fatty acids, calcium ions, tritophan, cysteine, glutathione, trace metal components, etc. differs for each product lot. Therefore, the effect of these components on the culture of animal cells and the like is concerned.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and has as its object to provide a culture medium capable of obtaining sufficient cell proliferation and having a stable quality and a small influence on culture. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for culturing animal cells that is stable (has good reproducibility).
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing and collecting a large amount of a physiologically active substance from animal cells capable of producing the physiologically active substance.
  • the present inventors have conducted studies in consideration of the above circumstances, and as a result, have found that cultivation is achieved by using HSA (r HSA) obtained by gene manipulation as an additive to a basic medium.
  • HSA HSA
  • the present inventors have found that sufficient proliferation of cells can be maintained without changing the effect when using HSA derived from plasma, and completed the present invention. That is, in the medium of the present invention, since rHSA having a constant quality is used, the influence on the culture effect can be further reduced (ie, reproducibility can be ensured).
  • the present invention is as follows. (1) A culture medium containing human serum albumin obtained by genetic manipulation.
  • the culture medium according to (1) above which contains a DMEM medium, a F12 medium, or an RPM11640 medium as a basic medium.
  • Animal cells are human kidney cell lines, Hypridoma, leukocytes, Namalba cells, BALL-1 cells, fibroblasts, lymphocytes, human kidney cells, melanoma cells, Vero cells, He1a cells, CHO cells, WI38 cells, BHK cells, COS-7 cells, MDCK cells, C127 cells, HKG cells, mouse myeloma cells, human lymphoblast cells or parent cells for human human hybridoma production, or their dhfr deficiency Culture method of (8) above, which is a strain, HGPRT-deficient strain,
  • a bioactive substance characterized by culturing animal cells capable of producing a bioactive substance in the medium of (1) to produce the bioactive substance, and collecting the bioactive substance from the culture. Manufacturing method.
  • the physiologically active substance is properokinase, perokinase, antithrombin-III, tissue plasminogen activator, hepatitis B virus surface antigen, pre-S-Hepatitis B virus surface antigen, interferon, colony formation stimulating factor or The method according to the above (11), which is a monoclonal antibody.
  • the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it contains human serum albumin (rHSA) obtained by gene manipulation. Specifically, for example, a medium obtained by adding rHSA to a basic medium can be mentioned.
  • rHSA human serum albumin
  • the basal medium includes a commonly used basal medium, that is, a medium containing a carbon source which can be normally assimilated by animal cells, a digestible nitrogen source, an inorganic salt, and the like, and If necessary, a trace amount of an effective substance such as a nutrient promoting substance or a precursor may be blended.
  • a basal medium any known medium for cell culture can be used.
  • the aforementioned DMEM medium, F12 medium and RPMI1640 medium are exemplified, and RPMI1640 medium is particularly suitable.
  • RHSA contained in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it is a human serum albumin produced by an HSA producing host prepared through genetic manipulation.
  • contaminant components derived from the producing host (E.g., protein-free), more preferably, the rHSA-producing host is cultured by known means, and then collected and purified from the culture filtrate, cells, or cells by known separation means and purification means, respectively. What was done is used.
  • the host for obtaining rHSA used in the present invention is not particularly limited as long as it is prepared through genetic manipulation, and may be any of those already described in the known literature and those which will be developed in the future. Can be used. Specific examples include bacteria (eg, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) that have been rendered rHSA-producing through genetic manipulation, animal cells, and the like.
  • yeast as a host, preferably Saccharomyces [e.g. For example, Saccharomyces cerevisiae] or a genus Pichia (eg, Pichia pastoris) is used.
  • An auxotrophic strain or an antibiotic-sensitive strain may also be used. More preferably, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his4, leu2, can1) and Pichia pastoris GTS115 strain (his4) are used.
  • the method for preparing these rHSA-producing hosts, the method for producing rHSA by culturing the host, and the method for separating and collecting rHSA from cultures should be carried out by using known methods and methods equivalent thereto.
  • a method for preparing an rHSA-producing host for example, a method using a normal HSA gene [Japanese Patent Laid-Open No. 58-56684 (corresponding to EP-A-73664)], No. 5 8-9 0 5 15 No. 5 (corresponding to EP—A—7 9 7 39), No. 5 8—15 0 5 17 No.
  • an appropriate host preferably Pichia yeast, specifically, the AOX of the GT S115 strain (NRRL accession number Y-15851), and the gene region under the control of AOX and the promoter by a conventional method.
  • a transformant is obtained by introducing a plasmid having a transcription unit expressing HSA into the yeast [Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-104290 (corresponding to EP-A-344449)] See].
  • This transformant has a weak growth ability in a methanol medium. Therefore, the transformant is cultured in a medium containing methanol to cause mutation, and only a viable strain is recovered. In this case, the methanol concentration is, for example, about 0.001 to 5%.
  • Medium artificial medium, 1 5 to 4 0 ° C as either good c culture conditions natural medium, 1 is about 1 0 0 0 hours are exemplified.
  • the rHSA-producing host can be appropriately fed with high-concentration glucose or methanol by fed-batch culture (half-batch culture).
  • a method of obtaining a high concentration of cells and products by avoiding high-concentration substrate inhibition on the producing cells Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-83595
  • r A method for enhancing the production of HS A Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-123495 (corresponding to U.S. Pat. No. 5,334,512, EP-A—5048283)]
  • the amount of rHSA to be added to the culture medium of the present invention is, for example, about 0.1 to 5 gZL, preferably about 0.1 to 2 gZL.
  • the culture medium of the present invention may contain, if necessary, insulin, peptone, transfrin and the like.
  • Insulin is not particularly limited in its origin, and preferably, insulin from insulin or recombinant human insulin is used.
  • the origin of peptone is not particularly limited, and peptone derived from beef is preferably used. Plant-derived peptone is also used. There is no particular limitation on the origin of transfusin, and human or human origin is preferably used.
  • the insulin content in the culture medium of the present invention is 0.1 to 10 mg ZL, preferably 0.1 to 2 mg / L, and the peptone content is 0.1 to 50 gZL, preferably 1 to 10 gL.
  • the content of gZL and transferrin is 0.5 to 20 mg ZL, preferably 1 to 15 mg ZL.
  • the culture medium of the present invention may further contain hypoxanthine 0.1 to 100 mgZL, preferably l to 20 mgZL, thymidine 0.01 to 100 mg / L, preferably 1 to 10 mg / L, if necessary.
  • selenium 0.0 1 to 1 to 00 ⁇ 2, preferably 1 ⁇ 1 0 g / L, ⁇ - tocopherol (vitamin E) 0. 00 1 ⁇ 1 0mg / / L, preferably 0.0 1-0. 5 mg ZL can be added.
  • the medium When a transformed animal cell containing a vector having a resistance gene is to be cultured, the medium may be further adapted to the resistance gene contained in the vector in order to maintain the stability of the plasmid transformation.
  • selective agents are added.
  • Choice Examples of the agent include those well-known to those skilled in the art, for example, neomycin, hygromycin, mycophenolic acid, hypoxanthine, xanthine, aminobulin, or methotrexite (MTX) and derivatives thereof.
  • Animal cells that can be cultured in the culture medium of the present invention may be those that are capable of producing a physiologically active substance by themselves, or those that are transformed by genetic engineering to produce a heterologous physiologically active substance.
  • Cells that themselves produce bioactive substances such as hybridomas that produce monoclonal antibodies, leukocytes that produce interferon (IFN) -1 ⁇ , Namaluba cells, BALL-1 cells, and IFN-3 Fibroblasts, lymphocytes producing IFN-7, human kidney cells producing properokinase or perokinase (pro-UK or UK), and melanoma producing tissue plasminogen activator (TPA).
  • Cells for example, Bowes cells are exemplified. ⁇
  • the established host cells transformed by gene engineering include Vero cells, He1a cells, CHO cells, WI38 cells, BHK cells, COS-7 cells, MDCK cells, and C127 cells. Cells, HKG cells, human kidney cell lines, and the like. Specifically, CHO— (Chinese hamster ovary cell: ATCC CCL 61), BHK (hamster kidney cell: ATCC CCL 10).
  • COS-7 (CV-1 Origin, SV-40 cell: ATCCCRL 16) 51), Vero cells (African green monkey kidney cells: ATCCCCL81) and the like, as well as mouse myeloma cells (X63-Ag8-653; P3U1) and human lymphoblast cells (IM-9.ATCC).
  • CCL 159 parent cells for producing human hybridomas, and dhfr-deficient strains, HGPRT-deficient strains, and ⁇ abain-resistant strains.
  • the method of culturing animal cells using the culture medium of the present invention is generally performed as follows. That is, for culturing animal cells using the culture medium of the present invention, a dish, flask, roller-bottle, spinner-flask, microcarrier, microcapsule, or hollow fiber well-known for culture is used.
  • the culture vessel such as the culture apparatus used can be used, but is not limited thereto.
  • the culture method is- In addition to the subculture usually performed in the above-mentioned culture vessel, the old culture solution is continuously or intermittently removed from the culture tank while containing the cells or separated from the cells.
  • the culture of animal cells using the culture medium of the present invention can be performed in the form of so-called high-density culture.
  • Cell number in particular is preferably carried out in 1 0 7 Zm ⁇ more dense.
  • Other culturing conditions include a culturing temperature of 30 to 37 ° (the culturing time is, for example, 1 to 10 days. C) If the medium is appropriately replaced, continuous culturing for a longer period can be performed.
  • Production of a physiologically active substance such as a protein by a cell may be performed by a means known per se.
  • Examples of such means include, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • a physiologically active substance of the present invention for example, antithrombin-III, pro-UK, UK, TP A. hepatitis B virus surface antigen, pre-S—hepatitis B virus surface antigen, IFN, colony formation Bioactive substances such as stimulating factors and monoclonal antibodies can be produced.
  • RPMI 1640 medium [Goding, J. W (1980) J. Immunol. Methods 39, 285, JAMA 199 (1957)] 10.2 g was used as a base medium, rHSA 1 g as an additive, insulin Lmg, beef-derived peptone 5g, transferrin 10mg, hypoxanthine 13mg, thymidine 4mg, 0.1 tocopherol 0.13mg and selenium 4tzg 1L of culture medium was prepared. r As HS A
  • Example 2 Culture of human kidney cell line The human kidney cell line as a cell number in the culture medium prepared with Example 1 which was attached to microcarrier beads were added to a 1 0 7 Zm 1. 3 7 ° C, 5% C0 was cultured in 2 conditions, 0.6 to 2.5 Production of U / m 1 equivalent pro UK was confirmed in culture medium at 2 days. After that, the culture medium was changed every 2-3 days, and continuous cultivation for a long period (at least one month or more) was possible.
  • rHSA human serum albumin

Description

明細書
培養用培地及びその用途
技術分野
本発明は、 遺伝子操作により得られたヒ ト血清アルブミン （以下、 rHSAと もいう） を含有してなる培養用培地、 及びその培地を用いて動物細胞を培養する 方法あるいは生理活性物質を産生、 採取する方法に関する。
背景技術
近年、 DNAの組み換え技術の進歩により、 タンパク質等の生理活性物質を細 胞産生物として製造する方法が研究されている。 この細胞産生物の製造のために は動物細胞の培養がより重要になってくるが、 このような細胞培養を工業的規模 で行うには、 多量の培地が必要になる。
従来、 動物細胞を生育 （増殖） させる際の培地としては、 極めて多種の培地、 例えば、 ダルベッコの改変イーグル培地 （DMEM) (Morton, H, J. J. (1970) In vitro 6， 89〕 、 F 1 2培地 〔Ham， R. 0. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53, 288 〕 及び R PM I 1 6 4 0培地 〔Goding， J. W. (1980) J. Immunol. Methods 39， 285, JAMA 199 (1957) 519] 等が使用されてきた。 しかし、 これら の培地を使用して動物細胞を生育 （増殖） させるには、 培地に血清を加えなけれ ばならない。 このため、 一般には、 ゥシ胎児、 ゥマまたはヒ ト等の血清を 1〜； 15 %程度の濃度で使用しなければならなかった。
しかし、 血清含有培地を使用する際には以下の様な問題があった。
① 血清自体が高価なためコスト高となる。
② 血清にはロッ ト差があり、 再現性が要求される培養には不利である。
③ 細胞産生物の培養上清からの精製が困難となる。
④ ウィルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがある。
このような現状に鑑みて、 培地中の血清濃度を減少させる方法が検討されてい る。 しかし、 血清濃度の減少によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死 滅し、 所望の細胞産生物 （例えばタンパク質等の生理活性物質） の収量が著しく 減少するなどの問題があり、 培地中の血清濃度の減少は困難であつた。 このような理由から、 血清を含まず、 尚且つ細胞が増殖性を失わずに培養され うる無血清培地に対して多大な関心が持たれるようになった。
ところで、 従来の無血清培地においては、 細胞の増殖性を維持するための添加 物として、 血漿由来ヒ ト血清アルブミン （以下 H S Aともいう） が使用されてい る。 しかしながら、 血漿由来 H S Aは必ずしも品質が一定とは言えない。 例えば、 夾雑する血漿由来成分、 例えばリポタンパク質、 ひ 1 —アンチトリブシン等のタ ンパク質分解酵素阻害物質、 トランスフヱ リ ン、 セル口プラスミ ン、 ハプ卜グロ ビンなどの金属やヘムの担体タンパク質等、 脂肪酸、 カルシウムイオン、 卜リブ トフアン、 システィン、 グルタチオン、 微量の金属成分等の混入度合がその製品 ロッ ト毎に異なる。 従って、 これらの成分が動物細胞等の培養に与える影響が懸
Έ、される。
発明の開示
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、 細胞の十分な増殖性が得られ ると共に、 品質の安定した、 培養に与える影響のより小さい培養用培地を提供す ることを目的とする。
本発明の別の目的は安定した （再現性が良い） 動物細胞の培養方法を提供する ことである。
さらに本発明の別の目的は、 生理活性物質を産生可能な動物細胞より該生理活 性物質を大量に産生、 採取する方法を提供することである。
本発明者らは、 上記のような事情を考慮にいれて検討を行った結果、 遗伝子操 作により得られた H S A ( r H S A ) を基本培地の添加物として用いることによ り、 培養時の効果を血漿由来の H S Aを用いた場合と変えることなく、 細胞の十 分な増殖性を維持することができることを見出し本発明を完成した。 即ち、 本発 明の培地においては品質が一定した r H S Aを用いていることから、 培養効果に おける影響をより少なく抑える （即ち、 再現性を確保する） ことができる。
本発明は以下の通りである。 ( 1 ) 遺伝子操作により得られたヒ ト血清アルブミンを含有してなる培養用培 地。
(2) 基本培地として DM EM培地、 F 1 2培地または RPM 1 1 640培地 を含有する上記 （1) の培養用培地。
(3) 遺伝子操作により得られたヒト血清アルブミンが、 ヒ ト血清アルブミン 産生性の酵母により産生されたものである上記 （1) の培養用培地。
(4) さらにインスリンを含有する上記 （1) の培養用培地。
( 5 ) さらにぺプトンを含有する上記 （ 1 ) の培養用培地。
(6) さらにトランスフユリンを含有する上記 （1) の培養用培地。
(7 ) さらにインスリン、 ペプトンおよびトランスフヱリンを含有する上記 (1 ) の培養用培地。
(8) 動物細胞を上記 （1) の培地にて培養することを特徴とする動物細胞の ¾ ^：ノ 5法。
(9) 動物細胞はそれ自体が生理活性物質を産生可能なもの、 または遺伝子ェ 学により形質転換されて異種の生理活性物質を産生するものである上記 （8) の ¾ ^：ノ 5法。
(10) 動物細胞がヒ ト腎細胞株、 ハイプリ ドーマ、 白血球、 ナマルバ細胞、 B ALL— 1細胞、 繊維芽細胞、 リンパ球、 ヒト腎細胞、 メラノーマ細胞、 Ve r o細胞、 H e 1 a細胞、 CHO細胞、 W I 38細胞、 BHK細胞、 COS— 7細 胞、 MDCK細胞、 C 1 27細胞、 HKG細胞、 マウスミエローマ細胞、 ヒトリ ンパ芽球細胞またはヒトヒ トハイプリ ドーマ作製用親細胞、 あるいはこれらの d h f r欠損株、 HGPRT欠損株、 ゥァバイン耐性株である上記 （8) の培養方
(11) 生理活性物質を産生可能な動物細胞を上記 （1) の培地で培養して当該 生理活性物質を産生させ、 培養物から該生理活性物質を採取することを特徴とす る生理活性物質の製造方法。
(12) 動物細胞はそれ自体が生理活性物質を産生可能なもの、 または遗伝子ェ 学により形質転換されて異種の生理活性物質を産生するものである上記 （11) の 製造方法。
(13) 生理活性物質がプロゥロキナーゼ、 ゥロキナーゼ、 アンチトロンビン— III 、 組織プラスミノ一ゲンァクチべ一タ、 B型肝炎ウィルス表面抗原、 プレ S 一 B型肝炎ウィルス表面抗原、 インタ一フヱロン、 コロニー形成刺激因子または モノクローナル抗体である上記 （11) の製造方法。
本発明の培養用培地は遣伝子操作により得られたヒ ト血清アルブミン （rHS A) を含有するものであれば特に限定はされない。 具体的には、 例えば基本培地 に r HS Aを添加したものが挙げられる。
本発明において、 基本培地としては一般的に用いられる基礎培地が挙げられ、 即ち通常動物細胞が同化しうる炭素源、 消化しうる窒素源及び無機塩等を含有さ せたものが用いられ、 また、 必要に応じて微量栄養促進物質、 前駆物質等の微量 有効物質を配合してもよい。 かかる基礎培地としては、 細胞培養のためのすべて の公知培地を使用することができる。 例えば前述の DMEM培地、 F 1 2培地及 び RPM I 1 640培地が例示され、 特に RPM I 1 640培地が好適である。 本発明の培養用培地に含められる rHS Aとは、 遺伝子操作を経て調製された HS A産生宿主により産生されるヒ ト血清アルブミンであれば特に限定されない カ^ 好ましくは産生宿主に由来する夾雑成分 （例えばタンパク質等） を実質的に 含まない、 より好ましくは公知の手段で rHS A産生宿主を培養した後、 その培 養濾液又は菌体、 細胞からそれぞれ公知の分離手段及び精製手段により採取及び 精製されたものが用いられる。
具体的には以下の方法が挙げられる。
本発明において用いられる、 rHS Aを得るための宿主は、 遺伝子操作を経て 調製されたものであれば特に限定されず、 既に公知文献記載のものの他、 今後開 発されるものであっても適宜利用することができる。 具体的には、 遺伝子操作を 経て rHS A産生性とされた菌 （例えば、 大腸菌、 酵母、 枯草菌等） 、 動物細胞 等が例示される。 特に、 宿主として酵母、 好ましくはサッカロマイセス属 〔例え ば、 サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 〕 、 もしくは ピキア属 〔例えば、 ピキア 'パストリス （Pichia pastoris ) 〕 を用いる。 また、 栄養要求性株や抗生物質感受性株を用いてもよい。 さらに好適にはサッカロマイ セス ·セレピシェ A H 2 2株 （a， his 4， leu 2， can 1) 、 ピキア .パストリス GT S 1 1 5株 （his 4 ) が用いられる。
これらの r H S A産生宿主の調製方法、 該宿主を培養することによる r H S A の生産方法及び培養物からの r H S Aの分離採取方法は、 公知ならびにそれに準 じた手法を採用することによって実施することができる。 例えば、 r H S A産生 宿主の調製方法としては、 例えば通常の H S A遗伝子を用いる方法 〔特開昭 5 8 — 5 6 6 8 4号 （E P— A— 7 3 6 4 6に対応） 、 同 5 8— 9 0 5 1 5号 （E P — A— 7 9 7 3 9に対応） 、 同 5 8— 1 5 0 5 1 7号公報 （ E P— A— 9 1 5 2 7に対応） 〕 、 新規な H S A遺伝子を用いる方法 〔特開昭 6 2 — 2 9 9 8 5号、 特開平 1 — 9 8 4 8 6号公報 （共に E P— A— 2 0 6 7 3 3に対応） 〕 、 合成シ グナル配列を用いる方法 〔特開平 1 一 2 4 0 1 9 1号公報 （米国特許第 5 4 0 9 8 1 5号、 E P—A— 3 2 9 1 2 7に対応） 〕 、 血清アルブミンシグナル配列を 用いる方法 〔特開平 2— 1 6 7 0 9 5号公報 （E P— A— 3 1 9 6 4 1に対応） 〕 、 組み換えプラスミ ドを染色体上に組み込む方法 〔特開平 3 — 7 2 8 8 9号公 報 （E P— A— 3 9 9 4 5 5に対応） 〕 、 宿主同士を融合させる方法 〔特開平 3
- 5 3 8 7 7号公報 （E P— A— 4 0 9 1 5 6に対応） 〕 、 メタノ一ル含有培地 で変異を起こさせる方法、 変異型 AOX2 プロモーターを用いる方法 〔特開平 6 一 9 0 7 6 8号、 同 4— 2 9 9 9 8 4号公報 （共に Ε Ρ— A— 5 0 6 0 4 0に対 応） 〕 、 枯草菌による HS Aの発現 〔特開昭 6 2— 2 5 1 3 3号公報 （E P— A
- 2 2 9 7 1 2に対応） 〕 、 酵母による H S Aの発現 〔特開昭 6 0 - 4 1 4 8 7 号 （E P— A— 1 2 3 5 4 4に対応） 、 同 6 3— 3 9 5 7 6号 （E P— A— 2 4 8 6 5 7に対応） 、 同 6 3— 7 4 4 9 3号公報 （E P— A— 2 5 1 7 4 4に対応 ) ) 、 ピキア酵母による H S Aの発現 〔特開平 2 - 1 0 4 2 9 0号公報 （E P— A- 3 4 4 4 5 9に対応） 〕 が例示される。 このうち、 メタノール含有培地で変異を起こさせる方法は具体的には以下のよ うに行う。 すなわち、 まず適当な宿主、 好ましくはピキア酵母、 具体的には GT S 1 1 5株 （NRRL寄託番号Y— 1 5 8 5 1 ) の AOX, 遺伝子領域に常法に より AOX, プロモータ一支配下に HS Aが発現する転写ュニッ トを有するブラ スミ ドを導入して形質転換体を得る 〔特開平 2 - 1 0 4 2 9 0号公報 （E P— A - 3 4 4 4 5 9に対応） を参照〕 。 この形質転換体はメタノール培地中での増殖 能は弱い。 そこで、 この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起 こさせ、 生育可能な菌株のみを回収する。 この際、 メタノール濃度としては 0. 0 0 0 1〜5 %程度が例示される。 培地は人工培地、 天然培地のいずれでもよい c 培養条件としては 1 5〜4 0°C、 1〜 1 0 0 0時間程度が例示される。
また、 r HS A産生宿主の培養方法としては、 上記の各公報に記載された方法 の他に、 フェツ ドバッチ培養 （半回分培養） により、 高濃度のグルコースあるい はメタノ一ル等を適度に少量ずつ供給し、 産生菌体に対する高濃度基質阻害を避 けて高濃度の菌体と産生物を得る方法 （特開平 3— 8 3 5 9 5号公報） 、 培地中 に脂肪酸を添加して r HS Aの産生を増強する方法 〔特開平 4一 2 9 3 4 9 5号 公報 （米国特許第 5 3 3 4 5 1 2号、 E P— A— 5 0 4 8 2 3に対応） 〕 等が例 示される。
培養処理により産生された r H S Aを、 宿主細胞に由来する成分及び培養成分 等から十分な精度をもって単離 ·精製する方法については各種の方法が提案され ている。 例えば、 従来行われている方法として r HS Aを含有する酵母培養液を、 圧搾→限外濾過膜処理—加熱処理—限外濾過膜処理に供した後、 陽ィォン交換体 のカラムクロマトグラフィー処理、 疎水性クロマトグラフィー処理、 陰イオン交 換体のカラムクロマトグラフィー処理等の工程に供する方法 〔特開平 5— 3 1 7 0 7 9号公報 （米国特許第 5 4 4 0 0 1 8号、 E P— A— 5 7 0 9 1 6に対応） 、 Biotechnology of Blood Proteins. 1993, vol. 227, 293-298) が挙げられる。 また、 上記従来法の後で、 さらにキレート樹脂処理またはホウ酸 '塩処理の工程 に供する方法も報告されている 〔特開平 6— 5 6 8 8 3号、 同 6— 2 4 5 7 8 9 号公報 （共に米国特許第 552 1 287号、 EP— A— 6 1 276 1に対応） 〕 c また、 当該酵母培養液を加熱処理後に、 吸着流動床技術を用いたストリームラ ィン法 〔特開平 8— 1 1 6985号公報 （EP— A— 699687に対応） 〕 等 を用いることもできる。 このようにして調製 ·精製された r H S Aは公知の手法、 例えば、 滅菌加熱、 限外濾過膜処理、 安定化剤の添加、 除菌濾過、 分注、 凍結乾 燥等により製剤化することができる。
本発明の培養用培地における rHS Aの添加量としては 0. l〜5 gZL、 好 ましくは 0. 1〜2 gZL程度が例示される。
本発明の培養用培地には必要に応じてインスリン、 ペプトン、 トランスフヱリ ン等を添加することができる。
インスリ ンは、 その由来には特に制限はなく、 好適にはゥシ由来インスリ ン又 は組み換えヒ トインスリンが使用される。 ペプトンは、 その由来には特に制限は なく、 好適には牛肉由来ペプトンが使用される。 また植物由来ペプトンも同様に 使用される。 トランスフヱリンは、 その由来には特に制限はなく、 好適にはヒ ト 又はゥシ由来のものが使用される。
本発明の培養用培地におけるインスリ ンの含有量は、 0. l〜1 0mgZL、 好ましくは 0. l〜2mg/L、 ペプトンの含有量は 0. l〜50 gZL、 好ま しく は l〜1 0 gZL、 トランスフェ リ ンの含有量は 0. 5〜20mgZL、 好 ましくは 1〜 1 5 mgZLである。
本発明の培養用培地には、 さらに必要に応じてヒポキサンチン 0. 1〜1 00 mgZL、 好ましくは l〜20mgZL、 チミジン 0. 0 1〜1 00mg/L、 好ましくは 1〜1 0mg/L、 セレン 0. 0 1〜1 00〃2 し、 好ましくは 1 〜1 0 g/L、 α— トコフエロール （ビタミ ン E) 0. 00 1〜1 0mg//L、 好ましくは 0. 0 1〜0. 5mgZLを加えることができる。
また、 耐性遺伝子を有するベクターを含有する形質転換された動物細胞を培養 しょうとする場合には、 プラスミ ド形質転換の安定性を保っために該培地に更に ベクター中に含有された耐性遺伝子に相応する選択剤を加えることもある。 選択 剤としては、 当業者には周知のもの、 例えばネオマイシン、 ヒグロマイシン、 マ ィコフエノール酸、 ヒポキサンチン、 キサンチン、 アミ ノブチリ ンまたはメ ト ト レキセィ ト （MTX) 及びその誘導体が例示される。
本発明の培養用培地で培養可能な動物細胞としては、 その細胞自体が生理活性 物質産生可能なものでも、 遗伝子工学により形質転換され異種の生理活性物質を 産生するものであってもよい。 細胞自体が生理活性物質を産生するものとして、 例えば、 モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ、 インターフヱロン （I FN) 一 αを産生する白血球、 ナマルバ細胞、 BALL— 1細胞、 I FN— 3を 産生する繊維芽細胞、 I FN— 7を産生するリ ンパ球、 プロゥロキナーゼあるい はゥロキナーゼ （プロ UKあるいは UK) を産生するヒ ト腎細胞、 組織プラスミ ノーゲンァクチベータ （TPA) を産生するメラノ一マ細胞 （例えば、 Bowe s細胞） 等が例示される。 遗伝子工学により形質転換される株化された宿主細胞 としては、 V e r o細胞、 H e 1 a細胞、 CHO細胞、 W I 38細胞、 BHK細 胞、 COS— 7細胞、 MDCK細胞、 C 1 27細胞、 HKG細胞、 ヒ ト腎細胞株 等が挙げられる。 具体的には、 CHO— (チャイニーズハムスター卵巣細胞 ： ATCC CCL 6 1) 、 BHK (ハムスター腎細胞： ATCC CCL 1 0 ) . COS-7 (CV- 1 Or i g i n, SV - 4 0細胞： A T C C C R L 1 6 5 1 ) 、 V e r o細胞 （アフリカミ ドリザル腎細胞： A T C C C C L 8 1 ) 等があり、 更にはマウスミエローマ細胞 （X63— Ag 8— 653 ; P 3U 1 ) 、 ヒ トリンパ芽球細胞 （IM— 9. ATCC CCL 1 59) 、 ヒ トヒ トハ イブリ ドーマ作製用親細胞、 ならびにこれらの d h f r欠損株、 HGPRT欠損 株、 ゥァバイン耐性株等が例示される。
本発明の培養用培地を使用して動物細胞を培養する方法としては、 通常、 次の 通りにして行われる。 即ち、 本発明の培養用培地を使用する動物細胞の培養には、 培養用としてよく知られているディ ッシュ、 フラスコ、 ローラ一ボトル、 スピン ナ一フラスコ、 マイクロキャリア一、 マイクロカプセルあるいは中空糸を用いた 培養装置等の培養容器が使用できるがこれらに限定されない。 培養方法としては- 上記の培養容器等で通常行われる継代培養のほか、 培養槽内から、 連続的に、 あ るいは間歇的に古い培養液を細胞を含んだまま、 あるいは細胞と分離して抜き出 しつつ、 それと見合う量の新しい培養液を供給して、 長時間培養条件を一定に制 御しつつ細胞を培養する連続的な培養法等が挙げられる。 また、 本発明の培養用 培地を用いる動物細胞の培養はいわゆる高密度培養の形態で行うことができる。 具体的には細胞数が 1 07 個 Zm〗以上の高密度で行うのが好ましい。 その他の 培養条件として培養温度は 3 0〜 3 7° (、 培養時間は 1〜 1 0日間が例示される c また、 当該培地は適宜交換すれば、 さらに長期間の連続培養が可能である。
細胞によるタンパク質等の生理活性物質の産生は、 自体既知の手段にて行えば よい。 かかる手段としては、 例えば特開昭 6 1 - 1 7 7 9 8 7号公報 （EP— A
- 1 5 4 2 7 2に対応） 、 特開昭 6 3— 1 4 6 7 8 9号公報 （米国特許第 5 0 9 8 8 4 0号、 E P— A— 2 5 3 2 4 1に対応） 等に記載の方法等が挙げられる。 本発明の生理活性物質の製造方法によれば、 例えばアンチ トロンビン— III 、 プロ UK、 UK、 TP A. B型肝炎ウィルス表面抗原、 プレ S— B型肝炎ウィル ス表面抗原、 I FN、 コロニー形成刺激因子、 モノクローナル抗体等の生理活性 物質を製造することができる。
実施例
以下に、 本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、 本発明はこれ らによって何ら限定されるものではない。
実施例 1 培養用培地の作製
基本培地として RPM I 1 6 4 0培地 〔Goding， J. W (1980) J. Immunol. Methods 39， 285， JAMA 199 (1957)〕 1 0. 2 gを用い、 添加物として rHSA 1 g、 インスリ ン l mg、 牛肉由来ぺプトン 5 g、 トランスフェ リ ン 1 0mg、 ヒポキサンチン 1 3mg、 チミ ジン 4 mg、 ひ一トコフエロール 0. 1 3 mg及 びセレン 4 tz gを用いて培養用培地 1 Lを作製した。 r HS Aとしては特開平 8
- 1 1 6 9 8 5号に準じて調製したピキア ·パストリス酵母由来のものを用いた。 実施例 2 ヒ ト腎細胞株の培養 ヒ ト腎細胞株をマイクロキャリアビーズに付着させたものを実施例 1で作製し た培養用培地中に細胞数として、 1 07 個 Zm 1 となるように添加した。 3 7°C、 5 %C02 の条件下で培養したところ、 2日間で培養液中に 0. 6〜2. 5 U/ m 1相当のプロ UKの産生が確認できた。 その後、 2〜3日毎に培養液を交換し、 長期間 （すくなくとも 1 ヶ月以上） の連続培養が可能であった。
発明の効果
本発明の培養用培地に、 品質の一定な遺伝子操作により得られたヒ 卜血清アル ブミ ン （r HSA) を使用することにより、 血清含有培地及び Zまたは血漿由来 HSAを含有してなる従来の無血清培地を使用した場合と同等の細胞増殖性及び 生理活性物質産生性等の効果を維持し、 且つ培地の品質の安定化、 培養の再現性 の確保が可能となった。 本出願は日本で出願された平成 8年特許願第 2 1 0 0 0 4号を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1. 遺伝子操作により得られたヒ 卜血清アルブミンを含有してなる培養用培地
2. 基本培地として D MEM培地、 F 1 2培地または RPM I 1 6 4 0培地を 含有する請求の範囲第 1項記載の培養用培地。
3. 遺伝子操作により得られたヒト血清アルブミンが、 ヒト血清アルブミ ン産 生性の酵母により産生されたものである請求の範囲第 1項記載の培養用培地。
4. さらにィンスリンを含有する請求の範囲第 1項記載の培養用培地。
5. さらにぺプトンを含有する請求の範囲第 1項記載の培養用培地。
6. さらにトランスフェリンを含有する請求の範囲第 1項記載の培養用培地。
7. さらにインスリン、 ペプトンおよびトランスフヱリンを含有する請求の範 囲第 1項記載の培養用培地。
8. 動物細胞を請求の範囲第 1項記載の培地にて培養することを特徴とする動 物細胞の培養方法。
9. 動物細胞はそれ自体が生理活性物質を産生可能なもの、 または遺伝子工学 により形質転換されて異種の生理活性物質を産生するものである請求の範囲第 8 項記載の培養方法。
1 0. 動物細胞がヒト腎細胞株、 ハイプリ ドーマ、 白血球、 ナマルバ細胞、 B ALL— 1細胞、 繊維芽細胞、 リ ンパ球、 ヒ ト腎細胞、 メラノーマ細胞、 V e r o細胞、 H e 1 a細胞、 CHO細胞、 WI 3 8細胞、 BHK細胞、 COS - 7細 胞、 MDCK細胞、 C 1 2 7細胞、 HKG細胞、 マウスミエローマ細胞、 ヒ トリ ンパ芽球細胞またはヒトヒ トハイプリ ドーマ作製用親細胞、 あるいはこれらの d h f r欠損株、 HGPRT欠損株、 ゥァバイン耐性株である請求の範囲第 8項記 載の培養方法。
1 1. 生理活性物質を産生可能な動物細胞を請求の範囲第 1項記載の培地で培 養して当該生理活性物質を産生させ、 培養物から該生理活性物質を採取すること を特徴とする生理活性物質の製造方法。
1 2. 動物細胞はそれ自体が生理活性物質を産生可能なもの、 または遺伝子ェ 学により形質転換されて異種の生理活性物質を産生するものである請求の範囲第
1 1項記載の製造方法。
1 3 . 生理活性物質がプロゥロキナーゼ、 ゥロキナーゼ、 アンチトロンビン一 I I I 、 組織プラスミノ一ゲンァクチベータ、 B型肝炎ウィルス表面抗原、 プレ S 一 B型肝炎ウィルス表面抗原、 インターフヱロン、 コロニー形成刺激因子または モノクローナル抗体である請求の範囲第 1 1項記載の製造方法。
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