WO1997036618A1 - Composition diagnostique pour maladies s'accompagnant de reactions auto-immunes declenchees par la decarboxylase d'acide 65k-glutamique - Google Patents

Composition diagnostique pour maladies s'accompagnant de reactions auto-immunes declenchees par la decarboxylase d'acide 65k-glutamique Download PDF

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cells
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Shigeo Kure
Kuniaki Narisawa
Yoshiko Muto
Yoshiyuki Sakata
Jo Satoh
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0006—Skin tests, e.g. intradermal testing, test strips, delayed hypersensitivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a method and a composition for diagnosing a disease associated with an autoimmune reaction caused by 65K glutamate decarboxylase.
  • Diagnosis in daily practice of insulin-dependent diabetes is based on test results such as blood glucose, urine and glucose tolerance tests. These are mostly studies reflecting the condition of insulin deficiency, and it is difficult to diagnose using these tests early on in diseases where insulin secretion is not very impaired.
  • Today, insulin-dependent diabetes mellitus is recognized as an endocrine disease in which auxin beta cells are destroyed by an autoimmune mechanism, resulting in an absolute lack of insulin. Therefore, it was hoped that the diagnosis could be made earlier by incorporating a test for detecting this autoimmune process.
  • glutamate decarboxylase which is abundant in the brain, and attempts to detect an immune response to this molecule have begun (Nature 347: 151-156, 1990).
  • Glutamate decarboxylase is an enzyme that produces the neurotransmitter 7-aminobutyric acid from glutamate. This enzyme has two isozymes with molecular weights of 65 K daltons and 67 K daltons, 65 K glutamate decarboxylase (GAD 65) and 67 K glutamate decarboxylase (GAD 67), respectively. is called. Subsequent searches have revealed that it is GAD 65 that elicits a stronger autoimmune response (J.C1 in. Invest. 1993: 91: 2084-2090). A humoral immune reaction, which is relatively easy to detect among the immune responses to GAD65, that is, an anti-GAD65 antibody was first searched.
  • an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) method, an RIA (radioimmuno assay) method, an immunoprecipitation method, an immunoblot method, and the like are used as a method for measuring the anti-GAD65 antibody titer.
  • an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) method, an RIA (radioimmuno assay) method, an immunoprecipitation method, an immunoblot method, and the like are used.
  • insulin-dependent diabetes mellitus there is a form in which the disease develops in the early stage of the disease in non-insulin-dependent diabetes mellitus, and thereafter gradually decreases insulin secretion and shifts to insulin-dependent diabetes mellitus (slowly progressive disease).
  • Insulin dependent diabetes mellitus This type of diabetes is prevalent in Japan and is estimated to account for about 5% of non-insulin-dependent diabetes (Diab TES CARE, 1993; 16: 780-788, Internal Medicine, 1995; 76: 31-35). .
  • measuring the anti-GAD65 antibody titer early in the disease is thought to be useful for accurate diagnosis, but even in this case, the case with a higher antibody titer is earlier in insulin. It does not lead to lack. In such cases, it is important to understand the dynamics of not only humoral immunity but also cellular immunity in order to determine prognosis and select appropriate treatment.
  • T cells can be calculated the material to become when the c capturing thymidine, tritium, thymidine amount labeled radioactive thymidine incorporated Ri by the keeping mixed into the medium at a beam of DNA synthesis when dividing.
  • mononuclear cells are separated from about 10 ml of peripheral blood by density gradient centrifugation.
  • thymidine After culturing for 3 to 7 days in an appropriate medium containing a partial peptide of GAD65, add radioactive thymidine and further culture for about 18 hours. After that, the amount of thymidine incorporated is calculated by collecting the cell fractions and measuring the radioactivity therein, and used as an index of cellular immunity.
  • the current method of measuring cellular immunity by incorporating radioactive thymidine is difficult to use for actual diagnosis in the following points.
  • radioactive thymidine is only permitted in certain controlled areas. Therefore, it cannot be performed in general clinical laboratories.
  • a method using fluorescently labeled thymidine without using a radioactive substance has been devised, but is inferior to the radioactive thymidine method in terms of sensitivity and is not widely used.
  • the required blood volume is at least 10 ml, and there is a problem in blood sampling in testing children who are the main target of insulin-dependent urinary disease.
  • the culture of mononuclear cells from the patient's peripheral blood generally contains fetal calf serum.
  • the reactivity of mononuclear cells to fetal bovine serum varies from one fetal serum to another, and it is not possible to simply compare the results of tests performed at different facilities. This is a consequence of the standardization of this inspection.
  • the present invention provides a simple method for evaluating cell-mediated immunity against GAD65, thereby providing a disease associated with an autoimmune reaction induced by 65K glutamate decarboxylase. It is an object to provide a composition that allows the diagnosis of a disease.
  • the present invention provides a method for evaluating cell-mediated immunity to GAD65 by a simple operation, and an autoimmune reaction induced by 65K glutamate decarboxylase by using the method. Disclosure of invention c also aims to provide a method for diagnosing a disease associated
  • the present inventors injected GAD65 partial peptides intradermally into NOD mice, which are model animals that naturally develop insulin-dependent diabetes. Two days later, the skin at the injection site was observed to show changes such as swelling and redness. This indicates that it is possible to evaluate cell-mediated immunity by the skin reaction generated by administration of the GAD65 partial peptide, and the present invention has been completed based on such findings. .
  • the present invention relates to a 65K-glutamic acid decarboxylase (65K-glutamic acid) capable of reacting with T cells in the skin of a mammal and at the surface of Z or skin to cause inflammation in the skin of the mammal.
  • An acid decarboxylase: GAD65 or a partial peptide thereof is provided.
  • a composition for diagnosing a disease associated with an autoimmune reaction induced by GAD65 by a percutaneous reaction is provided.
  • the present invention also provides a method for producing an inflammation in the skin of a mammal by reacting with T cells in the skin of the mammal and / or on the surface of the skin, and in the skin of the mammal and / or on the surface of the skin.
  • the obtained GAD65 or a partial peptide thereof is administered, and the size of a dermatitis caused by a percutaneous reaction between the GAD65 or the partial peptide and a T cell in the subject is measured.
  • a method for diagnosing a disease associated with an autoimmune reaction caused by GAD65 is provided.
  • the present invention provides a method for producing inflammation in the skin of a mammal by reacting with T cells in the skin of the subject, on the skin or on the surface of the skin, on the skin of the mammal, and on the surface of the skin or Z.
  • Administering GAD65 or a partial peptide thereof, and measuring the magnitude of inflammation of the skin / ⁇ caused by a skin reaction between the GAD6 ⁇ 5 or a partial peptide thereof and T cells in the subject. Provides a method for evaluating cell-mediated immunity to GAD65.
  • the present invention relates to a method for diagnosing a disease associated with an autoimmune reaction caused by GAD65 by a skin reaction, by reacting with T cells in the skin of a mammal and on the surface of the skin or the skin of the mammal. It also provides the use of GAD 65 or a partial peptide thereof, which can cause inflammation in the skin.
  • the present invention also relates to a method for producing a composition for diagnosing a disease associated with an autoimmune reaction elicited by GAD65 by a skin-capture reaction, wherein the disease is intradermally and / or on the surface of a mammal. Also provided is the use of GAD65 or a partial peptide thereof, which can react with cells to cause inflammation in the mammalian seedlings.
  • FIG. 1 is a diagram showing the time course of footpad swelling of NOD mice to which GAD65 partial peptide was administered.
  • FIG. 2 is a diagram showing swelling of the footpad of a NOD mouse by administration of various peptide antigens (GAD65 partial peptide, cyclophilin and carboxyl carrier protein).
  • Fig. 3 shows the footprint of the GAD65 partial peptide in mice of each strain (NOD, C3H / He, C57BL, Ba1b / c, BIO.A and DBA).
  • Fig. 4 shows the T cell embryos induced by GAD65 partial peptide administration in mice of each strain (NOD, C3H / He, C57BL, Ba1b / c, BIO.A and DBA). It is a figure which shows a weakening reaction.
  • FIG. 5 shows the foot-pat swelling response of the GAD65 partial peptide in mice of each strain (NOD, C3H / He, C57BL, BalbZc, BIOA and DBA).
  • FIG. 4 is a diagram showing a correlation between and the T cell embryogenic reaction.
  • GAD glutamic acid decarboxylase
  • GAD67 and GAD65 there are two isoforms, GAD67 and GAD65, and in the present invention, GAD65 having a molecular weight of 65,000 and consisting of 585 amino acids is used.
  • GAD65 of human, rat, mouse, mouse, etc. has been isolated and its amino acid sequence has been determined (see Fig. 2 of Proc. Natl. Acad.
  • GAD65 is human, rat, Because of high homology between mice, any of these can be used. From the viewpoint of early diagnosis and prognosis of human insulin-dependent diabetes, the use of human GAD65, which is the original recognition antigen of human T cells, is preferred in terms of improving detection sensitivity. No. In the present invention, GAD 65 does not necessarily have to be a protein having the entire amino acid sequence.
  • the peptide may be a partial peptide, for example, a peptide selected from a range of up to about 120 amino acids as counted from the terminal side of 0805 (: SEQ ID NO: 1 And a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • GAD65 is used in view of peptide length, which is easily synthesized by a solid phase method.
  • a mixture of peptides consisting of 10 to 30 amino acids, preferably 20 to 26 amino acids, selected from the range of about 120 amino acid sequences counted from the C-terminal side is used.
  • An example thereof is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to 6.
  • peptides are amino acids 473 to 498 of the human GAD65 partial peptide of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Acid sequence, amino acids 494-518 The amino acid sequence corresponds to the amino acid sequence at positions 514 to 538 and the amino acid sequence at positions 534 to 558.
  • Amino acid sequence at positions 508 to 509 in the amino acid sequence of the human GAD65 partial peptide of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2) Is Tyr-Ile, but it is Phe-Val in the mouse amino acid sequence (the 9th to 10th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) at the corresponding site. You may change it.
  • a mixture of peptides of about 30 amino acids can be easily obtained by chemical synthesis of each peptide by a solid phase method.
  • GAD65 or its partial peptide can be in any form as long as it can be administered to the skin of mammals such as humans and / or to the surface of the skin. Preferably, it is in a dosage form that can be administered. Specifically, for example, 25 to 75% by weight, preferably about 40 to 60% by weight of GAD 65, which is a diagnostically effective amount, is dissolved or suspended in a physiological saline solution or the like. Things can be mentioned.
  • potassium alum can be added to prevent diffusion in the skin. For this purpose, a precipitate is formed with a 10% solution of carimyoban, a 10% solution of sodium carbonate and an antigen peptide, and the precipitate is further resuspended in a physiological saline solution.
  • the final amount of potassium alum in the injection solution is 0.2 to 0.4%.
  • the solubility of GAD 65 or its partial peptide in the preparation is low, and A suspension of GAD65 or a partial peptide thereof is preferred.
  • the above-mentioned preparation by adjusting the pH so as to be in the range of 6.0 to 7.0.
  • a composition containing GAD65 or a partial peptide thereof is administered intradermally and Z or to the surface of the skin of a test individual, and the GAD65 or a partial peptide thereof and T cells in the test-individual are administered.
  • GAD65-induced diseases associated with autoimmune reactions such as insulin-dependent diabetes mellitus, SUffman syndrome, and certain types of autoimmunity, by measuring the magnitude of skin inflammation caused by the f-reaction.
  • Early diagnosis of thyroid disease, etc. Can be prognostic.
  • Examples of the subject include mammals such as humans, mice, and rats.
  • the diagnosis of insulin-dependent diabetes mellitus can be made by the following method. That is, the above-mentioned GAD65 or a partial peptide thereof is intradermally administered to the subject by subcutaneous injection or the like. Then, usually two days later, the skin is measured for changes such as swelling or redness. Alternatively, the above-mentioned GAD65 or its partial peptide may be adhered to the skin by pulling the skin (scratch test). Then, usually 48 hours later, changes such as swelling or redness of the skin are measured. This change, such as swelling or redness, may be due to the following mechanism.
  • IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • T cells After GAD65 or its partial peptide is taken up by antigen-presenting cells and undergoes the process, antigen stimulation is transmitted to T cells.
  • the resulting activated T cells trigger an inflammatory response, such as the release of various cytokines and the recruitment of mononuclear and multinuclear cell populations.
  • the degree of the change such as swelling or redness of the skin corresponds well to the current IDDM diagnosis by radioactive thymidine incorporation, so the degree of the change in advance, for example, redness If a correlation between the size and degree of induration and the symptoms of IDDM is determined, diagnosis can be made easily.
  • RNA was isolated from mouse brain and cDNA was synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase (this procedure was described in J.G1 in. Invest. 90, 160-164, 1992). According to the method). Using this cDNA solution as type II, PCR was performed using the two chemically synthesized primers described below.
  • SEQ ID NO: 8 A DNA fragment (about 300 bp) obtained by double digesting the obtained PCR product with the restriction enzymes BamHI and Ndel was separated by agarose gel electrophoresis, and then the DNA purification kit from Qiagen was purified. Was used to purify the DNA.
  • the expression vector pET14b (manufactured by Novagen, USA) was double-digested with the restriction enzymes BamHI and Ndel, and ligated to the approximately 300 bp DNA fragment obtained in the previous section using DNA ligase.
  • a vector having the circularized DNA fragment incorporated therein was introduced into Escherichia coli BL21, which was used for expression. Specifically, this Escherichia coli was cultured at 37 ° C in a broth medium supplemented with 50 / zg / ml ampicillin until the absorbance at 600 mn became 0.7, and then IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM. After further culturing at 37 ° C for 3 hours, the cells were collected.
  • the peptide solution eluted from the '(GSSHHHHHHSSGLVPRGSH V-) (SEQ ID NO: 9) column was dialyzed against phosphate buffered saline (PBS). At this time, the peptide is insolubilized. Resuspended in PBS. In this state, it can be stably stored at 180 ° C for a long time.
  • Example 2 To determine whether the hind limb swelling seen in Example 2 was a specific response to the GAD65 partial peptide, an experiment was performed using two peptides other than the GAD65 partial peptide. Select the rat cyclophilin (molecular weight 12000) and the carboxyl carrier protein (CCP: molecular weight 22000) of Escherichia coli that are not homologous in primary structure to GAD65. In the same manner as in Example 1), the expression vector pET14b was used to express in escherichia coli a form containing six histidine residues at the N-terminus, followed by purification using a nickel chelate column.
  • CCP carboxyl carrier protein
  • Example 5 T cell blastogenesis during antigen stimulation by GAD65 partial peptide
  • the incorporation of radioactive thymidine was measured using the same GAD65 partial peptide as the stimulating antigen used in the experiment of Example 2 ( J. Clim. Invest. 94, 2125-2129, 1994 J. Ex P. Med. 180, 1979-1984, 1994).
  • the mice used were N0D mice, four types of strains that do not spontaneously develop insulin-dependent diabetes: C3H / He, Ba1b / c, BIO.A, C57BL, and insulin. A total of six DBAs were spontaneously developing non-dependent diabetes.
  • the uptake of radioactive thymidine in NOD mice, which spontaneously develop insulin-dependent diabetes mellitus was significantly higher than in other strains of mice.
  • the cell-mediated immune response was found to be higher than in other strains of mice.
  • Example 6 Correlation between footpad swelling reaction and uptake of radioactive thymidine Incorporation of radioactive thymidine (the experiment in Example 5), which is a method for examining existing cellular immunity, and a method for evaluating cellular immunity by the method of the present invention
  • the correlation with the result of the intradermal reaction was examined. As shown in FIG. 5, a significant correlation was found between the two with a correlation coefficient (R) power of .809 and a P value of 0.05 or less. Therefore, it was found that the GAD65-based intradermal reaction method can sufficiently evaluate the cellular immune response instead of the conventional radioactive thymidine incorporation method.
  • a composition comprising GAD65 or a partial peptide thereof of the present invention is placed in the skin and / or on the surface of the skin of a subject, and after an appropriate period of time, the swelling and redness of the skin captive
  • a very simple operation of observing the change allows the evaluation of cellular immunity against the antigen.
  • pre-onset diagnosis and onset of diseases such as insulin-dependent diabetes, which were difficult only by measurement of humoral immunity, were made possible. Later prognosis can be determined.
  • it has the potential to be used for screening purposes in school children and non-insulin-dependent diabetic patients because it requires less time and effort than conventional measurement of humoral immunity.
  • Organism name human
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid PT
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA

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Description

明 細 書
6 5 Kグルタミン酸脱炭酸酵素が惹起する自己免疫反応を伴う疾患の診断用組成 物 技術分野
本発明は、 6 5 Kグルタミ ン酸脱炭酸酵素が惹起する自己免疫反応を伴う疾患 の診断方法および診断用組成物に関する。 背景技術
インスリ ン依存性糖尿病の日常診療における診断は、 血糖値、 尿糖値、 糖負荷 試験などの検査結果を基に行われている。 これらはほとんどィンスリン欠乏の病 態を反映する 査であり、 ィンスリンの分泌があまり障害されていない病気の初 期にこれらの検査を使って診断する事は困難である。 今日、 インスリ ン依存性糖 尿病は自己免疫学的機序により睇ベータ細胞が破壊され、 ィンスリ ンの絶対的不 足を来す内分泌疾患であると認識されている。 従って、 この自己免疫学的プロセ スを検出する検査を取り入れることによって、 より早期の診断が可能になるもの と期待されていた。 最近、 自己抗原の一つが脳内に豊富に存在するグルタミ ン酸 脱炭酸酵素であることが同定され、 この分子に対する免疫反応を検出する試みが 開始された （Nature 347:151-156, 1990)。 グルタミン酸脱炭酸酵素はグルタミン 酸から神経伝達物質である 7—ァミノ酪酸を生成する酵素である。 この酵素には 分子量が 6 5 Kダルトンと 6 7 Kダルトンからなる二つのアイソザィムが存在し、 それぞれ 6 5 Kグルタミン酸脱炭酸酵素 （GAD 6 5 ) と 6 7 Kグルタミン酸脱 炭酸酵素 （GAD 6 7 ) と呼ばれている。 その後の検索からより強い自己免疫反 応を惹起しているのは、 GAD 6 5の方であることが明らかになつてきた （J.C1 in. Invest.1993:91:2084- 2090)。 GAD 6 5に対する免疫反応のうち検出の比較 的容易な液性免疫反応、 即ち抗 GAD 6 5抗体の検索がはじめに行われた。 多く のィ ンスリ ン依存性糖尿病患者の患者血清中の抗体価が調べられ、 発症 1年以内 のイ ンスリン依存性糖尿病患者の 69%が抗 GAD 6 5抗体陽性であることが見出 された （Diabetes 41:548-551, 1992) 。 更に糖尿病未発症の患者第 1度近親者 (ィンスリ ン依存性糖尿病発症に関してハイリスク集団と考えられる） でも高率 に抗体陽性となり発症前診断の可能性が開かれてきた （Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:9841-9845, 1992) 。
抗 GAD 6 5抗体価の測定法には、 E L I S A (enzyme linked immunosorbent assay)法、 R I A (radioimmuno assay)法、 免疫沈降法、 ィムノブロッ ト法など が用いられている。 これらの方法では抗原として、 1 ) ブタ脳から精製された G AD 6 5、 2 ) 昆虫細胞中でバキュロウィルスべクターを用いて発現させた後精 製した GAD 6 5、 3) 大腸菌中で発現させた後精製した GAD 6 5などが用い られている。 この中には既に製品化されているものもある。 抗原の種類の違いや 測定方法の違いにより感度や正常力ッ トオフ値が異なっている。
抗 GAD 6 5抗体価はィンスリ ン依存性糖尿病の診断に有用であることを示す 多くの事例が報告されている。 一方、 多くの糖尿病患者の血清を検索した結果そ の限界も指摘されるようになった。 そのひとつが抗体価の高い症例が必ずしも短 期間にインスリ ン治療が必要になる訳でない点である。 つまり、 抗体価の高低で 予後の善し悪しを判定する事はできない。 むしろ抗体価の低い症例に早期にィン スリ ンを必要とする例が多いとの報告もある （Lancet 341:1565-1569, 1993)。 こ の原因については脖ベータ細胞を実際に破壊するのは細胞性免疫であり液性免疫 ではない事に起因していると推測されている。
ィンスリ ン依存性糖尿病の中には病気の初期にィンスリン非依存性糖尿病で発 症し、 その後徐々にィンスリ ン分泌が障害されてィンスリ ン依存性糖尿病に移行 する病型がある （緩徐進行型イ ンスリン依存性糖尿病） 。 このタイプの糖尿病は 本邦に多く、 非インスリ ン依存性糖尿病の約 5 %を占めるものと推測されている (Diab TES CARE, 1993;16:780-788,内科、 1995;76:31-35)。 これらの症例の場合 病気の初期に抗 GAD 6 5抗体価を測定する事は正確な診断のために有用である と考えられているが、 この場合でも抗体価の高い症例の方が早期にィンスリン欠 ¾に至るわけでない。 このような症例には液性免疫だけでなく細胞性免疫の動態 を把握することが予後判定や適切な治療を選択する上で重要であると考えられる。
し力、しな力くら、 細胞性免疫の検索は日常診療で行われることはほとんどない： というのは、 液性免疫の検出に比べて細胞性免疫の検出には煩雑な手技を必要と するからである。 最も代表的な方法は特異的な抗原刺激をすると T細胞が分裂を 開始する性質を利用するもので T細胞幼若化反応 （又は T細胞増殖反応） と呼ば れている。 T細胞は分裂するときに D N A合成の材料となるチミジンを取り込む c この際、 トリチウ,ムで標識された放射性チミジンを培地中に混ぜておくことによ り取り込まれたチミジン量を計算できる。 ヒ 卜でこの方法を用いて診断するには、 最初に約 10ml程度の末梢血から密度勾配遠心にて単核細胞を分離する。 次に、 G A D 6 5の部分べプチドを含む適切な培地中で 3から 7日間培養後、 放射性チミ ジンを加えて更に 18時間程度培養する。 その後、 細胞分画を集めてその中の放射 活性を測定する事により取り込まれたチミジンの量を算定し、 細胞性免疫の指標 とする。
現在行われているこのような放射性チミジンの取り込みによる細胞性免疫の測 定法は、 次の点で実際の診断に用いる事が困難である。
1 . ヒ ト末梢血から単核細胞を分離するのに約 1時間程度の時間を要し、 しか もこの過程は無菌操作を必要とする。 このため、 無菌操作とその後の培養が行え るような検査施設と技術が必要で、 一般の診療所や小規模な病院の外来では不可 能である。 また、 生細胞を分離しなくてはならないために、 血液検体を長期間保 存する事は出来ず、 また血液検体の輸送にも困難を伴う。
2 . 放射性のチミジンの使用は特定の管理区域内でしか許可されていない。 従 つて、 一般の臨床検査室では実施不可能である。 現在、 蛍光標識されたチミジン を用いて放射物質を用いずに行う方法も考案されているが、 感度の点で放射性チ ミジン法に劣り、 あまり普及していない。
3 . 必要な血液量は最低でも 10mlと多く、 インスリ ン依存性 尿病の主な対象 である小児の検査としては採血上の問題がある。
4 . 患者末梢血由来の単核細胞の培地は一般に牛胎児血清を含んでいる。 この 牛胎児血清に対する単核細胞の反応性は各胎児血清ごとにばらつきがあり、 異な つた施設で行つた検査結果を単純比較出来ない。 このことがこの検査の標準化の»げとなっている。
従って、 本発明は、 簡便な操作で、 G A D 6 5に対する細胞性免疫の評価を行 うことにより、 6 5 Kグルタミン酸脱炭酸酵素が惹起する自己免疫反応を伴う疾 患の診断を可能にする組成物を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 簡便な操作で、 GAD 6 5に対する細胞性免疫の評価を行 う方法、 ならびに該方法を利用することにより、 6 5 Kグルタミ ン酸脱炭酸酵素 が惹起する自己 ¾疫反応を伴う疾患を診断する方法を提供することも目的とする c 発明の開示
上記目的を達成するために、 本発明者らは、 インスリン依存性糖尿病を自然発 症するモデル動物である NODマウスの皮内に GAD 6 5部分べプチドを注射し た。 二日後に注射部位の皮膚を観察したところ、 腫脹および発赤といった変化が みられた。 このことは、 GAD 6 5部分ペプチドの投与により生じた皮慮反応に より細胞性免疫の評価が可能であることを示しており、 本発明は、 このような知 見に基づき完成されたのである。
すなわち、 本発明は、 哺乳動物の皮内および Zまたは皮膚の表面において T細 胞と反応して該哺乳動物の皮虜に炎症を生じさせ得る、 6 5 Kグルタミン酸脱炭 酸酵素（65K- glutamic acid decarboxylase: GAD 6 5 ) またはその部分べプチ ドを含有してなる、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患の、 皮廣反応 による診断のための組成物を提供する。
また、 本発明は、 被検個体の皮内および または皮虜の表面に、 哺乳動物の皮 内および Zまたは皮 の表面において T細胞と反応して該哺乳動物の皮) fに炎症 を生じさせ得る GAD 6 5またはその部分べプチドを投与し、 該 GAD 6 5また はその部分べプチドと該被検個体中の T細胞との皮廣反応により生じる皮慮の炎 症の大きさを測定することにより、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾 患を診断する方法を提供する。
さらにまた、 本発明は、 被検個体の皮内およびノまたは皮膚の表面に、 哺乳動 物の皮内および Zまたは皮膚の表面において T細胞と反応して該哺乳動物の皮廣 に炎症を生じさせ得る GAD 6 5またはその部分ペプチドを投与し、 該 GAD 6 ^ 5またはその部分べプチドと該被検個体中の T細胞との皮膚反応により生じる皮 /^の炎症の大きさを測定することにより、 GAD 6 5に対する細胞性免疫を評価 する方法を提供する。 本発明は、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患を皮膚反応により診 断するための、 哺乳動物の皮内およびノまたは皮廣の表面において T細胞と反応 して該哺乳動物の皮膚に炎症を生じさせ得る、 GAD 6 5またはその部分べプチ ドの使用も提供す,る。
本発明は、 また、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患の、 皮虜反応 による診断のための組成物を製造するための、 哺乳動物の皮内および/または皮 虜の表面において T細胞と反応して該哺乳動物の皮苗に炎症を生じさせ得る、 G AD 6 5またはその部分べプチドの使用も提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 GAD 6 5部分べプチド投与した NODマウスのフッ トパッ ド腫脹 の時間経過を示す図である。
第 2図は、 種々のぺプチド抗原 （GAD 6 5部分べプチド、 シクロフィ リンぉ よびカルボキシルキヤリヤータンパク質） の投与による、 NODマウスのフッ ド パッ ドの腫脹を示す図である。
第 3図は、 各系統のマウス （NOD， C 3 H/H e, C 5 7 B L, B a 1 b/ c， B I O. Aおよび DBA) における、 GAD 6 5部分ペプチドによるフッ ト パッ 卜の腫脹を示す図である。
第 4図は、 各系統のマウス （NOD, C 3 H/H e, C 5 7 B L, B a 1 b/ c, B I O. Aおよび DBA) における、 GAD 6 5部分ペプチド投与による T 細胞幼弱化反応を示す図である。
第 5図は、 各系統のマウス （NOD， C 3 H/H e, C 5 7 B L, B a l bZ c， B I O. Aおよび DBA) における、 GAD 6 5部分ペプチドによるフッ ト パッ ト腫脹反応と T細胞幼弱化反応との相関を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
' GAD (グルタミン酸脱炭酸酵素） は、 抑制性神経伝達物質である 7—アミノ 酪酸をグルタミン酸より合成するときに働く酵素であり、 主に脳のァーァミノ酪 酸作動性ニューロン神経終末に高澳度に存在している。 その他、 滕ラ氏島細胞、 甲状腺、 副腎皮質、 精巣、 卵管、 胃壁などにも存在する公知の物質である。 GA Dには GAD 6 7と GAD 6 5の 2つのアイソフォームが存在する力く、 本発明に おいては、 5 8 5個のァミノ酸からなる分子量 65， 000の GAD 6 5を使用する。 ヒト、 ラッ ト、 マ,ウス等の GAD 6 5が単離され、 そのアミノ酸配列がすでに明 らかにされている （Proc.Natl. Acad. USA 89, 2115- 2119， 1992の Fig- 2、 Neuron, 7, 91-100, 1991 の Fig3, Biochemica Biophysica Acta, 1216, 157-160, 1993 の Fig-2， 等） 力く、 本発明においては、 GAD 6 5のアミノ酸配列はヒト， ラッ ト， マウス 間で相同性が高いため、 これらのいずれのものも使用することができる。 ヒ 卜ィ ンスリ ン依存性糖尿病の早期診断および予後診断の観点からは、 ヒ ト T細胞の本 来の認識抗原であるヒ ト GAD 6 5を使用するのが検出感度の改善の面で好まし い。 本発明においては、 GAD 6 5は、 必ずしも全ァミノ酸配列を有するタンパ ク質でなくともよい。 即ち、 部分ペプチド、 例えば、 0八06 5の(：末端側から 数えて約 1 2 0個までのァミノ酸配列の範囲から選ばれるぺプチドであってもよ い。 その一例として、 配列番号 1のァミノ酸配列からなるぺプチドおよび配列番 号 2のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。 また、 本発明においては、 固相法による化学合成が容易であるペプチド長の観点から、 GAD 6 5の C末端 側から数えて約 1 2 0個のァミノ酸配列の範囲から選ばれた 1 0〜3 0個、 好ま しくは、 2 0〜 2 6のアミノ酸数からなるぺプチドの混合物を使用するのが好ま しい。 その一例として、 配列番号 3 ~6 のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げ られる。 これらのペプチドは、 それぞれ、 配列番号 2のヒ ト GAD 6 5部分ぺプ チドの 473〜498番目のァミノ酸配列、 494〜518番目のァミノ酸配列、 514~538 番目のアミノ酸配列および 534〜558番目のアミノ酸配列に相当する。 配列番号 2 のヒ ト GAD 6 5部分ペプチドのアミノ酸配列 （配列番号 2 ) の 508〜509番目の ァミノ酸配列は Tyr-Ileであるが、 これに相当する部位のマウスのァミノ酸配列 (配列番号 1のアミノ酸配列の 9〜 10番目の配列） では Phe- Val となっているの で、 このような配列に変えてもよい。
- これら GAD 6 5やそのペプチドは、 （Biochem. 231, 695- 703， 1985 Eur. J. B iochem, 86, 143-152, 1978, J. Neurochem.56， 720-723, 1991, J. Biochem.248， 3029-30 34， 1973, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 83, 8808-8812, 1986， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 89,9841-9845， 1992) に記載されているようにブタ脳， ラッ ト脳， ヒ 卜脳などの 生体材料から単離 '精製して得ることができ、 また、 （Eur.J. Biochem.212,597- 603, 1993, Proc. Natl. Acad, Sci USA 90, 2832-2836, 1993, J. Exp. Med 180, 1979-198 4,1994) に記載さ,れているような遺伝子工学的手法により、 容易に得ることがで きる。 その際、 発現した GAD 6 5またはその部分べプチドの単離 ·精製を容易 にするため、 その N末端側に例えば実施例に示すような 6〜7個連続したヒスチ ジン残基からなるぺプチドを結合させておくこともできる。
また、 3 0個アミノ酸程度のペプチドの混合物ならば各ペプチドを固相法によ る化学合成を用いれば容易に得る事が出来る。
GAD 6 5またはその部分べプチドは、 ヒ 卜等の哺乳動物の皮内および また は皮 の表面に投与され得るものであればいずれの製剤形態をも取りうるが、 注 射等によって皮内に投与できる剤型であるのが好ましい。 具体的には、 例えば、 診断上有効量の、 通常、 2 5〜 7 5重量％、 好ましくは、 4 0〜 6 0重量％程度 の GAD 6 5が生理食塩液等に溶解または懸濁しているものを挙げることができ る。 さらには、 皮内での拡散を'防ぐ目的でカリ ミ ヨウバンを加える事も出来る。 この目的には 1 0 %カリ ミヨゥバン溶液、 1 0 %炭酸ナトリウム溶液と抗原ぺプ チドの 3者で沈殿を形成させ、 この沈殿を更に生理食塩液に再懸濁して用いる。 この場合最終的に注射液中に含まれるカリ ミ ヨウバンの量は 0.2〜0.4%となる。 本発明においては、 GAD 6 5が皮内およびノまたは皮膚の表面の局所に留ま りやすいという観点から、 製剤中の GAD 6 5またはその部分べプチドの溶解性 は低い方が好ましく、 従って、 GAD 6 5またはその部分ペプチドの懸濁液が好 ¾ I： ' る。
また、 本発明においては、 上記製剤の pHは 6.0 〜7.0 の範囲となるように調整 して使用するのがよい。
被検個体の皮内および Zまたは皮膚の表面に、 GAD 6 5またはその部分ぺプ チドを含有する組成物を投与し、 該 GAD 6 5またはその部分ペプチドと該被検 -個体中の T細胞との皮; f反応により生じる皮膚の炎症の大きさを測定することに より、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患、 例えば、 インスリン依存 性糖尿病、 SUffman症候群、 ある種の自己免疫性甲状腺疾患などを早期診断また は予後診断することができる。 被検個体としては、 ヒ 卜、 マウス、 ラッ トなどの 哺乳動物などが挙げられる。
例えば、 インスリ ン依存性糖尿病 （ I DDM) の診断は、 次のような方法によ り行うことができ,る。 即ち、 上述の GAD 6 5またはその部分ペプチドを皮下注 射等によって被検個体の皮内に投与する。 その後、 通常 2日後に皮膚の腫脹ある いは発赤などの変化を測定する。 あるいは、 皮膚を引つ搔いて上述の GAD 6 5 またはその部分ペプチドを皮膚に密着させてもよい （スクラッチテスト） 。 その 後、 通常 4 8時間後に皮廣の腫脹あるいは発赤などの変化を測定する。 この皮慮 の腫脹あるいは発赤などの変化は、 次の機序によると考えられる。 GAD 6 5ま たはその部分べプチドが抗原提示細胞に取り込まれプロセスを受けた後、 抗原刺 激は T細胞へと伝えられる。 この結果活性化された T細胞は、 様々なサイ トカイ ンの放出や単核及び多核細胞群の動員といった炎症反応を引き起こす。
後述の実施例に示す通り、 この皮膚の腫脹あるいは発赤などの変化の程度は、 現在行われている放射性チミジンの取り込みによる I DDM診断とよく対応する ので、 予めその変化の程度、 例えば、 発赤の大きさや硬結の程度と I DDMの症 状との相関関係を求めておけば、 簡便に診断を行うことができる。
以下、 実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明の範囲はこれ らの実施例により限定されることはない。
GAD 6 5の部分ペプチドを利用した皮内反応の有用性を示すために、 インス リン依存性糖尿病を自然発症するモデル動物である NODマウス （Exp.Anim.29， 1-13, 1980) を用いて実験を行った。 ヒ トの場合、 ッベルクリン反応のように前 腕屈側面に皮内注射後、 その皮) tの発赤や硬結の程度を観察して評価すればよい c その他に、 スクラッチテストを行って評価する方法もある。 以下のマウスを用い た実験では、 皮下結合組織が密で注入した薬液が拡散しにくいフッ トパッ ドを用 いて皮内反応を観察した。
く例 1〉 マウス GAD 6 5の部分ペプチドの調製
- マウス GAD 6 5の C末端の 86ァミノ酸を含む部分べプチド （Biochem. Biophy sica Acta, 1216, 157-160, 1993) を以下のようにして、 調製した。
くマウス GAD 6 5ぺプチドの調製法〉 マウス脳より po A+RNAを単離し、 ォリゴ d Tプライマーと逆転写酵素を用い て c DN Aを合成した （このやり方については J.G1 in. Invest.90, 160-164, 1992 に記載の方法に従った） 。 この c DNA溶液を铸型として下記の化学合成した 2 種類のプライマ一を用いて P CRを行った。
正向きプライマ— ： 5' -CAGACATATGGCTCAACACACAAATGTCTGCTTC-3'
(配列番号 7 ) 逆向きプライマー ： 5' -CGGAATTCGGATCCTGAAACAGTTTGATGAGTGAGG-3'
(配列番号 8 ) 得られた P CR産物を制限酵素 BamHIと Ndelで二重消化する事により得られる DNA断片 （約 300bp)をァガロースゲル電気泳動にて分離し、 その後、 Qiagen社 DNA精製キッ 卜を用いて当該 DN Aを精製した。
発現べクタ一 pET14b (米国 Novagen社製）は制限酵素 BamHIと Ndelで二重消化し、 前項で得られた約 300bpの DNA断片と DNAリガーゼを用いて結合した。 環状 化したその DN A断片を組み込んだベクターを大腸菌 B L 2 1へ導入し、 この菌 を発現に供した。 具体的にはこの大腸菌を 50 /zg/mlアンピシリン添加い broth培 地で 600mnの吸光度が 0.7となるまで 3 7 °Cにて培養した後、 I PTGを終濃度 0.5 mMとなるよう添加した。 更に 3 7°Cで 3時間培養した後、 集菌した。
この菌体からの目的蛋白質の精製は Novagen社の His · Bind Resinと His · Bind B uffer Kitを用いて行った。 添付プロトコールのうち封入体に蛋白質が存在する 場合のやり方に従い、 6 M尿素存在下にニッケルカラムに発現蛋白質の N末端に 存在する 6個連続したヒスチジン残基を利用して精製した。 得られた蛋白質は、 配列番号 1に示すマウス GAD 6 5由来の部分べプチド （ 8 6アミノ酸） の N末 端側に、 発現ベクター pET14b由来の下記 2 3個のアミノ酸からなるペプチドが結 合した 1 0 9個のァミノ酸から成るものであった。
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu
Val Pro Arg Gly Ser His Met Val
' ( GSSHHHHHHSSGLVPRGSH V-) (配列番号 9 ) カラムから溶出されたペプチド溶液は phosphate buffered saline (P B S) に対して透析した。 この際にべプチドは不溶化するので遠心で沈殿を集めて再度 PB Sに再懸濁した。 この状態で一 8 0°Cにて長期安定に保存できる。
精製の過程でぺプチドは水に対して不溶性となったため、 この懸濁液を用いて 以下の実験を行った。
〈例 2〉 N 0 Dマウスのフッ トパッ ド腫脹の時間経過
GAD 6 5の部分べプチド 10 ig を 10%の力リ ミ ヨウバン溶液と共に混合した 後、 10%炭酸ナ卜リウム溶液にて pHを 6. 0—6. 3に調整した。 生じた沈澱を生理 食塩液で洗い、 最終的に 20 1 の生理食塩液に再懸濁した。 これを NODマウス の後左肢のフッ トパッ 卜へ皮下注射した。 その後に観察される腫脹を後肢の厚さ を精密ノギスにて測定することにより評価した。 その結果を第 1図に示した （第
1図の実線） 。 対照として、 同個体の後右肢にカリ ミ ョゥバンの炭酸ナトリウム による沈澱物のみを注射し、 その後に観察される腫脹を評価した （第 1図の点線） 48時間をピークにして GAD 6 5の部分べプチドを注射したマウスの後肢で腫脹 が観察された。 GAD 6 5の部分ペプチドに対する腫脹反応に雌雄差は認められ なカヽつた。
〈例 3 > 種々のべプチド抗^を投与した時のフッ ドパッ ドの腫脹
例 2で見られた後肢の腫脹が GAD 6 5の部分べプチドに対する特異的な反応 かどうかをみるため、 GAD 6 5の部分ペプチド以外の 2種類のペプチドを使用 して実験を行った。 GAD 6 5とは一次構造上相同性のないラッ トのシクロフィ リン （分子量 12000)と大腸菌のカルボキシルキヤリャ一タンパク質 （C C P :分 子量 22000)を選び、 GAD 6 5の部分ペプチド発現の場合 （例 1 ) と同じように 発現べクタ一 pET14bを用いて N末端にヒスチジンを 6残基含む形で大腸菌中で発 現させその後ニッケルキレートカラムを利用して精製を行った。 精製された両ぺ プチドを NODマウスの後肢に注射した 48時間後に後肢の腫脹を測定した。 その 結果、 第 2図に示す通り、 GAD 6 5の部分べプチドに対する反応はシクロフィ リンゃ C C Pに対する反応より有意に強いことが判明した。
〈例 4〉 各系統のマウスにおける GAD 6 5部分べプチドによるフッ トパッ ド の腫脹
糖尿病を自然発症しない系統のマウスである C 3 HZH e， C 5 7 B L, B a
1 b/c, B I O. Aやインスリ ン非依存性糖尿病を自然発症する系統のマウス である DBAで GAD 6 5部分べプチドに対する皮内反応が起こるかどうかを調 ベた。 方法は例 2と同様で、 各系統のマウス 4一 8匹 （12— 16週令） を対象に G AD 6 5部分べプチドに対するフッ 卜パッ ド試験を実施した。 その結果、 第 3図 に示すように、 ィ,ンスリ ン依存性糖尿病を自然発症する N 0 Dマウスは他の系統 のマウスに比べて有意に強い反応を示した。
く例 5〉 GAD 6 5部分ペプチドによる抗原刺激時の T細胞幼若化反応 例 2の実験で使用したのと同様の GAD 6 5の部分べプチドを刺激抗原として 放射性チミジンの取り込みを測定した （J.Clim. Invest.94， 2125- 2129, 1994 J. Ex P.Med.180, 1979-1984, 1994)。 用いたマウスは N 0 Dマウスの他、 インスリ ン依存 性糖尿病を自然発症しない系統の C 3 H/H e, B a 1 b/c, B I O. A, C 5 7 B Lの 4種類、 インスリン非依存性糖尿病を自然発症する DBAで、 全部で 6種類であった。 第 4図に示す通り、 ィンスリ ン依存性糖尿病を自然発症する N ODマウスの放射性チミジンの取り込み量は他の系統のマウスより有意に高く、 このことから、 NODマウスの GAD 6 5部分べプチドに対する細胞性免疫反応 は他の系統のマウスより高いことが明らかになった。
〈例 6> フッ トパッ ド腫脹反応と放射性チミジンの取り込み反応の相関 既存の細胞性免疫をみる方法である放射性チミジンの取り込み量 （例 5の実験） と本発明の方法による細胞性免疫の評価法である皮内反応の結果 （例 4の実験） との相関を調べた。 第 5図に示す通り、 両者の間には相関係数 （R) 力 .809 、 P値が 0.05以下の有意な相関が認められた。 従って、 GAD 6 5による皮内反応 法は、 従来の放射性チミジンの取り込み法に代わって、 細胞性免疫反応を十分評 価できることがわかった。 産業上の利用可能性
本発明の GAD 6 5またはその部分べプチドを含有してなる組成物を被検個体 の皮内および/または皮膚の表面に入れ、 適当な時間経過後にその腫脹、 発赤と 'いった皮虜の変化 （遅延型過敏反応） を観察するという非常に簡単な操作で、 同 抗原に対する細胞性免疫の評価を行うことができる。 それにより、 液性免疫の測 定だけでは困難であったィンスリ ン依存性糖尿病などの疾患の発症前診断や発病 後の予後判定が可能となった。 さらに、 従来の液性免疫の測定よりも手間が掛か らないために広く、 学童やインスリン非依存性糖尿病患者におけるスクリーニン グの目的にも使用できる可能性を有している。
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Π9Ί dsy JAi siH sAi dsy uio uio 3Md naq j/ί丄 jag ¾iv S!H }9Wl画 dfA!CW 8199C/.60AV 生物名 ： ヒ ト
配列
Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Tyr Asn He lie Lys Asn
5 10 15
Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp Gly Lys
20 配列番号： 4
配列の長さ ： 25
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ： ヒ ト
配列
Val Phe Asp Gly Lys Pro Gin His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe 1 5 10 15
Val Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp
20 25 配列番号： 5
配列の長さ ： 25
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
- 生物名 ： ヒ 卜
配列
Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys 1 5 10 15
Val Ala Pro Val He Lys Ala Arg Met Met
20 25 配列番号： 6
配列の長さ ： 25
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
起源
生物名 ： ヒ ト
配列
Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val Ser Tyr Gin
1 5 10 15
Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg
20 25 配列番号： 7
配列の長さ ： 3 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAGACATATG GCTCAACACA CAAATGTCTG CTTC 3 4
'配列番号： 8
配列の長さ ： 3 6
配列の型：核酸 P T
鎖の数：一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CGGAATTCGG ATCCTGAAAC AGTTTGATGA GTGAGG 3 6 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 2
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ser His Met Val
20

Claims

請 求 の 範 囲
1 - 哺乳動物の皮内および/または皮膚の表面において T細胞と反応して該哺乳 動物の皮膚に炎症を生じさせ得る、 6 5 Kグルタミン酸脱炭酸酵素（65K- glutami c acid decarboxylase: GAD 6 5) またはその部分ペプチドを含有してなる、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患の、 皮廣反応による診断のための 組成物。
2. GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患が、 インスリン依存性糖尿病 である、 請求の範囲第 1項記載の組成物。
3. 哺乳動物がヒ 卜である、 請求の範囲第 1項記載の組成物。
4. GAD 6 5がヒ ト、 ラッ トまたはマウスに由来するものである、 請求の範囲 第 1項記載の組成物。
5. GAD 6 5の部分べプチドが、 該酵素の C末端から 1 2 0個のァミノ酸配列 の範囲から選ばれるぺプチドである、 請求の範囲第 1項記載の組成物。
6. GAD 6 5の部分べプチドが、 該酵素の C末端から 1 2 0個のァミノ酸配列 のうちの 1 0〜 3 0個のァミノ酸からなるぺプチドの混合物である、 請求の範囲 第 1項記載の組成物。
7. GAD 6 5の部分ペプチドが、 配列番号 1のアミノ酸配列からなる、 請求の 範囲第 1項記載の組成物。
8. GAD 6 5の部分ペプチドが、 配列番号 2のアミノ酸配列からなる、 請求の 範囲第 1項記載の組成物。
9. 懸濁液の形態をとる、 請求の範囲第 1項記載の組成物。
1 0. 懸濁液が生理食塩水の懸濁液である、 請求の範囲第 9項記載の組成物。
1 1. さらにカリ ミ ヨウバンを含有する、 請求の範囲第 9項記載の組成物。
1 2. 被検個体の皮内および または皮膚の表面に、 GAD 6 5またはその部分 ぺプチドを含有する組成物を投与し、 該 GAD 6 5またはその部分べプチドと該 被検個体中の T細胞との皮膚反応により生じる皮^の炎症の大きさを測定するこ とにより、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患を診断する方法に用い られる、 請求の範囲第 1項記載の組成物。
1 3. 被検個体の皮内および または皮膚の表面に、 哺乳動物の皮内および/ま たは皮; *の表面において T細胞と反応して該哺乳動物の皮膚に炎症を生じさせ得 る GAD 6 5またはその部分べプチドを投与し、 該 GAD 6 5またはその部分べ プチドと該被検個体中の T細胞との皮/ f反応により生じる皮 Jfの炎症の大きさを 測定することにより、 GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患を診断する 方法。
1 4. 被検個体の皮内および Zまたは皮膚の表面に、 哺乳動物の皮内および/ま たは皮膚の表面において T細胞と反応して該哺乳動物の皮膚に炎症を生じさせ得 る GAD 6 5またはその部分べプチドを投与し、 該 GAD 6 5またはその部分べ プチドと該被検個体中の T細胞との皮虜反応により生じる皮慮の炎症の大きさを 測定することにより、 GAD 6 5に対する細胞性免疫を評価する方法。
1 5. GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患を皮膚反応により診断する ための、 哺乳動物の皮内および Zまたは皮廣の表面において T細胞と反応して該 哺乳動物の皮膚に炎症を生じさせ得る、 GAD 6 5またはその部分ペプチドの使 用 o
1 6. GAD 6 5が惹起する自己免疫反応を伴う疾患の、 皮廣反応による診断の ための組成物を製造するための、 哺乳動物の皮内および/または皮膚の表面にお いて T細胞と反応して該哺乳動物の皮廣に炎症を生じさせ得る、 GAD 6 5また はその部分べプチドの使用。
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