WO1997017438A1

WO1997017438A1 - Procede de clonage par expression d'un gene codant une proteine liee a un ligand

Info

Publication number: WO1997017438A1
Application number: PCT/JP1996/003233
Authority: WO
Inventors: Toshio Tanaka
Original assignee: Toshio Tanaka
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 1997-05-15
Also published as: EP0867505A1; AU703145B2; US6846624B1; EP0867505A4; AU7340196A

Description

明細書リガンド結合蛋白質をコードする遺伝子の発現クローニング方法技術分野

本発明は、リガンド結合蛋白質をコードする遺伝子の発現クローニング方法に関する。本発明によれば、有用な生物活性を有するリガンド結合蛋白質をコードする遺伝子を効率よくクローニングすることができる。背景技術

細胞の増殖や分化は、細胞外のシグナルが細胞の遺伝プログラムに作用するシグナル伝達のメ力ニズ厶より生ずる。シグナル伝達により初期に転写が修飾される遺伝子の多くは転写調節因子をコードする遺伝子である。このようなシグナル伝達を担う分子のあるものはリガンドと呼ばれる。

リガンドとは蛋白質に特異的に結合する分子であり、リガンドと結合する蛋白質をリガンド結合蛋白質という。リガンドとしては種々の薬剤、ヌクレオチド類、金属イオン等があり、リガンド結合蛋白質には、通常受容体（レセブ夕一）と呼称される蛋白質あるいは酵素、その他種々の生理活性蛋白質がある。リガンドはリガンド結合蛋白質と結合することにより、種々の生理活性のシグナル伝達に係わっていると考えられる。

リガンドの中でも、金属イオンは生体において重要な役割を果たしていることが知られている。たとえば、亜鉛イオンは数多くの転写調節因子に結合し、その機能発現に作用することが明らかにされている。また、転写調節因子は、発生、分化、炎症、細胞増殖などに関与することが知られている。しかしながら、転写調節因子は生体内に微量しか存在せず、その精製や分子構造の解析は困難であつた。

転写調節因子のあるものはジンクフィンガー（ z i n c f i n g e r ) 構造を有することが知られている。 Attar, R.M. ら（Mol. Cell. Biol. (1992) 12, 2432- 2443)は、血清応答因子（ s e r u m r e s p o n s e f a c t o r ) の DNAプローブを使用して血清応答因子に結合する z i n c f i n g e r構造を有する蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしたことを報告している。

ジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子のクローニングにはその特徴である基本構造に基づいたアミノ酸もしくは塩基配列の相同性を利用する方法を用いることができないと考えられている。既にク π—ニングされているジンクフィンガー蛋白質は、核内レセプ夕一を始め精製蛋白質の一部のアミノ酸配列に基づいて取得されたものが多いが、その他に G AT A転写因子群の様に転写調節領域に結合する蛋白質として同定されたもの（Tsai, S.-F. ら、 Nature ( 1989) 339, 446-451), Evans, T.ら（Cell (1989) 58. 877- 855)や、 T t g - 1遗伝子（Mcguire, E. A. ら、 Mol. Cell. Biol. (1989 ) 9, 2124-2132) の様に白血病細胞の染色体転座部位の構造解析の結果、ジンクフィンガー蛋白質であることが判明したものが知られている。同様に PML遗伝子も A P Lの染色体転座部位の解析から新たに同定されたもので、同じくジンクフィンガーであるレチノィン酸レセプター（RAR) と染色体転座によって融合した産物である PML— RARは白血病細胞の転写調節に深く関与していると考えられている（Kakizuka, ら、 Cell (1991) 66, 663-674, de Th e， H. ら、 Cell (1991) 66, 675-684)。この様にジンクフィンガー蛋白質は重要な機能を有しているが、標的 DNAを限定せず、リガンド、すなわち亜鉛イオンの結合という直接的な方法でしかも特異性の高い方法はこれまでにはみられなかった。発明の開示

本願発明者らは、効率よくリガンド結合蛋白質をコ一ドする遺伝子のクローニング方法について鋭意検討した結果、種々の遺伝子を含む D N Aライブラリーを使用し、これを発現させリガンドのリガンド結合蛋白質への結合性を利用してリガンド結合蛋白質を直接同定することにより、リガンド結合蛋白質を効率よく簡便に取得することができることを見出し本発明を完成させた。

従って、本発明は従来の方法では達成されなかった高い効率でリガンド結合蛋白質をコードする遺伝子をクロ一ニングする新規な方法を提供しょうとするものである。より詳しくは、亜鉛イオン結合蛋白質をコードする遺伝子を効率よく簡便にクローニングする新規な方法を提供する。

本発明は上記の課題を解決するため、発現ベクターに挿入された D N Aを導入した宿主をプレート培養し、該 D N Aを発現せしめ、該プレート上に膜を接触せしめることにより産生された蛋白質を前記プレートから前記膜に移行せしめ、該膜を前記プレートから剝がし取り、標識されたリガンドを該膜に添加して該リガンドを前記蛋白質に結合せしめ、該蛋白質に結合した標識を検出し、そして陽性を示した膜上の部位に対応するプレート上の宿主クローンから D N Aを単離することを特徴とするリガンド結合蛋白質をコードする遺伝子の発現クローニング方法を提供する。

本発明によれば、種々のリガンド結合蛋白質を、あらゆる細胞、組織から得ることが簡便になり、これらを標的分子とする医薬のスクリ一二ングが可能となった。発明の実施の形態

本発明の実施に当たってはまず、発現ベクター中に DNAを挿入して成る DNAライブラリーを用意する。 DNAの入手源としては、目的とするリガンド結合蛋白質をコードする D N Aをクローニングしょうとする任意の細胞、組織であることができ、例えば、脳、甲状腺、肺、心臓、胸腺、脾臓、脾臓、腎臓、副腎、腸、骨格筋、骨髄、上皮、臍帯、血管、血液等の組織、およびそれらに由来する細胞が挙げられる。これらの細胞、組織から取得する D N Aとしては c DNAでもジエノミック DNAでもよいが好ましくは c DNA がよい。 c DNAの場合、目的とする細胞、組織から mRNAを精製し、逆転写酵素により c DNAを合成しこれを使用することができる。上記の細胞、組織は正常なものでもよいし、特定の疾患に係わるリガンド結合蛋白質を対象とした場合には、対応する病的な状態のものでもよい。さらに、人工的に作り出した病的状態、すなわち各種の病態モデル由来の細胞、組織を使用することができる。また、これらの細胞、組織の由来は胎児または成人、ヒトまたはヒト以外の動物を問わない。

DNAライブラリーの作成は既知の常法に従って行うことができる。 DNAライブラリーを構成するための発現べクタ一としては D NAライブラリーの作成に常用されている任意のベクターを用いることができ、例えばファージベクタ一、プラスミドベクター等が使用される。これらは通常知られたプロモータ一、ェンハンサーなどの発現制御配列を含み、含有する DN Aを発現させることができるものであり、さらに発現誘導配列を含むものが好ましい。ファージベクターとしては、 λ ΖΑ Ρ, λ g t 1 1 等が挙げられる。

DNAライブラリーを構成する宿主としては、 DNAライブラリ —において常用されている、ベクターの感染性があるものであればよく、さらに、発現誘導の制御可能なものが好ましい。具体的には

、 Y 1 0 9 0等の大腸菌が挙げられる。発現ベクターとしては、揷入され D N Aを発現誘導剤の存在下で発現させるものが好ましく、このための発現誘導配列として、 1 a c オペロンの 1 a c プロモ一夕一やそれを改良した t a c プロモー夕一等が挙げられる。またそれに対応する発現誘導剤として、イソプロピル — D —チォガラクトシド（ I P T G ) が使用される。

次いで、前記 D N Aライブラリ一を構成する D N Aが挿入された発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を固体プレート培地上に接種し、培養する。培養は宿主細胞内で D N Aライブラリーが好適に発現されるような通常知られた条件で行えばよい。これにより、例えば、発現ベクターとしてファージベクターを使用した場合にはプラークが形成される。この培養により、発現の誘導を必要としない発現ベクターの場合には、挿入した D N Aの発現によりブラーク部分に蛋白質が産生され、前記プレート上に膜を接触せしめることにより産生された蛋白質を膜に移行させる。発現ベクターが D N Aの発現のために発現誘導剤を必要とする場合には、発現誘導剤を添加する。発現誘導剤を添加するには予め直接培養液に発現誘導剤を加えてもよいし、膜に発現誘導剤を含浸せしめてもよい。膜に発現誘導剤を添加した後、該膜を前記プレー卜の表面に接触せしめる。これにより、発現誘導剤が膜からプレート培地に移行し、該 D N Aによりコードされていた蛋白質の産生が誘導され、この蛋白質は前記膜に移行する。

本発明の方法に使用される膜としては、発現誘導剤を含浸せしめ、かつ蛋白質が移行し得る膜が好ましく、通常用いられているプロッティング膜、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等が使用される。次に、プレー卜から移行した培地成分や細胞等を除去するため膜を洗浄し、さらに蛋白質変性剤で処理してもよい。蛋白質変性剤としてはケア二ジン塩酸塩、尿素または種々の還元試薬等を使用することができる。蛋白質の変性は、前記の変性剤を含有する緩衝液、例えば、 T r i s— H C 1 緩衝液等により前記膜を処理することにより行う。この変性は菌体内で形成された蛋白質の好ましくない高次構造を一度破壊することにより、目的の蛋白質が容易にリガンドと結合しやすくするために行う。次に洗浄液、例えば T r i s — H C 1 緩衝液等により膜を洗浄することにより、前記蛋白質変性剤を洗浄除去する。次に、再生液より膜を処理することにより膜上の蛋白質を再生させる。

次に、膜を洗浄して再生液を除去した後、標識されたリガンドを含有する溶液を膜に適用する。リガンドとしては蛋白質に結合するものであればよく、種々の薬剤、ヌクレオチド類、金属イオン等が挙げられる。より好ましくは、リガンドは亜鉛イオンであり、放射活性を有する同位元素（ ^{6 5} Z n ) が好ましく例示される。

これにより、前記プレート上にリガンド結合蛋白質をコードする D N Aを含む宿主クローン（陽性クローン）が存在すれば、それに対応する膜上の蛋白質に標識されたリガンドが結合し、この標識を検出することにより、プレート上の陽性クローンの位置を決定することができる。標識及びその検出手段は、種々の生物学的アツセィに使用されている任意のものを使用することができ、例えばリガンドが金属イオンの場合には、その金属イオンの放射性同位元素を標識されたリガンドとして使用することができる。また、その他に、リガンドの性質に応じて蛍光標識、ピオチン標識、酵素標識、抗体標識を使用することができる。

検出手段としては標識物質に応じて任意の常用の手段を用いることができ、例えば標識されたリガンドとして金属ィォンの放射性同位体を用いる場合には、オートラジオグラフィーもしくはバイオイメ一ジアナライザ一により陽性スポットを同定し、それに対応する位置の前記プレート上の宿主クローンを同定することができる。また、その他の標識検出手段としては、上記標識物質に対応するものとして、画像解折装置等がある。

こうして得られた宿主クローンは、前記プレート培養から後のェ程を繰返し反応することにより純化することができる。こうして、陽性クローンが同定されれば、常法に従って宿主クローンの細胞からベクターを単離し、それから目的とする D NAを切り出すことができる。産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、あらゆる種の正常および病的細胞、組織からリガンド結合蛋白質をコードする DNAを非常に効率よくクロ —ニングすることができ、これらを標的分子とする医薬品のスクリ一ユングが可能となる。実施例

次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1.

ヒト肺発現 c DNAライブラリ一としては、 U n i — Z A P X R ライブラリー（Stratagene社製）を使用した。大腸菌（X L 1 一 B 1 u e , Stratagene社製）に感染させ、約 1 x 1 0 ⁴pfuの割合で 1 2 cm角プレートにトツプアガロースと混ぜてまいた。プレートを 4 2 °Cで約 3 — 4時間インキュベートした。プラークがある程度の大きさになった後、 2 0 mMイソプロピル — D—チォガラクトンド ( I P T G ) を染み込ませたニトロセルロース膜をプレート上にのせ、約 4 時間、 3 7 °Cでインキュベートし、蛋白質を発現させ膜上に転写させた。膜とプレートにマーキングをした後、膜をプレートから剝がし、 T B S T液（ 2 5 mM T r i s — H C 1 ( _PH 7. 5 ) ， 1 5 0 mM N a C 1 , 0. 0 5 % T w e e n 2 0 ) で膜を 4 °C で 1 時間洗った。

膜上の蛋白質を溶液 A ( 6 Mグァニジン H C 1 , 3 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 4 ) ， 5 mMジチオスレイト一ル（ D T T) ) で変性させた。溶液 B ( 3 0 mM T r i s — H C 1 ( pH 7. 4 ) , 1 5 0 mM N a C 1 ) でリンスしグァニジンを除去した後、溶液 C ( 3 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 7. 4 ) ， 1 5 0 mM N a C l , 2 mM D T T) で膜上の蛋白質を再生させた。再び膜を溶液 D ( 1 0 mM T r i s — H C 1 ( pH 7. 4 ) , 1 5 0 mM N a C l ) でリンスし、溶液 E ( 1 0 mM T r i s - H C l (pH7. 4 ) , 1 5 0 mM a C l , 1 0 pCi /ml⁶⁵ Z n ) で 1 5分間インキュベートした。その後、素早く溶液 F ( 1 0 mM T r i s - H C l ( pH 7. 4 ) , 1 5 0 mM N a C l ) で 1 0分間洗い、これを 3回繰り返した。

膜を十分乾燥させた後、オートラジオグラフィーを行い、 X線フイルム（コダック X A R— 5 ) に 4 日間感光させた。さらに、得られた陽性プラークに対して上記の操作を繰り返し、単一クローンを得、それらのクローンの一つの塩基配列を決定した。その結果、 k r u p p e l - 1 i k e z i n c ： f i n g e r p r o t e i nをコードする P L Z F ( p r o m y e l o c y t i c 1 e u k a e m i a z i n c f i n g e r ) 遺伝子の一部分をインサートに含んでいることが明らかになった。 P L Z Fは C末端側にいくつかのジンクフィンガーモチーフを持つ亜鉛イオン結合性の転写調節因子である。

実施例 2.

実施例 1 と同様の方法で、他の単一クローンを得て、その塩基配列を決定した。その結果、転写調節因子 J u n— i n t e r a c t i n g f a c t o r ( J i f ) 一 1遺伝子の一部分をインサートに含んでいることが明らかになった。そこで J i f 一 1の亜鉛ィォンとの結合性を調べるため、 P C R法により J i f - 1 をクロー二ングし、大腸菌を用いてグルタチオン— S— トランスフェラーゼ（ G S T) との融合蛋白質として発現させた。 G S T— J i f - 1融合蛋白質または G S T蛋白質を発現させた大腸菌の細胞溶解物の S D S— PAG Eを行い、ニトロセルロース膜に転写させた。 G S T - J i f 一 1融合蛋白質は亜鉛イオンと結合し、 G S T蛋白質は結合しなかったことから、 J i ί一 1 は亜鉛イオンと結合することが明らかとなった。

Claims

請求の範囲

1. 発現べクタ一に挿入された D N Aを導入した宿主をプレート培養し、該 D N Aを発現せしめ、該プレート上に膜を接触せしめることにより産生された蛋白質を前記プレー卜から前記膜に移行せしめ、該膜を前記プレ一卜から剥がし取り、標識されたリガンドを該膜に添加して該リガンドを前記蛋白質に結合せしめ、該蛋白質に結合した標識を検出し、そして陽性を示した膜上の部位に対応するプレート上の宿主クローンから D N Aを単離することを特徴とする、リガンド結合蛋白質をコ一ドする遺伝子の発現クローニング方法。

2. 前記リガンドが金属イオンである、請求項 1 に記載の発現ク口一ニング方法。

3. 前記金属イオンが亜鉛イオンである、請求項 2 に記載の発現クローニング方法。

4. 前記 D N Aが c D N Aである、請求項 1 に記載の発現クロー二ング方法。

5. 前記発現べクターが発現誘導剤の存在下でのみ挿入された D N Aを発現することができるものであり、該発現誘導剤の添加により該 D N Aを発現せしめる、請求項 1 に記載の発現クローニング方

6. 前記標識されたリガンドが放射性同位元素の金属ィォンである、請求項 1 又は 3 に記載の発現クローニング方法。

7. 前記検出の方法がォートラジオグラフィーである、請求項 1 又は 6 に記載の発現クローニング方法。