WO1991008301A1 - PROTEINES EMPECHANT L'INTERACTION ENTRE UN FRAGMENT Fc D'UNE IMMUNOGLOBULINE ET SON RECEPTEUR ET UTILISATION EN THERAPEUTIQUE, NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES AFFECTIONS LIEES AUX VIRUS HIV - Google Patents

PROTEINES EMPECHANT L'INTERACTION ENTRE UN FRAGMENT Fc D'UNE IMMUNOGLOBULINE ET SON RECEPTEUR ET UTILISATION EN THERAPEUTIQUE, NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES AFFECTIONS LIEES AUX VIRUS HIV Download PDF

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PCT/FR1990/000871
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David Khayat
Claude Soubrane
Philippe-Hervé HIREL
Sophie Visonneau
Roger Mouawad
Claude +Di Jacquillat
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Universite Pierre Et Marie Curie
Rhone Poulenc Sante
Jacquillat, Annie +Lf
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Definitions

  • the invention relates to proteins preventing the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its receptor as well as the use of these proteins in the treatment of autoimmune and viral immunosuppressive diseases.
  • the present invention relates in particular to the treatment of affections linked to HIV viruses with antibodies directed against the immunoglobulin receptors of the IgG type.
  • receptors that allow a relationship between antibodies and cells of immunity.
  • some have a specific affinity for the Fc fragment of the immunoglobulins.
  • CD 16 antigens carried by the Fc gamma R II I receptor are differentiation antigens expressed by human cells belonging to the following populations: so-called "natural killer” (NK) cells, K cells, macrophages, neutrophils and eosinophils and a subpopulation of T cells ( CD 16 + , CD 3 + ). They are specifically recognized by a series of monoclonal antibodies, the most used of which are 3G8 and anti-leu 11 B. (Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol. 1988; 6: 251-281).
  • the anti-CD 16 3G8 antibody is a mouse monoclonal antibody of the IgG 1 class, described and isolated by FLEIT (FLEIT et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA, 1982,79, 3275-3279) and resulting after cloning in agarose, the fusion of spleen cells of CD 2 F1 mice immunized intraperitoneally 2 weeks apart with 5 ⁇ 10 6 viable polynuclear cells and of P 3 U myeloma cells.
  • This monoclonal antibody is directed against the low affinity type III Fc receptor carrying the CD 16 antigen. It is studied and selected for its ability to inhibit the formation of ElgG rosettes (Unkeless et al. J. Exp. Med. 1979, 150,580).
  • the antibody is thus able to block in vitro the recognition of the Fc part of type G immunoglobulins by the CD 16 receptor.
  • the number of sites for binding of 3G8 to polynuclear cells is approximately 120,000 per cell.
  • This antibody recognizes a high proportion of monocytes cultured in vitro for several days, as well as certain specific cells such as pulmonary macrophages. (CLARKSON et al. J. Exp. Med, 1988; 167: 408-417).
  • this antibody blocks the Fc receptors inhibiting the phagocytosis of opsonized particles such as platelets coated with autoimmune antibodies. It was observed that the NK activity of the patients was strongly inhibited.
  • CD 16 antigens are carried by receptors for the Fc fragment of low affinity IgG or hu-Fc-gamma RIII. They have a preferential affinity for IgG aggregated or involved in complex immune systems.
  • CD 16 plays a key role in the clearance of IgG immune complexes (for which they have a particular affinity) whose role has been demonstrated in both primates and humans affected by autoimmune thrombocytopenic purpura by injection in vivo of a monoclonal antibody specific for the receptor (3G8), a key role finally in all phenomena of ADCC phagocytosis (cell cytotoxicity dependent antibody), recognition and presentation of antigens by competent cells of the immune system.
  • IgG anti P 815 Y rabbit (dilution 1/10000 e) or chicken erythrocytes sensitized with a 1/100 dilution of an IgG anti-chicken erythrocyte rabbit are used as target cells by PBL (lymphocytes peripheral blood) and monocytes.
  • PBL lymphocytes peripheral blood
  • monocytes monocytes.
  • the different antibodies ascites or supernatants are incubated during incubation periods. The concentration of the antibody is kept constant in each well.
  • NK cells The stimulation of NK cells in vitro by different immunological entities such as: anti-CD16 antibody type 3G8, immune complexes among other stimulatory antigens has been described (ANEGON et al., J.Exp. Med., 1988, 167,452-472; CUTURI et al., J. Exp. Med., 1989, 169, 569-583).
  • anti-CD16 antibody type 3G8 immune complexes among other stimulatory antigens
  • peripheral blood lymphocytes are cultured at 37 ° C. with RPMI 8866 lymphoblastoid cells irradiated with 50 grays for 10 days (5: 1 PBM / lymphoblastoid cells, 2.5 x 10 5 PBM / ml / RPMl / 10% FCS) in 5% CO 2 culture plates.
  • RPMI medium medium 1640
  • the total number of cells after 10 days of culture is increased by 10 times and the cell population comprises 60 to 80% of NK CD 16 + cells / NKH 1 + / CD 3- and 20 to 40% of T cells CD 3 + / CD 16-NKH 1-.
  • the rosette-forming ligands are anti CD 16 (3 G 8) antibodies linked to sepharose 4 B activated with cyanogen bromide (5 mg antibody / ml sepharose, 5 microliters of beads for 10 6 cells) and immune complexes, ie IgG antibodies sensitized by beef erythrocytes (EA7S).
  • Non-relevant antibodies linked to Sepharose 4B and erythrocytes are used as controls.
  • the sepharose beads are detached from the cells by vibration (vortex) and removed from the cell suspension after centrifugation for one minute at 500 Rpm.
  • the immune complexes are eliminated by lysis of the red blood cells with a hypotonic medium. Cell viability is greater than 95% under all conditions. The cells free of any ligand and the culture supernatants are then used in various assays for assaying cytokines by radioimmunological or immunoenzymatic tests according to conventional techniques available commercially.
  • cytotoxic molecules and cytokines and growth factors such as tumor necrosis factor (TNF), interferon.
  • TNF tumor necrosis factor
  • gamma IFN-gamma
  • IL 1 interleukin 1
  • IL 3 interleukin 3
  • GM-CSF granulocyte growth stimulating factor
  • beef erythrocytes are sensitized with rabbit IgG anti-bovine erythrocytes (EA7S) at a dilution of 1/50.
  • EA7S rabbit IgG anti-bovine erythrocytes
  • the EA7S preparation is kept in suspension at 1% in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum for at least 1 week.
  • the PBL cells 50 microliters, 5 ⁇ 10 15 cells
  • the mixture is centrifuged (1000 rpm / l minute) and the pellet is incubated at 4 ° C for 30 minutes. A minimum of two hundred cells are counted and cells carrying 5 and more EA7S are considered positive.
  • the PBLs 25 microliters, 5 ⁇ 10 5 cells
  • Monoclonal antibodies not relevant in specificity and of different subclasses of immunoglobulins G are used as controls.
  • the percentage inhibition is calculated according to the formula A / BX 100, in which A is the proportion of rosette-forming cells (RFC) in the presence of the inhibiting antibody and B is the proportion of RFCEA7S in the absence of the antibody.
  • CD 16 of neutrophils is a protein bound to the cell membrane by a phosphatidyl inositol glycan group and can therefore be released from the cell surface by the action of the enzyme phospholipase C.
  • Figures 13, 14, 15, 16, 17 and 18 represent the evolution as a function of time expressed in days, with variable scales for the days (on the abscissa) of the levels of serum cytokines, respectively of tumor necrosis factor (TNF) ), IFN-gamma, soluble i'terleukin 2 receptor (CD25S), interleukin 1 alpha 5, soluble interleukin 2 and macrophage and granulocyte growth stimulating factor (GM-CSF).
  • TNF tumor necrosis factor
  • CD25S soluble i'terleukin 2 receptor
  • GM-CSF granulocyte growth stimulating factor
  • the assay of serum cytokines was carried out using commercial immunoenzymatic kits of the Elisa type.
  • the immunization was carried out on several series of female BALB / c mice of 5 weeks at doses of 60 micrograms, of peptides emulsified with the complete Freund's adjuvant (volume / volume) at d (0) and 2 other injections at j 21 and j 36 at the same dose, and this intraperitoneally.
  • cell fusion is carried out according to the method derived from that of Kohler and Milstein (1975, Nature, 256, 495) as follows: The spleen cells of immunized mice (BALB / C) are fused with cells HGPRT deficient myeloma and immunoglobulin non-secretors (NSl / Ag line 4.1).
  • mice After 6 washes, 100 microliters of mouse anti-immunoglobulin antibody coupled to peroxidase and produced in sheep (second antibody), diluted to 1 / 1000th in PBS + 0.01% Tween 20 are deposited in each well and incubated for 1 hour at room temperature.
  • OPD orthophenylene diamine
  • the antibodies obtained belong to the following classes of immunoglobulins: IgG, IgM and IgA.
  • the hybridomas are cloned by the limit dilution method (Immunology, Today, 5, 265, Lefkovits et al. 1984).
  • DMEM Modified Medium from Dulbecco with 4.2 g of glucose
  • DMEM Modified Medium from Dulbecco with 4.2 g of glucose
  • These antibodies are selected for their anti CD 16 activity according to the Elisa method developed by KHAYAT et al. 1987 (J. Immunol. Method, 100,235) and this against the recombinant genetic CD 16, against the serum of a subject healthy containing a high level of soluble CD16 and against soluble CD16 purified on a column of specific antibodies (type 3G8) coupled to Sepharose 4B-C NBR or purified on a column of filtration gel, as well as in FACS against the various lines CD16-expressing blood cells, such as polynuclear cells (UNKELESS, 1988, Ann. Rev. Immunol, 6, 251).
  • the amplified fragment was hydrolyzed by the restriction enzymes BamHI and HindIII and incubated in the presence of T4-DNA ligase with the large fragment of the vector pSV2-cat (Gorman et al. 1982 , Mol. Cell. Biol., 2.1044-1051) cut with the enzymes BglII and HindIII, then transfected into the strain E. coli C 600.
  • the recombinant clones were characterized by enzymatic hydrolysis and one of between them was selected and prepared on a cesium gradient.
  • the DNA of the recombinant plasmid obtained (pXL 1603) was checked by sequencing and then introduced by cotransfection with the vector pSV2-dhfr (Subramani et al. 1981, Mol. Cell. Biol, 1. 854-864) in CHOdhfr cells. (URLAUB et al. 1980 Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 77, 4216).
  • the recombinant cells were selected by culture in DMEM medium without hypoxanthine or thymidine and then amplified in the presence of increasing amounts of methotrexate (up to '' at 25 micro M).
  • the milia conditioned by the recombinant clones was concentrated 10 times after precipitation with ammonium sulfate and then assayed by sandwich ELISA according to the method described in application WO 88 / 06.733 and a clone (P 2.4) was selected as indicated in FIG. 19 which shows the relationship between the optical density of the samples, determined by ELISA and the dilution of the cell culture medium.
  • the amplified fragment was hydrolyzed by the restriction enzyme BamHI and incubated in the presence of T4-DNA ligase and of the vector M13mpl8 (Pharmacia, Sweden) linearized by the enzyme EcoRI ( Biolabs, USA) then introduced by transfection into the E. coli TG1 strain.
  • the recombinant clones were characterized by enzymatic hydrolysis and one of them was selected and prepared on a cesium gradient.
  • the recombinant M13 DNA was hydrolyzed by the restriction enzymes Ndel Pvul and BamHI, and the restriction fragment of 608 bp was prepared by electroelution.
  • a recombinant clone was chosen in each case and was used to inoculate 10 ml of LB medium which was incubated overnight at 37 ° C. 600 microliters of each inoculum were used to inoculate 60 ml of fresh LB medium containing 100 micro g / ml of ampicillin and 50 micro g / ml of chloramphenicol. These cultures were incubated at 37 ° C with shaking (200 rpm) to an optical density of 1 to 650 nm. Each culture was divided into two and ImM IPTG were added to one, then the cultures were shaken an additional 3 hours at 37 ° C.
  • the bacteria were harvested by centrifugation and the pellets were taken up in 15 ml of lysis buffer (Tris 50mM pH8, DTT ImM, EDTA lmM, TritonX-100 0, 1%), frozen and then lysed by sonication.
  • lysis buffer Tris 50mM pH8, DTT ImM, EDTA lmM, TritonX-100 0, 1%
  • FIG. 20 shows the elution profiles of the proteins of the different strains, wells 1 and 8 corresponding to the molecular weight markers wells 2 and 3 to the BL 21 DE 3 strain not induced (well 2) or induced (well 3) ; wells 4 and 5 to the BL 21 pLys S strain not induced (well 4) or induced (well 5), wells 6 and 7 corresponding to the BL21pLysE strain not induced (well 6) or induced (well 7).
  • IBF activity of recombinant CD16 is defined as the inhibition by this molecule of the binding of type G immunoglobulins (IgG).
  • Lymphocytes are isolated on a Ficoll cushion from whole blood obtained from the blood bank of the Pitier Salgestrière Hospital from voluntary donors.
  • the cultivation conditions are as follows:
  • lymphocytes are cultured but do not secrete IgG.
  • This medium intended to induce an IgG secretion consists of the basic medium supplemented with Pockweed at 0.25 mg per ml, which is a mitogen.
  • the soluble CD 16 is added to the PW medium at concentrations of between 10 and 500 ng / ml after pretreatment. Pretreatment of recombinant CD 16.
  • the recombinant CD 16 (RHONE POULENC SANTE) is purified as follows:
  • the cultures are carried out in a 15 ml tube in a CO 2 oven (5% CO 2 , 37 ° C), the cell density being 2 10 cells per ml.
  • This operation is then carried out every 24 hours or 48 hours.
  • the level of secreted IgG is expressed in nanograms per milliliter (on the ordinate).

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Abstract

Protéine empêchant au moins partiellement l'interaction entre le fragment Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur, en particulier le récepteur R III. Cette protéine peut être une protéine ayant une communauté de séquence avec l'antigène CD 16 du récepteur III, ou un anticorps dirigé contre l'antigène CD 16. Ces anticorps peuvent être dirigés contre différents déterminants antigéniques de l'antigène CD 16, notamment l'anticorps 3 G 8. Ces protéines ou fragments de protéines y compris anticorps ou fragments d'anticorps peuvent rentrer dans la composition de médicaments, de compositions pharmaceutiques présentées en vue de l'administration parentérale ou entérale, ou peuvent être utilisées dans le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA, des myélodisplasies, et des affections auto-immunes. Les protéines présentant une communauté de séquence avec l'antigène CD 16 du récepteur Fc gamma III peuvent être obtenues par recombinaison génétique.

Description

Protéines empêchant l'interaction entre un fragment Fc d'une immunoglobuline et son récepteur et utilisation en thérapeutique , notamment dans le traitement des affections liées aux virus HIV.
L'invention a pour objet des protéines empêchant l'interaction entre le fragment Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur ainsi que l'utilisasation de ces protéines dans le traitement de maladies immunodépressives auto-immunes et virales.
La présente invention porte particulièrement sur le traitement des affections liées aux virus HIV par des anticorps dirigés contre les récepteurs des immunoglobulines de type IgG.
A la surface de nombreuses cellules, il existe des récepteurs qui permettent une relation entre les anticorps et les cellules de l'immunité . Parmi ces récepteurs, certains ont une affinité spécifique pour le fragment Fc des immunoglobulines .
Un modèle particulièrement étudié a été celui des antigènes CD 16 portés par le récepteur Fc gamma R II I . Les CD 16 sont des antigènes de di f fé renciation exprimés par les cellules humaines appartenant aux populations suivantes: cellules dites "natural killer " (NK), cellules K, macrophages, polynucléaires neutrophiles et eosino- philes et une sous population de cellules T (CD 16+, CD 3 +). Ils sont spécifiquement reconnus par une série d'anticorps monoclonaux dont les plus utilisés sont le 3G8 et l'anti-leu 11 B . (Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol. 1988 ; 6 : 251-281). L'anticorps anti CD 16 3G8 est un anticorps monoclonal de souris de sous classe IgG 1, décrit et isolé par FLEIT (FLEIT et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA, 1982,79, 3275-3279) et résultant après clonage en agarose, de la fusion de cellules spléniques de souris CD 2 F1 immuni sées par voie intrapéritonéale à 2 semaines d'intervalle par 5 x 106 polynucléaires viables et de cellules de myélome P3U. Cet anticorps monoclonal est dirigé contre le récepteur Fc de faible affinité de type III portant l'antigène CD 16. Il est étudié et sélectionné pour sa capacité à inhiber la formation de rosettes ElgG (Unkeless et al. J. Exp. Med.1979 ,150,580 ).
L'anticorps est ainsi apte à bloquer in vitro la reconnaissance de la partie Fc des immunoglobulines de type G par le récepteur CD 16. Le nombre de sites de liaison du 3G8 aux polynucléaires est de 120 000 environ par cellule. Cet anticorps reconnaît une forte proportion de monocytes cultivés in vitro pendant plusieurs jours, ainsi que certaines cellules spécifiques comme les macrophages pulmonaires . (CLARKSON et al. J. Exp. Med, 1988; 167: 408-417).
Cet anticorps monoclonal a été utilisé en clinique humaine dans le traitement des purpuras auto-immuns résistants (CLARKSON et al., N. Engl. J.Med., 1986,314,1236-1239).
Dans ce cas, cet anticorps bloque les récepteurs Fc inhibant la phagocytose des particules opsonisées telles que les plaquettes recouvertes d'anticorps auto-immuns. Il a été observé que l'activité NK des patients était fortement inhibée. Les antigènes CD 16 sont portés par les récepteurs pour le fragment Fc des IgG de faible affinité ou hu-Fc-gamma RIII . Ils ont une affinité préférentielle pour les IgG aggrégées ou impliquées dans des immuns complexes .
Lors de la maturation leucocytaire et monocytaire, ce récepteur apparaît tardivement (au stade métamyélocyte et macrophagique). In vivo, les CD 16 jouent un rôle clé dans la clairance des complexes immuns à IgG (pour lesquels ils ont une affinité particulière) dont le rôle fut démontré tant chez le primate que chez l'homme atteint de purpura thrombopénique autoimmun par l'injection in vivo d'un anticorps monoclonal spécifique du récepteur (le 3G8), rôle clé enfin dans tous les phénomènes de phagocytose ADCC (Cytotoxicité cellulaire Anticorps dépendante), de reconnaissance et de présentation des antigènes par des cellules compétentes du système immunitaire.
L'ADCC (Cytotoxicité Cellulaire Anticorpsdépendante ) est déterminée par la technique décrite par PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, N°1, 180-189) . Cette technique est réalisée dans des plaques de microtitration par un essai de relargage de chrome 51 de 3 heures. Les cellules
P815 Y de souris sensibilisées par un anticorps
IgG de lapin anti P 815 Y (dilution 1/10000e) ou des érythrocytes de poulet sensibilisés par une dilution au 1/100e de l'anticorps IgG de lapin anti-érythrocytes de poulet sont utilisés comme cellules cibles par les PBL (lymphocytes du sang périphérique ) et les monocytes . Dans l'expérience d'inhibition de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, les différents anticorps (ascites ou surnageants ) sont incubés pendant les périodes d'incubation . La concentration de l'anticorps est gardée constante dans chaque puits.
La stimulation des cellules NK in vitro par différentes entités immunologiques tels que : anticorps anti CD 16 type 3G8, complexes immuns entre autres antigènes stimulateurs a été décrite (ANEGON et al., J.Exp. Med., 1988, 167,452-472 ; CUTURI et al., J. Exp. Med., 1989,169, 569-583 ). Ces références bibliographiques décrivent un système de culture de cellules NK .
Selon cette technique les lymphocytes du sang périphérique sont cultivés à 37°C avec des cellules lymphoblastoïdes RPMI 8866 irradiées à 50 grays pendant 10 jours (5 : 1 PBM/ cellules lymphoblastoïdes, 2.5 x 105 PBM/ml/ RPMl /10% FCS ) dans des plaques de cultures à 5% CO2 . Le milieu RPMI (milieu 1640) est contient du L-glutamate, et est dépourvu de bicarbonate de soude (M00RE et al., 1967, J.A.M.A. , 199, 519) . Le nombre total de cellules après 10 jours de culture est augmenté de 10 fois et la population cellulaire comprend 60 à 80% de cellules NK CD 16+/ NKH 1+/CD 3- et 20 à 40% de cellules T CD 3+/CD 16-NKH 1-.
Des populations homogènes de cellules NK et T sont sélectionnées et purifiées par gradient de densité et technique de rosettes indirectes avec des anticorps de chèvre anti Ig de souris sensibilisées. La pureté de ces préparations ( supérieure à 98%) est déterminée par immunofluorescence indirecte (cytofluorométre de flux) grâce à un panel d'anticorps monoclonaux . Les cellules NK et T obtenues de ces cocultures sont cultivées à 37°C, 5 x 106 cellules/ml RPMI 10% sérum veau foetal, pendant différentes périodes avec différents in- ducteurs. Les ligands formant des rosettes (ligands FCR) sont des anticorps anti CD 16 (3 G 8) liés à la sépharose 4 B activée au bromure de cyanogène (5 mg anticorps / ml sépharose , 5 microlitres de billes pour 106 cellules) et des immuns complexes c'est-à-dire des anticorps IgG sensibilisés par des érythrocytes de boeuf (EA7S). Des anticorps non relevants liés à la sépharose 4B et des érythrocytes sont utilisés comme contrôles. Après culture, le surnageant de culture et/ou les cellules sont recueillis, les billes de sépharose sont détachées des cellules par vibrations (vortex) et éliminées de la suspension cellulaire après une centrifugation d'une minute à 500 Rpm . Les complexes immuns sont éliminés par lyse des globules rouges avec un milieu hypotonique . La viabilité cellulaire est supérieure à 95% dans toutes les conditions . Les cellules libres de tout ligand et les surnageants de culture sont ensuite utilisés dans différents essais de dosage de cytokines par tests radioimmunologiques ou immunoenzymatiques selon des techniques classiques disponibles dans le commerce.
On observe que cette mise en contact est suivie d'un effet de stimulation des cellules CD 16 NK et ces cellules stimulées relarguent alors des molécules cytotoxiques et cytokines et des facteurs de croissances telles que le facteur de nécrose tumorale (T.N.F.), l'interféron gamma (IFN-gamma ) , l'interleukine 1 (IL1) l'interleukine 3 (IL3), le facteur de stimulation de la croissance des macrophages et des granulocytes (GM-CSF).Aucune production d'interleukine 1 bêta (IL 1 bêta) ou de G-CSF n'est prouvée en revanche. PERUSSIA et al (J. of Immunology, 1986, 133, n° 1,180-189) ont aussi développé une technique de caractérisation des anticorps anti-CD 16, par inhibition de la formation de rosettes . Selon cette technique, des érythrocytes de boeuf sont sensibilisés par un anticorps IgG de lapin anti-érythrocytes de boeuf (EA7S) à une dilution au 1/50e. La préparation EA7S est gardée en suspension à 1% en RPMI 1640 supplémentée par 10% de sérum de veau foetal pendant au minimum 1 semaine . Les cellules PBL (50 microlitres , 5 x 1015 cellules) sont mélangées à 50 microlitres d'une suspension EA7S à 0.5% dans des plaques de microtitration pour la formation de rosettes . Le mélange est centrifugé (1000 rpm/l minute) et le culot est incubé à 4°C pendant 30 minutes . Deux cent cellules au minimum sont comptées et les cellules portant 5 et plus EA7S sont considérées positives . Dans les expériences d'inhibition de formation de rosettes EA7S, les PBL ( 25 microlitres , 5 x 105 cellules ) sont mélangés avec un volume égal de l'anticorps , et avec la préparation EA7S. Les anticorps monoclonaux non relevants en spécificité et de différentes sous classes d'immunoglobulines G sont utilisés cpmme contrôles . Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule A/B X 100, dans laquelle A est la proportion de cellules formant rosettes (RFC) en présence de l'anticorps inhibiteur et B est la proportion de RFCEA7S en absence de l'anticorps.
Récemment, le gène du CD 16 a été cloné par de nom breuses équipes . Ainsi, le CD 16 des neutrophiles est une protéine liée à la membrane cellulaire par un groupement phosphatidyl inositol glycane et peut, par conséquent , être relargué de la surface cellulaire par action de l'enzyme phospholipase C.
Le CD 16 des cellules NK et des macrophages est résistant à cette tentative de digestion . Ce CD 16 est en fait codé par un autre gène, lui aussi récemment clone, qui code pour un récepteur lié à la membrane cellulaire par une partie transmem- branaire et intracytoplasmique . (RAVETCH et al. J. Exp. Med. 1989, 170, 481-487).
II a été montré (DAERON et FRIDMAN, Ann. Inst. Pasteur/ Immunol. (1985), 136C, 383-437) que les récepteurs pouvaient être relargués in vitro à partir de cellules mises en culture dans des milieux sans sérum. Ces formes solubles de récepteurs ont été baptisées Immunoglobulin Binding Factors (IBF) , car , une fois relarguées, elles conservent leur affinité spécifique pour le fragment Fc des IgG .
Il a été prouvé que ces IBF ont la capacité , lorsqu'elles sont mises en contact avec des lymphocytes B activés d'inhiber puissamment et spécifiquement la sécrétion d'IgG par ces lymphocytes activés. A l'inverse, ces IBF sont sécrétées , lorsque le milieu de culture est enrichi en IgG . Ainsi, un véritable réseau de régulation de la sécrétion des IgG a été mis en évidence in vitro .
Par la suite, ce même type de réseau a été mis en évidence pour les autres classes d'immunoglobulines : récepteur à Fc-epsilon pour des IgE, récepteur à Fc-alpha pour les IgA définissant ainsi un réseau de régulation isotypique de la production d'immunoglobulines.
Chez la souris en 1984 et chez l'homme en 1987 , l'existence de ces formes solubles de récepteurs Fc gamma de faible affinité a été mise en évidence dans le sérum (KHAYAT et al., J. Immunol. (1985), 132 : 2496-2501; KHAYAT et al., J. Immunol. Methods., (1987) , 100: 235-241).Chez la souris, il a pu être montré que ces récepteurs sériques augmentaient avec l'âge ainsi qu'au cours de certaines affections autoimmunes, infectieuses ou de certains syndromes lymphoprolifératifs (KHAYAT et al., J. Immunol. (1985), 24:83-91 , KHAYAT et al . Scand. J. Immunol. 1986, 24, 83-91. PURE et al., J. Exp. Med. (1984) , 160: 1836-1849).
Il a été enfin décrit récemment l'existence de molécules CD 16 solubles dans le sérum ou plasma humain à l'aide d'un test immunoenzymatique (Elisa) spécifique basé sur l'utilisation de deux anticorps monoclonaux anti CD 16 (3G8 et anti- leu 11 B (KHAYAT et al., J. Immunol. Methods , (1987), 100: 235-241).
Ces molécules solubles du sérum ont pu être adsorbees par chromatographie sur colonne d'IgG -sépharose et Fc-sépharose , mais non sur Fab'2 sépharose démontrant qu'elles conservent leur affinité pour le Fc des IgG.
Le procédé d'isolement du récepteur CD 16 ainsi que le produit de ce procédé et un procédé de dosage de ce récepteur ont fait l'objet de la demande de brevet PCT/FR 88/00103 (publication WO 88/06733).
La demande PCT WO 8911.490 (numéro de dépôt US
89 02 182) a pour objet des fragments séquences du récepteur humain Fc gamma RI II sous ses formes solubles et membranaires ainsi que leur utilisation dans le traitement des purpura thrombocytopéniques auto- immuns . On a maintenant découvert que les protéines empêchant l'interaction entre un fragment Fc d'une immunoglobuline et son récepteur permettent de traiter des maladies immunodépressives et/ou des maladies auto-immunes.
Les demandeurs ont montré de manière surprenante en utilisant le procédé de dosage du CD 16 décrit dans la demande WO 88/06.733 précédemment citée que, parmi une population infectée par le virus HIV, le taux de CD 16 soluble pouvait être corrêlé de manière significative avec le taux de T4 de p24, ou d'anticorps anti p 24 , ainsi que d'une manière plus générale avec le stade clinique de la maladie HIV.
Faisant suite à cette étude , la demanderesse a montré que cet anticorps avait une efficacité réelle dans le traitement de malades atteint du Sida.
La présente invention a donc pour objet de nouvelles protéines empêchant au moins partiellement l'interaction entre le fragment Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur de type membranaire ou soluble, à l'exclusion des récepteurs gamma I et II.
Elle a également pour objet l'utilisation des protéines , anticorps ou autres et leurs fragments pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections auto-immunes .
Les anticorps ou fragments d'anticorps pourront être obtenus par tous les moyens connus en particulier à partir de culture d'hybridomes ou à partir de fluides ou de tissus corporels, notamment à partir de sang .
Les protéines ou leurs fragments autres que les anticorps antirécepteur empêchant au moins partiellement l'interaction entre un fragment Fc d'une IgG et son récepteur de type membranaire ou soluble, peuvent être notamment des protéines ayant une communauté de séquence avec le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines G.
Préférentiellement, ces protéines ou fragments de protéines auront une communauté de séquence avec le récepteur Fc gamma III porteur de l'antigène CD 16 , spécifique des immunoglobulines de type IgG et pourront notamment être obtenues par recombinaison génétique.Les fragments de protéines seront préférentiellement actifs et solubles .
Encore plus préférentiellement , ces protéines ou fragments de protéines ayant une communauté de séquence avec l'antigène CD 16 seront obtenues par expression d'un vecteur recombiné génétiquement dans des cellules procaryotes ( Escheria Coli ) ou dans des cellules eucaryotes , et en particulier dans la lignée de cellules d'hamster CHO.
L'invention a d'autre part pour objet des protéines caractérisées en ce qu'elles sont des anticorps ayant des activités immunologiques spécifiques dirigées contre des fragments de la protéine CD 16, ou des anticorps anti-idiotypes dirigés contre des anticorps anti-CD16.
De tels fragments seront notamment les fragments de la protéine CD 16 ayant les séquences d'acides aminés suivantes ou des fragments de ces séquences .
NH2-PRO-ARG-TRP- VAL-PHE - LYS-GLU-GLU-ASP-PRO-ILE HIS-LEU-ARG-CYS-CO2H.
NH2-LEU-GLN-ASNGLY-LYS-ASP-ARG-LYS-TYR-PHE-HIS-HIS- ASN-SER-CYS-CO2H.
NH2-ALA-THR-VALASN-ASP-SER-GLY-GLU-TYR-ARG-CYS-GLU- CO2H
NH2-VAL-SER-THR-ISO-SER-SER-PHE-SER-PRO-PRO-GLY-CO2H. Ces protéines ou fragments de protéines y compris les anticorps ou fragments d'anticorps peuvent notamment être définis comme inhibants au moins en partie la formation de rosettes entre des neutrophiles humains et des globul es de moutons opsonisés par des immunoglobulines G anti-globules rouges de moutons, selon la technique définie précédemment .
Les anticorps ou fragments d'anticorps peuvent aussi être définis comme stimulants la synthèse et éventuellement le relargage de cytokine(s) et/ou de facteur (s) de croissance par les cellules NK en cultures, notamment de TNF , selon la technique définie précédemment.
Les protéines ou fragments de protéines y compris les anticorps ou fragments d'anticorps précédemment décrits peuvent aussi être définis comme inhibants au moins partiellement la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante , (ADCC ) mesurée par la méthode telle que définie précédemment .
Les protéines ou fragments de protéines peuvent encore être définis comme inhibant au moins partiellement la sécrétion des IgG par les lymphocytes B activés .
L'invention a encore pour objet des médica- ments contenant ces protéines ou fragments de protéines pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections autoimmunes .
La présente invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace d'au moins une de ces protéines ou fragments de protéines en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables . Ces compositions peuvent être utilisées dans le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA, des myélodisplasies et/ou des affections auto-immunes.
Ces compositions peuvent notamment être administrées par voie parentérale et entérale.
L'invention est de plus relative à l'utilisation de ces protéines ou fragments de protéines pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections autoimmunes.
La présente invention , outre l'utilisation de protéines et de fragments de protéines présentant une communauté de séquence avec le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines G, a pour autre objet l'utilisation d'une protéine ou fragments de protéine , empêchant au moins partiellement l'interaction entre un fragment Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur de type membranaire ou soluble, à l'exclusion des récepteurs Fc gamma I et II, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des affections liées aux virus HIV , notamment du SIDA, des myélodisplasies et/ou des affections auto- immunes.
Ces protéines ou fragments de protéines peuvent notamment avoir une communauté de séquence avec le récepteur III pour le fragment Fc des immunoglobulinés G.
La protéine rentrant dans cette fabrication peut aussi être un anticorps anti-récepteur , c'est-à-dire un anticorps dirigé contre le récepteur membranaire ou soluble du fragment Fc de l'immunoglobuline , et en particulier un anticorps anti-CD 16 .
Cette protéine peut être définie comme inhibant au moins en partie la formation de rosettes selon la technique de PERUSSIA et al.(J.of Immunology 1986, 133 , n°1, 180-189) précédemment citéee Une telle protéine peut aussi inhiber au moins partiellement l'activité cytotoxique anticorps- dépendante (ADCC) telle que définie précédemment et mesurée selon PERUSSIA et al.(J. of Immunology, 1986, 133, n°1, 180-189).
Un anticorps de ce type peut aussi stimuler la synthèse et éventuellement le relarguage de cytokine(s) et/ou de facteur (s) de croissance par les cellules "Natural Killer" (NK) en culture selon la technique précédemment citée (ANEGON et al. 1988 J. of Exp. Med, 167, 452 - 472; CUTURI et al. , J. Exp. Med, 1989, 169, 569-583).
L'anticorps est en particulier l'anticorps monoclonal 3G8.
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention, le traitement des malades par l'anticorps se fait par voie parentérale ou entérale.
L'invention sera encore illustrée sans être aucunement limitée par les exemples qui suivent dans lesquels :
Les figures 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8 et 9 sont des diagrammes dans lesquels on a donné en abscisses le temps exprimé en jours, avec des échelles variablés selon les jours , et en ordonnées le nombre respectivement de plaquettes, d'érythroblastes, de réticulocytes, de myélocytes, de polyneutrophiles, de métamyélocytes, de monocytes , de leucocytes , et de lymphocytes.
La figure 10 représente l'évolution du taux de lymphocytes T4 (en ordonnée) en fonction du temps exprimé en jours (en abscisse).
La figure 11 représente l'évolution des activités des cellules NK et de la cytotoxicité cellulaire anticorps - dépendante (ADCC) en ordonnée, en fonction du temps exprimé en jours en abscisse. La figure 12 est un diagramme représentant l'évolution du taux d'anticorps 3G8 dans le sérum d'un patient traité par cet anticorps exprimé en ordonnée en ng/ml en fonction du temps exprimé en jours, avec des échelles variables selon les jours, en abscisse .
Les figures 13, 14, 15, 16, 17 et 18 représentent l'évolution en fonction du temps exprimé en jours, avec des échelles variables pour les jours (en abscisse) des taux de cytokines sériques, respectivement de facteur de nécrose tumorale (TNF), de l'IFN-gamma, du récepteur à l'i'terleukine 2 soluble (CD25S), de l'interleukine 1 5 alpha , de l'interleukine 2 soluble et du facteur de stimulation de la croissance des macrophages et des granulocytes (GM-CSF).
Sur ces 18 figures, Tl, T2, T3 et T4 correspondent aux quatre injections d'anticorps 3G8.
La figure 19 représente la mesure du taux de CD16 soluble dans le milieu conditionné dans les cellules CHO de hamster.
La figure 20 représente un gel obtenu par électrophorèse SDS-PAGE des protéines des souches BL 21 DE 3, 15 BL 21 plys E, BL 21 pLys S induites ou non induites.
La figure 21 est un diagramme représentant l'effet du CD 16 soluble recombinant (en abscisses) sur la sécrétion d'IgG par des lymphocytes activés (en ordonnées).
EXEMPLE 1 -
Etude sérologique de la distribution des anti- gènes CD 16 solubles .
A l'aide du procédé de dosage des CD 16 solubles décrits dans la demande de brevet W0 88/06.733 précédemment mentionnée des études séro-épidémiologiques dans des pathologies infectueuses, néoplasti ques et autoimmunes ont été effectuées pour définir la distribution du CD 16 soluble au cours de désordres pathologiques .
1°) Etude sérologique
Au cours de ce type d'études séroépidémiologiques , le taux de CD 16 soluble a été dosé dans plus de 500 serums appartenant à des individus sains ou atteints de différentes pathologies . Ainsi, une évolution tout à fait significative des taux de CD 16 soluble a été observée dans le sérum de patients atteints d'infection par le virus HIV au fur et à mesure de l'aggravation de leur maladie chez 73 individus tous infectés par le virus HIV et présentant des degrés différents de symptomatologie allant de la simpie séropositivité à l'acquisition de maladies graves ou tumorales.
Pour chacun de ces patients, une série large d'informations était disponible (âge, mode de contamination, sexe , stade clinique d'évolution, nombre de lymphocytes T4, de lymphocytes T8, taux sérique de p 24, d'anti p24, d'IgG, d'IgA, d'IgM, d'IgE) et on a ainsi pu rechercher l'existence de corrélation statistique entre le taux sérique de CD 16 soluble et les autres paramètres cliniques ou biologiques .
II a été ainsi mis en évidence une corrélation extrêmement significative entre le taux de CD 16 soluble et le stade clinique de la maladie HIV (p = 0.002) , le taux de T4 (p = 0.02 ) et le taux de p 24 circulant (p = 0.02) ainsi que le taux d'anticorps anti-p24 (p = 0.003).
Ces résultats figurent dans les tableaux I et II suivants ;dans le tableau II le taux de CD16 soluble est exprimé comme l'inverse de la dernière dilution positive du sérum.
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
Les chiffres entre parenthèses correspondent aux écarts types.
Ainsi , il apparaît que le taux de CD 16 soluble est directement proportionnel à la gravité de l'évolution clinique de la maladie HIV et que ce taux est également proportionnel aux paramètres biologiques classiques caractéristiques du pronostic de cette affection :T4, p24 et anti p-24.
II est apparu aussi que chez des patients dans le stade final de la maladie . Le stade IV dans la classification définie par le "Center for Disease Control" (stade CDC IV) le taux de CD 16 soluble peut devenir nul.
2) Etude cytologique
L'expression cellulaire du CD 16 a été également déterminée .
Il a été montré par BOROS et al.. (Abstract Th BP 84 in Program and Abstract from the V International Conférence on Aids, Montréal, Canada, 1989) que sur les neutrophiles des malades atteints de maladie HIV, l'expression du récepteur Fc était significativement diminuée lors du passage au Sida vrai, cependant aucune information n'était donnée quant à l'expression des CD 16 des cellules NK et lymphocytes T. Par des méthodes de fluorescence en double marquage, l'expression du CD 16 sur la membrane de cellules CD3+/CD16+ (T) et NK de 30 des 73 patients infectés a été observée et il a été prouvé que la population CD3+/CD 16+ est sensiblement augmentée en proportion et en valeur absolue chez les patients infectés.
Le tableau III ci-après résume les résultats obtenus. 5 Dans ce tableau les chiffres entre parenthèses correspondent aux écarts types.
Figure imgf000020_0001
EXEMPLE 2
a ) Utilisation thérapeutique de l'anticorps 3G8 :
Une étude pilote d'injection de l'anticorps
3G8 réalisée chez la souris et chez le primate a montré une bonne tolérance à ces injections. De plus, cet anticorps a été utilisé avec succès chez un patient dans le traitement d'un purpura autoimmun résistant (CLARKSON et al, 1986, N. Engl. J. Med., 314,1236-1239).
L'anticorps monoclonal 3G8 a été injecté à un patient atteint d'une maladie liée au virus HIV évoluée associée à un purpura auto-immun résistant à toute thérapeutique, tel qu'il se rencontre souvent au cours des maladies liées au virus HIV.
II s'agissait d'un patient de 35 ans ayant pour antécédent une hépatite B, plusieurs blénnoragies et un herpès génital .
Le patient présentait les signes généraux de la maladie HIV permettant de le classer ARC depuis au moins deux ans . Différentes thérapeutiques avaient été déjà tentées sur ce patient : la cyclosporine, suivie d'une splénectomie . Une thérapeutique par l'AZT et le zovirax ( aciclovir, dictionnaire Vidal, éd. 1989, p.1758) avait été aussi tentée sans résultat .
Avant le traitement par l'anticorps 3G8 , le patient se trouvait au stade III ou IV de la maladie HIV selon la classification CDC et n'avait pas subi de traitement ayant une action sur le système immunologique depuis au moins 28 jours .
L'injection de l'anticorps a été effectuée dans les conditions qui suivent :
L'anticorps monoclonal a été préparé dans des conditions de sécurité sur la lignée (stérilité, absence de virus leucemogenes, de mycoplasmes) sur l'anticorps purifié (pureté, concentration en anticorps , en protéines, en sous-classes d'Ig, DNA, polynucléotides, stérilité, absence de pyrogène et mycoplasmes ).
L'injection suit la posologie suivante : 0.4 mg/kg en perfusion intraveineuse d'une heure diluée dans une solution d'albumine à 4%.
La première injection a été réalisée entre 10 heures et 11 heures du matin en une perfusion d'une heure . Durant l'administration du produit , aucun effet n'a été à signaler , en revanche une heure plus tard, l'apparition de frissons intenses d'une fièvre à 40°C justifiait l'administration de 10 mg de polaramine (maléate de dexchlorphéniramine, dictionnaire Vidal, éd. 1989, p.1327) et 200 mg d'hémisuccinate d'hydrocortisone . L'ensemble de ces phénomènes fut régressif aux environs de 12 heures ; quant à la température , elle s'est norma lisée aux environs de 20 heures .
Une seconde injection de 3G8 à la même dose a été réalisée à la même heure 2 jours plus tard en brève perfusion. Celle-ci a été suivie du même phénomène thermique et de l'apparition de frissons intenses accompagnés de douleurs osseuses tolérablés .Ces phénomènes ont cessé, en deux heures pour les frissons , en 6 heures pour la fièvre et les algies osseuses, d'où recours à l'administration de prodalfalgan (chlorhydrate de propacétamol, dictionnaire Vidal, éd. 1989,p.1373) à raison de 3 ampoules et de 10 mg de polaramine et 200 mg d'hémisuccinate d' hydrocortisone .
Un dernier traitement par 3G8 a été réalisé comportant une première injection de 8 heures à 9 heures du matin suivie d'une deuxième injection de 10 heures à 11 heures du matin le même jour. Cette double dose a été suivie des mêmes phénomènes cliniques précédemment rencontrés , à savoir syndrome fébrile à 39°C durant 4 heures, frissons intenses durant 2 heures , l'ensemble de ces phénomènes ayant cessé sous 10 mg de polaramine et 200 mg d'hémisuccinate d'hydrocortisone.
En revanche , il convient de signaler l'apparition dès la fin de la 2ème injection de douleurs osseuses intenses justifiant la mise sous morphine par voie injectable . Ces douleurs osseuses se sont atténués sous stupéfiants mais n'ont vraiment cessé que 4 jours plus tard.
b ) Suivi de l'étude :
Cette étude s'est déroulée avec des examens réguliers et fondamentaux pour apprécier l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal anti CD 16 chez ce patient à savoir NFS plaquettes à J0, J1, (toutes les 3 heures ), J2 (matin et soir), J3 puis chaque jour - Profil Sanguin Biochimique chaque jour- sous populations lymphocy- taires à J0, J1 , J2, J3 puis 2 à 3 fois par semaine ainsi que l'activité NK à J0, J1, J3 puis 1 fois par semaine , mesure de 1'ADCC à Jo, J1, J3 puis 1 fois par semaine , dosage de la pharmacocinétique du 3G8 chaque heure pendant 8 heures puis 2 fois par jour, dosage des anticorps anti IgG de souris chaque jour, et prélèvement pour dosage des facteurs de croissance et lymphokines sériques 2 fois par jour, virémie, p24, anti p 24 et immunoglobulinés 1 fois par jour; ceci pendant l'hospitalisation elle-même du patient .
D'autre part, en ambulatoire, la consultation du patient est réalisée 1 fois par semaine pendant 1 mois puis régulièrement 1 fois par mois pendant toute la durée de l'étude et assortie de ces mêmes examens et prélèvements. c) Résultats - observations:
1) données hématologiques :
Il a été observé différentes données très significatives : tout d'abord une remontée spectaculaire et toujours durable à ce jour du taux de plaquettes (Fig.l). Celle-ci s'est affirmée dès la première injection de l'anticorps monoclonal 3G8 et ceci à la 22ème heure après injection, ce taux légèrement effondré à la deuxième injection s'est à nouveau élevé après celle-ci , les 3ème et 4ème injections ayant provoqué une remontée spectaculaire et toujours durable . Ceci est d'un intérêt considérable dans la mesure où sont alors écartés tous risques d'hémorragies incontrôlables toujours graves.
De la même façon, à la 3ème et 4ème injections de l'anticorps monoclonal et après une stabilisation du taux d'erythroblastes (Fig.2) au cours des 2 premières injections, est observée une remontée brusque et spectaculaire du taux d' erythroblastes. Ce taux est resté constant pendant les 18 jours où des prélèvements ont été effectués puis a retrouvé le niveau de base initial au jour 48.
A la 3ème injection et à partir du jour 10 de la 4ème injection, on a pu observer également une forte remontée du taux de réticulocytes (fig.3).
Les myélocytes sont également impliqués dans la réponse cellulaire à l'injection de 3G8 (fig.4). Après la première injection, le taux très élevé va chuter au jour 2, de la même façon le taux de myélocytes élevé à nouveau après la 2ème injection chute au jour 4, les 3ème et 4ème injections provoquent une remontée spectaculaire de taux de myélocytes constant pendant 24 heures avant de chuter au jour 9 . Les polynucléaires neutrophiles (fig.5) remontent à chaque injection de 3G8 immédiatement après la première injection , 2 jours après la deuxième injection, et dès la troisième et quatrième injections , le taux atteint un maximum qui ne réatteindra le niveau basai que deux jours plus tard.
Les métamyélocytes (fig.6) sont augmentés de la même façon après chaque injection de l'anticorps monoclonal rejoignant le niveau initial un jour après la première injection, 2 jours après la deuxième injection et 3 jours après les deux dernières injections .
Les taux de monocytes (fig.7) baissent après la première injection avant d'augmenter à J2, la deuxième injection montre un phénomène identique , les troisième et quatrième injections également.
Les taux de leucocytes (fig.8) augmentent dès la première injection ainsi que les trois suivantes avec une chute à chacune des injections un jour après la remontée maximale.
2)Données lymphocytaires :
De la même façon et comme pour les données hématologiques , on a pu obtenir à chacune des injections une élévation très spectaculaire et ensuite toujours durable du taux de lymphocytes totaux (fig.9) et T4 plus particulièrement (CD4+) (fig.10) .Cette observation est d'un grand intérêt puisque l'on sait que les T4 circulants sont directement liés au pronostic des affections liées aux virus HIV.
3) Activité NK.
L'activité naturelle des cellules NK a été testée comme décrit précédemment par la technique classique de Chrome - Release. On remarque figure 11 que la fonction NK est très altérée au début du traitement , ce qui est classique chez ce type de patient HIV , mais s'améliore de manière très significative au cours du traitement , et notamment à partir de la 3ème injection.
4) Données concernant la cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante . (ADCC).
L'activité ADCC a été mesurée par la méthode de PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, n°1, 180-189 ). Cette activité qui était très importante chez ce patient est tombée dès la première injection d'anticorps 3G8 et est restée à un taux faible durant toute la durée de l'étude, comme le montre la figure 11.
5) Pharmacocinétique de l'anticorps 3G8
Le taux de 3G8 dans le sérum du patient a été déter miné au cours du traitement . La pharmacocnétique de cet anticorps est représentée sur la figure 12, qui montre sa disparition progressive.
6) Production et relargage de cytokines sérigues.
Le dosage des cytokines sériques a été effectué à l'aide de kit immunoenzymatiques commerciaux de type Elisa.
Le taux de facteur de nécrose des tumeurs (TNF) sérique s'élève très rapidement après chaque injection et en particulier lors de la première injection , comme le montre la figure 13.
De façon similaire on a dosé d'autres cytokines : l'interféron gamma (figure 14), le récepteur à l'Interleukine 2 soluble (CD 25 S), (figure 15), 1 ' Interleukine 1 alpha (figure 16), l'Interleukine 2 soluble (figure 17) et le facteur de stimulation de la croissance des macropha ges et des granulocytes GM-CSF (figure 18). D'une façon tout à fait similaire , la première injection entraîne une augmentation importante du taux de ces diverses cytokines dans le sérum. Cette augmentation se retrouve lors des injections suivantes en fonction des cytokines dosées.
7)CONCLUSIONS DE L'ETUDE THERAPEUTIQUE
On remarquera tout d'abord que le patient ne s'est pas immunisé contre l'anticorps monoclonal 3G8 .
Cette étude a permis d'une manière générale de montrer l'efficacité du traitement par les anticorps 3G8 sur divers facteurs caractéristiques de la maladie HIV .
Notamment , on observe que l'injection d'anticorps 3G8 provoque une élévation importante des éléments hématopo'iétiques chez le patient infecté par le virus HIV et une élévation spectaculaire et durable du taux de lymphocytes et du taux de T4 circulants. Ce résultat est particulièrement intéressant car l'on sait que ces facteurs sont directement liés au diagnostic et au pronostic des affections liées aux virus HIV.
Il a d'autre part été observé par une anlyse effectuée par un appareil de triage de cellules par fluorescence (FACS ) que l'injection d'anticorps 3G8 induisait une myélimie importante se traduisant par l'apparition de cel Iules très immatures .
Toutes ces observations sont confirmées sur un autre patient infecté par le virus HIV et traité par l'anticorps monoclonal 3G8.
EXEMPLE III
Préparation des anticorps monoclonaux :
Les anticorps monoclonaux anti CD 16 solu bles humains sont produits après l'immunisation des souris par des séquences peptidiques formées de 15, 12 ou 11 acides aminés .
Ces séquences sont choisies par ordinateur à partir du gène du CD16 (Simmons et al.1988 , Nature, 333,563) et sont les suivantes:
Séquence n°1:
Proline-Arginine-Tryptophane-Valine-Phénylalanine- Lysine - Acide Glutamique-Acide Aspartique - Proline - Isoleucine-Histidine Leucine- Arginine Cystéine .
Séquence nº2:
Leucine - Glutamine -Aspargine-Glycine - Lysine - Acide Aspartique -Arginine- Lysine - Tyrosine- Phénylalanine-Histidine - Histidine- Aspargine- Sérine - Cystéine .
Séquence n°3:
Alanine- Thréonine- Valine- Aspargine -Aspartate- Sérine - Glycine - Glutamate- Tyrosine-Arginine- Cystéine- Glutamine .
Séquence n°4: Valine - Serine - Thréonine- Isoleucine - Serine - Serine- Phénylalanine- Sérine Proline - Proline- Glycine.
L'immunisation a été effectuée sur plusieurs séries de souris BALB/c femelles de 5 semaines à des doses de 60 microgrammes ,de peptides émulsifiées avec l'adjuvant complet de Freund (volume/volume) à j (0) et 2 autres injections à j 21 et j 36 à la même dose , et ceci par voie intrapéritonéale . Après la dernière injection, la fusion cellulaire est réalisée d'après la méthode dérivée de celle de Kohler et Milstein (1975, Nature, 256, 495) comme suit: Les cellules spléniques des souris immunisées (BALB/C) sont fusionnées avec des cellules de myélome déficient en HGPRT et non sécréteurs d'immunoglobulines (lignée NSl/Ag 4.1) .
L'hybridation est réalisée en présence d'agents chimiques tels que le polyéthylène-glycol (PEG à 33%), d'après la méthode de Galfre et al. (Méth. Enzym.1981, 73, 1 ).
La séparation ou la sélection des hybridomes est effectuée au moyen d'un milieu sélectif HAT composé de 90% de DMEM, 10% de sérum foetal de veau, 1% de pyruvate de sodium , 1% antibiotique, 2,5g/ml d'amphotéricine et 10-4M d'hypoxanthine 4 x 10-7M d' aminophtérine et 1 , 6 x 10-5 de thymidine . Ce traitement entraîne la mort des cellules non fusionnées , seules restent vivantes les cellules hybrides (Littlefield et al., Science 1964, 145, 709)
La sélection d'hybridomes sécréteurs d'anticorps est réalisée par des microdosages par une technique enzymoimmunologique (ELISA), contre le peptide immunisant de la façon suivante : dans une plaque de microtitration en polystyrène rigide Nunc on dépose 100 microlitres de tampon de couplage contenant 1 micro g du peptide imunisant et on laisse incuber pendant une nuit à 4°C . Ensuite , la plaque est lavée 5 fois avec du PBS + 0,1% Tween 20. Après ces lavages, on dépose 100 microlitres du milieu de culture des clones cultivés et on incube pendant 2 h à température ambiante.
Après 6 lavages, 100 microlitres d'anticorps anti-immunoglobuline de souris couplé à la peroxydase et produit chez le mouton (deuxième anticorps), diluée au l/1000ème dans du PBS + 0,01 % Tween 20 sont déposés dans chaque puit et incubés pendant 1 heure à température ambiante.
Après 6 autres lavages, on ajoute par puits 100 microlitres d'orthophénylène diamine (OPD) di luée à 0,04% dans un tampon phosphate-citrate PH 5,6 et 14 microlitres de peroxyde (H2O2 à 30%) . La réaction est ensuite bloquée avec de l'acide sulfurique à 10%. La quantité de deuxième anticorps est déterminée à partir de la densité optique dans un lecteur Titertek (Société Flow) à une longueur d'onde de 492 mm. Dans chaque plaque des témoins négatifs constitués du même milieu de culture mais n'ayant jamais servi à la culture de ces clones sont présents.
Les anticorps obtenus appartiennent aux classes suivantes des immunoglobulines : IgG, IgM et IgA.
Afin d'obtenir un type unique d'anticorps, les hybridomes sont clones par la méthode de dilutions limites (Immunology ,Today, 5, 265, Lefkovits et al . 1984).
Après le clonage et lorsque les lignées d'hybridomes sont établies, leur prolifération et simultanément la production en masse de leurs anticorps monoclonaux sont réalisées,
a) soit in vitro par culture cellulaire dans un milieu formé de 90% de DMEM (Milieu Modifié de Dulbecco avec 4,2 g de glucose ) (Dulbecco et al., 1959 ,Virology,8,396) + 10% de sérum embryonnaire de veau + 100 unités de pénicilline et 50 micro g de streptomycine par ml de milieu + 2,5 micro g d'amphotéricine par ml de milieu.
L'incubation de ces boîtes est effectuée à 37°C dans une atmosphère humide contenant 6% de CO2 dans l'air ,
b) soit in vivo sous forme d'ascites , d'après la méthode de GOSSE et coll. (1983 , Hybridomes Perspectives et Réalités SELF éd. Paris). Dans ce cas 5 x 106 cellules hybrides sont injectées dans le péritoine de souris BALB/C âgées, pré-traitées au pristane . En moyenne 15 jours après l'innoculation , le liquide d'ascite s'étant accumulé, sera prélevé, centrifugé et testé en Elisa.
Ces anticorps sont sélectionnés pour leur activité anti CD 16 d'après la méthode Elisa mise au point par KHAYAT et coll.1987 (J. Immunol. Method, 100,235) et ceci contre le CD 16 recombinant génétique, contre le sérum d'un sujet sain contenant un taux élevé de CD16 soluble et contre du CD 16 soluble purifié sur colonne d'anticorps spécifiques (type 3G8) couplée à du sépharose 4B-C NBR ou purifiée sur colonne de gel de filtration, ainsi que en FACS contre les différentes lignées cellulaires du sang exprimant le CD16 , comme les polynucléaires (UNKELESS , 1988, Ann. Rev. Immunol , 6, 251).
La purification de ces anticorps à partir des surnageants ou des ascites est effectuée par précipitation au sulfate d'ammonium à 50% puis dialyse contre du PBS pendant la nuit et par chromatographie d'affinité (EY et coll.1978 - Immunochemistry, 1978, 15, 429) soit sur antigène immobilisé sur supports (type sépharose couplé au peptide immunisant ) ou sur des supports comportant des immunoglobulines anti IgG ou anti IgM de souris selon la classe de l'anticorps considéré. EXEMPLE IV
Production de CD16 soluble in vitro dans des systèmes procaryotes et eucaryotes:
1°) PRODUCTION DE CD16 SOLUBLE EN CELLULES CHO
Les oligonucléotides
Xo122 (5-GAATTCAAGCTTCATATGTGGCAGCT
-GCTCCTCCCAACT-3') et xo123
(5'-GAATTCGGATCCTTAGTACCC10 AGGTGGAGAGAATGATGA-3') ont été synthétisés sur un appareil 8600 (Milligen/Biosearch, Burlington, USA) . Ils ont ensuite été utilisés pour amplifier par PC (Réaction en chaîne utilisant une polymérase) (SAIKI et al., 1988, Science, 239, 487-491) un fragment codant pour la partie extracellulaire du Fc RIII avec son peptide signal à partir du plasmide pCD16 portant le cDNA du gène complet (SIMMONS & SEED 1988, Nature, 333,568-570) 30 cycles d'amplification ont été réalisés à une température d'élongation de 65°C.
Après extraction par le chloroforme et précipitation par l'éthanol,le fragment amplifié a été hydrolyse par les enzymes de restriction BamHl et HindIII et incubé en présence de T4-DNA ligase avec le grand fragment du vecteur pSV2-cat ( Gorman et al. 1982, Mol. Cell. Biol., 2,1044-1051) coupé par les enzymes BglII et HindIII,puis trans- fecté dans la souche E. coli C 600. Les clones recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique et l'un d'entre eux a été sélectionné et préparé sur gradient de césium.
L'ADN du plasmide recombinant obtenu (pXL 1603) a été contrôlé par séquençage puis introduit par cotransfection avec le vecteur pSV2-dhfr (Subramani et al.1981, Mol. Cell. Biol, 1. 854-864 ) dans des cellules CHOdhfr. (URLAUB et al. 1980 Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)77, 4216) .Les cellules re- combinantes ont été sélectionnées par culture en milieu DMEM sans hypoxanthine ni thymidine puis amplifiées en présence de quantités croissantes de méthotrexate (jusqu'à 25 micro M). Le milie conditionné par les clones recombinants a été concentré 10 fois après précipitation au sulfate d'ammonium puis dosé par ELISA sandwich selon la méthode décrite de la demande WO 88/06.733 et un clone (P 2.4 ) a été sélectionné comme indiqué sur la figure 19 qui montre la relation entre la densité optique des échantillons, déterminée en ELISA et la dilution du milieu de culture des cellules .
2°) PRODUCTION DE CD16 SOLUBLE DANS ESCHERICHIA COLI
Les oligonucléotides xol23 (cf. paragraphe précédent et xo124)
(5'-AAGCTTGAATTCATATGCGGACTGAAGATCTCCCAAAGG-3') ont été synthétisés sur un appareil 8600 (Milligen/Biosearch, Burlington, USA). Ils ont ensuite été utilisés pour amplifier par PCR un fragment codant pour la partie extracellulaire mature du Fc RIII , sans son peptide signal, à partir du plasmide pCDl6 portant le cDNA complet du gène d'un Fc RIII membranaire . 30 cycles d'amplification ont été réalisés à une température d'élongation de 62°C.
Après extraction par le chloroforme et précipitation par l'éthanol, le fragment amplifié a été hydrolyse par l'enzyme de restriction BamHI et incubé en présence de T4-DNA ligase et du vecteur M13mpl8 (Pharmacia, Suède) linéarisé par l'enzyme EcoRI (Biolabs, USA) puis introduit par transfection dans la souche E. coli TGl. Les clones recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique et l'un d'entre eux a été sélectionné et préparé sur gradient de césium. L'ADN du M13 recombinant été hydrolyse par les enzymes de restriction Ndel Pvul et BamHI, et le fragment de restriction de 608 pb a été préparé par électroélution . Ce fragment portant le gène codant pour la partie extracellulaire du CD16 a été clone en tre les sites Ndel et BamHI du vecteur d'expression pET3a (Rosenberg et al.1987, Gène , 56,125-135) et transfecté dans E. coli C600. Les plasmides recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique, l'un d'entre eux (pXLl790) a été choisi et introduit par transformation dans les souches E. coli BL21(DE3), BL21 (DE3 )pLysS et BL21 (DE3 )pLysE. Les clones recombinants ont été sélectionnés en présence d'ampicilline et de chloramphénicol (pour pLysS et pLysE).
Un clone recombinant a été choisi dans chaque cas et a servi à inoculer 10 ml de milieu LB qui a été incubé une nuit à 37°C. 600 microlitres de chaque inoculum ont servi à ensemencer 60 ml de milieu LB frais contenant 100 micro g/ml d' ampicilline et 50 micro g/ml de chloramphénicol. Ces cultures ont été incubées à 37°C avec agitation (200 rpm) jusqu'à une densité optique de 1 à 650 nm. Chaque culture a été divisée en deux et ImM IPTG ont été rajoutés à l'une, puis les cultures ont été agitées 3 heures de plus à 37°C. En fin d'induction, les bactéries ont été récoltées par centrifugation et les culots ont été repris dans 15 ml de tampon de lyse (Tris 50mM pH8 , DTT ImM , EDTA lmM,TritonX-100 0, 1% ), congelés puis lysés par sonication.
1,5 ml d'extrait cellulaire ainsi préparé des différentes souches ont été centrifugés 5 min. à 10.000 g et le culot a été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide à 12,5 % . La figure 20 montre les profils d'élution des protéines des différentes souches, les puits 1 et 8 correspondant aux marqueurs de poids moléculaire les puits 2 et 3 à la souche BL 21 DE 3 non induite (puits 2) ou induite (puits 3); les puits 4 et 5 à la souche BL 21 pLys S non induite (puits 4) ou induite (puits 5) , les puits 6 et 7 correspon- dants à la souche BL21pLysE non induite (puits 6) ou induite (puits 7).
EXEMPLE V.
Activité IBF du CD16 recombinant. L'activité IBF d'une molécule est définie comme l'inhibition par cette molécule de la fixation des immunoglobulines du type G (IgG).
L'effet d'un CD16 soluble (Rc gamma RIII) obtenu par recombinaison (Exemple IV) sur la sécrétion des IgG et recherché sur les cultures lymphocytaires après stimulation par une lectine .
Des lymphocytes sont isolés sur coussin de Ficoll à partir de sang total obtenu à la banque de sang de l'Hôpital Pitier Salpétrière chez des donneurs volontaires .
A chaque culture correspond un donneur .
Les conditions de cultures sont les suivantes:
1°) Milieu de culture de base (RPMI complet) RPMI 1640 complémenté en :
glutamine 2 mM
pénicilline et streptomycine
SVF 10%.
Dans ce milieu de base , les lymphocytes sont mis en culture mais ne sécrètent pas d'IgG.
2°) Milieu de stimulation. (Milieu PW).
Ce milieu destiné à induire une sécrétion des IgG est constitué du milieu de base complémenté par du Pockweed à 0,25 mg par ml, qui est un mitogène.
Le CD 16 soluble est ajouté au milieu PW à des concentrations comprises entre 10 et 500 ng/ml après prétraitement . Prétraitement du CD 16 recombinant .
Le CD 16 recombinant (RHONE POULENC SANTE) est purifié de la manière suivante :
a) filtration sur membrane (diamètre de pore 0,2 micron ) afin d'éliminer les aggrégats insolubles.
b) dialyse de la préparation contre du tampom PBS .
c) stérilisation par filtration sur membrane (diamètre de pore 0,2 micron ) en milieu stérile .
Les cultures sont effectuées en tube de 15 ml dans une étuve à CO2 (5% de CO2 , 37°C), la densité cellulaire étant de 2 10 cellules par ml.
Après une période de stimulation (3 à 4 jours d'incubation ) les tubes sont centrifugés (600 g , 10 minutes ) puis le surnageant est recueilli et le milieu de culture est renouvelé.
Cette opération est ensuite effectuée toutes les 24 heures ou 48 heures.
Les résultats obtenus sont résumés sur la figure 21 . La concentration de CD 16 est mentionnée en abscisse en nanogrammes par millilitre , les deux colonnes à gauche de l'histogramme représentant respectivement le témoin cellules non activés et le témoin cellules activés sans CD 16.
Le taux d'IgG sécrété est exprimé en nanogramme par millilitre (en ordonnées ).
On montre donc qu'il y a un effet d'inhibition de la synthèse d'IgG par des lymphocytes activés , à partir d'environ 25 à 50 nanogrammes par millitre de CD 16.

Claims

REVENDICATIONS
1.Utilisation pour le traitement des affections liées au HIV, de protéines ou fragments de protéines empêchant, au moins partiellement, l'interaction entre le fragment Fc d'une IgG et son récepteur de type membranaire ou soluble , à l'exclusion des récepteurs Fc gamma I et II.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la protéine est constituée d'un fragment de la protéine CD16.
3.Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la protéine est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-CD16 , ou un anticorps ou fragment d'anticorps anti-idiotype dirigé contre un anticorps anti-CD16.
4.Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'anticorps est le 3G8.
5.Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un fragment de la protéine CD16 correspondant à l'une des séquences d'acides aminés suivantes, ou une partie de ces séquences :
( a ) NH2-Pro-Arg-Trp-Val-Phe-Lys-Glu-Glu-Asp- Pro-Ile-His-Leu-Arg-Cys-COOH
(b) NH2-Leu-Gln-Asn-Gly-Lys-Asp-Arg-Lys-Tyr- Phe-His-His-Asn-Ser-Cys-COOH
(c) NH2-Ala-Thr-Val-Asn-Asp-Ser-Gly-Glu-Tyr- Arg-Cys-Glu-COOH
(d) NH2-Val-Ser-Thr-Iso-Ser-Ser-Phe-Ser-Pro -Pro-Gly-COOH.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins en partie la formation de rosettes entre deux neutrophiles humains et des globules rouges de mouton opsonises par des IgG anti-globules rouges de mouton.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins en partie la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante .
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 d'un anticorps ou fragment d'anticorps stimulant la synthèse et éventuellement le relargage de cytokine(s) et/ou de facteur (s) de croissance et notamment de TNF par les cellules NK en culture.
9.Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins partiellement la sécrétion d'IgG par des lymphocytes B.
10. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'au moins une protéine ou fragment de protéine empêchant , au moins partiellement , l'interaction entre le fragment Fc d'une IgG et son récepteur de type membranaire ou soluble , à l'exclusion des récepteurs Fc gamma I et II .
11.Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine est constituée d'un fragment de la protéine CD16.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la protéine est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-CD16 , ou un anticorps ou fragment d'anticorps anti-idiotype dirigé contre un anticorps anti-CD16.
13. Composition selon la revendication 12 , caractérisée en ce que l'anticorps est le 3G8.
14. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un fragment de la protéine CD16 correspondant à l'une des séquences d'acides aminés suivantes , ou une partie de ces séquences :
(a) NH2-Pro-Arg-Trp-Val-Phe-Lys-Glu-Glu- Asp-Pro-Ile-His-Leu-Arg-Cys-COOH.
(b) NH2-Leu-Gln-Asn-Gly-Lys-Asp-Arg-Lys- Tyr-Phe-His-His-Asn-Ser-Cys-COOH
(c) NH2-Ala-Thr-Val-Asn-Asp-Ser-Gly-Glu-Tyr- Arg-Cys-Glu-COOH
(d) NH2-Val-Ser-Thr-Iso-Ser-Ser-Phe-Ser- Pro-Pro-Gly-COOH.
15. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 contenant une quantité efficace d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins en partie la formation de rosettes entre des neutrophiles humains et des globules rouges de mouton opsonises par des IgG anti-globules rouges de mouton.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 contenant une quantité efficace d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins en partie la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante .
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 contenant une quantité efficace d'un anticorps ou fragment d'anticorps stimulant la synthèse et éventuellement le relargage de cytokine(s) et/ou le facteur (s) de croissance et notamment de TNF par des cellules NK en culture .
18. Composition selon l'une des revendications 10 et 11 contenant une quantité efficace d'une protéine ou fragment de protéine inhibant au moins partiellement la sécrétion des IgG par des lymphocytes B activés.
19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 10 à 18, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement des affections liées au virus HIV, notamment du SIDA, des myélodisplasies et des affections autoimmunes.
20. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 10 à 19 présentée en vue de l'administration parentérale ou entérale.
21.Anticorps dirigé contre un fragment de la protéine CD16 correspondant à l'une des séquences d'acides aminés suivantes, ou une partie de ces séquences :
(a) NH2-Pro-Arg-Trp-Val-Phe-Lys-Glu-Glu- Asp-Pro-Ile-His-Leu-Arg-Cys-COOH.
(b) NH2-Leu-Gln-Asn-Gly-Lys-Asp-Arg-Lys-Tyr- Phe-His-His-Asn-Ser-Cys-COOH.
(c) NH2-Ala-Thr-Val-Asn-Asp-Ser-Gly-Glu-Tyr- Arg-Cys-Glu-COOH.
(d) NH2-Val-Ser-Thr-Iso-Ser-Ser-Phe-Ser-Pro- Pro-Gly-COOH.
22. Fragment d'un anticorps selon la revendication 21.
23.Anticorps anti-idiotype dirigé contre un anticorps anti-CD16.
24.Fragment de la protéine CD16 empêchant au moins partiellement l'interaction entre le fragment Fc d'une IgG et son récepteur de type membranaire ou soluble ,à l'exclusion des récepteurs Fc gamma I et II.
25.Fragment de la protéine CD16 selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il est obtenu par recombinaison génétique .
26. Fragment de la protéine CD16 selon la revendication 24 , caractérisé en ce qu'il est obtenu par expression d'un vecteur recombiné génétiquement dans les cellules eucaryotes ou procaryotes .
27. Anticorps ou protéine selon l'une quelconque des revendications 21 à 26 , caractérisé en ce qu'il inhibe au moins en partie la forma tion de rosettes entre des neutrophiles humaiuns et des globules rouges de mouton opsonises par des IgG anti-globules rouges de mouton.
28. Anticorps ou protéine selon l'une quelconque des revendications 21 à 26 , caractérisé en ce qu'il inhibe au moins en partie la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante.
29. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 21 à 26 , caractérisé en ce qu'il stimule la synthèse et éventuellement le relargage de cytokine(s) et/ou de facteur (s) de croissance et notamment de TNF par les cellules NK en culture .
30.Fragment de la protéine CD16 selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce qu'elle inhibe au moins partiellement la sécrétion des lgG par des lymphocytes B activés.
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