WO1997013524A1 - Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite du cd16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus vih - Google Patents

Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite du cd16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus vih Download PDF

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WO1997013524A1
WO1997013524A1 PCT/FR1996/001566 FR9601566W WO9713524A1 WO 1997013524 A1 WO1997013524 A1 WO 1997013524A1 FR 9601566 W FR9601566 W FR 9601566W WO 9713524 A1 WO9713524 A1 WO 9713524A1
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hiv
infection
cells
cd16s
virus
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Application number
PCT/FR1996/001566
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Inventor
Wolf H. Fridman
Jérome Galon
Nicole Haeffner-Cavaillon
Michel D. Kazatchkine
Nathalie Thieblemont
Catherine Sautes
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the use of a polypeptide having the activity of soluble human CDl ⁇ in the treatment of infection by the HIV virus.
  • RFC7III-I is a single chain receptor linked to the surface of the cell membrane by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) residue and expressed exclusively by the neutrophils which represent the most abundant cell type of the immune system.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • RFc ⁇ III-1 fixes the IgG1 and the IgG3 complexed, but not the IgG2 and the IgG4 (T. W. J. Huizinga et al., J. Immunol., 142, 2359, 1989).
  • RFc ⁇ III-2 is a membrane receptor expressed on so-called natural killer (NK) cells, macrophages and monocytes in culture (J. C. Edberg et al., J. Immunol., 144, 4729, 1990).
  • Fc-gamma receptors play an important role in the regulation of immune system reactions (W. H. Fridman et al., Immunol. Rev., 125, 49, 1992).
  • One of the properties of the Fc-gamma receptors is based on the existence of soluble forms which bind complexed IgGs. It has been shown that Fc-gamma receptors can be released in vitro in T cell culture supernatants and retain their specific affinity for the Fc fragment of IgG. These soluble receptors have been called IgGBF (Immunoglobulin G Binding Factor) (W. H. Fridman et al., Cell. Immunol., Ll, 442, 1974). These soluble forms also circulate in human biological fluids.
  • IgGBF Immunoglobulin G Binding Factor
  • RFc ⁇ lIIs also called soluble CD16 (CD16s)
  • RFc ⁇ lIIs soluble forms of RFc ⁇ lII
  • CD16s soluble CD16
  • CD16s or RFc ⁇ lIIs are produced by proteolysis of the two extracellular domains of membrane receptors (T. w. J. Huizinga et al., 1990, already cited).
  • CD16s can be determined according to known methods such as the isotypic specificity test for the binding of IgG described by Sectionlaud et al., 1993 (already cited) or the inhibition of rosette formation between erythrocytes covered with 'IgG and cells expressing RFc ⁇ lII receptors according to the method described by WH Fridman et al., Meth. Enzymol. , Flight. 116, 403, 1986.
  • CD16 The immunosuppressive biological properties described for CD16 allow their use in the field of autoimmune diseases, transplant rejection and lympho- O 97/13524 PC17FR96 / 01566
  • CD16s comprising cell attachment to the receptor of the complement fragment C3bi or CR3, also designated CDllb / CD18, as well as the inhibition of infection of monocytes by virus HIV opsonized, that is to say covered with complement, as well as with HIV virus opsonized by complement and anti-HIV antibodies.
  • CDllb / CD18 the complement fragment C3bi or CR3
  • An illustration of these properties is given later in the experimental part.
  • CD16s can therefore be used as a medicament, in particular as an agent for preventing the penetration of the HIV virus into target cells in the individual. healthy or as a dimi- nution of the viral load in the individual infected with the HIV virus.
  • the invention therefore relates to the use of a polypeptide having the activity of soluble human CD16 for preparing a pharmaceutical composition intended for the prevention or reduction of infection by the HIV virus in humans.
  • the use according to the invention makes it possible in particular to reduce the viral load in the individual already infected with the virus.
  • the subject of the invention is in particular the use characterized in that the polypeptide is a recombinant soluble CD16, that is to say a CD16s or RFc ⁇ lIIs obtained by recombinant DNA technology.
  • An example of preparation of a recombinant RFc ⁇ lIIs receptor and a variant thereof are described respectively in Example III and in Example IV of European patent application EP 0343950.
  • the subject of the invention is particularly the use characterized in that the recombinant soluble CD16 is a soluble human RFc ⁇ lII receptor having the amino acid sequence SEQ ID No. 1 shown in FIG. 1.
  • the recombinant soluble CD16 can be produced in prokaryotic cells, for example E. coli or in eukaryotic cells, for example yeast or mammalian cells such as L cells, CHO cells, BHK cells or COS cells.
  • RFc ⁇ lIIs having the amino acid sequence of FIG. 1 expressed in L cells is described in examples 1 and 2 of European patent application EP 0614978.
  • the invention particularly relates to the use for reducing the penetration or infection of target cells by the HIV-1 virus.
  • Target cells include monocytic cells as well as related cells such as for example microglia cells, dendritic cells and Langerhans cells of the skin.
  • compositions of the invention intended as a medicament for such therapeutic uses are prepared according to the usual methods and include as active ingredient a CD16s and an inert pharmaceutical excipient.
  • These compositions can be, for example, solid or liquid and can be presented in the galenical forms commonly used, for example, simple or coated tablets, capsules, capsules, granules, suppositories, ova, injectable preparations. .
  • the active principle can also be incorporated into micro ⁇ spheres or liposomes.
  • creams, ointments, gels, lotions, powders, emulsions, aerosols there may be mentioned creams, ointments, gels, lotions, powders, emulsions, aerosols. Among these, genital aerosols, oral aerosols, vaginal gels with applicator are particularly recommended.
  • the dose in these compositions may depend on the form used. It will in particular be between 0.01 and 1% of active ingredient.
  • compositions make it possible to administer a daily dose of CD16s which can vary from 0.5 to 10 mg / kg depending on the route of administration and the subject to be treated. Administration can be done, for example, parenterally, orally, rectally, nasally, vaginally or locally.
  • CD16s can be used according to the invention alone or as a mixture or in combination with other drugs indicated for treating infection with the HIV virus and which act at the same phase of viral infection, for example soluble CD4, or in later stages of the HIV infection cycle such as drugs that inhibit viral replication, such as a nucleoside antiretroviral drug such as as zidovudine (AZT), didanosine (ddl) or zalcitabine (ddC) or for example interferon alpha, which can be used alone or in combination as well as drugs aimed at strengthening the natural and specific defenses - that of the host against the virus, for example a cytokine such as interleukin-2 or an interferon.
  • drugs that inhibit viral replication such as a nucleoside antiretroviral drug such as as zidovudine (AZT), didanosine (ddl) or zalcitabine (ddC) or for example interferon alpha, which can be used alone or in combination as well as drugs aimed at strengthening the natural and specific
  • FIG. 1 represents the amino acid sequence (SEQ. ID No. 1) of the human soluble RFC ⁇ lII receptor described in patent application EP 0614978.
  • FIG. 2 represents the FACS analysis of the binding of soluble CD16 (SCD16) to monocytes of the THP1 line without preincubation (2b) or with preincubation with an anti-CR3 antibody (2c) or an anti-CD54 antibody (2d) compared to THP1 control cells (2a).
  • SCD16 soluble CD16
  • FIG. 3 represents the kinetics of production of p24 antigen by human monocytes either directly infected with HIV-1 (strain HTLV-III-B) opsonized (VO), or pretreated before infection with two anti-CR3 monoclonal antibodies ( VO + anti-CR3) or with soluble CD16 (VO + CD16S), the production being measured on D3, D6, D9 and D12 after the viral infection compared to a direct infection with non-opsonized virus (V).
  • FIG. 3 represents the kinetics of production of p24 antigen by human monocytes either directly infected with HIV-1 (strain HTLV-III-B) opsonized (VO), or pretreated before infection with two anti-CR3 monoclonal antibodies ( VO + anti-CR3) or with soluble CD16 (VO + CD16S), the production being measured on D3, D6, D9 and D12 after the viral infection compared to a direct infection with non-opsonized virus (V).
  • FIG. 3 represents the kinetics of production of
  • p24 antigen at D10 represents the production of p24 antigen at D10 by human monocytes either directly infected by opsonized HIV-1 (VO) or by opsonized HIV-1 and coated with anti-HIV antibodies (VO + anti-HIV), or pretreated before infection with one or more of the following agents: anti-CR3 antibody (anti-CR3), control antibody (Ac Ctl), soluble CD16 (CD16S) or denatured soluble CDl ⁇ (CD16SD).
  • anti-CR3 antibody anti-CR3
  • control antibody Ac Ctl
  • CD16S soluble CD16
  • CD16SD denatured soluble CDl ⁇
  • Example 1 Ability of the CD16s to attach to the CR3 receiver (CDllb / CD18)
  • CD16s to use as cell receptor the receptor for the fragment of the complement C3bi or CR3 (CD11b / CD18) is demonstrated by experiments of O 97/13524 PC17FR96 / 01566
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • THP1 cells (ATCC TIB 202) prepared according to the usual methods are incubated in PBS at 0.5 % BSA for 30 minutes at 4 ° C. with 25 ⁇ g / ml of recombinant CD16s prepared according to Example 1 of European patent application EP 0614978, in BHK cells instead of L cells, then coupled to the biotin. The cells are then washed and then incubated for 30 min at 4 ° C with the SAPE conjugate (6 ⁇ g / ml).
  • FIG. 2 shows the results obtained expressed as an average fluorescence intensity as a function of the number of cells.
  • the intensity of the fluorescence in FIG. 2b shows that CD16s binds to the target cells compared to the intensity of the control fluorescence (FIG. 2a).
  • Example 2 Ability of CDl ⁇ s to inhibit the release of the p24 antigen of the HIV virus by infected human monocytes.
  • Demonstration of the inhibition of the release of the p24 antigen is carried out by pretreating the monocytes with CD16s or with two anti-CR3 antibodies as controls, before infection with opsonized HIV, according to the following conditions:
  • the kinetics of production of the p24 antigen represented in FIG. 3 shows an inhibition of the release of this with the pretreatment with CD16s. The inhibition is comparable to that observed when the monocytes are pretreated with anti-CR3-control antibodies. These results show that CDl ⁇ s is capable of blocking the infection of human monocytes by opsonized HIV. 2) Infection with the opsonized HIV virus and coated with anti-HIV antibodies.
  • HIV-1 virus above opsonized and coated with anti-antibodies.
  • HIV (noted VO + anti-HIV) obtained by incubation of viral particles with human seronegative serum and a mixture of mouse anti-HIV monoclonal antibodies, anti-gp 120 (clones 104.1, 119.1, 157.12 and 105.34) and anti gp 41 (clone 9.11) (Institut Pasteur, Hybridolab laboratory). The production of the p24 antigen was measured in comparison with an infection with the opsonized virus (denoted VO).
  • the monocytes were incubated before the viral infection, as indicated above, in the presence of the two anti-CR3 antibodies above (noted anti-CR3) or of a control antibody W6 / 32 ATCC HB95 (noted Ac Ctl) or recombinant CD16s above (denoted CD16S), possibly denatured beforehand by heating (denoted CD16SD).
  • the production of the p24 antigen is measured on D10 after infection.
  • the results represented in FIG. 4 show that CD16s strongly inhibits (around 90%) the production of p24 antigen by monocytes infected with opsonized HIV virus and coated with anti-HIV antibodies whereas denatured CD16s has no inhibitory effect.
  • CD16s in individuals already infected, such as HIV-positive individuals and individuals who reach the AIDS stage of the disease.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble pour préparer une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou la diminution de l'infection par le virus VIH chez l'homme.

Description

Utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus VIH
La présente invention concerne l'utilisation d'un poly- peptide ayant l'activité du CDlβ humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus VIH.
Deux types de récepteurs Fc-gamma III humains ou CDlβ, respectivement RFC7III-I (désigné aussi RFcγlIIB) et RFcγIII-2 (désigné aussi RFcγlIIA) qui possèdent des struc- tures et des expressions cellulaires différentes, ont été décrits (J. V. Ravetch et al., J. Exp. Med., 170, 481, 1989). RFC7III-I est un récepteur à une seule chaîne lié à la sur¬ face de la membrane cellulaire par un résidu glycosyl- phosphatidylinositol (GPI) et exprimé exclusivement par les neutrophiles gui représentent le type cellulaire le plus abondant du système immunitaire. RFcγIII-1 fixe les IgGl et les IgG3 complexées, mais pas les IgG2 et les IgG4 (T. W. J. Huizinga et al., J. Immunol., 142, 2359, 1989). Deux allèles du gène codant pour le RFcγIII-l, appelés respectivement NA1 et NA2, ont été clones (P. A. Ory et al., J. Clin. Invest., 84, 1688, 1989). RFcγIII-2 est un récepteur membranaire exprimé sur les cellules dites natural killer (NK) , les macrophages et les monocytes en culture (J. C. Edberg et al., J. Immunol., 144, 4729, 1990). Les récepteurs Fc-gamma jouent un rôle important dans la régulation de réactions du système immunitaire (W. H. Fridman et al., Immunol. Rev. , 125, 49, 1992). Une des propriétés des récepteurs Fc-gamma repose sur l'existence de formes solubles qui lient les IgG complexées. II a été montré que les récepteurs Fc-gamma peuvent être libérés in vitro dans des surnageants de cultures de cellules T et conserver leur affinité spécifique pour le fragment Fc des IgG. Ces récepteurs solubles ont été appelés IgGBF (Immu- noglobulin G Binding Factor) (W. H. Fridman et al., Cell. Immunol., ll, 442, 1974). Ces formes solubles circulent également dans les liquides biologiques humains.
Ainsi des formes solubles de RFcγlII (RFcγlIIs) , que l'on nomme aussi CD16 soluble (CD16s) , sont elles détectées dans des surnageants de cultures de cellules du sang périphé¬ rique (W. H. Fridman et al., Immunol. Rev. , 56, 51, 1981) et dans du sérum humain (T. W. J. Huizinga et al. , J. Clin. Invest., 86, 416, 1990) ou dans la salive (C. Teillaud et al., Journal de Parodontologie, Vol 12, N°i, l, 1992). Chez des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humain (VIH), D. Kayat et al., J. Inf. Dis., 161, 430, 1990, ont montré une corrélation entre le taux de CD16s dans le sérum et le taux des paramètres biologiques les plus impor- tants de la maladie (diminution des lymphocytes CD4+, augmen¬ tation de l'antigène p24 ainsi qu'avec le stade clinique de 1'infection.
Les CD16s ou RFcγlIIs sont produits par protéolyse des deux domaines extracellulaires des récepteurs membranaires (T. w. j. Huizinga et al., 1990, déjà cité).
La préparation d'une forme soluble de RFcγlII recombi¬ nant humain constituée d'une chaîne polypeptidique de 188 acides aminés a été décrite dans la demande de brevet euro¬ péenne EP-A-0343950 ainsi que son utilisation dans le traite- ment du purpura thrombocytopénique immun. D'autre part, C. Teillaud et al., Blood, 82, 3081-3090, 1993, a décrit un CD16s recombinant humain ayant 194 acides aminés qui contient les deux domaines extracellulaires du RFcγIII exprimé par les neutrophiles. Ce récepteur a une activité immunosuppressive et se lie aux IgG humaines ainsi qu'à une fraction des cellu¬ les mononuclées du sang périphérique contenant des monocytes ainsi qu'un faible pourcentage de cellules T et NK et de lymphocytes B.
L'activité du CD16s peut être déterminée selon les méthodes connues telle que le test de spécificité isotypique de la fixation des IgG décrit par Teillaud et al., 1993 (déjà cité) ou l'inhibition de la formation de rosettes entre des érythrocytes couverts d'IgG et des cellules exprimant des récepteurs RFcγlII selon la méthode décrite par W. H. Fridman et al., Meth. Enzymol. , Vol. 116, 403, 1986.
Les propriétés biologiques immunosuppressives décrites pour les CDl6s permettent leur utilisation dans le domaine des maladies autoimmunes, des rejets de greffe et des lympho- O 97/13524 PC17FR96/01566
3 proliférations malignes.
Les inventeurs viennent de mettre en évidence de nou¬ velles propriétés biologiques du CD16s humain comprenant la fixation cellulaire au récepteur du fragment du complément C3bi ou CR3, désigné aussi CDllb/CD18, ainsi que l'inhibition de l'infection des monocytes par du virus VIH opsonisé, c'est-à-dire recouvert de complément, ainsi que par du virus VIH opsonisé par le complément et des anticorps anti-VIH. Une illustration de ces propriétés est donnée plus loin dans la partie expérimentale.
En l'absence d'un traitement anti-viral capable d'éradi¬ quer le VIH chez les personnes infectées, les stratégies thérapeutiques actuelles s'orientent vers des combinaisons de plusieurs traitements. Ces combinaisons cherchent à utiliser des médicaments agissant à différentes phases du cycle de l'infection virale : pénétration dans la cellule cible ; transcription inverse de l'ARN viral en ADN ; intégration de l'ADN viral dans le génome de l'hôte ; transcription de l'ADN viral ; synthèse de nouvelles particules virales. L'obtention de nouveaux médicaments contribuant à ces approches thérapeutiques dans le domaine du SIDA est particu¬ lièrement recherchée, notamment l'approche thérapeutique au niveau de la pénétration du virus VIH.
De nombreux travaux portant sur l'étude de la pénétra- tion du virus VIH dans les cellules cibles n'ont pas abouti à définir des médicaments efficaces à ce niveau. Par exemple, D. Klatzmann et al., Science, 225, 59, 1984 ont montré le rôle du récepteur CD4 dans la pénétration du VIH in vitro et in vivo. Mais le blocage du récepteur CD4 par des anticorps dirigés contre le site de fixation du virus sur cette molé¬ cule ne prévient pas l'infection des cellules cibles expri¬ mant le CD4 par le virus opsonisé par le complément seul ou par le complément et des anticorps anti-VIH.
En raison de sa capacité inattendue à bloquer l'infec- tion de monocytes humains par le virus VIH opsonisé, le CDl6s peut donc être utilisé comme médicament, notamment comme agent de prévention de la pénétration du virus HIV dans les cellules cibles chez l'individu sain ou comme agent de dimi- nution de la charge virale chez l'individu infecté par le virus VIH.
L'invention concerne donc l'utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble pour préparer une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou la diminution de l'infection par le virus VIH chez l'homme. On entend par polypeptide ayant l'activité du CDlβ humain soluble un CD16s naturel, un CD16s obtenu par synthèse chimique ou un CD16s recombinant qui inhibe l'infection de cellules monocytaires par le VIH opsonisé. Des exemples d'inhibition de l'infection par un CD16s sont décrits plus loin dans la partie expérimentale utilisant un test in vitro dans lequel des cellules monocytaires THP1 sont infectées par le virus VIH-1 opsonisé. L'infection par le virus est mesurée par détection de l'antigène p24 à l'aide d'un test ELISA.
Par prévention, on entend l'utilisation chez des indivi¬ dus sains exposés au virus VIH. L'utilisation selon l'inven¬ tion permet notamment de diminuer la charge virale chez l'individu déjà infecté par le virus. L'invention a pour objet notamment l'utilisation carac¬ térisée en ce que le polypeptide est un CD16 soluble recombi¬ nant, c'est-à-dire un CD16s ou RFcγlIIs obtenu par la technologie de l'ADN recombinant. Un exemple de préparation d'un récepteur RFcγlIIs recombinant et d'un variant de celui- ci sont décrits respectivement à l'exemple III et à l'exemple IV de la demande de brevet européenne EP 0343950.
L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation caractérisée en ce que le CD16 soluble recombinant est un récepteur RFcγlII humain soluble ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°l montrée à la figure 1. Le CD16 soluble recombinant peut être produit dans des cellules procaryotes, par exemple E. coli ou dans des cellules eucaryotes, par exemple une levure ou des cellules de mammifères telles que les cellules L, des cellules CHO, des cellules BHK ou des cellules COS. Un exemple de préparation d'un récepteur
RFcγlIIs ayant la séquence en acides aminés de la figure 1 exprimé dans des cellules L est décrit à l'exemple 1 et 2 de la demande de brevet européenne EP 0614978. L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation pour réduire la pénétration ou l'infection des cellules cibles par le virus VIH-l. Les cellules cibles comprennent les cellules monocytaires ainsi que des cellules apparentées telles que par exemple les cellules de la microglie, les cellules dendritiques et les cellules de Langerhans de la peau.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention desti¬ nées à titre de médicament à de telles utilisations thérapeu- tiques sont préparées selon les méthodes usuelles et compren¬ nent comme principe actif un CD16s et un excipient pharmaceu¬ tique inerte. Ces compositions peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes galéni- ques couramment utilisées, par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les capsules, les granules, les suppositoires, les ovules, les préparations injectables. Le principe actif peut être aussi incorporé dans des micro¬ sphères ou des liposomes. Dans le cas de formes galéniques habituelles propres à assurer au mieux un traitement préven- tif, on peut citer les crèmes, pommades, gels, lotions, poudres, émulsions, aérosols. Parmi celles-ci, les aérosols génitaux, les aérosols oraux, les gels vaginaux avec applica- teur sont tout particulièrement recommandés. La dose dans ces compositions peut dépendre de la forme utilisée. Elle sera notamment comprise entre 0,01 et l % de principe actif.
Les compositions pharmaceutiques permettent d'adminis¬ trer une dose quotidienne de CD16s qui peut varier de 0,5 à 10 mg/kg selon la voie d'administration et le sujet à traiter. L'administration peut être faite, par exemple, par voie parentérale, orale, rectale, nasale, vaginale ou locale.
Le CD16s peut être utilisé selon l'invention seul ou en mélange ou en association avec d'autres médicaments indiqués pour traiter l'infection par le virus VIH et qui agissent à la même phase de l'infection virale, par exemple le CD4 soluble, ou à des phases ultérieures du cycle de l'infection VIH tels que les médicaments inhibant la réplication virale, par exemple un médicament antirétroviral nucléosidique tel que la zidovudine (AZT) , la didanosine (ddl) ou la zalcita- bine (ddC) ou par exemple l'interféron alpha, qui peuvent être utilisés seuls ou en association ainsi que des médica¬ ments visant à renforcer les défenses naturelles et spécifi- ques de l'hôte contre le virus, par exemple une cytokine telle que 1 'interleukine-2 ou un interféron.
Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention :
La figure l représente la séquence en acides aminés (SEQ. ID N° 1) du récepteur RFCγlII soluble humain décrit dans la demande de brevet EP 0614978.
La figure 2 représente l'analyse par FACS de la fixation du CD16 soluble (SCD16) aux monocytes de la lignée THP1 sans préincubation (2b) ou avec préincubation avec un anticorps anti-CR3 (2c) ou un anticorps anti-CD54 (2d) comparativement aux cellules-contrôles THP1 (2a) .
La figure 3 représente la cinétique de production d'antigène p24 par des monocytes humains soit directement infectés par VIH-1 (souche HTLV-III-B) opsonisé (VO) , soit prétraités avant l'infection avec deux anticorps monoclonaux anti-CR3 (VO + anti-CR3) ou avec du CD16 soluble (VO + CD16S) , la production étant mesurée à J3 , J6, J9 et J12 après l'infection virale comparativement à une infection directe par du virus non opsonisé (V) . La figure 4 représente la production d'antigène p24 à J10 par des monocytes humains soit directement infectés par VIH-1 opsonisé (VO) ou par VIH-l opsonisé et recouvert d'anticorps anti-VIH (VO+anti-VIH) , soit prétraités avant l'infection avec l'un ou plusieurs des agents suivants : anticorps anti-CR3 (anti-CR3) , anticorps contrôle (Ac Ctl) , CD16 soluble (CD16S) ou CDlβ soluble dénaturé (CD16SD) .
Les exemples suivants illustrent 1 ' invention sans la limiter. Exemple 1 : Capacité du CD16s à se fixer au récepteur CR3 (CDllb/CD18)
La propriété du CD16s à utiliser comme récepteur cellu¬ laire le récepteur du fragment du complément C3bi ou CR3 (CDllb/CD18) est mise en évidence par des expériences d'inhi- O 97/13524 PC17FR96/01566
7 bition à l'aide de la technologie de l'analyse cytofluori- métrique.
La fixation du CD16s aux cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) a été décrite par Teillaud et al., Blood, 82, 1993, 3081-3090, par incubation des cellules avec le CDl6s couplé à la biotine puis avec le conjugat streptavidine-phycoerythrinine (SAPE) et par détection par analyse FACS.
Le test d'inhibition de la fixation du CD16s aux PBMC ou à la lignée monocytaire THP1 a été réalisé de la façon suivante : IO6 cellules de THP1 (ATCC TIB 202) préparées selon les méthodes usuelles sont incubées dans du PBS à 0,5 % BSA pendant 30 minutes à 4°C avec 25 μg/ml de CD16s recombi¬ nant préparé selon l'exemple 1 de la demande de brevet euro- péen EP 0614978, dans des cellules BHK au lieu de cellules L, puis couplé à la biotine. Les cellules sont ensuite lavées puis incubées pendant 30 mn à 4°C avec le conjugat SAPE (6 μg/ml) . Après trois lavages, 5000 cellules viables sont analysées sur un FACScan (Becton Dickinson) par rapport aux cellules-contrôles. Dans les expériences d'inhibition de la fixation, les cellules THP1 sont préincubées pendant 30 mn à 4°C avec différents anticorps monoclonaux (10 μg/ml) , lavées puis incubées avec le CDl6s couplé à la biotine puis avec le SAPE, comme indiqué ci-dessus. La figure 2 montre les résultats obtenus exprimés en moyenne d'intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules. L'intensité de la fluorescence à la figure 2b montre que CD16s se fixe sur les cellules cibles comparative¬ ment à l'intensité de la fluorescence contrôle (figure 2a). Lorsque les cellules sont préalablement préincubées avec l'anticorps monoclonal anti-CR3 (0YM1 ; Orthσdiagnotics) , l'intensité moyenne de fluorescence est inhibée (figure 2c) alors que l'anticorps monoclonal contrôle anti-CD54 (LB-2 ; Becton Dickinson) n'a pas d'effet sur la fixation du CDl6s (figure 2d) .
Les résultats obtenus indiquent que le CD16s se fixe sur les monocytes humains de façon inattendue en utilisant le récepteur CR3 (CDllb/CD18) . Exemple 2 : Capacité du CDlβs à inhiber la libération de l'antigène p24 du virus VIH par les monocytes humains infec¬ tés.
1) Infection par le virus VIH opsonisé. La production de l'antigène p24, marqueur de l'infection virale et reflet de la réplication virale VIH, est faite par infection de monocytes humains avec le virus VIH-1 (souche HTLV-III-B) préalablement opsonisé par incubation des parti¬ cules virales avec du sérum humain séronégatif selon le protocole expérimental décrit par N. Thieblemont et al., Clin. Exp. Immunol., 106-113, 1993.
La mise en évidence de l'inhibition de la libération de l'antigène p24 est réalisée en prétraitant les monocytes avec le CD16s ou avec deux anticorps anti-CR3 comme contrôles, avant l'infection par VIH opsonisé, selon les conditions suivantes :
5 X 105 monocytes humains sont incubés à 37°C pendant 3 heures dans le milieu de culture seul ou en présence du CD16s recombinant ci-dessus (3 μg/ml) ou des anticorps anti- CR3 (OKMχ ; Orthodiagnostics et 4B3 ; N. Thieblemont et al., déjà cité) (10 μg/ml) , puis incubés avec le virus VIH-1 opsonisé (noté VO) . Les surnageants cellulaires sont prélevés aux jours J3, J6, J9 et J12 et remplacés par du milieu conte¬ nant les mêmes quantités de CDlβs ou des anticorps anti-CR3 ou de milieu seul. L'antigène p24 est dosé par la méthode ELISA (ELISA NEN) dans les surnageants cellulaires jusqu'à J12 après l'infection virale.
La cinétique de production de l'antigène p24 représentée figure 3 montre une inhibition de la libération de celui-ci avec le prétraitement avec du CD16s. L'inhibition est compa¬ rable à celle observée lorsque les monocytes sont prétraités avec des anticorps anti-CR3-contrôles. Ces résultats montrent que le CDlβs est capable de bloquer l'infection de monocytes humains par le VIH opsonisé. 2) Infection par le virus VIH opsonisé et recouvert d'anti¬ corps anti-VIH.
Des infections de monocytes ont été réalisées avec du virus VIH-1 ci-dessus opsonisé et recouvert d'anticorps anti- VIH (noté VO + anti-VIH) obtenu par incubation de particules virales avec du sérum séronégatif humain et un mélange d'anticorps monoclonaux de souris anti-VIH, anti-gp 120 (clones 104.1, 119.1, 157.12 et 105.34 ) et anti-gp 41 (clone 9.11) (Institut Pasteur, laboratoire Hybridolab) . La produc¬ tion de l'antigène p24 a été mesurée comparativement à une infection avec le virus opsonisé (noté VO) .
Les monocytes ont été incubés avant l'infection virale, comme indiqué ci-dessus, en présence des deux anticorps anti- CR3 ci-dessus (noté anti-CR3) ou d'un anticorps contrôle W6/32 ATCC HB95 (noté Ac Ctl) ou du CD16s recombinant ci- dessus (noté CD16S) , éventuellement préalablement dénaturé par chauffage (noté CD16SD) . La production de l'antigène p24 est mesurée à J10 après l'infection. Les résultats représentés figure 4 montrent que le CD16s inhibe fortement (environ 90 %) la production d'antigène p24 par les monocytes infectés par du virus VIH opsonisé et recouvert d'anticorps anti-VIH alors que le CD16s dénaturé n'a pas d'effet inhibiteur. L'inhibition de l'infection des monocytes par le virus VIH-1 recouvert de complément et d'anticorps anti-VIH, ce qui est la situation des particules virales chez les individus séropositifs, permet de prévoir une efficacité de l'utilisa¬ tion du CD16s chez les individus déjà infectés, tels que les individus séropositifs et les individus qui atteignent le stade SIDA de la maladie.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: ROUSSEL UCLAF
(B) RUE: 102, Route de Noisy
(C) VILLE: ROMAINVILLE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 93230
(G) TELEPHONE: (33) 1.49.91.49.91 (H) TELECOPIE: (33) 1.49.91.46.10
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble dans le traitement de l'infection par le virus VIH.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(x) INFORMATION DE LA PUBLICATION:
(H) NUMERO DU DOCUMENT: EP 0614978 Al
(I) DATE DE DEPOT: 08-MAR-1994
(J) DATE DE PUBLICATION: 14-SEP-1994
(K) RESIDUES PERTINENTS DANS LA SEQ ID NO: 1 : DE 1 JUSQU'AU 194 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gin Trp 1 5 10 15
Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gin Gly Ala 20 25 30
Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gin Trp Phe His Asn Glu Ser Leu 35 40 45
Ile Ser Ser Gin Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asn 50 55 60
Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gin Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp 65 70 75 80
Pro Val Gin Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gin Ala Pro 85 90 95
Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser 100 105 110
Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gin Asn Gly Lys 115 120 125
Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys Ala 130 135 140
Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser 145 150 155 160
Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gin Gly Leu 165 170 175
Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Arg 180 185 190
Leu Val

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un polypeptide ayant l'activité du CD16 humain soluble pour préparer une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou la diminution de l'infection par le virus VIH chez l'homme.
2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le polypeptide est un CD16 soluble recombinant.
3) Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que le CD16 soluble recombinant est un récepteur RFcγlII humain soluble ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°l de la figure 1.
4) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 pour réduire la pénétration ou l'infection des cellules cibles par le virus VIH-1.
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