WO1997041217A1 - GENES RECEPTEURS DE LA PROTEINE ob ET UTILISATION DE CES GENES - Google Patents
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Description
明 細 書
o b 蛋白 レセプタ 一遺伝子及びそ の用途
技 術 分 野
本発明は o b 蛋 白 レセプタ ーの遺伝子及びそ の変異体、 詳細に は、 肥満の表現形質を発現する 温血動物に 由来す る o b 蛋 白 レセプタ ー の遺伝子に関する。
更に本発明は、 こ れ らの o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子の 各種分野におけ る 応用 に関す る。
背 景 技 術
実験医学の分野では、 長い間実験的発症モデル （ indu ced animal model )力く疾患モデル動物 と して利用 さ れ、 そ の結果、 感染症の疾患や栄養障害に よ る疾患等 と いっ た 多 く の疾患が克服 さ れ、 人類が健康で文化的な生活を営 むこ と を可能 と し、 平均寿命を飛躍的に増加 さ せ る 等、 重要な役割を果た して き た。
しか し、 近年に至 っ て、 病因がま だ解明 さ れな い疾患 と して、 ヒ 卜 の体質に 内在する 因子、 言い換えれば遺伝 性の素因 に よ っ て引 き起こ され る疾病が ク ロ ー ズア ッ プ さ れて き てお り、 こ れ ら の疾患の病因を解明 し、 治療法 を確立す る ための研究に使用でき る疾患モデル動物 （ 自
然発症モ デノレ ： spontaneous animal model)力 '必要に な つ て き た。 すなわ ち、 モデル動物 と して、 ヒ 卜 の疾患に酷 似 した症状を 自然発症す る 突然変異動物や異常形質を発 現す る 系統動物が必要 と な っ て き て いる。
と こ ろで、 肥満症は、 産業の発達 し た現代社会におい て万人に共通 し た健康上の問題であ り、 ま たそれは糖尿 病、 高血圧、 高脂血症等 と い っ た重篤な疾患 と も 関連 し て いる ため、 永年その病因の解明が望ま れて いる 疾患の 一つであ る。
こ の病因 に関 して は、 1994年に Y. Zhangら に よ っ てマ ウ スか ら、 高イ ン シ ュ リ ン， 高血糖症 （ I I型糖尿病） を発 現する obese遺伝子（以下、 o b 遺伝子 と い う。 ）が単離 · 同定さ れ、 その遺伝子の劣性突然変異に よ っ て、 重篤な 遺伝性肥満症が引 き起こ さ れ る こ とが示さ れた 〔 Nature 372- 425-432 (1994)) 。
その後の多 く の研究に よ り、 大腸菌（E. coli) か ら精製 さ れた o b 遺伝子の生成物 （以下 o b 蛋白 と も いう。 le ptin ： レ プチ ン ） をマ ウ ス に投与する こ と に よ り、 マ ウ ス の体重が減少す る こ とが示 さ れて い る 〔 Science 219, 540 - 543 ( 1995 ) ； Science 269, 543 - 546 ( 1995 ) ； Scie nce 269, 546-549 (1995) ； Nature 377, 530-532 (1995)〕
ま た、 良 く 特徴づけ ら れて い る マ ウ ス の劣性肥満の変 異形質 ( recessive obesity mutation) は 糖尿病 ( d i abetes； db) であ る。 d b 変異がホ モ 〔 同型接合体（db/ db)〕 であ る マ ウ ス は、 同様 に 0 b 変異が ホ モ で あ る （ 0 b/ob) マ ウ ス の表現型 （ phenotype)と ほ と ん ど同 じ肥満 表現型 を示す。 （ ob/ob) マ ウ ス と （ db/db) マ ウ ス につ いて の研究力、 ら、 （db/db)マ ウ ス は 0 b 蛋 白 シ グナ ルの受 容機能を欠損 して い る 可能性が示 さ れて い る 〔 Diabetol ogia 14, 141 - 148 ( 1978 ) ) 0
1995年後半、 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A力、'、 マ ウ ス脈絡膜叢由来の c D N A発現 ラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ーニ ン グす る こ と に よ り ク ロ 一 ニ ン グさ れ、 そ の生成 物た る レ セ プタ ー は一回膜を貫通す る 膜貫通型 レ セ プタ — であ る こ と が示唆 さ れた。 それ は、 g p 1 3 0、 イ ン タ ー ロ イ キ ン 6 レ セ プタ ー の シ グナル変換成分、 グラ ニ ュ ロ サ イ ト コ ロ ニ ー 刺激因子の レ セ プ夕 一 及び 白 血病阻 害因子の レ セ プタ 一 と 極めて深 く 関連す る も の で あ る。 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の細胞内 ド メ イ ン は、 上記 レ セ プタ ー及び ア ミ ノ 酸 3 0 4 個力、 ら な る ヒ 卜 の相 同物 と 比べて短 く、 た っ た の 3 4 ア ミ ノ 酸か ら な る も の であ る が、 遺伝子マ ッ ピ ン グに よ り、 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プ夕 一遺伝子が こ れ ら と 近接な 関係 に あ る こ と が示 さ れて い
る o
ま た最近、 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー 遺伝子に い く つ かの ス プラ イ ス変異体が存在す る こ と が報告 さ れてお り、 (db/db)マ ウ ス の遺伝子 に異常な 形 に ス プラ イ ス さ れ た変 異体が見つか つ て い る 〔 Cell 84, 491 - 495, ( 1996 )； Na ture 319, 632-635 (1996)] 0
一方、 ラ ッ ト に つ いて は、 マ ウ ス に 比較 して そ の遺伝 学は あ ま り 発展 して お ら ず、 従来、 系統に つ いての関心 も 薄か っ た。 と こ ろカ^ 上述す る よ う に、 近年遺伝性の 素因 に よ っ て惹起 さ れ る 病気が ヒ ト の 医療に お け る 重要 な 問題 と な っ て く る と と も に、 ラ ッ 卜 につ いて も 疾患モ デル と な り う る 遺伝的特性を有す る も のが、 強 く 求め ら れ る よ う に な っ て き た。 それ と 共 に、 かか る 自 然発症モ デル ラ ッ 卜 の迅速な 選別 お よ び該動物の安定 し た供給が 重要な課題 と な っ て い る。 発 明 の 開 示
本発明者 ら は、 鋭意研究を重ねた結果、 S D ラ ッ ト 並 び に肥満表現型 （ fatty) の ホ モ体で あ る Zucker(fa/fa) ラ ッ ト 力ヽ ら、 o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A を ク ロ ー二 ン グす る こ と に成功 し た。 そ して、 そ れ ら の配列 を解析 しかつ比較検討す る こ と に よ り、 それ ら特定領域が ラ ッ
卜、 ヒ 卜 及びマ ウ ス間で良 く 保存 さ れて い る こ と、 及び
S D ラ ッ 卜 由来の c D N A と Zucker(fa/ia)ラ ッ 卜 由来 の c D N A と の間 に、 ヌ ク レオチ ドの相違力 あ る こ と を 発見 し、 更に、 こ の相違が肥満表現型に関連 して いる こ と を見いだ して、 本発明を完成 した。
すなわ ち、 本発明は、 配列番号 1 で示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配列を コ 一 ドす る塩基配列を有す る こ と を特徴 とす る 0 b 蛋白 レセプ夕 一遺伝子、 ま た、 配列番号 2 で示 さ れ る 塩基配列を有す る こ と を特徴 とする o b 蛋 白 レセ プ夕 一 遺伝子であ る （以下、 こ の遺伝子を第一番 目 の o b 蛋白 レ セプタ 一遺伝子 と も いう。 ） 。
さ ら に本発明は、 肥満の表現形質を発現す る 温血動物 由来の o b 蛋白 レ セプタ ー遺伝子であ る。 具体的には、 上記第一番 目 の o b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子において、 コ ド ン 2 6 9 位がグノレ夕 ミ ン の代わ り にプロ リ ンを コ 一 ド す る塩基配列であ る こ とを特徴 とす る o b 蛋 白 レセ プタ 一遺伝子、 ま た、 上記第一番 目 の o b 蛋白 レセプ夕 一遺 伝子にお いて、 塩基番号 8 0 6 位の ヌ ク レオチ ドがアデ ニ ン の代わ り に シ 卜 シ ン であ る こ と を特徴 とする o b 蛋 白 レセプ夕 一遺伝子であ る （以下、 こ の遺伝子を第二番 目 の o b 蛋 白 レセ プタ ー遺伝子 と も いう。 ） 。
以下、 本明細書にお いて用 いる ア ミ ノ 酸、 ぺプチ ド、
塩基配列、 核酸な どの略号に よ る 表示は、 I U P A C、 I U B の規定、 「塩基配列又はァ ミ ノ 酸配列を含む明細 書等の作成のため のガイ ドラ イ ン」 （ 日 本特許庁編） 及 び当該分野におけ る 慣用記号に従う もの とす る。
ま ず、 本発明の第一番 目 の o b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子 に つ いて説明する。
本発明の遣伝子は、 配列番号 1 で示さ れ る ア ミ ノ 酸配 列を コ ー ドする塩基配列を有する こ と を特徴 とする ラ ッ 卜 由来の o b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子であ る。
本発明の遺伝子の塩基配列は、 配列番号 1 に示 さ れる ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る も のであれば、 特に制限 さ れ ず、 コ ド ン の縮重性に基づいて、 該ア ミ ノ 酸配列の各ァ ミ ノ 酸残基を コ ー ド し得る任意の コ ド ンを組み合わた塩 基配列を有す る こ と も でき る。 好ま し く は、 配列番号 1 に示さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る塩基配列であ っ て、 且つその配列 中に制限酵素 H p a I Iま たは M s p I の認 識部位を有 しな い塩基配列であ る。 よ り 好ま し く は、 配 列番号 2 で示 さ れ る塩基配列であ る。
尚、 本発明の 0 b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子は、 少な く と も前述す る よ う な塩基配列を構成要素 と して有する も の であればよ く、 従 っ て、 例え ば該塩基配列の 5 ' 末端又 は /及び 3 ' 末端側 に 1 乃至は複数の任意の塩基配列を
有 して いて も 良い。
当該遺伝子は、 ラ ッ ト、 好ま し く は肥満の形質を発現 し な い ラ ッ 卜 に 由 来す る 0 b 蛋 白 レ セ プタ ー の遺伝子で あ る。 肥満の形質を発現 し な い も のであれば、 ラ ッ ト の 系統は特 に 制 限 さ れ な い力く、 好ま し く は、 S D ( Sprang ue-Dawley)ラ ッ ト 、 Wistarラ ッ 卜 等力く挙げ られ る。
本発明 の遺伝子は、 S D ラ ッ 卜 の肺 由 来の全 R N Aを 用 い、 ま たプラ イ マ一 と して マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A の翻訳 も し く は非翻訳領域に対 して特異的で あ る セ ン ス プ ラ イ マー 〔 セ ン ス プ ラ イ マ 一 S 1 ： G C A A A T C C A G G T G T A C A C C T C T G A A G A A A G ( マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A の塩基番号
— 3 0 1 の残基） 、 セ ン ス プラ イ マー S 2 ： G C A
T T G T G A G T G A C C G A G T T A G C A A A G T T A ( マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A の塩基番号 1 1 3 9 ~ 1 1 6 8 の残基） 〕 及びア ン チ プラ イ マ一 〔 ア ン チセ ン ス プラ イ マー A 3 ： C T G C T C A T T G C A G C A G T A C A C T G C G T C A T A ( マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A の塩基番号 1 2 4 2 カヽ ら 1 2 1 3 残基） 、 ア ン チセ ン ス プラ イ マ一 A 4 : T T G G G T T C A T C T G T A G T G G T C A T G A G A G A
C ( マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N A の塩基番号 2
7 1 6 力、 ら 2 6 8 7 残基） 〕 〔 Cell 83. 1263-1271 (19 95) を使用 して、 逆転写ポ リ メ ラ ー ゼ鎖反応 （ R T — P し R ： reverse transcription-polymerase chain react ion) ( Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 8 , 5698-5702 (1988) ; Science 241 , 708-712 (1988) ; Science 241, 1823 - 1825 ( 1988 ) ] に よ り 得 られた も のであ る （実施例 1 参照） 。
ただ し、 ラ ッ ト は上述の よ う に S D ラ ッ ト に限定さ れ ず、 ま た組織 も肺に 限定さ れず、 種 々 の組織、 器官 （心 臓、 肺、 脾臓、 腎臓、 睾丸、 筋肉、 脂肪組織、 脾臓、 小 腸、 肝臓等） に 由来す る R N A を用 い る こ とができ る。 ま た、 P C R に用 いる プラ イ マー と して は、 マ ウ ス o b 蛋白 レセ プタ ー の c D N A に 由来す る も のであ る必要は な く、 本発明で明 らかに さ れた本発明の遺伝子の配列情 報に基づいて適宜設定す る こ とができ、 ま たそれ らは常 法に従い合成す る こ とができ る。
次に、 本発明の第二番 目 の o b 蛋 白 レ セプタ 一遺伝子 について説明する。
本発明の遺伝子は、 肥満の表現形質を発現する 温血動 物由来の o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子であ り、 具体的には 配列番号 1 で示さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る 塩基配 列を有す る遺伝子にお いて、 その塩基配列の一部が、 肥
満の表現形質を発現す る よ う に変異 してな る 0 b 蛋白 レ セプタ 一遺伝子等が例示 さ れ る。
こ こ で、 変異 と は、 肥満の表現形質を発現する よ う な 変異であれば特に 限定さ れず、 前述す る塩基配列の一部 が他の 1 な い しは複数個の ヌ ク レオチ ド又は塩基配列で 置換 さ れてな る 態様、 上記塩基配列の一部に他の 1 な い し は複数個の ヌ ク レオチ ド又は塩基配列が付加 さ れてな る態様、 及び上記塩基配列の任意の場所の 1 乃至は複数 個の ヌ ク レオチ ド又は塩基配列が削除さ れてな る 態様の いずれを も含む概念であ る。
好ま し い変異は、 0 b 蛋白 レセ プタ 一遺伝子の発現能 力 は損なわれな いが、 発現， 生成 さ れ る o b 蛋白 レセプ タ ーの o b 蛋 白 に対す る 受容機能が低下 も し く は損なわ れ、 肥満形質を誘発す る よ う な変異であ る。 よ り 好ま し く は、 変異に よ っ て制限酵素認識部位の新たな形成、 も し く は消失を伴う 変異の態様であ る。
かかる変異態様を有する遺伝子であれば、 形成及び / 又は消失 した部位を認識する 制限酵素を利用する こ と に よ り、 簡便に変異遣伝子を検出す る こ とができ る。 ま た、 かか る遺伝子の検出 は、 ひいて は遺伝子変異に よ り 肥満 形質を発現する 温血動物を正常な温血動物 と 区別、 選別 する こ と に応用でき る。
な お、 本発明で温血動物 と は、 哺乳類 （ ヒ ト、 ラ ッ ト、 ゥ シ、 豚、 羊な ど） 及び鳥類等を広 く 含む も のであ る。
変異の う ち、 好適に は、 上記第一番 目 の o b 蛋白 レセ プタ ー遺伝子が有す る塩基配列中の一部が、 肥満形質を 発現す る よ う に他の ヌ ク レオチ ドで置換 してな る態様の も のが挙げ られ る。
具体的 に は、 第一番 目 の o b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子に お いて、 コ ド ン 2 6 9 位がグル夕 ミ ン の代わ り に プロ リ ン を コ一 ドす る塩基配列 と な る よ う に置換さ れてな る こ と を特徴 とす る 0 b 蛋白 レセプタ 一遺伝子が例示 される。 よ り 具体的 に は、 配列番号 3 で示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る 塩基配列を有す る こ と を特徴 とする o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子が挙げ られ る。 かかる遺伝子の塩基配 列は、 配列番号 3 に示さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドする も のであれば、 特に制限さ れず、 コ ド ンの縮重性に基づ いて、 該ア ミ ノ 酸配列の各ア ミ ノ 酸残基を コ ー ド し得る 任意の コ ド ン を組み合わた塩基配列を有する こ と も でき る。 好ま し く は、 配列番号 3 記載のア ミ ノ 酸配列を コ ー ド し、 塩基番号 8 0 6 位領域部分に制限酵素 H p a l lま たは M s p i の認識部位を有 して いる も のであ る。 よ り 好ま し く は、 第一番 目 の o b 蛋 白 レセプタ ー遺伝子にお いて、 塩基番号 8 0 6 位の ヌ ク レオチ ドがアデニ ンの代
わ り に シ 卜 シ ンであ る こ と をを特徴 とす る o b 蛋 白 レセ プタ 一遺伝子であ り、 具体的に は、 配列番号 4 で示され る塩基配列を有する こ とを特徴 とする も のであ る。
尚、 当該第二番 目 の 0 b 蛋白 レセプタ ー遺伝子 も、 前 記第一番 目 の o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子 と 同様、 上で述 ベ る特定の塩基配列を有する 限 り、 その 5 ' 末端又はノ 及び 3 ' 末端側に 1 乃至複数の任意の塩基配列を有 して いて も良い。
当該遺伝子は、 肥満形質を発現す る 温血動物、 具体的 に は遺伝子型 と して fa/ia ( fatty遺伝形質の ホモ体、 同 型接合体） を有する 温血動物の o b 蛋白 レセプタ ーの遺 伝子であ る。 かか る遺伝子型を有する も のであれば、 動 物の系統は特に制限さ れな い。
本発明の遺伝子は、 具体的に は、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 [ Zucker, L. . , and Zucker, T. F. (1961) J. Hered. 52. 275 - 278 ) の肺由来の全 R N A を用 い、 ま たプラ イ マ — と して、 前述 したマ ウ ス o b 蛋白 レセ プタ ー c D N A の翻訳 も し く は非翻訳領域に対 して相同性を有す る セ ン ス プラ イ マー及びア ン チプラ イ マ一 〔 Cell 83, 1263 - 12 71 (1995)〕 を使用 して、 逆転写ポ リ メ ラ 一ゼ鎮反応 （ R T 一 P C R ) に よ り 得 られた も のであ る。
ただ し （ ia/fa)ラ ッ ト は上述の よ う に Zucker(fa/fa)ラ
ッ 卜 に 限定 さ れず、 ま た組織 も 肺に 限定 さ れず、 種 々 の 組織、 器官 （ 心臓、 肺、 脾臓、 腎臓、 睾丸、 筋 肉、 脂肪 組織、 脾臓、 小腸、 肝臓等 ） に 由 来す る R N Aを用 い る こ と がで き る。
ま た、 P C R に用 い る プラ イ マ 一 と し て は、 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー の c D N Aに 由 来す る も の であ る 必要 はな く、 本発明 で明 ら か に さ れ た本発明 の遺伝子の配列 情報 に基づ いて適宜設定す る こ と がで き、 ま た こ れ ら は 常法に従い合成す る こ と がで き る。
本発明 の第二番 目 の o b蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子の塩基 配列 は、 前述す る 第一番 目 の遺伝子 と 比較 して、 そ の塩 基番号 8 0 6 位がア デニ ンではな く シ 卜 シ ン であ る 点が 相違 して い る （表現型連関 ヌ ク レオ チ ド変化、 図 4、 図 5 参照 ） 。 こ の部位の ヌ ク レオチ ドの置換 （変異 ） に基 づいて、 （fa /fa) 動物 由来の o b 蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子 の塩基配列 中 に は新 た に制 限酵素 H p a I Iま たは M s p I 認識部位が形成 さ れて いる。 ま た、 こ の ヌ ク レ オ チ ド 変化に よ り、 該 ヌ ク レオ チ ドが形成す る コ ド ン 2 6 9 は. 正常型 （例え ば S D ラ ッ 卜 ） が グルタ ミ ン （ C Λ G ) で あ る の に対 し、 （fa/fa) 型 〔 例え ば（fa/ fa) ラ ッ ト 〕 で は プ ロ リ ン （ C _^ G ) に な っ て し、 る。
こ の よ う に、 本発明 の第二番 目 の o b 蛋 白 レ セ プタ ー
遺伝子は、 肥満形質 （肥満表現型 ： obese phenotype) を 発現す る （fa /fa)動物が有す る特有の 0 b 蛋白 レセプ夕 一 遺伝子であ る。 従っ て、 正常な動物の o b 蛋 白 レ セ プ夕 一遺伝子 との塩基番号 8 0 6 位に おけ る 相違に基づ く、 o b 蛋 白 レセプタ ーのア ミ ノ 酸配列の相違 （ G 1 n 269 -→
P r o 269 ) 力、 該 レセプタ 、の 。 b 蛋白 （ レ プチ ン ） の結合機能を何 らかの形で破壊す る こ と に よ っ て、 動物 の肥満表現型の発現に関連 して いる も の と考え られる。
前述する本発明の第一番 目 及び第二番 目 の o b 蛋白 レ セプタ 一遺伝子は、 本発明 に よ り 開示さ れた配列情報に 基づいて、 化学合成、 遺伝子工学的手法等の常法を用 い て容易 に製造する こ と力 でき る [ Molecular Cloning 2n d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989 ) ; 続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I , I I, III」 、 日 本 生化学会編（ 1986 ) 等参照〕 。
例えば、 本発明の第一番 目 の o b 蛋白 レセ プタ ー遺伝 子については、 前述の方法の他、 ラ ッ ト 等の c D N A ラ ィ ブラ リ 一か ら、 本発明遺伝子に特有の適当 な プロ ー ブ や抗体を用 いて、 所望の ク ロ ー ン を選択す る こ と に よ り 調製する こ とができ る 〔 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 18, 6613 (1981)3 0
プロ ー ブ と して は、 本発明で開示する o b 蛋 白 レセプ
タ ー遺伝子の 配列情報 に基づいて適宜設定す る こ と がで き、 こ れ ら は常法に従い合成す る こ と がで き る 力^ 好適 に は、 後述 の実施例 3 ( 1 ) で示 さ れ る よ う な 〔 α — 3 2 P 〕 c C T P で ラ ベル化 さ れ た ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ 一 c D N A プ ロ ー ブが例示 さ れ る。 c D N A ラ イ ブ ラ リ 一 は、 簡便 に は市販 さ れて い る も の を使用 す る こ と がで き る。
ま た本発明 の第二番 目 の o b 蛋 白 レ セ プタ ー 遺伝子に ついて は、 前述の よ う に、 遺伝子型 と して fa/fa、 即 ち肥 満形質の表現型が ホ モ （ 同型接合体） で あ る 温血動物、 具体的 に は Zucker(f a/fa)ラ ッ 卜、 W i s t a r ( f a / f a )ラ ッ ト 等の全 R N A か ら、 適 当 な プラ イ マ ー を用 いて、 逆転写 ポ リ メ ラ 一 ゼ鎖反応 （ R T — P C R ) に よ り c D N Aを 製造す る 方法が挙げ ら れ る。
こ こ でプラ イ マ 一 は、 実施例 1 に具体的 に示すマ ウ ス 0 b 蛋 白 レ セ プタ 一 c D N A の一部 と 相補的 な 配列を有 す る セ ン ス プラ イ マ ー S 1 及び S 2、 ア ン チセ ン ス プラ イ マ一 A 3 及び A 4 が用 い ら れ る 他、 本発明で開示す る 第二番 目 の o b 蛋 白 レ セ プタ 一 遺伝子の配列情報に基づ いて適宜設定 さ れ、 ま た常法に よ り 合成 さ れ る も の を も 使用す る こ と がで き る。 尚、 P C R増幅 に よ り 得 られた c D N A は、 常法に従 っ て単離、 精製す る こ と が出 来 る。
単離、 精製方法 と して は、 特に制 限 さ れな いが例えばゲ ル電気泳動法等が挙げ られ る。
c D N Aや R N A の調製に用 い られ る組織又は器官は. 本発明の こ れ ら の遺伝子を有す る もので有れば、 特に制 限さ れな い。 具体的に は、 ラ ッ ト の心臓、 肺、 脾臓、 肾 臓、 睪丸、 筋肉、 脂肪組織、 脾臓、 小腸、 肝臓な どが挙 げ られ る。
全 R N A の調製、 m R N A の分離 . 精製、 c D N Aの 取得お よびその ク ロ ーニ ン グはいずれ も常法に従 っ て行 う こ とができ る。
c D N A ラ イ ブラ リ ーか ら本発明の遺伝子をス ク リ ー ニ ン グす る 方法 も ま た常法に従 っ て行う こ とが出来る。 該ス ク リ ーニ ン グ方法 と しては、 目 的の D N A配列に選 択的に結合する プロ ー ブを用 いたプラ ー ク ハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ヨ ン、 コ ロニーハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン等、 及び こ れ ら の組合わせを例示する こ とができ る。
プロ ー ブ と しては、 本発明で開示す る遺伝子配列情報 を も と に して化学合成 され る D N A 配列、 好ま し く は放 射性標識 （例えば、 [ひ 一 32 P ] d C T P ) 等で ラ ベル化 さ れた も のを用 いる こ とができ、 具体的には実施例 3 ( 1 ) で示さ れる も のが例示さ れ る。
上記方法に従 っ て得 られ る本発明の遺伝子、 あ る いは
各種 D N A 断片等の塩基配列の決定 も、 常法に従 っ て行 う こ とが出来る。 例え ば、 ジデォキ シ法 〔 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. 74, 5463 - 5467 ( 1977 )) や、 マキサム ー ギノレノく 一 卜 法 C Method in Enzymology, 65. 499 ( 198 0 )〕 等が挙げ られる。 ま た、 かかる塩基配列の決定は、 市販の シ ー ク ェ ン ス キ ッ ト 等を用 いる こ と に よ り、 簡便 に行う こ とが出来る。
ま た、 本発明 の遺伝子は、 通常の遺伝子組換え技術に よ っ て も製造す る こ とができ る。 ま た、 本発明の遺伝子 を利用する こ と に よ り、 遺伝子組換え技術を用 いて、 0 b 蛋白 レセプタ ー遺伝子生成物、 つま り o b 蛋 白 レセプ タ 一 （蛋白質） を製造 · 取得する こ とが出来る。 かかる 蛋白質の製造は、 本発明の遺伝子を有する発現ベク タ ー を構築 し、 該発現べ ク タ 一 を本発明の遺伝子が発現 し得 る よ う な宿主細胞に導入 して、 該細胞、 即ち形質転換体 を培養する こ と に よ り 行う こ とが出来る。
こ こ で宿主細胞 と しては、 原核生物及び真核生物のい ずれを も使用す る こ とができ る。 該真核生物の細胞には、 脊椎動物、 酵母、 昆虫な どの細胞が含ま れ、 脊椎動物細 胞 と しては、 c o s (サル） 、 C H O (ハム ス タ ー ） 等 が例示 さ れ る。
原核生物の宿主 と しては、 通常大腸菌や枯草菌が用 い
られ る。 こ れ ら を宿主 と して利用す る 場合、 例え ば該宿 主中で複製可能な プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー を用 い、 こ のべ ク 夕 一 中 に本発明 の遣伝子が発現で き る よ う に 該遺伝子の 上流に プ ロ モ ー タ 一及び S D ( シ ャ イ ン · ア ン ド . ダル ガー ノ ） 塩基配列、 更に タ ンパク 合成開始に必要な 開始 コ ド ン （例え ば A T G ) を付与 し た発現 プラ ス ミ ドを利 用す る のが好ま し い。 上記宿主 と し ての大腸菌 と し て は、 ェ シエ リ ヒ ア · コ リ ( Escherichia coli) K 1 2 株な ど力、' 良 く 用 い られ、 ベ ク タ ー と して は一般に p B R 3 2 2 及 びそ の改良べ ク タ 一が良 く 用 い ら れ る 力 、 特に こ れ ら に 限定 さ れず、 公知の各種の菌株お よ びベ ク タ ー を用 いる こ と がで き る。 プ ロ モー タ 一 と し て は、 例え ば ト リ プ 卜 フ ァ ン （ trp)プ ロ モ ー タ 一、 1 p p プ ロ モー タ 一、 1 a c プ ロ モー タ 一、 PL /PRプ ロ モ ー タ 一 等を使用す る こ とが でき る。
真核生物 と して は、 酵母、 特 に サ ッ カ ロ マ イ セ ス属酵 母が一般的 に用 い ら れ る。 該酵母等の真核微生物の発現 ベ ク タ ー と して は、 例え ば酸性ホ ス フ ァ タ一ゼ遣伝子に 対す る プ ロ モ ー タ ー を有す る p A M 8 2 C Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 80. 1 - 5 ( I 983 )〕 等を利用す る こ と が で き る。
脊椎動物の発現べ ク タ 一 と し て は、 通常発現 し よ う と
する遺伝子の上流に位置す る プロ モー タ ー、 R N A の ス プラ イ ス部位、 ポ リ アデニル化部位及び転写終了配列な どを保有す る も のを使用でき、 こ れは更に必要に よ り 複 製起点を有 していて も良い。 該発現ベ ク タ ー の例 と して は、 例え ば、 s V 4 0 の初期プロ モー タ ー有す る p S V 2 dhf r [ Mol. Cell. Biol. , 1 , 854 ( 1981 ) ) 等力、'例示で き る。
か く して得 られ る所望の組換え D N A の宿主細胞への 導入方法及び こ れに よ る 形質転換法は、 当業界で用 い ら れる 各種の手法が用 い られ る。 ま た、 得 られ る形質転換 体は、 常法に従 っ て培養でき、 該培養に よ り 本発明遺伝 子に よ り コ ー ド さ れる o b 蛋白 レセプ夕 一 （蛋白質） が 発現 ， 産生さ れる。 該培養に用 い られる培地 と しては、 採用 す—る 宿主細胞に応 じて慣用 さ れ る各種の も のを適宜 選択利用でき、 そ の培養 も宿主細胞の生育に適 した条件 下で実施でき る。
かか る 方法に よ り 製造 さ れる 0 b 蛋 白 レセプタ ー蛋白 は、 必要に応 じて、 その物理的性質、 化学的性質な どを 利用 し た各種の分離操作 〔 「生化学デー タ ー ブ ッ ク Π」 、 1175 - 1259頁、 第 1 版第 1 刷、 東京同人発行 ； Biochemi s try, 15 ( 25 ), 8274 - 8277 ( 1986 )； Eur. J. Biochem. , 163, 313 - 321 ( 1987 )等参照〕 に よ り 分離、 精製でき る。
力、 く して、 得 られ る 蛋 白質は、 0 b 蛋白 レセ プ夕 一 に対 す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体の作製に、 ま た o b 蛋白 レセプ タ ー測定の標準品 と して有用であ る。
ま た、 本発明 に よ っ て明 らかに さ れた本発明の第一番 目 お よ び第二番 目 の遣伝子の配列情報を基に し、 こ れ ら の遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用する こ と に よ り、 各系統の温血動物、 ま た温血動物の各組織におけ る 本発明遺伝子の発現を検出する こ とができ る。
具体的 には、 本発明の遺伝子の一部又は全部を有する D N A 配列を例えば放射性標識に よ り ラ ベル化 してプロ — ブ と し、 ノ 一ザ ンブ ロ ッ テ ィ ン グ解析 [ Molecular C1 on i ng ： A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring H arbor Laboratory Press (1989)〕 等に よ り 実施する こ と ができ る。
すなわ ち、 本発明の第一番 目 又は第二番 目 の遺伝子は、 その全部又は一部を用 いる こ と に よ り、 本発明の第一番 目 又は第二番 目 の遺伝子を特異的に増幅 Z検出す る こ と ができ る プラ イ マ一 ノブ ロ ー ブ と して有用であ る。
従っ て、 本発明は、 本発明の第一番 目 又は第二番 目 の 遺伝子を特異的に增幅ノ検出する こ とができ る プラ イ マ ー ノプロ ー ブを提供す る も ので も あ る。
ま た、 本発明の第一番 目 の遺伝子は、 その 0 13 ¾白 レ
セ プタ ー遺伝子の変異型を発見、 評価、 検出す る ための 対照 （標準品 ） と して有用であ る。
さ ら に、 本発明 は、 肥満形質を発現す る （f a / i a )温血動 物に 由来す る 本発明の第二番 目 の 0 b 蛋 白 レセ プ夕 一遺 伝子の検出方法を提供する。
本発明の第二番 目 の o b 蛋白 レ セプタ 一遺伝子は、 前 述 した よ う に肥満表現型の温血動物に 由来する 遺伝子で あ り、 そ の塩基配列の一部 （塩基番号 8 0 6 位） が正常 の温血動物の o b 蛋白 レセ プタ ー遺伝子 と 相違する も の であ る。
本発明の方法は、 かかる特定の相違 （変異） を検出す る こ と を特徵 とす る も のであ り、 こ れは、 温血動物の o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子多型の遺伝子診断 と して有用で あ る。 ま た、 こ の検出方法は、 ひいては当該遺伝子を有 す る 肥満表現型 〔 （f a / f a )型〕 の温血動物の検出、 選別方 法等に応用す る こ とができ る。
かかる 方法は、 本発明に よ っ て明 らかに さ れ且つ特徴 付け られた前述の特定の変異を検出す る も のであ る 限 り に お いて、 そ の手法等は特に制限さ れず、 例え ば常法で あ る 各種の方法を広 く 採用す る こ とができ る。 すなわち、 本発明に よ っ て検出すべき遺伝子変異が明 らかに さ れ、 こ れが特定 さ れて いる 以上、 そ の検出のための手法等は
本明細書の開示に従 っ て 当業者に適宜容易 に採用す る こ とができ る。
具体的な検出方法 と しては、 （ 1 ) 前述の特定 さ れた 変異位置の塩基配列を解析す る 方法、 （ 2 ) 変異に よ り 生 じ た物理化学的性質上の差や制限酵素部位の相違を利 用する 方法 （例えば . 本発明にかか る変異部位を含む適 当 な D N A試料におけ る ゲル電気泳動やキ ヤ ピラ リ ー電 気泳動等の各種電気泳動手段等に お いて、 挙動の差を利 用する方法） 、 （ 3 ) 本発明 にかか る変異の検出 に適当 な検出用 プロ ーブを利用す る 方法等、 及び （ 4 ) こ れ ら の組み合わせに よ る 方法等が例示 さ れる。
本発明 においては . 特に変異に よ っ て o b 蛋白 レセプ タ ー遺伝子の塩基配列に新たに制限酵素認識部位 （例え ば、 H p a I Iま たは M s p I 認識部位等） が形成さ れる こ とか ら、 好適に は . 制限酵素サイ ト の相違を利用する 方法が用い られる。 具体的 に は、 ラ ッ 卜 の適当 な組織の R N Aか ら R T - P C R を用 いて c D N A を ク ロ ーニ ン グ、 増幅 して、 得 られた P C R生成物を制限酵素 H ρ a I Iま たは M s p I で消化 し、 該消化物を電気泳動に よ り 分画 し、 分画さ れた D N A のノ ン ドをェチ ジ ゥ ム ブ ロ マ ィ ド等で直接検出する力、、 又は適当 なプロ一ブを用 いて 検出す る方法が挙げ られ る。
な お、 P C R で用 い られ る プラ イ マ 一 と して は、 前述 した も のが例示 さ れ る。
ま た こ こ で、 用 い ら れ る検出用 プロ ー ブは、 被検 D N A試料 と のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン に お いて、 採用する 検出条件下で検出可能な程度の特異性を与え る も のであ れば、 特に制限 さ れな い。
上記検出方法 と して、 よ り 具体的 に は、 例え ばサザ ン ハィ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン法及び ド ッ 卜 ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン法 〔 J, Mol. Biol. , 9i, 503 - 517 (1975)等〕 や、 P C R ( Polymerase chain reaction)— R F L P 法 （ Re striction fragment length polymorphism ： 制限酵素断 片長多型分析法） 、 ？ 〇 1 — 3 3 じ ？ 法 〔 $^815 5 311 d conformation olymorphism ： 短鎖 ¾ι次構造多型分析法. Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 86. 2766 -2770 ( 1989)等〕 、 P C R ― S S 0法 ( Specific sequence ol igonucleotid e : 特異的配列オ リ ゴヌ ク レオチ ド法） 、 P C R — S S O 法 と ド ッ ト ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン法 と を用 い る対立遣 伝子特異的ォ リ ゴ ヌ ク レオチ ド法 〔 A S 0 ： allele spe cific oligomer； Nature, 324, 163 - 166 ( 1986 )等〕 と い つ た D N A 増幅手法 と の組み合わせに よ る 方法及びこ れ らの方法の組み合わせ等を例示する こ とが出来る。 中で も P C R法を組み合わせて利用する 方法は、 少量の D N
A試料を利用 して簡便且つ容易 に しか も感度及び精度の 高い検出が可能であ る 点で、 よ り 好ま し い も のであ る。
簡便性の面か ら は、 R F L P 法を利用 した検出手段力く 好ま し い。 以下、 こ の検出法を例 と して よ り 詳細に説明 する。
尚、 上記検出法にお いて、 採用 さ れ得 る 各種の操作、 例えば一部 D N A の化学合成、 D N A の切断、 削除、 付 加乃至結合を 目 的 とする 酵素処理、 D N A の単離、 精製、 複製、 選択な どはいずれ も 常法に従 う こ とが出来る 〔分 子遺伝学実験法、 共立出版 （株） 1983年発行 ； P C R テ ク ノ ロ ジー、 宝酒造 （株） 1990年発行等〕 。 例え ば、 D N Aの単離精製は、 ァ ガロ ー ス ゲル電気泳動法等に従う こ とができ、 D N A 配列の決定は、 例えばジデォキ シ法 ( Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463-5467 ( 1977 )3 やマキサム 一 ギノレノくー ド法 [ Method in Enzymology, 6 , 499 - 560 ( 1980)〕 等に従う こ とができ る。 D N A塩基配 列の決定は、 市販の シ ー ク ェ ン ス キ ッ 卜 な どを用 いる こ と に よ っ て容易 に行う こ とができ る。 D N A の特定領域 の増幅のための P C R法 も ま た常法 〔例えば、 Science, 210, 1350 - 1354 ( 1985 )等〕 に従う こ とができ る。 こ れ ら各種の基本的操作は例えば本明細書で引用す る 文献に お いて も採用 さ れてお り、 後述の実施例 と と も に こ れ ら
の各文献が参照 さ れ る。
本発明 の遺伝子の検出 に お いて、 測定対象であ る ゲ ノ 厶 D N A は、 温血動物 由 来の サ ン プルであ り、 こ れを含 む も の で あれば特 に 制限 さ れ な い。 例え ば、 血液、 骨髄 液、 精液、 腹腔液、 尿な どの体液 ； 肝臓等の組織細胞 ； 体毛な どを利用す る こ と がで き る。 ゲ ノ ム D N A は、 こ れ ら サ ン プル よ り 常法に従 っ て 抽 出、 精製 し、 調製す る こ と がで き る。
該ゲ ノ ム D N A よ り、 本発明 にかか る 変異部位を含む D N A領域を増幅 し、 多量に且つ濃縮 さ れた被検体を得 る こ と も で き る。 測定対象 と して は、 こ の変異部位を含 む D N A領域を増幅 し た も のが特に好 ま し い。 こ れは、 例え ば本発明 の遺伝子の変異部位 （塩基番号 8 0 6 位） を含む領域を特異 的 に増幅す る よ う に適宜設定 し た ブラ イ マ一を採用 して、 P C R法に従い増幅す る こ と がで き る。 かか る プラ イ マ一の設定は、 常法に従 っ て行 う こ と が 出来 る。 増幅す る 領域の塩基の長 さ 等 に も 特 に制 限は な く、 通常 l O O b p カヽ ら 2 0 0 0 b p 程度 と す る こ と 力 出来 る。
かか る プラ イ マ一設定の好適な 一例 と して は、 セ ン ス プラ イ マ一 ： 5 ' - A A T C A C A T C T G C T G G T G T G A G — 3 ' ( ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A
塩基配列 6 3 9 位力、 ら 6 5 9 位 ） 、 ア ン チセ ン ス プラ イ マ ー ： 5 ' - C C A G T C A C T C C A G A C T C C T G - 3 * ( ラ ッ 卜 o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A塩基配列 9 6 0 位力、 ら 9 1 位の 配列 に 対す る 相補的配列 ） 等力く 挙げ ら れ る。 かか る プラ イ マ 一 に よ れば、 本発明の遺伝 子を含む特定の長 さ の増幅 さ れ た D N A フ ラ グメ ン 卜 と し て上記所望の被検体を提供す る こ と がで き る。
上記の よ う に して P C R 法に従い増幅 さ れ た所望の D N A領域は、 制 限酵素 （ 例え ば H p a I Iま た は M s p I 等） に よ り 消化 さ れ、 生成 し た切断断片 は電気泳動 に よ り 特定バ ン ド と して確認 さ れ る。
こ の よ う に して得 られ たバ ン ドのパタ ー ン に よ り、 o b 蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子の変異体 （本発明 に お け る 第二 番 目 の o b 蛋 白 レ セ プタ ー 遺伝子 ） を検出す る こ と が出 来る。
ま た こ の変異遺伝子の検出 方法は、 肥満形質を発現す る 温血動物 〔 （ fa/fa) 型動物 〕 の遺伝子診断法 と して有 用 であ る。
即 ち、 こ の検出方法は、 当 該変異遺伝子を有 し肥満形 質を発現す る （fa/fa)型の 温血動物を迅速 に検出、 選別す る 方法 と し て応用す る こ と がで き る。 ま た、 こ の こ と は 肥満症 に つ いて の 自 然発症モ デル動物 （ 疾患モ デル動物、
例えばラ ッ 卜 等） を、 遺伝子的に安定にかつ確実に供給 でき る 効果につながる。
通常、 肥満疾患モ デル動物は、 そ の ホ モ接合体 （ fa/ f a ) は生殖能力がな いため、 f a 遺伝子を も つヘテ ロ接合 体同士を掛け合わせて 〔 （fa/Fa) X (fa/Fa)〕 、 得 られた も のの 中力、 ら、 約 1 Z 4 の割合で生 じ る （fa/fa)遺伝子を 有する も のを選別 しな く てはな ら な い力、 従来は特にそ の選別手段がなか っ たため、 実験モデル動物供給業者が 同腹子 と一緒に飼育 して、 その 中で特別 に肥満 した もの を あ る 時点 （約 1 2 週令） で選別 し、 提供す る 形態が採 られて き て いる。 しか し、 こ れでは、 離乳後の環境要因 等の後天的な影響を受け、 遺伝的 に安定 した疾患モデル 又は厳密な動物実験系を提供す る には不適当であ る。 即 ち、 Russelと Burchらの演出型説 （ 1959年） に鑑みれば、 遣伝的異常に基づ く 疾患モデル動物を安定に提供す る た め には、 環境要因 （発生環境、 近隣環境） の影響が入 ら ぬ よ う 環境的背景を充分コ ン ト ロ ー ルす る必要があ るで あ ろ う。
本発明 に よれば、 0 b 蛋 白 レセ プタ ー遺伝子に変異が あ る ため に肥満 して し ま う 実験モデル動物を、 環境的要 因が加わ る 前、 すなわ ち 出生後にす ぐ に選別でき、 遺伝 的疾患モデル （肥満モデル） と して厳密な動物実験系の
動物 （例えば、 ラ ッ ト ） を提供す る こ とができ る。 ま た、 従来は （ f aバ a ) 動物を 1 匹創 出す る ため に は、 確率的 に 不要な 3 匹の動物を約 1 2 週ま で飼育せねばな ら な いの に対 して、 本発明 はそ の よ う な飼育をす る 必要がな いた め実験動物供給者の動物飼育に伴う コ ス ト を削減でき る 点で も有用であ る。 さ ら に、 研究面において も、 誕生直 後の （ f a / f a )動物 （例えば、 ラ ッ 卜 等） の入手が可能 と な り、 従来の方法では不可能であ っ た誕生直後か ら肥満発 症ま での病態及び生理的解析が可能 と な る 点で極めて有 用であ る。
さ ら に ま た、 厳密な動物実験系の動物を提供す る ため には、 特定の遺伝形質を有 した疾患モデル動物カ 、 その 生育 · 生産及び供給の課程に お いて、 当初 も っ て いた遺 伝的均一性や特性を維持 して いる かを客観的に監視する こ と も重要であ る。 従っ て、 本発明で開示す る 方法は、 かかる疾患モデル動物の遺伝的モニ タ リ ン グに も有用で あ る。
尚、 こ のよ う な遺伝子検出 /診断に際 しては、 本発明 に関する変異の存在を検出す る ための試薬を有効成分 と して含有す る 診断剤を利用する のが好ま し い。
かか る観点か ら、 本発明 は（ f a / f a )型の温血動物由来 o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子の検出用診断剤を も 提供する も
のであ る。
かか る 診断剤 に は、 本発明の （f a / f a )型温血動物由来の 0 b 蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子の存在を検出す る ための方法 に応 じた特異的試薬が必須成分 と して含有さ れ る。 かか る 特異的試薬は、 採用す る検出方法に従い、 適宜選択設 定 さ れ構成さ れ る 力 例え ば、 前述の検出用 プロ ー ブと しての D N A 断片及び Z又は特定の制限酵素 （例えば、 H p a I I ま たは M s p i等） 等の本発明 にかか る 変異を 特異的に検出する ための手段に必要な試薬を含有す る も の と して特徴づけ られ る。
ま た、 本発明で開示す る変異に関す る領域を特異的に P C R増幅する ための試薬、 例えばそ の ために設定され たプラ イ マ一等 も、 例えばハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ンのた めの試薬類 と 同様に、 本発明の診断剤に含ま せ る こ とが で き る。
なお、 本発明は前述する よ う に、 温血動物の肥満に関 連す る遣伝子及び正常な動物を肥満に導 く 遺伝子の変異 に関す る有用 な情報を提供す る も のであ り、 かかる 本発 明は、 実験動物に限 らず、 温血動物一般の肥満化方法並 びに肥満形質を有する 温血動物の提供につなが る も ので あ る。
図面の簡単な説明
図 1 は、 ラ ッ 卜 o b 蛋 白 レ セ プ夕 一 c D N A の ク ロ ー ニ ン グ ' ス ト ラ テ ジ ー を示すス キ ー ムであ る。 なお、 図 中、 黒枠はマ ウ ス 0 b 蛋 白 レセプタ ー c D N A の翻訳領 域 ( coding region of mouse OB - R cDNA)を、 太線は 5 ' 側 と 3 ' 側の非翻訳領域を意味す る。 矢印は R T — P C R に使用 したプラ イ マー の相同領域を示す。 S 1 及び S 2 は、 それぞれマ ウ ス o b 蛋 白 レセプ夕 一 c D N A の非 翻訳領域及び翻訳領域 と相同性を有す る セ ン ス プラ イ マ —であ り、 A 3 及び A 4 は、 それぞれマ ウ ス o b 蛋白 レ セプタ 一 c D N A の翻訳領域及び非翻訳領域 と相同性を 有する ア ンチセ ン ス プラ イ マ 一 であ る。
図 2 は、 S D ラ ッ ト （SD rat)お よび B A L B Z c マ ウ ス（BALB/c mouse)の肺由来の全 R N A の R T - P C R生 成物の電気泳動パタ ー ンを示す図面に代わ る 写真であ る ( 矢印は、 ゲルか ら単離さ れ、 p U C 1 9 の H i n c 11消 ィ匕物に ク ロ ー ン さ れた、 増幅さ れた o b 蛋白 レセ プ夕 一 c D N A (約 1. 3 k b 及び 1. 6 k b ) を示す。 尚、 図 中 「 MarkerJ は、 分子量の ス タ ン ダー ド標品を電気泳 動 した レー ンを示す。 ま た、 図 中 「 S 1 — A 3 」 はブラ イ マ一 と して S 1 一 A 3 を用 いた R T — P C R 生成物の 電気泳動の レ ー ン を、 「 S 2 — A 4 」 はプラ イ マー と し
て S 2 — A 4 を用 い た R T — P C R 生成物の電気泳動の レ ー ン を示す。
図 3 は、 S D ラ ッ ト 由来の o b 蛋 白 レ セ プ夕 一 c D N A の塩基配列 （上段） 及びそ れか ら 演繹 さ れ る ア ミ ノ 酸 配列 （下段） を示す図 であ る。 塩基番号は、 翻訳開始 コ ド ン 中の ア デニ ン を + 1 と し、 ま た ア ミ ノ 酸番号は、 翻 訳開始 コ ド ン に よ っ て コ ー ド さ れ る メ チォニ ン を + 1 と し て表 し た。 塩基配列 中、 大文字 は、 マ ウ ス 由 来の 0 b 蛋 白 レ セ プタ 一 c D N A と は異な る ヌ ク レオ チ ドを意味 す る。 ▲ は、 推定 さ れ る シ グナルぺプチ ダー ゼに よ る 切 断部位を示す。 太線の下線領域は、 推定 さ れ る 膜貫通 ド メ イ ン を示す。 二つの T r p — S e r — X ( A s p 又は A s n ) 一 T r p — S e r モ チー フ は細 い下線で示す。 黒枠で囲む 「 cag/Gln」 は、 Zucker ( f a / f a )ラ ッ 卜 と相違 す る コ ド ン 2 6 9 位を示す。
図 4 は、 o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の塩基番号 7 6 3 位か ら 8 3 7 位 （ ア ミ ノ 酸番号 2 5 5 位カヽ ら 2 7 9 位） の領域につ いて、 S D ラ ッ 卜 の ヌ ク レ オ チ ド配列 （上） と 推定 ア ミ ノ 酸配列 （ 下 ） につ いて、 マ ウ ス の も の と ヒ 卜 の も の と を 比較 し た 図で あ る 〔 上段 ： マ ウ ス （ 図 中 rao useと 表記） 、 中段 ： S D ラ ッ ト （ 図 中 ratと 表記） 、 下 段 ： ヒ ト （ 図 中 humanと 表記 ） 〕 。 マ ウ ス と ヒ ト の配列 は.
S D ラ ッ 卜 と異な る 配列のみを記載 した。 黒枠は、 Zuck er(fa/fa)ラ ッ 卜 で変化 し た配列を示す。
図 5 は、 S D ラ ッ 卜 （図中、 SD ratと表記） と Zucker (fa/fa)ラ ッ 卜 （図 中、 fa/fa ratと 表記） の o b 蛋白 レ セプタ ー c D N A の相違領域の ヌ ク レオチ ド配列 と推定 さ れる ア ミ ノ 酸配列を示す図であ る。 相違す る ヌ ク レオ チ ド及びァ ミ ノ 酸を太字で示す。 Zucker(fa/fa)ラ ッ ト に お いて新たに 出来た制限酵素 H p a I I部位を ラ イ ンで示 す。
図 6 は、 種 々 系統の ラ ッ 卜 〔 S D ラ ッ ト、 Zucker(fa/ ia)ラ ッ ト、 Wistar(ia/fa)ラ ッ ト 〕 の肺 R N A の R T — P C R 生成物を H p a I I消化後、 電気泳動に供 した電気 泳動パタ ー ン を示す図面に代わ る 写真であ る。 矢印は、 制限酵素 H p a I Iの消化に よ り 切断さ れなか っ た R T — P C R 生成物 （約 6 0 0 b p ) 及び切断さ れた R T — P C R生成物 （約 4 3 0 b p 及び 1 7 0 b p ) を示す。 尚、 図中、 no digestionと は未消ィ匕物を、 Hpa I I digestion は制限酵素 H p a I Iに よ る 消化物を意味する。 ま た、 1 e an 1 i t termate of Zucker(ia/fa)と は、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子を、 lean litterinate of Wistar (fa/fa)と は、 Wistar(fa/ia)ラ ッ ト の同腹子を意味す る。
図 7 は、 種 々 系統の ラ ッ 卜 〔 レ ー ン左側力ヽ ら、 Zucker
(fa /fa)ラ ッ ト、 同腹子 N o . 1、 同腹子 N o . 2、 同腹 子 N o . 3、 同腹子 N o . 4、 ff istarラ ッ 卜、 S D ラ ッ 卜 〕 の染色体 D N A の各種制 限酵素に よ る 消化物を電気 泳動 し た後、 ラ ッ 卜 o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A フ ラ グ メ ン ト を プ ロ ー ブ と し て ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン し た結果を示す図 面に代わ る 写真であ る。
な お、 消化 に使用 さ れ た 制 限酵素は、 E c o R I ( 図 A ) 、 H i n d m ( 図 B ) 、 B a m H I ( 図 C ) 及び P s t I ( 図 D ) であ る。
図 8 に お （^て A (ま Zucker(fa/fa)ラ ッ ト の種 々 の組織で の o b 蛋 白 レセ プタ ー m R N A の発現 レ ベル、 具体的 に は、 Zucker(fa/fa)ラ ッ ト の 同腹子 N o . 4 の さ ま ざ ま な 組織か ら 単離 し た全 R N A ( 1 3 μ g ) を電気泳動 し、 ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A プ ロ ー ブでをハイ ブ リ ダィ ズ した膜のェチ ジ ゥ ム ブ ロ ミ ド蛍光をォ 一 ト ラ ジォ グ ラ ムで示す図面に代わ る 写真であ る。 尚、 左 レ ー ンカヽ ら、 脳（brain)、 心臓（heart)、 肺（lung)、 月卑臓（spl een)、 腎臓（kidney)、 睪丸（testis), 筋 肉 （ mu s c 1 e )、 脂 肪組織 (adipose tissue)、 脾臓 (pancreas)、 小腸 (smal l intestine), 肝臓（ 1 i ver )を意味す る。
ま た、 図 8 中 B は、 種 々 系統の ラ ッ ト の脳及び肺での o b 蛋 白 レ セ プ タ ー m R N A の発現 レ ベル、 具体的 に は、
S D ラ ッ 卜、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 及び Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 ( lean littermate) N o . 4 の脳 （brain)と 肺 （lung)に 由来す る 全 R N A を 同様 に 電気泳動 し、 ハイ ブ リ ダィ ズ し た結果を示す図面に代わ る 写真であ る。 発明 を実施す る ため の最良 の形態
以下、 本発明 の実施例を具体的 に説明す る 力 本発明 は こ れ ら に 限定 さ れ る も の では な い。
実施例 1
ラ ッ ト 由来の o b蛋白 レセプタ ー c D N Aの ク ロ ーニ ン グ
S D ( Sprangue-Dawley)ラ ッ 卜 （雄、 日 本 S L C株式 会社） 、 Z u c k e r (fa/fa)ラ ッ ト （雄， Kiwa Labora tory Animals Co. , Ltd)及び B A L A , c マ ウ ス （雄、 日 本 S L C 株式会社 ） の肺に 由来す る 全 R N A を用 いて、 R T — P C R法を利用 して、 こ れ ら の o b 蛋 白 レ セ プ夕 — c D N A を ク ロ ー ニ ン グ し た。
( 1 ) 全 R N A の 調製
ラ ッ 卜 の肺組織を、 4. 4 M グァ ニ ジ ン . チオ シ ァ ネ ー ト、 0. 1 M /S — メ ノレカ プ ト ェ タ ノ 一 ノレ及び 2 5 m M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム を含む溶液 （ P H 7 ) 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し、 続 いて 5. 7 M C s C 1 を添力！] し て遠心
( 140, 000 x g, 1 0 2 0 分間 ） す る こ と に よ り、 全 R N A を調製 し た ( Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Mania tis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manu a 1 , 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press ； Ullrich, A. , Shine, J. , Chirgwin. J. , Pictet, R. ,
Tischer, E. , Rutter, . J. , and Goodman, H. M. (1977)
Science 19_6. 1313-1319) 0
( 2 ) R T — P C R を用 いた ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の ク ロ ー ニ ン グ
( i ) c D N A の調製
( 1 ) で調製 し た各種 ラ ッ 卜 の肺 由 来の全 R N A を用 いて、 逆転写 ポ リ メ ラ ー ゼ鎖反応を行い、 c D N A を調 製 し た。
具体的 に は、 ま ず （ 1 ) で調製 し た全 R N A ( 1 0 g ) を逆転写用 の反応混液 （ 1 0 ^ I : 5 0 m M ト リ ス （ p H 8. 3 ) 、 5 0 m M K C 8 m M M g C 1 2、 5 m M ジ チ オ ス レ ィ ト ー ル、 各 d N T P を 2 0 m Mずつ、 R N a s e 阻害剤 を 5 0 ュニ ッ 卜 〔 プ ロ メ ガ . コ―ポ レ一シ ョ ン (Promega Corporation)、 マ ジ ソ ン (Ma dison)、 ウ ィ ス コ ン シ ン州 （Wiscon)、 U S A. 〕 、 オ リ ゴ （ d T ) 1 7 5 0 p m o 1、 及びア ビア ン · ミ エ ロ ブ ラ ス ト シ ス · ヴ ア イ ラ ス 一 リ バ一 ス ' ト ラ ン ス ク リ プタ
f X L 1 7 ュニ ッ 卜 [ avian myeloblastosis virus
-reverse transcriptase XL : ラ イ フ サ イ エ ン ス 社 (Life Science inc. , )製 〕 中で 4 2 °C、 2 時間 イ ン キ ュ べ 一 シ ヨ ン し た。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン後、 力、力、 る 混液を 9 8 °C で 1 0 分間加熱 し て、 反応を停止 し て、 c D N A を調製 し た。
( i i ) c D N A の増幅 （ P C R 法）
つ いで、 得 ら れた c D N A を増幅 さ せ る ため に、 上記 の逆転写反応混液 （ 1 μ 1 ) 、 各 2 0 O Mの d N T P s ( デォキ シ ヌ ク レオ シ ド ホ ス フ エ 一 卜 ） 0. 5 ュニ ッ 卜 の Perfect Match® PCR Enhancer 〔 ス ト ラ 夕 ジ 一 ン . ク ロ ー ニ ン グ ' シ ス テ ム ズ社 ( Stratagene Cloning Sys tems)製 〕 、 2 . 5 ユニ ッ ト の Ta aRa LA Taq DNA ポ リ メ ラ ー ゼ （ タ カ ラ 酒造株式会社製 ） 及び各ア ン チセ ン ス . キナ ーゼ ' プラ イ マ 一 を 1 7 p m o l 含む反応液 （ 5 0 I ) を用 いて、 ポ リ メ ラ ー ゼ鎖反応 （ P C R ) を行 つ た。
プ ラ イ マー と して、 2 セ ッ ト の プラ イ マ ー、 S 1 — A 3 ( セ ン ス プラ イ マ ー S I と ア ン チ セ ン ス プラ イ マ ー A 3 力、 ら な る ） 及び S 2 — A 4 ( セ ン ス プ ラ イ マ 一 S 2 と ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ 一 A 4 か ら な る ） を使用 して、 p C R を行 っ た。
プラ イ マ ー S 1 と A 4 は、 マ ウ ス o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の 5 ' 又 は 3 ' 側の非翻訳領域に 特異的であ り、 S 2 と A 3 は そ の翻訳領域 に特異的であ る （ 図 1 参 照 ） 。 セ ン ス プラ イ マ 一 S 1 は 3 0 塩基の長 さ であ り、 翻訳開始部位で あ る ア デニ ンか ら、 — 3 0 か ら 一 1 の残 基、 G C A A A T C C A G G T G T A C A C C T C T G A A G A A A G カヽ ら 構成 さ れて い る。 セ ン ス プラ イ マ ー S 2 は 3 0 塩基の長 さ であ り、 塩基番号 1 1 3 9 力、 ら 1 1 6 8 の残基、 G C A T T G T G A G T G A C C G A G T T A G C A A A G T T Aか ら構成 さ れて い る。 ア ン チ セ ン ス プラ イ マ ー A 3 は 3 0 塩基長 さ であ り、 塩基番号 1 2 4 2 か ら 1 2 1 3 残基、 C T G C T C A T T G C A G C A G T A C A C T G C G T C A T Aカヽ ら構成 さ れて い る。 ア ン チセ ン ス プラ イ マー A 4 は、 3 0 塩基長 さ で あ り、 塩基番号 2 7 1 6 か ら 2 6 8 7 残基、 T T G G G T T C A T C T G T A G T G G T C A T G A G A G A C
か ら構成 さ れて い る。
P C R は、 G e n e A m p ® P C R シ ス テ ム 9 6 0 0 〔 ノ、° — キ ン エ ノレマ 一 · コ ー ポ レ 一 シ ョ ン （ Perkin-Elmer Corp. , )製 〕 を用 いて、 9 6 °Cで 4 0 秒間、 6 5 °Cで 4 0 秒間、 7 2 °Cで 1 0 0 秒間 の反応を 3 5 サ イ ク ル実施 す る こ と に よ り 行 っ た。
実施例 2
ラ ッ ト 由来の o b蛋白 レセプタ ー c D N Aの塩基配列の 解析
( 1 ) S D ラ ッ ト 由 来の o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の 塩基配列
実施例 1 で得 ら れ た P C R生成物を ァ ガ ロ ー ス ゲル中 で電気泳動 にか け て分画 し た。 図 2 に、 S D ラ ッ ト お よ び B A L B Z c マ ウ ス の 0 b 蛋 白 レ セ プタ 一 c D N A の P C R生成物の電気泳動ノヽ0夕一 ン を示す。
該ゲルか ら、 S U P R E C T M ( タ 力 ラ 酒造株式会社製） を用 い る こ と に よ り、 約 1. 3 キ ロ ベー ス （ k b ) の P C R生成物 （ S 1 — A 3 ) 及び約 1 6 k b の P C R生 成物 （ S 2 — A 4 ) を単離 して、 それを プラ ス ミ ド p U C 1 9 の H i n c II消化物の 中 に ク ロ ー ン し た。
次いで、 S D ラ ッ ト 由来の 0 b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の塩基配列を、 該べ ク タ ー も し く は ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A配列 に 相 同性の あ る 合成オ リ ゴ ヌ ク レ ォ チ ド · プラ イ マ 一 〔 p U C 1 9 の ク ロ ー ニ ン グサイ 卜 に 隣接 し た R V — M、 M 1 3 - 2 0 ( 夕 カ ラ 酒造株式会 社製） を用 いて、 プラ イ マ ー ェ ク ス テ ン シ ョ ン に よ っ て 塩基配列 を決定 して常法に よ り 調製 し た も の。 〕 を用 い
て、 A B I 3 7 3 A 自 動 D N A シ ー ク ェ ン シ ン グ ' シ ス テ ム （パー キ ン一エルマ一株式会社 ） に よ り、 ジ デォキ シ ヌ ク レ オ チ ドチ ェ イ ン · タ 一 ミ ネ ー シ ョ ン法で決定 し た [ Sanger, F. , Nicklen, S.， and Coulson, A. R. (19 77) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74. 5463-5467 ； Adam s， M. D. , Fields, C. , Venter, J. (1994) Automat ed D A Sequencing and Analysis, Academic Press, Lo nd on o
結果を 図 3 に 示す。 な お、 配列 中 の下段は得 ら れ た塩 基配列力、 ら 演繹 さ れ る S D ラ ッ 卜 の o b 蛋 白 レ セ プ夕 一 の ア ミ ノ 酸配列 を示す。 か力、 る 配列か ら、 g p 1 3 0 の よ う なサ イ ト カ イ ン レ セ プタ 一 · ク ラ ス I の 中で保存 さ れて い る T r p - S e r - X - T r ρ - S e r モチ ー フ の二つの コ ピー力 ラ ッ ト o b 蛋 白 レセ プタ ー c D N A 中 に存在 して い る こ と が分か っ た （ 図 3、 細 い下線領域） 。
塩基配列 中、 塩基番号 7 6 3 位か ら 8 3 7 位の領域 ( ア ミ ノ 酸番号 2 6 3 位力、 ら 2 7 7 位） につ いて、 S D ラ ッ ト、 マ ウ ス及び ヒ 卜 の 間で比較 し た結果を 図 4 に示 す。 図 4 カヽ ら 分力、 る よ う に、 かか る 領域 に お いて、 塩基 配列及びア ミ ノ 酸配列 の 両者が と も に 良 く 保存 さ れて い た。
( 2 ) Zucker(fa/fa)ラ ッ ト 由来の o b 蛋 白 レ セ プ夕 一 c
D N A の塩基配列
( 1 ) と 同様 に して、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 由 来の ◦ b 蛋 白 レ セ プ夕 一 c D N A を P C R で増幅 し、 そ の塩基配 列 を決定 し た。 そ の結果、 塩基番号 8 0 6 位がア デニ ン で はな く シ ト シ ン であ る 点を 除 いて は、 すべて 図 3 で示 す S D ラ ッ ト 由来の o b 蛋 白 レ セ プタ 一 c D N A の塩基 配列 と 同一であ つ た。 塩基配列 に お いて、 8 0 6 位の ヌ ク レ オ チ ド変化す る こ と に よ り、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 由 来の c D N A配列 に お いて、 新 た に制 限酵素 H p a I Iが 形成 さ れ （ 図 5 ) 、 ま た こ の変化 に よ り 該 ヌ ク レ オチ ド に対応す る コ ド ン 2 6 9 は、 S D ラ ッ 卜 が グルタ ミ ンで あ る の に対 し、 Zucker(f a/f a)ラ ッ 卜 では、 プロ リ ン に な つ て いた （ 図 5 ) 。
( 3 ) ラ ッ 卜 o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の制 限酵素 H p a I I消化に よ る 解析
( 2 )で示 し た ヌ ク レ オチ ドの変化が、 実際に 存在 して い る のか否かを確認す る ため に、 種 々 の株に 由 来す る ラ ッ ト し S D ラ ッ 卜、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜、 Zucker(fa/f a)ラ ッ ト の 同腹子 （ N o . 1 〜 4 ) 、 Wistarラ ッ ト、 Wis tar(fa/fa)ラ ッ 卜、 Wistar(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 ( o 1 〜 4 ) ] の肺の R N A s につ いて プラ イ マ ー S 1 5 及 び A 3 を使用 して、 実施例 1 ( 1 ) で行 っ た方法 に 従 つ
て R T — P C R を行 っ た。
セ ン ス プラ イ マ 一 S 1 5 は 2 1 塩基の長 さ で、 ラ ッ ト 0 b 蛋 白 レセプタ ー c D N A の 6 3 9 残基か ら 6 5 9 残 基ま での配列に特異的な ヌ ク レ オチ ド配列、 A A T C A C A T C T G C T G G T G T G A G を有す る。 P C R は、 9 6 °Cで 3 0 秒、 5 7 °Cで 3 0 秒、 お よ び 7 2 °Cで 6 0 秒の反応を 3 0 サイ ク ル実施す る こ と に よ り 行 っ た。 P C R後、 得 られた生成物を、 順次 フ ヱ ノ ー ル Z ク ロ ロ ホ ル ム抽 出 お よ びエタ ノ ール沈殿に供 した。 該サ ンプルを 制限酵素 H p a I Iも し く は M s p I で消化 し、 ァガ口 一 スゲルの電気泳動にかけて分画 した。
も し、 得 られた R T — P C R 生成物 （約 6 0 0 b p ) 、 8 0 6 位付近に H p a l l切断部位を含んでいる な ら ば、 H p a 11消化の結果 と して約 4 3 0 b 及び 1 7 0 b p の切断さ れた フ ラ グメ ン 卜 が生成する こ とが期待 され る。
結果を図 6 に示す。 Zucker(f a/f a)ラ ッ ト及び Wistar (fa/fa)ラ ッ ト 由来の R T — P C R生成物はほ とん ど完全 に H p a I I消化に よ り 断片化さ れた。 S D ラ ッ ト 由来の R T 一 P C R 生成物及び Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 N 0. 1 は H p a I I消化に抵抗性を示 した。 他の Zucker(;f a/fa)ラ ッ ト 及び Wistar(fa/fa)ラ ッ 卜 の同腹子由来の R
4 I
T 一 P C R 生成物は、 H p a I I消化 に よ り 部分的 に 断片 化 さ れ た。 ま た、 制限酵素 H p a I Iと 同 じ配列 を認識す る M s p I で消化す る こ と に よ つ て も、 同 じ結果が得 ら れた。
こ れ ら の結果は、 f a/ faラ ッ 卜 の 8 0 6 位の ヌ ク レオ チ ド は シ ト シ ン であ り、 ア デニ ン でな い こ と を示 して い る。 ま た、 こ の変化に よ り 塩基番号 8 0 6 位付近に 制限 酵素 H p a l lも し く は M s p I の認識部位が形成 さ れ る こ と が明 らか に な つ た。
さ ら に こ れ ら の結果は、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 N o. 1 の遺伝子型 ( genotype) は ホモ Fa/Fa [ S巴満形 質 （優性形質） の 同型接合体 ] で あ り、 Zucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の他の 同腹子及び Wistar(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子の遺 伝子型がヘテ ロ Fa/fa [ 非肥満形質 と 肥満形質 （劣性形質 ） の異型接合体 ] であ る こ と を示唆 し て い る。 実施例 3
ラ ッ ト o b蛋白 レセプタ ー c D N Aフ ラ グメ ン ト の D N A分析及び R N A分析プロ ーブと しての利用
( 1 ) ラ ベル化プ ロ ー ブの調製
実施例 2 ( 1 ) で調製 し た プラ ス ミ ドベ ク タ ー 力、 ら ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A フ ラ グメ ン ト （ S 1 と
A 3、 S 2 と A 4 か ら作製 し た も の を 同量混ぜて用 いた ） を切断 し て、 〔 a — P 32〕 d C T P を用 いて、 常法に従 つ て放射性標識化を行い、 ラ ベル化プ ロ ー ブを 調製 し た C Anal. Biocheni. , U2, 6 - 13 ( 1983 ) ; Molecular cloni ng： A Laboratory Manua 1 , 2nd ed.， Cold Spring Har b or Laboratory Press, 〕 0
( 2 ) 数種系統の ラ ッ 卜 染色体 D N A の ブ ロ ッ 卜 ノヽ イ ブ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン
Wistarラ ッ ト、 S D ラ ッ 卜、 Zucker(fa/fa)ラ ッ ト 及び そ の 同腹子を含む種 々 の系統の ラ ッ 卜 の染色体 D N A を 用 い た。 D N A は こ れ ら の ラ ッ 卜 の肝臓力ヽ ら、 プ ロ テナ ー ゼ K 消化、 フ ヱ ノ ー ル Zク ロ 口 ホ ルム抽 出 お よ びエ タ ノ ー ル沈殿を逐次 （連続的 に ） 行 う こ と に よ り 抽 出 し た C Nucleic Acids Res. 3， 2303- 2308 ( 1976 )〕 0
得 ら れ た D N A ( 5 g ) を E c o R I、 H i n d I I I、 B a m H I 又 は P s t I で完全 に 消化 し、 0. 7 % ァ ガ ロ ー ス ゲル中で分離 し た後、 H y b o n d TM— N ナイ ロ ン ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン膜 （ ア マ シ ャ ム . ィ ン タ ー ナ シ ョ ナル社製） に移 し た 〔 J. Mol. Biol. 98- 503 - 51 7 (1975 )〕 。 該膜を （1) で調製 し た 〔 ひ 一 32 P 〕 d C T P ラ ン ダム プ ラ イ ミ ン グ · ラ ベルイヒ ラ ッ ト 0 b 蛋 白 レセ プタ ー c D N A プ ロ ー ブでハ イ ブ リ ダィ ズ し、 正確 に、
0. 5 x 希釈の標準 ク ェ ン酸生理食塩水 （ S S C ; l x S S C は 1 5 0 m M N a C し 1 5 m M ク ェ ン 酸ナ ト リ ウ ムカヽ ら な る ） 、 0. 1 % 硫酸 ドデ シ ノレナ ト リ ウ ム ( S D S ) で 6 8 °C下で洗浄 し、 X線 フ イ ノレム に 曝 し た。 結果を図 7 に 示す。 図 7 に 示す よ う に、 E c o R I 消 化で生成 し た約 6 k b、 4 k b 及び 0. 7 k b の フ ラ グ メ ン ト （ 図 7 A ) 、 8 3 111 «[ 1 消化で生成 し た約 2 5 1^ b 及び 1 0 k b の フ ラ グ メ ン ト （ 図 7 C ) 、 H i n d I I I消化で生成 し た約 8 k b、 2. 5 k b 及び 1. 5 k b の フ ラ グ メ ン ト を含む 7 つ以上の D N A フ ラ グメ ン ト （図 7 B ) . 及び P s t l消化で生成 し た 1 0 k b、 6 k b、 3 k b 及び 2 k b の も の を含む 8 つ以上の D N A フ ラ グ メ ン ト （ 図 7 D ) 力く、 〔 ひ 一 P 32〕 d C T P ラ ベルイ匕 o b 蛋 白 レ セ プ夕 一 c D N A プ ロ ー ブ とハ イ ブ リ ダイ ズ し た。
7 種類の ラ ッ ト 株間で、 ハ イ ブ リ ダィ ズ · バ ン ドのパ タ ー ン に は違いは見 られず、 こ れ ら の ラ ッ 卜 株 に は、 o b 蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子の 明 らか な構造変化は見 ら れな カヽ つ た。
( 3 ) ラ ッ 卜 の様 々 な組織での m R N A の発現 レベル
Zucker(ia/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 N o. 4 を用 いて、 そ の 様 々 な組織 （脳、 心臓、 肺、 脾臓、 腎臓、 睪丸、 筋 肉、
脂肪組織、 脾臓、 小腸、 肝臓） に 由 来す る 全 R N A を実 施例 1 ( 1 ) に従 っ て調製 し た。
次 いで得 ら れ た全 R N A s ( 1 3 g ) を 5 0 % ホル 厶 ア ミ ド、 2 . 2 Mホ ノレム ァゾレデ ヒ ド 中 に、 6 5 °C下で 1 0 分間置 いて変性 さ せ、 そ し て 2 . 2 Mの ホルム ァ ノレデ ヒ ド を含む 1 % ァ ガ ロ ー ス ゲルを用 いた電気泳動にか け た。 そ し て該ゲルを H y b o n d τ M— N ナ イ ロ ンハ イ ブ リ ダ ィ ゼ一 シ ョ ン膜 （ ア マ シ ャ ム · ィ ン タ ー ナ シ ョ ナル社製） に ブ ロ ッ テ イ ン グ し た。 該膜を （ 1 ) で調製 し た 〔 α — 3 2 Ρ ) d C T P ラ ン ダム プラ イ ミ ン グ ' ラ ベル し た o b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A フ ラ グメ ン ト プ ロ ー ブでハ イ ブ リ ダィ ズ し、 0 . 1 % 硫酸 ドデ シ ノレ ナ ト リ ウ ム （ S D S ) を含有す る 0 . 5 倍希釈の標準 ク ェ ン 酸生理食塩水 （ S S C ; l x S S C は 1 5 0 m M N a C l、 1 5 m M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム力、 ら な る ） で 6 8 °C下で洗浄 し、 X線 フ イ ル ム に 曝 し た。
結果を 図 8 に示す。 ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン シ グナル は脳、 肺、 脾臓、 脂肪細胞、 小腸及び肝臓由来の R N A に は っ き り と 観察 さ れた。 こ れ ら の う ち、 特に脾臓は o b 蛋 白 レ セ プタ ー m R N A を高 い レ ベルで発現 して いた ( 図 8 A ) 。
引 き 続いて、 S D ラ ッ ト、 Zucker(fa/fa)ラ ッ ト 及び Z
ucker(fa/fa)ラ ッ 卜 の 同腹子 N o . 4 の い く つか の脳お よ び肺に お け る o b 蛋 白 レ セ プタ ー m R N A の発現 レ べ ルに つ いて、 同様に し て測定 し た。 こ れ ら の器官 に 関 し て は、 ラ ッ ト 間 に お いて、 o b 蛋 白 レ セ プタ ー m R N A の発現 レベルの違いは見 ら れなか っ た （ 図 8 B ) 。 ゲル の各 レ ー ン に おけ る R N A量は、 ェチ ジ ゥ 厶 ブ 口 マ イ ド 蛍光に よ る 検出、 ま た、 ナ イ ロ ンノ、 イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン膜に R N Aを移 し た後 に、 ゲノレカヽ ら 1 8 S と 2 8 S D N A に特異的 なパ' ン ドを直接的 に 同定す る こ と に よ り . 一定であ る と 判断 さ れた。 な お、 定量に は、 バイ オ — ィ メ ー ジ . ア ナ ラ イ ザー B A S 2 0 0 0 ( 富士 フ ィ ル ム株 式会社製 ） を使用 し た。 実施例 4
制限酵素 H p a ll消化によ る変異型ラ ッ ト 0 b 蛋白 レセ プタ ー ¾伝子の検出
実施例 3 で增幅 · 調製 し た S D ラ ッ ト、 Zucker(fa/fa) ラ ッ 卜、 Wis tarラ ッ 卜、 ffistar(fa/fa)ラ ッ ト の肺 由 来の P C R反応物 （ c D N A ) 1 0 1 を用 いて、 こ れ に制 限酵素緩衝液 1 μ 1 及び制 限酵素 H p a I Iを 1 n 1 加え、 3 7 °Cでー晚消化 し た後、 2 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 に かけ、 変異遺伝子の判定を以下の よ う に行 っ た。
即 ち、 P C R に 際 して、 セ ン ス プ ラ イ マ一 と して S I δ ( ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プ夕一 c D N A の塩基番号 6 3 9 か ら 6 5 9 残基 ま での配列 に相 同性の あ る ヌ ク レオチ ド配列、 A A T C A C A T C T G C T G G T G T G A G ) 、 ア ン チ セ ン ス プラ イ マ 一 と して A 3 ( ラ ッ ト o b 蛋 白 レ セ プタ一 c D N A の塩基番号 1 2 4 2 か ら 1 2 1 3 残基 ま での配列 に相 同性の あ る ヌ ク レオ チ ド配列、 C T G C T C A T T G C A G C A G T A C A C T G C A T C A T
A ) を用 いて P C R を行 う と、 各 c D N A の対応す る 塩 基配列 を有す る 約 6 0 O b p の断片が増幅 さ れ る。
かか る 断片 を、 制 限酵素 H p a I I消化 し た後、 2 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 にかけ る と、 塩基番号 8 0 6 位力 シ 卜 シ ン に変異 し た Zucker(fa/fa)ラ ッ ト 及び Wistar(fa /fa)ラ ッ 卜 由 来の c D N A は、 4 3 0 b p 及び 1 7 0 b p の断片 のバ ン ドが観察 さ れた。 一方、 S D ラ ッ ト 及び Wis tarラ ッ ト 由 来の c D N A は、 分解 さ れず 6 0 0 b p 断片 のバ ン ドが観察 さ れた。 実施例 5
ヘテ ロ （fa/Fa)同士 を掛け合わせた子 ラ ッ 卜 の尾か ら微 量の血液を採取 し て常法に従 っ て D N A を抽 出 す る。 次 に ラ ッ 卜 0 b 蛋 白 レ セ プタ ー c D N A の塩基配列 に 基づ
いて、 塩基番号 8 0 6 位の ヌ ク レオ チ ドを含むよ う に、 適宜 P C R プラ イ マ一 のペア を合成す る。 こ の プラ イ マ 一を用 いて常法に従 っ て、 P C R を実施す る。 増幅 した フ ラ グメ ン ト を、 制限酵素 H a p I Iで消化 · 切断 して、 電気泳動にかけて、 図 6 に示す と 同様に、 f a 遺伝子の ホモ（fa/fa)、 あ る いはヘテ ロ （ia/Fa)、 も し く は正常型 の ホモ（Fa/ Fa)をその切断パタ ー ンか ら判定す る。
以上の実施例か ら、 H p a I I消ィ匕に よ る制限 フ ラ グメ ン 卜 の長 さ の違いに基づいて、 変異型 o b 蛋白 レセプ夕 一遺伝子の存在を検出す る こ と がで き、 こ の方法力^ ラ ッ 卜 の生後す ぐ も し く は離乳前に Zuckerラ ッ ト ゃ Wistar ラ ッ 卜 の肥満症の遺伝子型（fa / fa)を検出する のに有用で あ る こ とが示さ れた。 産業上の利用可能性
本発明は o b 蛋白 レセプタ ー の遺伝子を提供す る。 ま た本発明は、 肥満の表現形質を発現する、 温血動物に 由 来する o b 蛋 白 レセプタ ーの遺伝子の突然変異体を明 ら かに し、 かか る変異型遺伝子を提供する。 かか る遺伝子 情報は、 遺伝子ダ一 ゲ ッ テ ィ ン グ等の方法に よ る こ れ ら の遺伝子破壊動物の作成等、 家畜を始め とす る 温血動物 を早期に肥満 さ せる方法にお いて有用であ る。
更に本発明 は、 肥満形質を発現す る 温血動物に 由来す る ο b 蛋白 レ セ プタ ー遺伝子 （変異型） を検出す る方法 を提供する。 当該方法に よれば、 肥満を 自 然発症する モ デル動物を迅速に検出す る こ とが可能 と な り、 こ れは肥 満の メ カニズムや関連疾患の病因を解明す る ため に使用 さ れ る 疾患モデル動物の生産及び供給に有用であ る。
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 894
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列 ：
Met Thr Cys Gin Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu
5 10 15
Tyr Val lie Thr Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Thr Ser Pro Trp Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Phe Cys Ala Pro Pro Ser Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu
35 40 45
Ser Pro Ala Gly Val Pro Asn Asn Thr Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser 50 55 60
Glu Ala Leu Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Thr Gly lie Tyr Val Ser 65 70 75 80
Glu Leu Ser Lys Thr He Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gin Gly
85 90 95
Gin Asn Cys Ser Ala Leu Thr Gly Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala
100 105 110
Ser Val Val Lys Pro Leu Val Phe Arg Gin Leu Gly Val Asn Trp Asp
115 120 125
l ie Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe He Cys His Met
130 135 140
Glu Pro Leu Leu Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val l ie Asp Asp Leu Pro Leu Pro Pro
165 170 175
Leu Lys Asp Ser Phe Gin Thr Val Gin Cys Asn Cys Ser Val Arg Glu
180 185 190
Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Val Asn Tyr Ala Leu
195 200 205
Leu Met Tyr Leu Glu lie Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gin Ser Pro
210 215 220
Leu Met Ser Leu Gin Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu 225 230 235 240 Gly Leu Arg Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys lie Ser Trp
245 250 255
Asp Ser Gin Thr Lys Ala Pro Phe Pro Leu Gin Tyr Gin Val Lys Tyr
260 265 270
Leu Glu Asn Ser Thr l ie Val Arg Glu Ala Ala Glu lie Val Ser Asp
275 280 285
Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val 290 295 300
Gin Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp
305 310 315 320
Ser Leu Pro Gin Leu Phe Thr Thr Gin Asp Val Met Tyr Phe Pro Pro
325 330 335 Lys lie Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe Cys Cys l ie Tyr
340 345 350
Lys Asn Glu Asn Gin Thr l ie Ser Ser Lys Gin He Val Trp Trp Met
355 360 365
Asn Leu Ala Glu Lys He Pro Glu Thr Gin Tyr Asn Thr Val Ser Asp 370 375 380
His He Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg
385 390 395 400
Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gin Ala Cys
405 410 415 His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val lie Asp Val Asn lie Asn l ie
420 425 430
Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser
435 440 445
Pro Ser Thr l ie Gin Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gin Leu Arg Tyr 450 455 460
His Arg Arg Ser eu Tyr Cys Pro Asp Asn Pro Ser lie Arg Pro Thr
465 470 475 480
Ser Glu Leu Lys Asn Cys Val Leu Gin Thr Asp Gly Phe Tyr Glu Cys
485 490 495
Val Phe Gin Pro He Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp He Arg
500 505 510
He Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu
515 520 525
Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu
530 535 540
l ie Thr He Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val 545 550 555 560
Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gin Phe Gin l ie Arg Tyr Gly Leu Asn Gly
565 570 575
Lys Glu l ie Gin Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys
580 585 590
Ser Ala Ser Leu Pro Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gin
595 600 605
Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser
610 615 620
Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly 625 630 635 640
Pro Glu Phe Trp Arg lie Met Asp Gly Asp He Thr Lys Lys Glu Arg
645 650 655
Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys
660 665 670
Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr
675 680 685
Trp Ser GLn Asp Val Gly Asn Gin Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Ala 690 695 700
Glu Ser Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala l ie Asn Ser l ie Gly Ala 705 710 715 720
Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val
725 730 735
Asn Ala Val Gin Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val
740 745 750 l ie leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asn Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu
755 760 765
Val lie Glu Trp Lys Asn Leu Asn Asp Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu 770 775 780
Arg lie Pro Ser Asn Val Asn Lys Tyr Tyr l ie His Asp Asn Phe l ie 785 790 795 800
Pro lie Glu Lys Tyr Gin Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly
805 810 815
Val Gly Lys Pro Lys l ie l ie Asn Gly Phe Thr Lys Asp Asp l ie Ala
820 825 830
Lys Gin Gin Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val l ie Val Pro l ie He l ie
835 840 845
Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu l ie Ser His Gin Arg
850 855 860
Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser
865 870 875 880
Trp Ala Gin Gly Leu Asn Phe Gin Lys Arg Ala Asp Thr Leu***
885 890 配列番号： 2
配列の長さ ： 2685
配列の型： 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： DM (cDNA)
配列の特徴：
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 2682
特徴を決定した方法： S
配列：
ATGACGTGTC AGAAATTCTA TGTGGTTTTG TTACACTGGG AATTTCTGTA TGTGATAACT 60 GCACTTAACC TGGCCTATCC AACCTCTCCC TGGAGATTTA AGCTGTTTTG TGCGCCACCG 120
ACTCA C¾ GTACCTGT Tc AACAT TCGTCATGT ACACAC¾cT ACCATTT i >-3 > - o > c~>
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3»
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配列番号： 3
配列の長さ ： 894 codon
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列：
Met Thr Cys Gin Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu
5 10 15
Tyr Val lie Thr Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Thr Ser Pro Trp Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Phe Cys Ala Pro Pro Ser Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu
35 40 45
Ser Pro Ala Gly Val Pro Asn Asn Thr Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Thr Gly lie Tyr Val Ser 65 70 75 80
Glu Leu Ser Lys Thr l ie Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gin Gly
85 90 95
Gin Asn Cys Ser Ala Leu Thr Gly Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala
100 105 110
Ser Val Val Lys Pro Leu Val Phe Arg Gin Leu Gly Val Asn Trp Asp
115 120 125
He Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe l ie Cys His Met
130 135 140
Glu Pro Leu Leu Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His 145 150 155 160
Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val He Asp Asp Leu Pro Leu Pro Pro
165 170 175
Leu Lys Asp Ser Phe Gin Thr Val Gin Cys Asn Cys Ser Val Arg Glu
180 185 190
Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Val Asn Tyr Ala Leu
195 200 205
Leu Met Tyr Leu Glu l ie Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gin Ser Pro 210 215 220
Leu Met Ser Leu Gin Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu 225 230 235 240
Gly Leu Arg Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys He Ser Trp
245 250 255
Asp Ser Gin Thr Lys Ala Pro Phe Pro Leu Gin Tyr Pro Val Lys Tyr
260 265 270
Leu Glu Asn Ser Thr lie Val Arg Glu Ala Ala Glu l ie Val Ser Asp
275 280 285
Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val 290 295 300
Gin Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp
305 310 315 320
Ser Leu Pro Gin Leu Phe Thr Thr Gin Asp Val Met Tyr Phe Pro Pro
325 330 335
Lys lie Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe Cys Cys l ie Tyr
340 345 350
Lys Asn Glu Asn Gin Thr l ie Ser Ser Lys Gin lie Val Trp Trp Met
355 360 365
Asn Leu Ala Glu Lys lie Pro Glu Thr Gin Tyr Asn Thr Val Ser Asp 370 375 380
His He Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg 385 390 395 400
Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gin Ala Cys
405 410 415
His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val He Asp Val Asn lie Asn lie
420 425 430
Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser
435 440 445
Pro Ser Thr l ie Gin Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gin Leu Arg Tyr 450 455 460
His Arg Arg Ser Leu Tyr Cys Pro Asp Asn Pro Ser He Arg Pro Thr 465 470 475 480
Ser Glu Leu Lys Asn Cys Val Leu Gin Thr Asp Gly Phe Tyr Glu Cys
485 490 495
Val Phe Gin Pro He Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp l ie Arg
500 505 510 l ie Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu
515 520 525
Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu
530 535 540
He Thr l ie Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val 545 550 555 560 Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gin Phe Gin l ie Arg Tyr Gly Leu Asn Gly
565 570 575
Lys Glu l ie Gin Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys
580 585 590
Ser Ala Ser Leu Pro Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gin
595 600 605
Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser
610 615 620
Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly 625 630 635 640 Pro Glu Phe Trp Arg He Met Asp Gly Asp l ie Thr Lys Lys Glu Arg
645 650 655
Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys
660 665 670
Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr
675 680 685
Trp Ser Gin Asp Val Gly Asn Gin Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Ala 690 695 700
Glu Ser Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala He Asn Ser l ie Gly Ala 705 710 715 720
Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val
725 730 735 Asn Ala Val Gin Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val
740 745 750 l ie Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asn Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu
755 760 765
Val l ie Glu Trp Lys Asn Leu Asn Asp Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu 770 775 780
Arg l ie Pro Ser Asn Val Asn Lys Tyr Tyr He His Asp Asn Phe l ie 785 790 795 800
Pro l ie Glu Lys Tyr Gin Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly
805 810 815 Val Gly Lys Pro Lys lie l ie Asn Gly Phe Thr Lys Asp Asp l ie Ala
820 825 830
Lys Gin Gin Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val l ie Val Pro lie He l ie
835 840 845
Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu l ie Ser His Gin Arg
850 855 860
Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser
865 870 875 880
Trp Ala Gin Gly Leu Asn Phe Gin Lys Arg Ala Asp Thr し eu**氺
885 890 配列番号： 4
配列の長さ ： 2685
配列の型： 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： DNA (c讓)
配列の特徴：
特徴を表す記号 CDS
存在位置： し 2682
特徴を決定した方法： S
配列：
ATGACGTGTC AGAAATTCTA TGTGGTTTTG TTACACTGGG AATTTCTGTA TGTGATAACT 60 GCACTTAACC TGGCCTATCC AACCTCTCCC TGGAGATTTA AGCTGTTTTG TGCGCCACCG 120 AGTACAACTG ATGACTCCTT TCTCTCTCCT GCTGGAGTCC CAAACAATAC TTCGTCTTTG 180
133 iiLVVVVV 13VV
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Claims
請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 1 で示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る塩 基配列を有する こ と を特徴 とす る o b 蛋 白 レセ プタ ー 遺伝子。
2 . 配列番号 2 で示さ れ る塩基配列を有する こ と を特徴 とす る 請求項 1 記載の o b 蛋白 レセ プタ ー遺伝子。
3 . 肥満の表現形質を発現す る 温血動物 由来の o b 蛋白 レセプタ ー遺伝子。
4 . 請求項 1 又は 2 記載の o b 蛋 白 レセ プタ ー遺伝子に おいて、 コ ド ン 2 6 9 位力くグルタ ミ ン の代わ り にプロ リ ン を コ一 ドする塩基配列であ る こ と を特徴 とす る請 求項 3 記載の o b 蛋白 レセプタ 一遺伝子。
5 - 請求項 1 又は 2 記載の o b 蛋白 レ セ プタ 一遺伝子に お いて、 塩基番号 8 0 6 位の ヌ ク レオ チ ドがア デニ ン の代わ り に シ ト シ ンであ る こ と を特徴 とす る 請求項 3 ま たは 4 記載の o b 蛋白 レ セプタ 一遺伝子。
6 . 請求項 1 乃至 2 に記載さ れ る o b 蛋 白 レセプ夕 一遺
伝子に対す る 変異を検出する こ と を特徴 とす る、 肥満 の表現形質を発現す る 温血動物の遺伝子診断方法。 . 前記変異が制限酵素部位の新たな形成及び Z又は欠 失を導 く も のであ る、 請求項 6 記載の肥満表現形質を 発現する 温血動物の遺伝子診断方法。 . 前記制限酵素部位が、 H p a I I又は M s p I の少な く と も 1 種であ る こ と を特徴 とする 請求項 6 又は 7 記 載の肥満表現形質を発現する 温血動物の遺伝子診断方 法。 . 請求項 3 乃至 5 の いずれかに記載さ れ る o b 蛋白 レ セプタ ー遣伝子を検出す る こ と を特徴 とする 請求項 6 乃至 8 の いずれかに記載の肥満表現形質を発現す る 温 血動物の遺伝子診断方法。 0. 請求項 6 乃至 9 の いずれかに記載さ れ る 肥満表現形 質を発現する 温血動物の遺伝子診断方法におけ る、 請 求項 1 乃至 5 に記載され る いずれか少な く と も 1 種の 0 b 蛋 白 レ セ プタ ー遺伝子の一部又は全部の使用。
11. 請求項 1 乃至 5 に記載さ れる いずれか少な く と も 1 種の o b 蛋白 レ セ プタ 一遺伝子の一部又は全部を含む こ と を特徴 とす る、 肥満表現形質を発現す る 温血動物 を遺伝子学的に検出す る ための診断剤。
12. 請求項 3 乃至 5 の いずれかに記載され る 0 b 蛋 白 レ セプタ ー遺伝子を有す る こ と を特徴 とす る、 肥満表現 型の温血動物。 13. 請求項 3 乃至 5 のいずれかに記載さ れ る o b 蛋白 レ セプ夕 一遺伝子を有する こ と を特徴 とす る、 請求項 12 記載の肥満表現型疾患モ デル動物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| AU24083/97A AU2408397A (en) | 1996-04-30 | 1997-04-24 | Ob protein receptor genes and use of the same |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8/134422 | 1996-04-30 | ||
| JP13442296 | 1996-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=15128021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1997/001470 WO1997041217A1 (fr) | 1996-04-30 | 1997-04-24 | GENES RECEPTEURS DE LA PROTEINE ob ET UTILISATION DE CES GENES |
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| AU (1) | AU2408397A (ja) |
| WO (1) | WO1997041217A1 (ja) |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2408397A (en) | 1997-11-19 |
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