WO1997012908A1 - NOUVELLE PROTEINE MEMBRANAIRE p76 D'HELICOBACTER PYLORI - Google Patents

NOUVELLE PROTEINE MEMBRANAIRE p76 D'HELICOBACTER PYLORI Download PDF

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WO1997012908A1
WO1997012908A1 PCT/FR1996/001551 FR9601551W WO9712908A1 WO 1997012908 A1 WO1997012908 A1 WO 1997012908A1 FR 9601551 W FR9601551 W FR 9601551W WO 9712908 A1 WO9712908 A1 WO 9712908A1
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nacl
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centrifugation
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Ling Lissolo
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Pasteur Merieux Serums & Vaccins
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the subject of the present invention is in particular a protein d! Helicobacter pylori newly obtained in substantially purified form, as well as the pharmaceutical compositions containing them.
  • Helicobacter is a bacterial genus characterized by gram negative spiral bacteria. Several species colonize the gastrointestinal tract of mammals. We cite in particular H. pylori, H. heilmanii, H. felis and H. mustelae. Although H. pylori is the species most commonly associated with human infections, in some admittedly rare cases, H. heilmanii and H. felis have been isolated from humans.
  • Helicobacter infects more than 50% of the adult population in developed countries and almost 100% of that of developing countries; making it one of the predominant infectious agents worldwide.
  • H. pylori is found exclusively to date on the surface of the stomach lining in humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Furthermore, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H. pylori.
  • H. proteins. pylori have been characterized or isolated to date. These include urease, composed of two subunits A and B of 30 and 67 kDa respectively ( ⁇ u & Mobley, Infect. Immun. (1990) 58: 992; Dunn et al. J. Biol. Chem (1990) 265: 9464; Evans et al. Microbial Pathogenesis (1991) K): 15; Labigne et al, J. Bact, (199) 173: 1920); 87 kDa vacuolar cytotoxin (VacA) (Cover & Blaser. J. Biol. Chem. (1992) 267: 10570: Phadnis et al, Infect. Immun.
  • urease composed of two subunits A and B of 30 and 67 kDa respectively ( ⁇ u & Mobley, Infect. Immun. (1990) 58: 992; Dunn et al. J. Biol. Chem (1990) 265:
  • HpaA fibrillar hemaglutinin
  • Hpn fibrillar hemaglutinin
  • a 15 kDa protein rich in histidine Hpn
  • a 30 kDa outer membrane protein Bolin et al, J. Clin. Microbiol. (1995) 33: 381
  • a 20 kDa lipoprotein associated with the membrane Kostrcynska et al, J. Bact.
  • urease is recognized as being a first choice antigen which can be used for this purpose (WO 94/9823; WO95 / 3824; WO 95/22987; Michetti et al, Gastroenterology (1994) 107: 1002).
  • WO 94/9823 WO95 / 3824
  • WO 95/22987 Michetti et al, Gastroenterology (1994) 107: 1002
  • the subject of the invention is in particular an H. protein. pylori in substantially purified form, capable of being obtained from a membrane fraction of H. pylori and whose molecular weight after electrophoresis on 10% polyacrylamide gel in the presence of SDS. appears on the order of 76 kDa.
  • substantially purified form is meant that the protein is separated from the environment in which it exists naturally. Among others, it may be a preparation in particular devoid of the cytoplasmic and periplasmic proteins of H. pylori.
  • the membrane protein whose apparent molecular weight is of the order of 76 kDa is capable of being obtained according to a process in which:
  • the membrane fraction consisting of the centrifugation pellet is recovered, which is resuspended in an aqueous medium, advantageously in a carbonate buffer pH 9.5 containing 5% of zwittergent 3-14;
  • the membrane fraction is subjected to anion exchange chromatography on a Q-Sepharose column in 0.1 - 0.5 M NaCl gradient, advantageously in carbonate buffer pH 9.5 at 0.1% of zwittergent 3-
  • the fraction eluted is recovered in 0.25 - 0.45 M NaCl, eg in 0.25 - 0.35 M NaCl or preferably, in 0.35 - 0.45 M NaCl, which is subjected to a cation exchange chromatography on an S-Sepharose column in NaCl gradient 0 - 1 M, advantageously in acetate buffer pH 5 at 0.1% zwittergent 3-14 (advantageously, the NaCl fraction 0.25 - 0, 45 M, eg in 0.25 - 0.35 M NaCl or 0.35 - 0.45 M NaCl, is first dialyzed against acetate buffer pH 5 at 0.1% of zwittergent 3-14); and
  • the fraction eluted is recovered in NaCl 0.15 - 0.2 M. preferably in NaCl 0.15 M.
  • a fraction eluted in 0.25-0.45 M NaCl should be understood as follows: a fraction eluted at an NaCl concentration of between 0.25 and 0, 45 M.
  • the fraction eluted can therefore include material eluted between 0.25 and 0.45 M or else material eluted between two concentrations in the range from 0.25 to 0.45 M. eg 0.35 - 0.45 M .
  • the NaCl gradient applied to the S-Sepharose column is preferably a step gradient.
  • 0.1 M 0.15 M, 0.2 M and 1 M NaCl steps are used.
  • the 76 kDa membrane protein has the presumed biological function of being a porin. probably located at the level of the external membrane. Exner et al, Infect. Immun. (Apr.1995) 63: 1567 characterizes a family of porins which each present in SDS-Page electrophoresis, a different migration profile depending on whether they were heated to 95 ° C (conventional process) or not. This is not the case with regard to the 76 kDa protein according to the invention; indeed its migration on gel is not modified with a sample heated to 60 ° C and not to 95 ° C.
  • the N-terminal sequence of the 76 kDa protein of an H. strain. pylori is as follows (one letter code): EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.
  • allelic differences in the amino acid sequence may consist of one or more substitutions, deletions or additions of amino acids, which do not alter the biological function.
  • biological function is meant the function of the protein which participates in the survival of cells in which the protein exists naturally (even if the function is not absolutely essential).
  • the function of a porine is to allow compounds present in the external environment to enter the interior of the cell.
  • the biological function is distinct from the antigenic function.
  • a protein can have more than one biological function.
  • the subject of the invention is also a protein in substantially purified form and capable of having been purified according to the method described above from a bacterium of the genus Helicobacter e.g., H. pylori. H. heilmanii, H. felis and H. mustelae.
  • Helicobacter e.g., H. pylori. H. heilmanii, H. felis and H. mustelae.
  • the subject of the invention is also any other protein or polypeptide. in substantially purified form, insofar as it is analogous in terms of antigenicity to a protein to 'Helicobacter capable of being purified according to the process described above.
  • polypeptides these are in particular polypeptides derived by fragmentation or by mutation of one or more amino acids, eg by deletion, addition or substitution, of a protein which exists in nature and whose purified form can be obtained according to the process described above.
  • Such polypeptides can in particular be obtained by enzymatic digestion using proteases such as pepsin or trypsin. It is not necessary that such polypeptides can be purified according to the method described above.
  • polypeptide regardless of the size of the molecules (length of the amino acid chain) and any post-translational modifications.
  • polypeptide is reserved to denote a product derived from a protein by fragmentation or mutation.
  • a protein or a polypeptide according to the invention must be capable of being recognized by monospecific antibodies established against a protein d! Helicobacter capable of being purified according to the process described above
  • This specific antigenicity can be revealed by a number of methods; for example by Western biot (Towbin et al, PNAS (1979) 76: 4350). dot biot and ELISA.
  • the product intended to be tested eg either in the form of a purified preparation, or in the form of a bacterial extract
  • SDS-Page gel polyacrylamide 10%
  • the latter is incubated with a hyperimmune monospecific serum diluted in the range of dilutions from 1: 50 to 1: 5000, preferably from 1: 100 to 1: 500
  • the specific antigenicity is demonstrated as soon as a band corresponding to the product tested exhibits reactivity to one of the dilutions included in the range established above.
  • the product to be tested is preferably used to cover the wells. It is preferred to use a purified preparation, although a total extract may also be used.
  • 100 ⁇ l of a preparation at 10 ⁇ g of protein / ml are distributed in the wells of a 96-well plate. The plate is incubated for 2 hrs at 37 ° C. and then overnight at 4 ° C. The plate is washed with PBS buffer (phosphate buffered saline) containing 0.05% of Tween 20 (PBS / Tween buffer). The wells are saturated with 250 ⁇ l of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the reaction is measured by colorimetry (absorbance measured by spectrophotometry). Under these conditions, a positive reaction is observed when an OD value of 1 is associated with a dilution of at least 1:50, preferably at least 1: 500.
  • the appropriate wavelength at which the optical density depends on the substrate.
  • a preparation of the product to be tested with 100 ⁇ g of protein / ml is diluted in series twice in 50 mM Tris-HCl pH 7.5.
  • 50 mM Tris-HCl pH 7.5 One hundred ⁇ l of each dilution is applied to a 0.45 ⁇ m nitrocellulose membrane in a 96-well biot dot apparatus (Biorad).
  • the buffer is removed by vacuum.
  • the wells are washed by adding 50 mM Tris-HCl pH 7.5 and the membrane is air dried.
  • the membrane is saturated with blocking buffer (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 0.15 M.
  • the reaction is revealed according to standard methods. For example, a rabbit anti-immunoglobulin goat peroxidase-immunoglobulin conjugate is added to the wells. The incubation is continued for 90 min at 37 ° C., then the plate is washed. The reaction is developed with the appropriate substrate. The reaction is measured by colorimetry or chemiluminescence.
  • a reaction is positive when a coloration is observed at the level of the deposition on the nitrocellulose sheet directly for revelation by colorimetry or on photographic film for revelation by chemiluminescence, associated with a dilution of at least 1:50, preferably at least 1: 500.
  • a protein according to the invention can in particular be obtained by purification from Helicobacter or expressed by recombinant way in a heterologous system (which can also be the case for a polypeptide according to the invention).
  • the protein may have post-translational modifications which are not identical to those of the corresponding protein derived from the original strain.
  • the therapeutic or prophylactic efficacy of a protein or a polypeptide according to the invention can be evaluated according to standard methods; for example by measuring the induction of a mucosal immune response or the induction of an immune response with a therapeutic or protective effect using e.g. the mouse / H. felis model and the procedures described in Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & ⁇ epatology, (1995) 7: 303 or Lee et al, J. Infect. Say. (1995) 172: 161, provided that the following precaution is taken: When the protein originates from a species other than H felis, the strain of H.
  • felis must be replaced by a Helicobacler strain belonging to the species from which the protein originates and adapted for this purpose (the other experimental conditions remaining identical).
  • a Helicobacler strain belonging to the species from which the protein originates and adapted for this purpose (the other experimental conditions remaining identical).
  • the capacity of a polypeptide derived by fragmentation of an H. protein is tested.
  • pylori to induce a protective or therapeutic effect, by substituting a strain of H. pylori.
  • Such a strain is proposed by e.g. Kleanthous et al, Abstr. presented at the VlIIth International Workshop on Gastroduodenal Pathology 7-9th July 1995, Edinburgh, Scotland.
  • a protective effect is noted when an infection in the gastric tissue is less compared to a control group. Infection is assessed by testing urease activity. bacterial load or leukocyte infiltration. For example, when a reduction in urease activity in the gastric tissue is found after the test, even if it is
  • the invention also relates to (i) a composition of matter comprising a protein or a polypeptide according to the invention and a diluent or a support; in particular (ii) a pharmaceutical composition in particular intended for the prevention or treatment of a Helicobacter infection, which comprises, as active principle, a protein or a polypeptide according to the invention, in an amount effective from a prophylactic point of view or therapeutic; (iii) the use of a protein or a polypeptide according to the invention as a therapeutic or prophylactic agent; (iv) the use of a protein or a polypeptide according to the invention for the manufacture of a medicament intended for the prevention or the treatment of a Helicobacter infection; as well as (v) a method of inducing an immune response against Helicobacler eg, H.
  • a composition of matter comprising a protein or a polypeptide according to the invention and a diluent or a support
  • a mammal is administered an immunologically effective amount of a protein or polypeptide according to the invention in order to to develop an immune response; in particular (vi) a method of preventing or treating a Helicobacterllc infection, an individual is administered a prophylactically or therapeutically effective amount of a protein or a polypeptide according to the invention.
  • the methods and pharmaceutical compositions according to the invention can treat or prevent infections with Helicobacter and consequently, gastrointestinal diseases associated with such infections. These include, in particular, acute chronic atrophic gastritis; peptic ulcers e.g. gastric and duodenal ulcers; gastric cancers; chronic hyperopia; refractory non-ulcerative dyspepsia; intestinal metaplasia and certain lymphomas (e.g. low grade MALT lymphoma).
  • peptic ulcers e.g. gastric and duodenal ulcers
  • gastric cancers chronic hyperopia
  • refractory non-ulcerative dyspepsia e.g. low grade MALT lymphoma
  • intestinal metaplasia e.g. low grade MALT lymphoma
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular through a mucosal surface (eg ocular, nasal, oral, gastric, intestinal, rectal, vaginal, or of the urinary tract) or parenterally (eg subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal).
  • a mucosal surface eg ocular, nasal, oral, gastric, intestinal, rectal, vaginal, or of the urinary tract
  • parenterally eg subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • the choice of administration route depends on a certain number of parameters such as the adjuvant associated with the protein or the polypeptide according to the invention. For example, if a mucosal adjuvant is used, the nasal or oral route is preferred. If a lipid formulation is used, the parenteral route will be chosen. preferably the subcutaneous or intramuscular route.
  • a composition according to the invention can comprise, in addition to a protein or a polypeptide according to the invention, at least one other Helicobacler antigen such as the apoenzyme of urease, or a subunit, fragment, homologous, mutant or derivative. of this urease.
  • a protein or a polypeptide according to the invention can be formulated in or with liposomes, preferably neutral or anionic liposomes. microspheres. ISCOMs or viral pseudo-particles (VLPs), to promote targeting of the protein or polypeptide or to increase the immune response.
  • liposomes preferably neutral or anionic liposomes. microspheres. ISCOMs or viral pseudo-particles (VLPs)
  • VLPs viral pseudo-particles
  • Adjuvants other than liposomes can also be used. Many are known to those skilled in the art. Such adjuvants are referenced below
  • aluminum compounds such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and aluminum hydroxyphosphate are mentioned.
  • the antigen can be adsorbed or precipitated on an aluminum compound according to standard methods.
  • Other adjuvants such as the RIBI from ImmunoChem (Hamilton, MT) can be used for parenteral administration.
  • bacterial toxins e.g. cholera toxin (CT), toxin from E. coli. heat labile coli (LT) Clostridium difficile toxin and pertussis toxin (PT) as well as the detoxified forms (subunit, toxoid or mutant) of these toxins.
  • CT cholera toxin
  • LT heat labile coli
  • PT pertussis toxin
  • a preparation containing the CT subunit B (CTB) and a smaller amount of CT can be used.
  • Fragments, homologs and derivatives of these toxins are likewise suitable insofar as they retain an adjuvant activity.
  • a mutant having reduced toxicity is used.
  • Such mutants are described eg in WO 95/1721 1 (Arg-7-Lys CT mutant), WO 95/34323 (Arg-9-Lys Glu-129-Gly PT mutant) and WO 96/6627 (Arg-192- Gly LT mutant).
  • Other adjuvants such as the major bacterial lipopolysaccharide (MPLA) from e.g. E. coli. Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium or Shigella flexneri, can be used for mucosal administration.
  • MPLA major bacterial lipopolysaccharide
  • Adjuvants useful for both mucosal and parenteral administration include in particular polyphosphazene (WO 95/2415).
  • DC-chol (3 beta-fN- (N'.N'-dimethyl aminomethane) -carbamoyl] cholesterol) (USP 5,283,185 and WO 96/14831) and QS-21 (WO 88/9336).
  • the administration can take place in single or repeated dose one or more times after a certain delay.
  • the appropriate dosage varies according to various parameters, for example, the individual treated (adult or child) of the vaccine antigen itself, the mode and frequency of administration, the presence or absence of adjuvant and if present, the type of adjuvant and the desired effect (eg protection or treatment), as can be determined by those skilled in the art.
  • an antigen according to the invention can be administered in an amount ranging from 10 ⁇ g to 500 mg, preferably from 1 mg to 200 mg.
  • a parenteral dose should not exceed 1 mg, preferably 100 ⁇ g. Higher doses may be prescribed for eg oral use.
  • the amount of protein administered to humans by the oral route is, for example, of the order of 1 to 10 mg per dose, and at least 3 doses are recommended at 4-week intervals.
  • a composition according to the invention can be produced in a conventional manner.
  • a protein or a polypeptide according to the invention is combined with a diluent or a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view, eg water or a saline solution such as a phosphate salt buffer (PBS), supplemented. optionally with a bicarbonate salt such as sodium bicarbonate eg 0.1 to 0.5 M when the composition is intended for oral or intragastric administration.
  • a diluent or carrier is selected based on the mode and route of administration and standard pharmaceutical practices. Pharmaceutically acceptable diluents and carriers and all that is necessary for their use in pharmaceutical formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference text in this area and in the USP / NP.
  • a protein or a polypeptide according to the invention can be encapsulated alone or in the presence of other H. pylori proteins in gelatin capsules in order to protect the antigen against degradation by gastric juice or else administered in presence of sodium bicarbonate.
  • Such formulations have already been used for pharmaceutical compositions (Black et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 5_3: 9).
  • the protein can also be encapsulated in PLGA microspheres (copolymers of glycolic acid and lactic acid) according to the protocol described elsewhere (Eldridge et al, Curr.
  • the protein can also be included in liposomes prepared according to conventional methods widely described ("Liposomes: a practical approach. Ed. RRC New. D. Rickwood & B.D. ⁇ ames,
  • a protein or polypeptide according to the invention can be administered parenterally.
  • a protein or polypeptide according to the invention is adsorbed on alumina gel in a completely conventional manner.
  • the protein in solution at 1 mg / ml in a buffer whose p ⁇ is close to 6.5 is brought into contact for 1 hour with aluminum hydroxide at 10 mg / ml measured at AL " 1 " * -1 '.
  • the final composition of the preparation is as follows: protein 50 ⁇ g / ml, AL +++ 250 ⁇ g / ml, merthiolate 1 / 10,000, all in PBS. As in the case of oral administration, 3 injections are recommended each spaced 4 weeks from the previous one.
  • a polypeptide according to the invention can also be useful as a diagnostic reagent, for example for detecting the presence of anti-Helicobacter antibodies in a biological sample e.g. a blood sample.
  • a polypeptide advantageously comprises 5 to 80 amino acids, preferably 10 to 50 amino acids.
  • a polypeptide reagent according to the invention may or may not be labeled, depending on the diagnostic method used. Diagnostic methods are described further in the text.
  • the invention provides a monospecific antibody capable of recognizing a protein or a polypeptide according to the invention.
  • an antibody capable of reacting mainly with a single Helicobacler protein. Such an antibody can only be obtained by using a substantially purified protein for immunogen.
  • An antibody according to the invention can be polyclonal or monoclonal; the monoclonals can be chimeric (for example, constituted by a variable region of murine origin associated with a constant human region) or humanized (only the hypervariable regions are of animal origin, for example of murine origin) and / or by a single chain.
  • the polyclonal as the monoclonal can also be in the form of fragments of immunoglobulins for example a fragment F (ab) '2 or Fab.
  • An antibody according to the invention can also be of any isotype, for example IgG or IgA; a polyclonal can be of a single isotype or a mixture of all or part of them.
  • An antibody which is directed against a protein according to the invention can be produced and subsequently identified using a standard immunoassay, for example analysis by Western biot, dot biot or ELISA (see for example Coligan et al Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & sons Inc., New York,
  • An antibody according to the invention can be useful in diagnosis, as well as in affinity chromatography for purifying on a large scale, a protein or a polypeptide according to the invention; such an antibody is also potentially useful as a therapeutic agent in a passive immunization procedure.
  • the invention also provides (i) a reagent for detecting the presence of Helicobacler in a biological sample, which comprises an antibody or a polypeptide according to the invention; and (ii) a diagnostic method for detecting the presence of Helicobacler in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with an antibody or a polypeptide according to the invention, so that an immune complex is formed: optionally, the unbound material is eliminated, and the immune complex formed between the sample and the antibody or the polypeptide according to the invention is detected, as an indicator of the presence of Helicobacler in the sample or in the organ from which the sample was taken.
  • an antibody according to the invention makes it possible to test the presence of Helicobacler in a gastric extract.
  • the reagent to be presented in free form or immobilized on a solid support can be any support commonly used in this field, for example, a tube, a ball or a well.
  • Immobilization can be obtained by direct or indirect means.
  • the direct means include passive adsorption (non-covalent bond) or covalent bonds between the support and the reagent.
  • indirect means it is meant that an anti-reagent compound capable of interacting a reagent is first of all attached to a solid support. For example, if a polypeptide reagent is used.
  • an antibody capable of binding it can be used as an anti-reagent, provided that it can bind to an epitope of the polypeptide which is not involved in the recognition of the antibodies present in the biological samples.
  • the indirect means can also be implemented via a ligand-receptor system, for example by grafting a molecule, such as a vitamin, onto a polypeptide reagent and then immobilizing the corresponding receptor in solid form. This is illustrated eg by the biotin-streptavidin system.
  • indirect means are used for example by adding a peptide tail to the reagent eg by means chemical, and by immobilizing the grafted product by passive adsorption or by covalent bonding of the peptide tail.
  • the invention also relates to a method for purifying a protein or a polypeptide according to the invention from a biological sample, according to which the biological sample is subjected to an affinity chromatography using a monospecific antibody according to the invention.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal, preferably of the IgG type.
  • Purified IgGs can be prepared from an antiserum according to commonly practiced methods (see for example Coligan et al).
  • a biological sample preferably in a buffer solution
  • chromatography equipment preferably equilibrated with the buffer used for diluting the biological sample so that the protein or the polypeptide according to the invention (antigen ) can be adsorbed on the material.
  • the chromatography equipment such as a gel or a resin associated with an antibody according to the invention, can be in the form of a bath or a column.
  • the components which remain unbound are eliminated by washing and the antigen is then eluted in an appropriate elution buffer, such as for example, a glycine buffer or a buffer containing a chaotropic agent eg guanidine HCl, or a rich concentration. salt (for example, 3M MgCU).
  • the eluted fractions are recovered and the presence of the antigen is then demonstrated, for example by measuring the absorbance at 280 nm.
  • the subject of the invention is also (i) a composition of matter comprising a monospecific antibody according to the invention, and a diluent or a support; in particular, (ii) a pharmaceutical composition comprising a monospecific antibody according to the invention in an amount effective from a therapeutic or prophylactic point of view; (iii) the use of a monospecific antibody according to the invention in the preparation of a medicament to treat or prevent Helicobacter infection; as well as (iv) a method for treating or preventing a Helicobacter infection (for example, H. pylori, H. felis, H. musielae or H. heilmanii), according to which a therapeutically or prophylactically effective amount of an antibody is administered according to the invention, to an individual in need of such treatment.
  • a Helicobacter infection for example, H. pylori, H. felis, H. musielae or H. heilmanii
  • the monospecific antibody can be polyclonal or monoclonal, preferably of the IgA isotype (predominantly).
  • the antibody is administered mucosally to a mammal, for example in the gastric mucosa, either orally or intragastrically, advantageously in the presence of a bicarbonate buffer.
  • a monospecific antibody according to the invention can be administered as the sole active component or as a mixture comprising at least one monospecific antibody specific to each Helicobacler polypeptide.
  • the dose of antibody to be used in this method can be readily determined by those of skill in the art. For example, it is indicated that a dosage can be characterized by a daily administration of between 100 and 1000 mg of antibody for one week; or a dose comprising 100 to 1000 mg of antibody administered three times a day for two to three days.
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody according to the invention can be produced according to the rules set out above for a composition comprising a protein or a polypeptide according to the invention. Likewise, identical medical indications apply.
  • FIG. 1 presents the analysis of the Cg2d P membrane fraction by electrophoresis on 10% polyacrylamide gel and staining with Coomassie blue. The molecular weight markers appear in column 1.
  • FIG. 3 shows, after electrophoresis on 10% polyacrylamide gel and staining with Coomassie blue, the electrophoretic profile of fraction D resulting from chromatography on a Q-Sepharose column of the membrane fraction C ⁇ 2d (column 3) and of the D fraction from chromatography on an S-Sepharose column from fraction D (column 4).
  • Column 1 corresponds to the molecular weight markers and column 2 to the membrane fraction Cg2d-
  • the H. pylori ATCC 43579 strain is cultured in a liquid medium in a 10 L fermenter.
  • a glycerol germ freeze is used to inoculate a 75 cm ⁇ flask containing so-called "biphasic" medium (a solid phase in Colombia agar containing 6% fresh sheep blood and a liquid phase in soy trypticase containing 20% fetal calf serum). After 24 hours of culture under microaerophilic conditions, at 37 ° C. the liquid phase of this culture is used to inoculate several 75 cm ⁇ flasks in a biphasic medium in the absence of sheep's blood. After 24 hours of culture, the liquid phase makes it possible to inoculate a biofermenter of 2 1 in a soy trypticase liquid medium containing beta cyclodextrin at 10 g / 1.
  • This culture with DO 1.5-1.8 is inoculated in a 10 1 fermenter in liquid medium. After 24 hours of culture, the bacteria are harvested by centrifugation at 4000 x g for 30 minutes at 4 ° C. A culture of 10 liters of H. pylori ATCC 43579 in a fermenter makes it possible to obtain approximately 20 to 30 g (wet weight) of bacteria.
  • the pellet of germs obtained previously is washed with 500 ml of PBS (phosphate buffered saline; NaCl 7.650 g, disodium phosphate 0.724 g monopotassium phosphate 0.210 g for one liter: p ⁇ 7.2) per liter of culture. Then the germs are again centrifuged under the same conditions.
  • the bacterial pellet obtained (Cj) is resuspended in a 1% solution of OG (Sigma) (30 ml / liter of culture). The bacterial suspension is incubated for 1 hour at room temperature with magnetic stirring, then centrifuged at 17,600 xg for 30 minutes at 4 ° C.
  • the precipitate formed during the dialysis is recovered by centrifugation at 2,600 x g for 30 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant (S2d) is eliminated and the pellet (C ⁇ 2d) ⁇ contains membrane proteins, is stored at -20 ° C.
  • the resuspension of the pellet is carried out in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and Pefabloc 100 ⁇ M (buffer A).
  • the membrane fraction C £ 2d is analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of SDS according to the method of Laemmli (1970). The proteins are visualized after staining with Coomassie blue.
  • the protein profile of the membrane fraction shows the presence of 4 major bands at 76, 67, 50 and 30 kDa ( Figure 1. column 4).
  • Electrophoresis is carried out on polyacrylamide gel according to the method of Laemmli (1970) with a gel of concentration of 5% and a separation gel of 10%.
  • the membrane fraction is resuspended in buffer A, then diluted to half in the 2X sample buffer. The mixture is heated for 5 minutes to 95 ° C.
  • About 19 mg of protein are deposited on a gel with a dimension of 16 x 12 cm and a thickness of 5 mm.
  • Premigration is carried out at 50 V for 2 hours, followed by migration at 65 V overnight.
  • the coloring of the gel with Coomassie R250 blue (0.05% in ultrafiltered water) allows good visualization of the bands.
  • the 76 kDa major band is cut with a scalpel and ground with ultra-turrax in the presence of 10 or 20 ml of 25 mM Tris-HCl extraction buffer pH 8.8, 8 M urea, 10% SDS, phenyl methyl 100 ⁇ M fluoric sulfonyl (PMSF) and 100 ⁇ M Pefabloc (buffer C).
  • the filtrate is precipitated with 3 volumes of a 50:50 mixture of 75% methanol and 75% isopropanol, then ultracentrifuged at 240,000 x g for 16 hours at 10 ° C. on a 70 TFT rotor (J8-55, Beckman).
  • the pellet is taken up in 2 ml of 10 mM NaP04 solubilization buffer pH 7.0, 1 M NaCl, 0.1% Sarkosyl, 100 ⁇ M PMSF, 100 ⁇ M Pefabloc and 6 M urea (buffer D).
  • the solubilized sample is dialyzed successively against 100 ml of buffer D with 4 M urea and 0.1% of Sarkosyl, against 100 ml of buffer D with 2 M of urea and 0.5% of Sarkosyl and against 2 times 100 ml of buffer D without urea and 0.5% Sarkosyl. Dialysis is carried out for 1 hour with magnetic stirring at room temperature.
  • the final dialysate is incubated for 30 minutes in an ice bath, then centrifuged at low speed for 10 minutes at 4 ° C (Biofuge A. Heraeus Sepatech). The supernatant is recovered, filtered on a Millipore filter at 0.45 ⁇ m and stored at -20 ° C.
  • the protein balance shows that 55% of the proteins are eluted during the 0.1-0.5 M NaCl gradient, 15% are eluted during the washing with 0.1 M NaCl and 15% are eluted during the washing with NaCl. 1 M.
  • Fraction D or E dialyzed beforehand against the equilibration buffer (50 mM acetate pH 5.0, Pefabloc 100 ⁇ M and Zwittergent 3-14 0.1%) is deposited on the S-Sepharose column. The column is then washed with the same buffer until the absorbance at 280 nm is stabilized. About 3 column volumes are required to return to the baseline.
  • the proteins are eluted by a gradient of 0 to 0.5 M NaCl in equilibrium buffer (10 times VT), followed by washing with the equilibrium buffer containing 0.5 and 1 M NaCl (4 times VT). The collected fractions are analyzed, collected and stored as before.
  • the fraction D 'or E' leaving during the 0-0.5 M NaCl gradient, between 0.15 and 0.20 M NaCl, preferably at the concentration of 0.15 M NaCl, is recovered.
  • an analysis by SDS-PAGE and by Western biot is carried out. The results are shown in Figure 3.
  • EXAMPLE 4 Preparation of a hyperimmune serum against the 76 kDa membrane protein.
  • a polyclonal serum specific for the major membrane protein of H. pylori is obtained by hyperimmunization of rabbits respectively with the antigen purified by preparative SDS-PAGE.
  • the first OJ injection multisite and intramuscular subcutaneous is carried out with a preparation containing 50 ⁇ g of membrane protein emulsified in complete Freund's adjuvant, then the reminders J21 and J42 are made by injection of 25 ⁇ g of membrane protein in incomplete adjuvant Freund.
  • the animals are sacrificed on D60.
  • the sera obtained are decomplemented for 30 minutes at 56 ° C and sterilized by filtration on a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m (Millipore).
  • the antiserum reacts with the 76 kDa protein as isolated according to Example 3.
  • a monospecific serum can be obtained in an equivalent manner using a preparation purified according to the method described in 3.B from fraction E obtained after chromatography on Q-Sepharose (3. A) and corresponding to the fraction eluted in 0.15 M NaCl on S-Sepharosis.
  • a hyperimmune serum as prepared in Example 4 is placed on a Protein A Sepharose 4 Flast Flow column (Pharmacia) previously balanced in Tris- ⁇ Cl 100 mM p ⁇ 8.0.
  • the resin is washed with 10 column volumes of Tris- ⁇ CI 100 mM p ⁇ 8.0 then with 10 column volumes of Tris- ⁇ Cl 10 mM p ⁇ 8.0.
  • the IgGs are eluted in 0.1 M glycine buffer p ⁇ 3.0. IgGs are collected as 5 ml fractions to which 0.25 ml of 1 M Tris- ⁇ Cl p ⁇ 8.0 is added.
  • the optical density of the eluate is measured at 280 nm and the fractions containing the IgGs are combined and if necessary, frozen at -
  • CNBr - activated Sepharose 4B gel (knowing that 1 g of dry gel gives approximately 3.5 ml of hydrated gel and that the capacity of the gel is 5 to 10 mg of IgG per ml of gel) manufactured by Pharmacia ( ref: 17-0430-01) is suspended in 1 mM NaCl buffer. The gel is then washed using a buchner by adding small amounts of 1 mM HCl. The total volume of 1 mM HCl used is 200 ml per gram of gel.
  • the purified IgGs are dialyzed for 4 hrs at 20 + 5 ° C against 50 vol. 500 mM sodium phosphate buffer pH 7.5. They are then diluted in 500 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 to a final concentration of 3 mg / ml.
  • the IgGs are incubated with the gel overnight at 5 + 3 ° C with rotary shaking.
  • the gel is placed in a chromatography column and washed with 2 vol. column of 500 mM phosphate buffer pH 7.5.
  • the gel is then transferred to a tube and incubated in 100 mM ethanolamine pH 7.5 at room temperature with stirring. It is then washed by 2 vol. PBS column.
  • the gel can be stored in PBS merthiolate 1 / 10,000.
  • the amount of IgGs coupled to the gel can be determined by measuring the difference in optical density at 280 nm from the initial solution of IgGs and the direct eluate plus washes .
  • a protein preparation of antigen in Tris-HCl 50 mM pH 8.0 EDTA 2 mM, for example the Cg2d fraction obtained in 1.B is filtered through a 0.45 ⁇ m membrane and is then deposited on the balanced column beforehand with 50 mM Tris-HCl pH 8.0 2 mM EDTA. at a flow rate of approximately 10 ml / hr.
  • the column is washed with 20 vol. 50 mM Tris-HCl pH 8.0 2 mM EDTA.
  • the adsorption can be carried out in a bath; incubation is continued at 5 + 3 ° C overnight and with shaking.
  • the gel is washed with 2 to 6 vol. 10 mM sodium phosphate buffer, pH 8.
  • the antigen is eluted with 100 mM glycine buffer pH 2.5.
  • the eluate is collected in 3 ml fractions to which are added 150 ⁇ l of 1 M sodium phosphate buffer, pH 8.0.
  • the optical density of each fraction is measured at 280 nm; the fractions containing the antigen are pooled together and stored at -70 ° C.
  • a 25 cm 2 bottle containing a two-phase medium is inoculated.
  • the biphasic medium comprises a solid phase consisting of 10 ml of Colombia agar (BioMérieux) supplemented with 6% of fresh sheep blood and a liquid phase consisting of 3 ml of Trypticase soy broth (Difco) containing 20% of fetal calf serum.
  • the bottles are placed in a waterproof bag called
  • This 48 hour culture is used to re-inoculate vials containing biphasic medium.
  • the initial absorbance of this culture at 600 nm must be between 0.15 and 0.2.
  • the flasks are incubated under conditions identical to those described above.
  • the bacterial suspension is transferred to a test tube.
  • the absorbance of this culture is measured and it must be between 3.0 and 3.5 at 600nm.
  • the appearance of the germs is checked under a microscope after Gram staining.
  • Example 4 An antiserum as obtained in Example 4 is filtered through a 0.45 ⁇ m membrane to remove the small aggregates if they exist before use.
  • the anti-76 kDa antiserum gives a very strong agglutination reaction. Under the conditions tested, H. bacteria. pylori quickly clump together and the reaction is complete after a minute. The results indicate that the 76 kDa protein is likely exposed on the surface of H. pylori.
  • mice Groups of ten Swiss Webster mice aged 6 to 8 weeks (Taconic Labs, Germantown, NY) are immunized intragastrically with 1, 5, 25. 50 or 100 ⁇ g of the 76 kDa antigen purified by chromatography as described in Example 3, and diluted in PBS or in PBS containing 0.24 M sodium bicarbonate.
  • the antigen is supplemented with 5 or 10 ⁇ g of cholera toxin (CT) (Calbiochem, San Diego) or heat-labile toxin (LT) (Berna Products. Coral Gables FL).
  • CT cholera toxin
  • LT heat-labile toxin
  • mice Four doses are administered to each mouse 7-10 days apart. Two weeks after the last antigen administration, the mice are tested by a single dose of the H. pylori strain ORV2002 (1 ⁇ 10 7 of live bacteria in 200 ⁇ l of PBS; OD 550 of approximately 0.5) administered by the route. intragastric. A group having received no dose of antigen and serving as a control is likewise tested. Two weeks after the test, the mice are sacrificed. The percentage of protection is determined either by measuring the urease activity or by evaluating the bacterial load by histology as described in Lee et al (supra) or directly by quantitative culture of H. pylori.
  • NAME Pasteur Merieux serums and vaccines
  • B STREET: 58 avenue Leclerc

Abstract

L'invention a pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10 % en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76 kD.

Description

NOUVELLE PROTEINE MEMBRANAIRE p76 D 'HELICOBACTER PYLORI
La présente invention a notamment pour objet une protéine d! Helicobacter pylori nouvellement obtenue sous forme substantiellement purifiée, ainsi que les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien que H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas certes rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme.
Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement ; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.
H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.
II apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à H. pylori. Un tel vaccin serait très probablement de nature sous-unitaire.
Différentes protéines d'H. pylori ont été caractérisées ou isolées à ce jour. Il s'agit notamment de l'uréase, composée de deux sous-unités A et B de 30 et 67 kDa respectivement (Ηu & Mobley, Infect. Immun. (1990) 58 : 992 ; Dunn et al. J. Biol. Chem. (1990) 265 : 9464 ; Evans et al. Microbial Pathogenesis (1991 ) K) : 15 ; Labigne et al, J. Bact, ( 199) 173 : 1920) ; de la cytotoxine vacuolaire de 87 kDa (VacA) (Cover & Blaser. J. Biol. Chem. (1992) 267 : 10570 : Phadnis et al, Infect. Immun. (1994) 62 : 1557 ; WO 93/18150) ; d'un antigène immunodominant de 128 kDa associé à la cytotoxine (CagA, also called TagA) (WO 93/18150 ; USP 5 403 924) ; des heat shock protéines ΗspA et ΗspB de 13 et 58 kDa respectivement (Suerbaum et al, Mol. Microbiol. (1994) \4 : 959 ; WO 93/18150) ; d'une catalase de 54 kDa (Hazell et al, J. Gen. Microbiol. (1991) 137 : 57) ; d'une hémaglutinine fibrillaire (HpaA) de 20kDa ; d'une protéine de 15 kDa riche en histidine (Hpn) (Gilbert et al, Infect. Immun. (1995) 63 : 2682) ; d'une protéine de la membrane externe de 30 kDa (Bôlin et al, J. Clin. Microbiol. (1995) 33 : 381) ; d'une lipoprotéine de 20 kDa associée à la membrane (Kostrcynska et al, J. Bact. (1994) 176 : 5938) ainsi que d'une famille de porines HopA, HopB, HopC et HopD, de poids moléculaires compris entre 48 et 67 kDa (Exner et al, Infect. Immun. (1995) 63 : 1567).
Certaines de ces protéines ont déjà été proposées comme antigènes vaccinaux potentiels. En particulier, l'uréase est reconnue comme étant un antigène de premier choix pouvant être utilisé à cette fin (WO 94/9823 ; W095/3824 ; WO 95/22987 ; Michetti et al, Gastroenterology (1994) 107 : 1002). Il reste que la recherche de nouveaux antigènes doit être poursuivie, notamment dans la mesure où l'on prévoit que, pour obtenir un effet vaccinal optimisé, plusieurs antigènes devront être vraisemblablement incorporés dans un vaccin.
En résumé, il apparaît toujours nécessaire d'identifier des antigènes supplémentaires en vue de les incorporer dans un vaccin à forte efficacité.
C'est pourquoi l'invention a notamment pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS. apparaît de l'ordre de 76 kDa.
Par "forme substantiellement purifiée", on entend que la protéine est séparée de l'environnement dans lequel elle existe de manière naturelle. Entre autres, il peut s'agir d'une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et périplasmiques d'H. pylori.
La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kDa est susceptible d'être obtenue selon un procédé dans lequel :
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl β-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugalion : (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation ;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 ;
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl 0,1 - 0,5 M, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-
14 ;
(v) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,25 - 0,45 M, e.g. en NaCl 0,25 - 0,35 M ou de préférence, en NaCl 0.35 - 0,45 M, que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCl 0 - 1 M, avantageusement en tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCl 0,25 - 0,45 M, e.g. en NaCl 0,25 - 0,35 M ou en NaCl 0,35 - 0,45 M, est d'abord dialysée contre du tampon acétate pH 5 à 0.1 % de zwittergent 3- 14); et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCl 0.15 - 0.2 M. de préférence en NaCl 0,15 M.
Par souci de clarté, on précise qu'une expression telle que "une fraction éluée en NaCl 0,25 - 0,45 M" doit se comprendre comme suit : une fraction éluée à une concentration en NaCl comprise entre 0,25 et 0,45 M. La fraction éluée peut donc inclure le matériel élue entre 0,25 et 0,45 M ou bien le matériel élue entre deux concentrations comprises dans la gamme de 0,25 à 0,45 M. e.g. 0.35 - 0,45 M.
On précise de même que le gradient de NaCl appliqué à la colonne de S- Sépharose est de préférence un gradient par palier. Par exemple on met en oeuvre des paliers de NaCl 0,1 M. 0,15 M, 0,2 M et 1 M.
La protéine membranaire de 76 kDa a pour fonction biologique présumée d'être une porine. vraisemblablement située au niveau de la membrane externe. Exner et al, Infect. Immun. (Apr.1995) 63 : 1567 caractérise une famille de porines qui chacunes présentent en électrophorèse de SDS-Page, un profil de migration différent selon qu'elles ont été chauffées à 95°C (procédé conventionnel) ou non. Tel n'est pas le cas pour ce qui conceme la protéine de 76 kDa selon l'invention ; en effet sa migration sur gel n'est pas modifiée avec un échantillon chauffé à 60°C et non à 95°C.
La séquence N-terminale de la protéine de 76 kDa d'une souche d'H. pylori (ATCC 43579) est comme suit (code une lettre) : EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV. Cette information n'exclue pas le fait que des protéines équivalentes susceptibles d'être purifiées selon le procédé indiqué ci-avant puissent avoir une séquence N- terminale légèrement différente, dans la mesure où elles seraient dérivées d'une autre souche bactérienne. Une telle différence refléterait en effet le phénomène de variance allélique communément rencontré au sein d'une même espèce. Par exemple, une espèce bactérienne est usuellement représentée par un ensemble de souches qui diffèrent entre elles par des caractéristiques alléliques mineures. Un polypeptide qui remplit la même fonction biologique dans différentes souches peut avoir une séquence d'acides aminés qui n'est pas la même pour toutes les souches. Une telle variation allélique se retouve également au niveau de l'ADN.
Les différences alléliques au niveau de la séquence d'acides aminés peuvent être constituées par une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions d'acides aminés, qui n'altèrent pas la fonction biologique.
Par "fonction biologique" on entend la fonction de la protéine qui participe à la survie des cellules dans lesquelles la protéine existe de manière naturelle (même si la fonction n'est pas absoluement indispensable). Par exemple, la fonction d'une porine est de permettre à des composés présents dans le milieu extérieur d'entrer à l'intérieur de la cellule. La fonction biologique est distincte de la fonction antigénique. Une protéine peut avoir plus d'une fonction biologique.
L'invention a aussi pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée et susceptible d'avoir été purifiée selon le procédé décrit ci-avant à partir d'une bactérie du genre Helicobacter e.g., H. pylori. H. heilmanii, H. felis et H. mustelae.
L'invention a également pour objet tout autre protéine ou polypeptide. sous forme substantiellement purifiée, dans la mesure où il est analogue en terme d'antigénicité à une protéine à' Helicobacter susceptible d'être purifiée selon le procédé décrit ci-avant. Pour ce qui concerne les polypeptides, il s'agit notamment de polypeptides dérivés par fragmentation ou par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, e.g. par délétion, addition ou substitution, d'une protéine qui existe dans la nature et dont la forme purifiée peut être obtenue selon le procédé décrit ci-avant. De tels polypeptides peuvent être notamment obtenus par digestion enzymatique à l'aide de protéases telles que la pepsine ou la trypsine. Il n'est pas nécessaire que de tels polypeptides puissent être purifiés selon le procédé décrit ci-avant.
La présente description fait usage des termes "protéine" et "polypeptide" indépendamment de la taille des molécules (longueur de la chaîne d'acides aminés) et des éventuelles modifications post-traductionnelles. Dans la suite de la description le terme "polypeptide" est réservé pour désigner un produit dérivé d'une protéine par fragmentation ou mutation.
Une protéine ou un polypeptide selon l'invention doit être capable d'être reconnu par des anticorps monospecifiques établis à l'encontre d'une protéine d! Helicobacter susceptible d'être purifiée selon le procédé décrit ci-avant Cette antigénicité spécifique peut être révélée selon un certain nombre de méthodes ; par exemple par Western biot (Towbin et al, PNAS (1979) 76 : 4350). dot biot et ELISA.
En Western biot, le produit destiné à être testé, e.g. soit sous forme de préparation purifiée, soit sous forme d'extrait bactérien, est soumis à une électrophorèse en gel de SDS-Page (polyacrylamide 10%) tel que décrit par Laemmli U.K., Nature ( 1970) 227 : 680. Après transfert sur une membrane de nitrocellulose, cette dernière est incubée avec un sérum hyperimmun monospécifique dilué dans la gamme des dilutions de 1 : 50 à 1 : 5000, de préférence de 1 : 100 à 1 : 500. L'antigénicité spécifique est démontrée dès qu'une bande correspondant au produit testé présente une réactivité à une des dilutions comprises dans la gamme établie ci- dessus.
En ELISA, le produit destiné à être testé est de préférence utilisé pour recouvrir les puits. On préfère utiliser une préparation purifiée, bien qu'un extrait total puisse être aussi utilisé. En bref, 100 μl d'une préparation à 10 μg de protéine/ml sont distribués dans les puits d'une plaque de 96 puits. La plaque est incubée 2 hrs à 37°C puis une nuit à 4°C. La plaque est lavée avec du tampon PBS (phosphate buffer saline) contenant 0.05 % de Tween 20 (tampon PBS/Tween). Les puits sont saturés avec 250 μl de PBS contenant 1 % de sérum albumine bovine (BSA). On laisse incuber 1 hr à 37°C puis la plaque est lavée avec du tampon PBS/Tween. Un antisérum de lapin monospécifique est dilué en série dans du tampon PBS/Tween contenant 0,5 % de BSA. Cent μl d'une dilution sont ajoutés à chaque puit. La plaque est incubée 90 min à 37°C puis lavée. La plaque est révélée selon des méthodes standards. Par exemple, un conjugué peroxydase-immunoglobuline de chèvre anti- immunoglobulines de lapin est ajouté dans les puits. L'incubation est poursuivie 90 min à 37°C puis la plaque est lavée. On développe la réaction avec le substrat approprié. La réaction est mesurée par colorimétrie (absorbance mesurée par spectrophotométrie). Dans ces conditions, une réaction positive est observée lorsque une valeur de DO de 1 est associée à une dilution d'au moins 1 : 50, de préférence d'au moins 1 : 500. La longueur d'onde appropriée à laquelle on mesure la densité optique dépend du substrat.
En dot biot, on préfère utiliser une préparation purifiée du produit à tester, bien qu'un extrait total puisse être aussi utilisé. En bref, une préparation du produit à tester à 100 μg de protéine/ml est diluée en série deux fois dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Cent μl de chaque dilution sont appliqués sur une membrane de nitrocellulose 0.45 μm dans un appareil de dot biot à 96 puits (Biorad). Le tampon est éliminé par mise sous vide. Les puits sont lavés par ajout de Tris-HCl 50 mM pH 7,5 et la membrane est séchée à l'air. La membrane est saturée par du tampon bloquant (Tris- HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0.15 M. lait écrémé 10 g/1) puis incubée avec un antisérum monospécifique dilué dans ia gamme de 1 : 50 à 1 : 5000. de préférence de 1 : 50 à 1 : 500. La réaction est révélée selon des méthodes standards. Par exemple, un conjugué peroxydase-immunoglobuline de chèvre anti-immunoglobulines de lapin est ajouté dans les puits. L'incubation est poursuivie 90 min à 37°C puis la plaque est lavée. On développe la réaction avec le substrat approprié. La réaction est mesurée par colorimétrie ou chimioluminescence. Dans ces conditions, une réaction est positive lorsque l'on observe une coloration au niveau du dépôt sur la feuille de nitrocellulose directement pour révélation par colorimétrie ou sur film photographique pour révélation par chimioluminescence, associée à une dilution d'au moins 1 : 50, de préférence d'au moins 1 : 500.
Selon un mode particulier, une protéine selon l'invention peuvent être notamment obtenue par purification à partir d'Helicobacter ou exprimée par voie recombinante dans un système hétérologue (ce qui peut être aussi le cas pour un polypeptide selon l'invention). Dans ce dernier cas. la protéine peut présenter des modifications post-traductionnelles qui ne soient pas identiques à celles de la protéine correspondante issue de la souche d'origine.
L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention peut être évalué selon des méthodes standards ; par exemple en mesurant l'induction d'une réponse immunitaire mucosale ou l'induction d'une réponse immunitaire à effet thérapeutique ou protecteur en utilisant e.g. le modèle souris / H. felis et les procédures décrites dans Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Ηepatology, (1995) 7 : 303 ou Lee et al, J. Infect. Dis. (1995) 172 : 161, à condition de prendre la précaution suivante : Lorsque la protéine est originaire d'une espèce autre que H felis, la souche d'H. felis doit remplacée par une souche d'Helicobacler appartenant à l'espèce dont la protéine est originaire et adaptée à cet effet (les autres conditions expérimentales restant identiques). Par exemple, on teste la capacité d'un polypeptide dérivé par fragmentation d'une protéine d'H. pylori, à induire un effet protecteur ou thérapeutique, en substituant une souche d'H. pylori. Une telle souche est proposée par e.g. Kleanthous et al, Abstr. presented at the VlIIth International Workshop on Gastroduodenal Pathology 7-9th July 1995, Edinburgh, Scotland. Un effet protecteur est constaté dès lors qu'une infection dans le tissu gastrique est moindre par rapport à un groupe contrôle. L'infection est évaluée en testant l'activité uréase. la charge bactérienne ou l'infiltration leucocytaire. Par exemple, lorsque l'on constate après épreuve, une réduction de l'activité uréase dans le tissu gastrique, même si elle n'est pas complètement abolie on est en droit d'affirmer qu'il y a protection partielle.
Par conséquent l'invention concerne également (i) une composition de matière comprenant une protéine ou un polypeptide selon l'invention et un diluant ou un support ; en particulier (ii) une composition pharmaceutique notamment destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à Helicobacter, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'invention, en quantité efficace d'un point de vue prophylactique ou thérapeutique ; (iii) l'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique ; (iv) l'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à Helicobacter ; ainsi qu'(v) une méthode d'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre d'Helicobacler e.g., H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. musielae chez un mammifère, selon laquelle on administre audit mammifère une quantité efficace d'un point de vue immunologique d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention afin de développer une réponse immunitaire ; en particulier (vi) une méthode de prévention ou de traitement d'une infection à Helicobacterllc on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention.
Les méthodes et les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent traiter ou prévenir des infections à Helicobacter et par conséquent, les maladies gastro-intestinales associées à de telles infections. Il s'agit en particulier, des gastrites aiguëes chroniques et atrophiques ; des ulcères peptiques e.g. des ulcers gastriques et duodénaux ; des cancers gastriques ; des dypepsies chroniques ; des dyspepsies non- ulcéreuses réfractaires ; des métaplasies intestinales et certains lymphomes ( e.g. low grade MALT lymphoma).
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier au travers d'une surface mucosale (e.g. oculaire, nasale, orale, gastrique, intestinal, rectale, vaginale, ou du tractus urinaire) ou par voie parenterale (e.g. sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, ou intrapéritonéale). Le choix de la voie d'administration dépend d'un certain nombre paramètres tel que l'adjuvant associé à la protéine ou au polypeptide selon l'invention. Par exemple, si un adjuvant mucosal est utilisé, on préférera la voie nasale ou orale. Si on utilise une formulation lipidique, on choisira la voie parenterale. de préférence la voie sous-cutanée ou intramusculaire.
Une composition selon l'invention peut comprendre outre une protéine ou un polypeptide selon l'invention, au moins un autre antigène d'Helicobacler tel que l'apoenzyme de l'uréase, ou une sous-unité, fragment, homologue, mutant ou dérivé de cette uréase.
Pour usage dans une composition selon l'invention, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être formulé dans ou avec des liposomes, de préférence des liposomes neutres ou anioniques. des microspères. des ISCOMs ou des pseudo-particules virales (VLPs), afin de favoriser le ciblage de la protéine ou du polypeptide ou d'augmenter la réponse immunitaire. L'homme du métier dispose de ces composés sans difficulté ; par exemple voir Liposomes : A Practical Approach, RRC New ED. IRL press (1990). Des adjuvants autres que les liposomes peuvent être aussi utilisés. Un grand nombre sont connus de l'homme du métier. De tels adjuvants sont référencés ci-après
Pour administration parenterale, on cite notamment des composés d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium et l'hydroxyphosphate d'aluminium. L'antigène peut être adsorbé ou précipité sur un composé d'aluminium selon des méthodes standards. D'autres adjuvants tels que le RIBI d'ImmunoChem (Hamilton, MT) peuvent être utilisés pour administration parenterale.
Pour administration mucosale, on cite notamment les toxines bactériennes e.g. la toxine cholérique (CT), la toxine d'E. coli labile à la chaleur (LT) la toxine de Clostridium difficile et la toxine pertussis (PT) ainsi que les formes détoxifiées (sous- unité, toxoid ou mutant) de ces toxines. Par exemple, une préparation contenant la sous-unité B de la CT (CTB) et en quantité moindre de la CT peut être utilisée. Des fragments, des homologues et des dérivés des ces toxines sont de même appropriés dans la mesure où ils conservent une activité d'adjuvant. De préférence, on utilise un mutant ayant une toxicité réduite. De tels mutants sont décrits e.g. dans WO 95/1721 1 (Arg-7-Lys CT mutant), WO 95/34323 (Arg-9-Lys Glu-129-Gly PT mutant) et WO 96/6627 (Arg-192-Gly LT mutant). D'autres adjuvants tels que le lipopolysaccharide bactérien majeur (MPLA) de e.g. E. coli. Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium ou Shigella flexneri, peuvent être utilisés pour administration mucosale.
Des adjuvants utiles à la fois pour administration mucosale et parenterale, incluent notamment le polyphosphazène (WO 95/2415). le DC-chol (3 bétâ-fN- (N'.N'-dimethyl aminométhane)-carbamoyl] cholestérol) (USP 5 283 185 et WO 96/14831) et le QS-21 (WO 88/9336).
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité (adulte ou enfant) de l'antigène vaccinal lui-même du mode et de la fréquence d'administration, de la présence ou absence d'adjuvant et si présent, du type d'adjuvant et de l'effet désiré (e.g. protection ou traitement), comme cela peut être déterminé par l'homme de l'art. En général, un antigène selon l'invention peut être administré en quantité allant de 10 μg à 500 mg, de préférence de 1 mg à 200 mg. En particulier, on indique qu'une dose parenterale ne doit pas excéder 1 mg, de préférence 100 μg. Des doses plus fortes peuvent être prescrites pour e.g. usage oral. Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est par exemple, de l'ordre de 1 à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines.
Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe une protéine ou un polypeptide selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g. de l'eau ou une solution saline tel qu'un tampon de sel de phosphate (PBS), complémentée de manière optionnelle avec un sel de bicarbonate tel que du bicarbonate de sodium e.g. 0,1 à 0,5 M lorsque la composition est destinée à l'administration orale ou intragastrique. En général, le diluant ou le support est sélectionné sur la base du mode et de la voie d'administration et de pratiques pharmaceutiques standards. Des diluants et des supports acceptables d'un point de vue pharmaceutique ainsi que tout ce qui est nécessaire à leur usage dans des formulations pharmaceutiques sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un texte de référence standard dans ce domaine et dans le USP/NP.
De manière plus détaillée, on propose à titre d'exemple, d'administrer une protéine ou un polypeptide selon l'invention par voie orale. A cet effet, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être encapsulée seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 5_3 : 9). La protéine peut également être encapsulée dans des microsphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit ailleurs (Eldridge et al, Curr.
Top. Microbiol. Immuno. (1989) 146 : 59) la protéine peut également être incluse dans des liposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes : a practical approach. Ed. RRC New. D. Rickwood & B.D. Ηames,
1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1 ).
De manière alternative, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être administré par voie parenterale. Pour ce faire, une protéine ou un polypeptide selon l'invention est adsorbé sur gel d'alumine de façon tout à fait conventionnelle.
La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pΗ est voisin de 6.5 est mise en contact pendant 1 heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré à AL"1"*-1'. La composition finale de la préparation est la suivante : protéine 50 μg/ml, AL+++ 250 μg/ml, merthiolate 1/10 000, le tout en PBS. Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées chacune espacée de 4 semaines de la précédente.
Un polypeptide selon l'invention peut être aussi utile en tant que réactif de diagnostic, par exemple pour détecter la présence d'anticorps anti-Helicobacter dans un échantillon biologique e.g. un échantillon de sang. A cette fin, un tel polypeptide comprend de manière avantageuse 5 à 80 acides aminés, de préférence 10 à 50 acides aminés. Un réactif polypeptidique selon l'invention peut être marqué ou pas, selon la méthode de diagnostic mise en oeuvre. Des méthodes de diagnostic sont décrites plus avant dans le texte.
Selon un autre aspect, l'invention fournit un anticorps monospécifique capable de reconnaître une protéine ou un polypeptide selon l'invention.
Par "anticorps monospécifique" on entend un anticorps capable de réagir majoritairement avec une seule protéine d'Helicobacler. Un tel anticorps ne peut être obtenu qu'en utilisant pour immunogène, une protéine substantiellement purifiée. Un anticorps selon l'invention peut être polyclonal ou monoclonal ; les monoclonaux peuvent être chimériques (par exemple, constitués par une région variable d'origine murine associée à une région constante humaine) ou humanisée (seules les régions hypervariables sont d'origine animale, par exemple d'origine murine) et/ou par une chaîne simple. Les polyclonaux comme les monoclonaux peuvent aussi être sous forme de fragments d'immunoglobulines par exemple un fragment F(ab)'2 ou Fab. Un anticorps selon l'invention peut aussi être de n'importe quel isotype par exemple IgG ou IgA ; un polyclonal peut être d'un isotype unique ou un mélange de tous ou partie d'entre eux.
Dans la suite du texte, les termes "anticorps monospécifique" et "antisérum monospécifique" seront employés de manière indifférente.
Un anticorps qui est dirigé à l'encontre d'une protéine selon l'invention, peut être produit et par la suite identifié en utilisant un dosage immunologique standard par exemple analyse par Western biot, dot biot ou ELISA (voir par exemple Coligan et al. Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & sons Inc., New York,
NY) : Antibodies : A laboratory Manual, D. Lane, (1988) Harlow Ed.). Un anticorps selon l'invention peut être utile en diagnostic, ainsi qu'en chromatographie d'affinité pour purifier à grande échelle, une protéine ou un polypeptide selon l'invention ; un tel anticorps est aussi potentiellement utile en tant qu'agent thérapeutique dans une procédure d'immunisation passive.
En conséquence, l'invention fournit également (i) un réactif pour détecter la présence d'Helicobacler dans un échantillon biologique, qui comprend un anticorps ou un polypeptide selon l'invention ; et (ii) une méthode de diagnostic pour détecter la présence d'Helicobacler dans un échantillon biologique, selon laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un anticorps ou un polypeptide selon l'invention, afin que se forme un complexe immun : de façon optionnelle, on élimine le matériel non lié, et on détecte le complexe immun formé entre l'échantillon et l'anticorps ou le polypeptide selon l'invention, en tant qu'indicateur de la présence d'Helicobacler dans l'échantillon ou dans l'organe dans lequel l'échantillon a été prélevé.
Comme on peut aisément le comprendre, un anticorps selon l'invention permet de tester la présence d'Helicobacler dans un extrait gastrique.
Pour l'utilisation dans un test diagnostic, le réactif pour être présenté sous forme libre ou immobilisé sur support solide ; ce dernier peut être n'importe quel support utilisé couramment dans ce domaine par exemple, un tube, une bille ou un puits. L'immobilisation peut être obtenue par des moyens directs ou indirects. Les moyens directs comprennent l'adsorption passive (liaison non covalente) ou des liens covalents entre le support et le réactif. Par "moyen indirect" on signifie qu'un composé anti-réactif capable d'interagir un réactif, est tout d'abord attaché à un support solide. Par exemple, si on utilise un réactif polypeptidique. un anticorps capable de le lier peut être utilisé comme anti-réactif, à condition qu'il puisse se lier à un épitope du polypeptide qui n'est pas impliqué dans la reconnaissance des anticorps présents dans les échantillons biologiques. Les moyens indirects peuvent aussi être mis en oeuvre par l'intermédiaire d'un système ligand-récepteur, par exemple en greffant une molécule, telle qu'une vitamine, sur un réactif polypeptidique et en immobilisant alors sous forme solide le récepteur correspondant. Ceci est illustré e.g. par le système biotine-streptavidine. De manière alternative, on utilise des moyens indirects par exemple en ajoutant une queue peptidique au réactif e.g. par des moyens chimiques, et en immobilisant le produit greffé par adsorption passive ou par liaison covalente de la queue peptidique.
L'invention concerne également un procédé de purification d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention à partir d'un échantillon biologique, selon lequel on soumet l'échantillon biologique à une chromatographie d'affinité mettant en oeuvre un anticorps monospécifique selon l'invention.
A cette fin, l'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal, de préférence de type IgG. Des IgGs purifiées peuvent être préparées à partir d'un antisérum selon les méthodes couramment pratiquées (voir par exemple Coligan et al).
Les supports de chromatographie conventionnels de même que des méthodes standard de greffe des anticorps sont décrites par exemple dans : Antibodies : A Laboratory Manual, D. Lane, Harlow Ed. (1988),
En bref, un échantillon biologique, de préférence dans une solution tampon, est appliqué à un matériel de chromatographie, de préférence équilibré avec le tampon utilisé pour la dilution de l'échantillon biologique afin que la protéine ou le polypeptide selon l'invention (antigène) puisse être adsorbé sur le matériel. Le matériel de chromatographie, tel qu'un gel ou une résine associé à un anticorps selon l'invention, peut se présenter sous la forme d'un bain ou d'une colonne. Les composants qui restent non-liés sont éliminés par lavage et l'antigène est alors élue dans un tampon d'élution approprié, comme par exemple, un tampon de glycine ou un tampon contenant un agent chaotropique e.g. la guanidine HCl, ou une concentration riche en sel (par exemple, MgCU 3M). Les fractions éluées sont récupérées et la présence de l'antigène est alors mise en évidence par exemple en mesurant l'absorbance à 280 nm.
L'utilité thérapeutique ou prophylactique d'un anticorps selon l'invention peut mise en évidence selon le test de protection de Lee et al, proposé ci-avant pour les protéines ou polypeptides selon l'invention. Ainsi. l'invention a également pour objet (i) une composition de matière comprenant un anticorps monospécifique selon l'invention, et un diluant ou un support ; en particulier, (ii) une composition pharmaceutique comprenant un anticorps monospécifique selon l'invention en quantité efficace d'un point de vue thérapeutique ou prophylactique ; (iii) l'utilisation d'un anticorps monospécifique selon l'invention dans la préparation d'un médicament pour traiter ou prévenir une infection à Helicobacter ; ainsi que (iv) une méthode pour traiter ou prévenir une infection à Helicobacter (par exemple, H. pylori, H. felis, H. musielae ou H. heilmanii), selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'un anticorps selon l'invention, à un individu ayant besoin d'un tel traitement.
A cette fin, l'anticorps monospécifique peut être polyclonal ou monoclonal, de préférence d'isotype IgA (d'une manière prédominante). Dans le cadre d'une méthode d'immunisation passive, l'anticorps est administré par voie mucosale à un mammifère, par exemple au niveau de la muqueuse gastrique, soit par voie orale ou intragastrique, avantageusement en présence d'un tampon bicarbonate. Un anticorps monospécifique selon l'invention peut être administré en tant que seul composant actif ou en mélange comprenant au moins un anticorps monospécifique particulier à chaque polypeptide d'Helicobacler. La dose d'anticorps qui doit être utilisée dans cette méthode peut être aisément déterminée par l'homme du métier. Par exemple, on indique qu'une posologie peut être caractérisée par une administration journalière comprise entre 100 et 1 000 mg d'anticorps pendant une semaine ; ou une dose comprenant 100 à 1 000 mg d'anticorps administrée trois fois par jour pendant deux à trois jours.
Une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention peut être fabriquée selon les règles énoncées ci-avant pour une composition comprenant une protéine ou un polypeptide selon l'invention. De même, s'appliquent des indications médicales identiques.
L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes :
La Figure 1. colonne 4, présente l'analyse de la fraction membranaire Cg2d Par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. Les marqueurs de poids moléculaire apparaissent dans la colonne 1.
La Figure 2, colonne 4, présente l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. de la protéines de 76 kDa purifiée à partir d'un gel préparatif. Les marqueurs de poids moléculaire apparaissent dans les colonnes 1 et 8. La Figure 3 présente, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, le profil électrophorétique de la fraction D issue de la chromatographie sur colonne de Q-Sépharose de la fraction membranaire C§2d (colonne 3) et de la fraction D' issue de la chromatographie sur colonne de S- Sépharose de la fraction D (colonne 4). La colonne 1 correspond aux marqueurs de poids moléculaire et la colonne 2, à la fraction membranaire Cg2d-
EXEMPLE 1 : Préparation des fractions membranaires
IA - Culture
La souche H. pylori ATCC 43579 est cultivée en milieu liquide dans un fermenteur de 10 1.
Un congelât de germes en glycérol est utilisé pour ensemenser un flacon de 75 cm^ contenant du milieu dit "biphasique" (une phase solide en gélose Colombia contenant 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide en trypticase de soja contenant 20 % de sérum de veau foetal). Après 24 heures de culture dans des conditions microaérophiles, à 37°C. la phase liquide de cette culture est utilisée pour ensemenser plusieurs flacons de 75 cm^ en milieu biphasique en l'absence de sang de mouton. Après 24 heures de culture, la phase liqude permet d'ensemenser un biofermenteur de 2 1 en milieu liquide trypticase soja contenant de la bêta cyclodextrine à 10 g/1. Cette culture à DO 1.5-1.8 est inoculée dans un fermenteur de 10 1 en milieu liquide. Après 24 heures de culture, les bactéries sont récoltées par centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4°C. Une culture de 10 litres de H. pylori ATCC 43579 en fermenteur permet d'obtenir environ 20 à 30 g (poids humide) de bactéries.
IB - Extraction par le n octyl β-D giucopyranoside (OG)
Le culot de germes obtenu précédemment est lavé avec 500 ml de PBS (Phosphate buffer saline ; NaCl 7,650 g, phosphate disodique 0,724 g phosphate monopotassique 0,210 g pour un litre : pΗ 7.2) par litre de culture. Puis les germes sont à nouveau centrifugés dans les mêmes conditions. Le culot bactérien obtenu (Cj) est remis en suspension dans une solution d'OG (Sigma) à 1 % (30 ml/litre de culture). La suspension bactérienne est incubée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation magnétique, puis centrifugée à 17 600 x g pendant 30 minutes à 4°C.
Le surnageant (S2) obtenu est dialyse (MWCO=10 000 Da, Spectra/por) pendant une nuit à 4°C sous agitation magnétique contre 2 fois 1 litre de PBS dilué au 1/2. Le précipité formé au cours de la dialyse est récupéré par centrifugation à 2 600 x g pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant (S2d) est éliminé et le culot (C§2d) ^ contient des protéines de membrane, est conservé à -20°C.
La remise en suspension du culot est effectuée dans du tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 et Pefabloc lOOμM (tampon A).
IC - Analyse des fractions membranaires
La fraction membranaire C£2d est analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Les protéines sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie.
Le profil protéique de la fraction membranaire montre la présence de 4 bandes majeures à 76, 67. 50 et 30 kDa (Figure 1. colonne 4).
EXEMPLE 2 Purification de la protéine de 76 kDa par SDS-PAGE preparative
Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide selon la méthode de Laemmli (1970) avec un gel de concentration de 5% et un gel de séparation de 10%. La fraction membranaire est remise en suspension dans du tampon A, puis diluée au demi dans le tampon échantillon 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95°C. Environ 19 mg de protéines sont déposés sur un gel de dimension 16 x 12 cm et d'épaisseur 5 mm. Une prémigration est effectuée à 50 V pendant 2 heures, suivie d'une migration à 65 V pendant la nuit. La coloration du gel au bleu de Coomassie R250 (0,05% dans de l'eau ultrafiltrée) permet une bonne visualisation des bandes. La bande majeure à 76 kDa est découpée au scalpel et broyée à l'ultra-turrax en présence de 10 ou 20 ml de tampon d'extraction Tris-HCl 25 mM pH 8,8, urée 8 M, SDS 10%, phenyl methyl sulfonyl fluorique (PMSF) 100 μM et Pefabloc 100 μM (tampon C). Le broyât est filtré sur un préfiltre Millipore AP20 (φfiitre = 4.7 cm, φ p0re = 20 μm) à l'aide d'un extrudeur à une pression de 7 bars, à température ambiante ; puis lavé avec 5 à 10 ml de tampon C et filtré comme précédemment. Les deux filtrats obtenus à partir des deux broyats sont rassemblés.
Le filtrat est précipité avec 3 volumes d'un mélange 50 : 50 méthanol 75% et isopropanol 75%, puis ultracentrifugé à 240 000 x g pendant 16 heures à 10°C sur rotor 70 TFT (J8-55, Beckman).
Le culot est repris par 2 ml de tampon de solubilisation NaPÛ4 10 mM pH 7,0, NaCl 1 M, Sarkosyl 0,1%, PMSF 100 μM, Pefabloc 100 μM et urée 6 M (tampon D). L'échantillon solubilisé est dialyse successivement contre 100 ml de tampon D à 4 M d'urée et 0,1% de Sarkosyl, contre 100 ml de tampon D à 2 M d'urée et 0.5% de Sarkosyl et contre 2 fois 100 ml de tampon D sans urée et à 0,5% de Sarkosyl. La dialyse est effectuée pendant 1 heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le dialysat final est incubé pendant 30 minutes dans un bain de glace, puis centrifugé à faible vitesse pendant 10 minutes à 4°C (Biofuge A. Heraeus Sepatech). Le surnageant est récupéré, filtré sur filtre Millipore à 0.45 μm et conservé à -20°C.
Une analyse SDS-PAGE est réalisée (Figure 2. colonne 4). L'analyse du profil électrophorétique de la fraction montre que celle ci est pure avec une seule bande sur gel.
EXEMPLE 3 Purification de la protéine membranaire de 76 kDa à partir de la fraction membranaire C§2d
3A - Séparation des protéines de la fraction membranaire C§2d sυr 'a colonne Q-Sépharose
Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire Cg2d préalablement solubilisée ont été déposées sur une colonne Q-Sépharose préparée comme suit Une colonne de Q-Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel de 40 ml (φ=2,5 cm, h=8 cm). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 μM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie a été suivie par une détection UV à 280 nm à la sortie de la colonne.
Après que la colonne ait été lavée avec le tampon d'équilibrage (NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 μM et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'au retour à la ligne de base, un lavage avec NaCl 0,1 M en tampon d'équilibrage a été réalisé jusqu'au retour à la ligne de base (fraction A), suivi d'un gradient de NaCl de 0,1 à 0,5 M en tampon d'équilibrage (fractions B. C. D et E), puis d'un lavage avec NaCl IM en tampon d'équilibrage (fraction F). Les résultats sont représentés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000020_0001
Le bilan protéique nous montre que 55% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCl 0.1-0,5 M, 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCl 0,1 M et 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCl 1 M.
Les profils SDS-PAGE de chacune des fractions obtenues après passage de la fraction membranaire Cs2d sur 'a colonne Q-Sépharose, sont différents. De plus, certaines protéines sont enrichies par rapport à la fraction membranaire Cg2d de départ. On observe notamment un enrichissement de la protéine de 76 kDa sur le profil correspondant à la fraction D ou de préférence à la fraction E, dont la purification est poursuivie comme suit.
3B - Purification sur colonne S-Sépharose, de la protéine de 76 kDa à partir de la fraction D ou E obtenue sur colonne Q-Sépharose Une colonne de S-Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (φ=l,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/ml de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 μM et Zwittergent 3-14 à
0,1%.
La fraction D ou E dialysée préalablement contre le tampon d'équilibrage (acétate 50 mM pH 5.0, Pefabloc 100 μM et Zwittergent 3-14 0.1%) est déposée sur la colonne de S-Sépharose. La colonne est ensuite lavée avec le même tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Environ 3 volumes de colonne sont nécessaires pour le retour à la ligne de base. Les protéines sont éluées par un gradient de 0 à 0,5 M de NaCl en tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage avec le tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1 M de NaCl (4 fois VT). Les fractions collectées sont analysées, rassemblées et conservées comme précédemment.
La fraction D' ou E' sortant au cours du gradient de NaCl 0-0,5 M, entre 0.15 et 0,20 M NaCl, de préférence à la concentration de 0,15 M NaCl, est récupérée. Sur cette fraction, une analyse par SDS-PAGE et par Western biot est effectuée. Les résultats sont représentés à la Figure 3.
Ces résultats montrent qu'après deux colonnes échangeuses d'ions, la protéine de 76 kDa est enrichie ; mais elle demeure contaminée avec une protéine de 54 kDa et une protéine de 67 kDa (colonne 4). La protéine de 54 kDa ne réagit pas avec les anticorps anti-catalase. par conséquent elle ne correspond donc pas à la catalase, de même la protéine de 67 kDa ne réagissant pas avec l'anticorps anti-ureB en western biot, par conséquent elle ne correspond pas à la sous-unité B de l'uréase. L'analyse par Western biot en présence d'un antisérum anti-76 kDa montre que les faibles bandes observées en dessous de la bande à 76 kDa correspondent à une dégradation de la protéine de 76 kDa, puisqu'elles réagissent faiblement avec cet antisérum (colonne 7).
EXEMPLE 4 Préparation d'un sérum hyperimmun à l'encontre de la protéine membranaire de 76 kDa. Un sérum polyclonal spécifique de la protéine membranaire majeure d'H. pylori est obtenu par hyperimmunisation des lapins respectivement avec l'antigène purifié par SDS-PAGE preparative. La première injection JO (sous-cutanée multisites et intramusculaire) est effectuée avec une préparation contenant 50 μg de protéine membranaire émulsionnée en adjuvant complet de Freund, puis les rappels J21 et J42 se font par injection de 25 μg de protéine membranaire en adjuvant incomplet de Freund. Les animaux sont sacrifiés à J60. Les sérums obtenus sont décomplémentés pendant 30 minutes à 56°C et stérilisés par filtration sur membrane de porosité 0,22 μm (Millipore).
L'antisérum réagit avec la protéine de 76 kDa telle qu'isolée selon l'Exemple 3.
Un sérum monospécifique peut être obtenu de manière équivalente en utilisant une préparation purifiée selon le procédé décrit en 3.B à partir de la fraction E obtenue après chromatographie sur Q-Sépharose (3. A) et correspondant à la fraction éluée en NaCl 0.15 M sur S-Sépharose.
EXEMPLE 5 Purification de la protéine membranaire de 76 kDa par immunoaffinité
5.A - Purification des IgGs
Un sérum hyperimmun tel que préparé dans l'Exemple 4, est déposé sur une colonne Protéine A Sépharose 4 Flast Flow (Pharmacia) préalablement équilibrée en Tris-ΗCl 100 mM pΗ 8.0. La résine est lavée par 10 volumes de colonne de Tris-ΗCI 100 mM pΗ 8.0 puis par 10 volumes de colonne de Tris- ΗCl 10 mM pΗ 8.0. Les IgGs sont éluées en tampon glycine 0,1 M pΗ 3.0. Les IgGs sont collectées en tant que fractions de 5 ml auxquelles est ajouté 0.25 ml de Tris-ΗCl 1 M pΗ 8.0. La densité optique de l'éluat est mesurée à 280 nm et les fractions contenant les IgGs sont rassemblées et si nécessaire, congelées à -
70°C.
5.B - Préparation de la colonne
Une quantité appropriée de gel CNBr - activated Sépharose 4B (sachant que 1 g de gel sec donne environ 3,5 ml de gel hydraté et que la capacité du gel est 5 à 10 mg d'IgG par ml de gel) fabriqué par Pharmacia (ref : 17-0430-01 ) est mis en suspension dans du tampon NaCl 1 mM. Le gel est ensuite lavé à l'aide d'un buchner en ajoutant de petites quantités d'HCl 1 mM. Le volume total d'HCl 1 mM utilisé est de 200 ml par gramme de gel.
Les IgGs purifiées sont dialysées pendant 4 hrs à 20 + 5°C contre 50 vol. de tampon phosphate de sodium 500 mM pH 7.5. Elles sont ensuite diluées en tampon phosphate de sodium 500 mM pH 7.5 à une concentration finale de 3 mg/ml.
Les IgGs sont incubées avec le gel pendant une nuit à 5 + 3 °C sous agitation rotative. Le gel est mis dans une colonne de chromatographie et lavé avec 2 vol. de colonne de tampon phosphate 500 mM pH 7.5. Le gel est alors transferré dans un tube et incubé en éthanolamine 100 mM pH 7.5 à la température ambiante sous agitation. Il est ensuite lavé par 2 vol. de colonne de PBS. Le gel peut être conservé en PBS merthiolate 1/10 000. La quantité d'IgGs couplées au gel peut être déterminé en mesurant la différence de densité optique à 280 nm de la solution initiale d'IgGs et de l'éluat direct plus les lavages.
5.C - Adsorption et élution de l'antigène
Une préparation protéique d'antigène en Tris-HCl 50 mM pH 8.0 EDTA 2 mM, par exemple la fraction Cg2d obtenue en l .B est filtrée au travers d'une membrane de 0,45 μm puis est déposée sur la colonne équilibrée au préalable avec du Tris-HCl 50 mM pH 8.0 EDTA 2 mM. à un débit d'environ 10 ml/hr.
Ensuite, la colonne est lavée par 20 vol. de Tris-HCl 50 mM pH 8.0 EDTA 2 mM. de manière alternative, l'adsorption peut être mise en oeuvre en bain ; l'incubation est poursuivie à 5 + 3°C pendant la nuit et sous agitation.
Le gel est lavé par 2 à 6 vol. de tampon phosphate de sodium 10 mM, pH
6,8. L'antigène est élue avec du tampon glycine 100 mM pH 2,5. L'éluat est récolté dans des fractions de 3 ml auxquelles sont ajoutés 150 μl de tampon phosphate de sodium 1 M. pH 8.0. La densité optique de chaque fraction est mesurée à 280 nm; les fractions contenant l'antigène sont rassemblées ensemble et conservées à -70°C.
EXEMPLE 6 Test d'agglutination 6.A - Culture
A partir d'une souche d'H. pylori n° ATCC 43579 (disponible auprès de l'ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD - USA) conservée en glycérol à
- 70 °C, on ensemence un flacon de 25 cm2 contenant un milieu biphasique. Le milieu biphasique comprend une phase solide constituée de 10 ml de gélose Colombia (BioMérieux) additionnée de 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide constituée de 3 ml de bouillon Trypticase soja (Difco) contenant 20 % de sérum de veau foetal. Les flacons sont placés dans un sac étanche dit
"generbag" (BBL) et incubés sous agitation rotative douce à 37°C pendant 48 heures en condition de microaérophilie (8-10 % C02, 5-7 % 02 et 85-87 % N>) obtenu par le System Microaer (BBL).
Cette culture de 48 heures est utilisée pour ensemencer de nouveau des flacons contenant du milieu biphasique. L'absorbance initiale de cette culture à 600 nm doit être comprise entre 0,15 et 0,2. Les flacons sont incubés dans des conditions identiques à celles décrites précédemment.
Après 48 heures, la suspension bactérienne est transvasée dans un tube à essai. L'absorbance de cette culture est mesurée et elle doit se situer entre 3,0 et 3.5 à 600nm. L'aspect des germes est contrôlé sous microscope après une coloration au Gram.
6.B - Antisérums
Un antisérum tel qu'obtenu dans l'Exemple 4 est filtré sur une membrane 0,45 μm pour éliminer les petits agrégats s'il en existe avant utilisation.
6.C - Test d'agglutination
Sur une lame pour immunoprécipitation à fond noir (Prolabo réf. 10050), on dépose 20 μl d'eau physiologique dans le premier puit, 20 μl de sérum prélevé avant immunisation dans le puit central et 20 μl d'antisérum dans le troisième puits. Vingt μl de suspension bactérienne d'H. pylori sont ajoutés dans chacun des trois puits et on mélange ensuite les gouttes à l'aide d'une pipette Pasteur à bout rond fermé. On observe sous une loupe miroir, l'apparition d'une agglutination 5 minutes maximum après avoir réalisé le mélange. L'agglutination est complète lorsque le mélange se présente sous la forme d'une solution limpide comprenant de gros agrégats. Les témoins négatifs, soit avec de l'eau physiologique, soit avec le sérum de pré-immunisation, doivent rester troubles, révélant que la suspension bactérienne est intacte.
L'antisérum anti-76 kDa donne une réaction d'agglutination très forte. Dans les conditions testées, les bactéries d'H. pylori s'agglutinent rapidement et la réaction est complète après une minute. Les résultats indiquent que la protéine de 76 kDa est vraisemblablement exposée à la surface d'H. pylori.
EXEMPLE 7 Mise en évidence de l'effet protecteur de la protéine membranaire de 76 kDa
Des groupes d'une dizaine de souris Swiss Webster âgées de 6 à 8 semaines (Taconic Labs, Germantown, NY), sont immunisés par voie intragastrique avec 1, 5, 25. 50 ou 100 μg de l'antigène de 76 kDa purifié par chromatographie tel que décrit à l'Exemple 3, et dilué en PBS ou en PBS contenant 0.24 M de bicarbonate de sodium. L'antigène est supplémenté par 5 ou 10 μg de toxine cholérique (CT) (Calbiochem, San Diego) ou de heat-labile toxine (LT) (Berna Products. Coral Gables FL) . Les souris sont tout d'abord anesthésiées avec de l'isoflurane : puis la dose est administrée sous un volume d'environ 0,5 ml à l'aide d'une canule. Quatre doses sont administrées à chaque souris à 7-10 jours d'intervalle. Deux semaines après la dernière administration d'antigène, les souris sont éprouvées par une dose unique de la souche H. pylori ORV2002 (1 x IO7 de bactéries vivantes dans 200 μl de PBS ; DO550 de 0,5 environ) administrée par voie intragastrique. Un groupe n'ayant reçu aucune dose d'antigène et servant de contrôle est éprouvé de même. Deux semaines après l'épreuve, les souris sont sacrifiées. Le pourcentage de protection est déterminé soit en mesurant l'activité uréase ou en évaluant la charge bactérienne par histologie ainsi que cela est décrit dans Lee et al (supra) ou directement par culture quantitative d'H. pylori. Dans ces conditions, on est en mesure d'observer une réduction sensible de la charge infectieuse chez la plupart des souris immunisées avec 25 μg, par rapport au groupe contrôle ; ceci permet de conclure que l'antigène de 76 kDa d'H. pylori est partiellement protecteur (taux de protection d'environ 60-70 %). LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Pasteur Merieux serums et vaccins (B) RUE: 58 avenue Leclerc
(C) VILLE: Lyon
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69007
(G) TELEPHONE: 72 73 79 31 (H) TELECOPIE: 72 73 78 50
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Nouvelle protéine membranaire ρ76 d'Helicobacler pylori
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DE FRAGMENT: N-terminal (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
Glu Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ser Val Gly Tyr Gin Ile 1 5 10
Gly Glu Ala Ala Gin Met Val 15 20

Claims

Revendications
1. Une protéine d'Helicobacler pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76 kDa.
2. Une protéine selon la revendication 1, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kDa et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel :
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl β-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation ;
(ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pΗ 7,2, suivie d'une centrifugation ;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux ;
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl 0.1 - 0.5 M ;
(v) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,25 - 0.45 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCl 0 - 1 M ; et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,15 - 0.20 M.
3. Une protéine selon la revendication 2, dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kDa et qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel :
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl β-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation ; (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation ;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux ;
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl 0,1 - 0,5 M ;
(v) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,35 - 0,45 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCl 0, 1 - 1 M ; et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,15 M.
4. Une protéine selon la revendication 1, 2 ou 3, qui a pour fonction biologique d'être une porine.
5. Une protéine selon l'une des revendications 1 à 4, qui a pour séquence N- terminale la séquence d'acide aminés telle que montrée dans ID SEQ No. 1.
6. Une protéine d' Helicobacter sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel :
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl β-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation :
(ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation ;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux ;
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl 0,1 - 0.5 M ; (v) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,25 - 0,45 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCl 0 - 1 M ; et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCl 0,15 - 0,20 M.
7. Une protéine selon la revendication 6, qui est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel :
(i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl β-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation ;
(ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pΗ 7,2, suivie d'une centrifugation ;
(iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux ;
(iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCl 0,1 - 0,5 M ;
(v) on récupère la fraction éluée en NaCl 0.35 - 0.45 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCl 0,1 - 1 M ; et
(vi) on récupère la fraction éluée en NaCl 0, 15 M.
8. Un polypeptide dérivé par mutation ou fragmentation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 7, sous forme substantiellement purifié, qui est capable d'être reconnu par un anticorps monospécifique établi à l'encontre d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Un anticorps monospécifique capable de reconnaître une protéine ou un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8.
1 1. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori, qui comprend à titre de principe actif un anticorps monospécifique selon la revendication 10.
12. Une méthode de diagnostic permettant de détecter la présence d' Helicobacter dans un échantillon biologique, selon laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 10 ou un polypeptide selon la revendication 8, afin que se forme un complexe immun, on élimine de façon optionnelle, le matériel non lié, et on détecte le complexe immun formé entre l'échantillon et l'anticorps ou le polypeptide.
13. Un procédé de purification d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8, à partir d'un échantillon biologique, selon lequel on soumet l'échantillon biologique à une chromatographie d'affinité mettant en oeuvre un anticorps monospécifique selon la revendication 10.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998004702A2 (fr) * 1996-07-26 1998-02-05 Chiron Behring Gmbh & Co. Proteines, notamment proteines membranaires, d'helicobacter pylori, leur preparation et utilisation
WO1998043479A1 (fr) * 1997-04-01 1998-10-08 Merieux Oravax POLYPEPTIDES D'HELICOBACTER DE 76 kDa, 32 kDa ET 50 kDa ET MOLECULES DE POLYNUCLEOTIDES CORRESPONDANTES
WO2000000614A2 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 American Cyanamid Company NOUVEAUX ANTIGENES D'$i(HELIOBACTER PYLORI)
US6709656B1 (en) * 1996-06-10 2004-03-23 Thomas Boren Helicobacter pylori adhesin binding group antigen

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3869556B2 (ja) * 1998-06-15 2007-01-17 勇 近藤 ヘリコバクター・ピロリ由来抗原及びそれを用いたヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法
JP5250812B2 (ja) * 2006-04-27 2013-07-31 国立大学法人富山大学 ヘリコバクター・ピロリ菌由来の新規抗原、抗原組成物およびピロリ菌抗体の検出方法。

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2669929A1 (fr) * 1990-12-04 1992-06-05 Quidel Corp Composition d'antigenes, procede de detection de helicobacter pylori a l'aide de cette composition et necessaire la contenant.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2669929A1 (fr) * 1990-12-04 1992-06-05 Quidel Corp Composition d'antigenes, procede de detection de helicobacter pylori a l'aide de cette composition et necessaire la contenant.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M.M. EXNER ET AL.: "ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A FAMILY OF PORIN PROTEINS FROM HELICOBACTER PYLORI.", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 63, no. 4, April 1995 (1995-04-01), WASHINGTON US, pages 1567 - 1572, XP002003585 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6709656B1 (en) * 1996-06-10 2004-03-23 Thomas Boren Helicobacter pylori adhesin binding group antigen
US7271251B2 (en) 1996-06-10 2007-09-18 Thomas Boren Helicobacter pylori adhesin binding group antigen
WO1998004702A2 (fr) * 1996-07-26 1998-02-05 Chiron Behring Gmbh & Co. Proteines, notamment proteines membranaires, d'helicobacter pylori, leur preparation et utilisation
WO1998004702A3 (fr) * 1996-07-26 1998-04-23 Chiron Behring Gmbh & Co Proteines, notamment proteines membranaires, d'helicobacter pylori, leur preparation et utilisation
WO1998043479A1 (fr) * 1997-04-01 1998-10-08 Merieux Oravax POLYPEPTIDES D'HELICOBACTER DE 76 kDa, 32 kDa ET 50 kDa ET MOLECULES DE POLYNUCLEOTIDES CORRESPONDANTES
WO2000000614A2 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 American Cyanamid Company NOUVEAUX ANTIGENES D'$i(HELIOBACTER PYLORI)
WO2000000614A3 (fr) * 1998-06-26 2000-05-04 American Cyanamid Co NOUVEAUX ANTIGENES D'$i(HELIOBACTER PYLORI)

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