WO1997010498A1

WO1997010498A1 - Procede et appareil de detection d'electrochemiluminescence

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Publication number: WO1997010498A1
Application number: PCT/JP1996/002612
Authority: WO
Inventors: Yuzaburo Namba; Michinori Usami
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 1995-09-12
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 1997-03-20
Also published as: JP3574457B2; NO972150D0; EP0791821A1; NO972150L; EP0791821A4; CA2205050A1

Description

明細書電気化学発光検出方法と装置 [技術分野]

この発明は、電気化学発光に際して行われる電極反応を制御する方法と装置に関する。

[背景技術]

電気化学発光（electrochemiluminescence： E C L ) とは、金属キレ一卜などの電気化学発光物質が電極反応によって励起されて発光する現象をいう。例えば特表平 2 - 5 0 1 7 4 9号、特表昭 6 2 - 5 0 0 6 6 3号、特表昭 6 4— 5 0 0 1 4 6号、特表平 4— 5 0 2 2 0 8号、特表平 4— 5 0 2 2 0 9号、特公平 7 - 6 9 1 3号、および特公平 7 - 3 7 4 6 4号において、電気化学発光物質を含んだ電解質からなる測定液、もしくはそれに更に電気化学発光補助物質を含んだ電解質からなる測定液をセル内に導入して、該セル内において電極反応させ、その電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法が公知である。

また、電気化学発光を利用して抗原や抗体などの微量物質を検出、定量する方法に関して、例えば次の文献 1〜3が知られている。

「文献 1 "電気化学発光（E C L ) 法によ ^ 度免疫学的測定法の検討" 、 "電化学発光（ E C L) 法による A F P測定の検討'；「臨床病挫」，第 3 9巻，補冊， 1 9 9 1年

：文献 2 _| "Electrogenerated Chemiluminescence: An Oxidatr e-Redu ct ion lype ECL Reaction Sequence Using Tri propyl Amine" 、 Γ J. El ectrochem. Soc.」， Page 3127-3131， Vol.137, No.10, October 1990 厂文献 3 J " Elect rochemi luminescence Detection for Development o f Immunoassays and DNA Probe Assays for Clinical Diagnostics" 、 rCLI ICALCHEMISTRYJ , Page 1534-1539, Vol.37, No.9, 1991

ここで、電気化学発光を利用して抗原や抗体などの微量物質を検出し、定量する方法を具体的に説明すると、次のようになっている。先ず、図 1 3はウィルス抗原、癌抗原、異常代謝物などの抗原 1を検出する方法であり、' この場合は抗原 1に対する抗体結合磁気ビーズ 2 と標識抗体 3 を用いる。抗体結合磁気ビーズ 2は、フェライトを含有せしめたラテツクスなどからなる磁気ビーズ 5にモノク口一ナル抗体などからなる抗体 6を固相化させた構成である。標識抗体 3は、次式（ 1 ) または（ 2 ) で示される Ru (bpy)

次式（ 3 ) で示される Re錯体（ここで、 ( 3 ) 式中、 nは整数であって好ましくは 2または 3、 mは 1、 2または 3であって好ましくは 1、 Wは C H〇、 C〇 OH、 11₂または8 、 Rは陰イオンである）、次式（ 4 ) で示されるオスミウム（Os) 錯体などの電気化学発光物質 7にモノクローナル抗体などからなる抗体 8を固相化させた構成である。

そて、これら抗体^合磁気ビーズ 2 と標識抗体 3を抗原 1 に結合させることにより、抗原 1を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドィッチ形成させた状態）にして、検出及び定量が行われる, 一方、抗体 1 0を検出する方法の場合は、図 1 4に示すように、抗原結合磁気ビーズ 1 1 と標識抗体 1 2を用いる。抗原結合磁気ビーズ 1 1 は磁気ビーズ 1 3 と抗原 1 4 との結合体で構成される。標識抗体 1 2は電気化学発光物質 1 5に抗体 1 6を固相化させた構成である。そして、これら抗原結合磁気ビーズ 1 1 と標識抗体 1 2を抗体 1 0に結合させることにより、抗体 1 0を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドイッチ形成させた状態）にして、検出及び定量が行われる。図 1 5は、抗体結合磁気ビーズ 2 と標識抗体 3を用いて抗原 1をサンドィッチ形成させ、電極反応によって生じた電気化学発光を検出する方法を、時経列的に示したものである。即ち、該検出方法は

( 1 ) 容器に反応溶液 2 1を供袷する工程

( 2 ) 抗原 1を含む検査検体 2 2を供給する工程

( 3 ) 抗原 1 に対する抗体結合磁気ビーズ 2を供給する工程

( 4 ) 所定温度（例えば 3 7 V ) で所要時間（例えば 5〜 1 0分間程度）攪拌して抗原 1 と抗体結合磁気ビーズ 2を十分に反応させることにより抗原 1を磁石によって捕集できるようにした後、磁石 2 3を容器の周囲に配置させて抗原 1を容器内に保持する。そして、この状態で液部分を排除し、バッファを供給して洗浄することにより、容器内の未反応の検査検体 2 2 と抗体結合磁気ビーズ 2をバッファと共に除去する工程

( 5 ) 抗原 1 に対する標識抗体 3を供給する工程

( 6 ) 再び攪拌して抗原 1 と標識抗体 3を反応させることにより抗原 1 を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドイッチ形成させた状態）にした後、磁石 2 5を容器の周囲に配置させて抗原 1を容器内に保持する。一して、この状態で洗浄することにより、容内の未反応の^識体 3をバッファと共に除去すろ工程

( 7 ) リン酸ニ水素力リウム（K H ₂ P (J ₄ ) などの電解液に T P A ( Tr ipropy lam i ne ) などの電気化学 ¾光補助物質を含ませてなる電気化学発光（ E C L ) 電解液を供給して測定液を作る工程 ( 8 ) 測定液に電流を通じて電極反応を生じさせ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質 1 5からの発光を検出する工程を含んでいる。

ここで、上記工程（ 8 ) において行われる電気化学発光の発生原理を図 1 6について説明すると、次のようになっている。即ち、抗原 1に結合した標識抗体 3に保持されている電気化学発光物質 7である例えば R u (bpy) は、陽電極 3 0上で酸化されて Ru (bpy) -となる。また、電気化学発光補助物質 3 1 として電解液中に含まれている例えば T P A は、陽電極 3 0上で酸化されて陽イオンラジカル T P A となり、更にプロトン '：一 H—) を失って、還元状態のラジカル T P A *となる。そして、このラジカル T P A *から電子が与えられることにより、前記 Ru

(bpy) ₃ ³'は、 2価の励起状態である Ru (bpy) になって、概略 6 2 0 n mの波長のホトン（光子） 3 2を放出し、再び基底状態の Ru (b py) 3 に戻ることとなる。そして、ホ卜ン 3 2の放出と共に T P Aは消費されるカ^ T P Aは Ru (bpy) 'に比べて過剰に存在するので速やかに補給され、基底状態の Ru (bpy) ₃ ^{2 +}は、図 1 6に示すような反応循環を行い、こうして電気化学発光物質 7である Ru (bpy) ₃ ²Ίま、繰り返し励起されてホトン 3 2を次々に放出するのである。

従って、陽電極 3 0上で励起された Ru (bpy) ₃ ² から放出されたホ卜ン 3 2を光電子増倍管などの光検出器を用いて検出することによって、その光量から測定液中に含まれる抗原 1を検出し、定量することができる。かかる電気化学発光を利用した検出方法は、化学発光法（ C L法）等による測定方法に比べて測定液の調製が容易であるだけでなく、より高度な検出が可能な方法であり、微量物質の検出法として臨床医学面などの分野において大きな期待を寄せている。 -. 以上のような電気化学発光を利用して検出を行うための装置は、国際公開番号 U S 9 0 / 0 1 3 7 0において明らかにされている。図 1 7に、従来の一般的な電気化学発光検出装置 4 0の構成の概略を示す。該装置

4 0において、本体 4 1の内部にセル 4 2が設けられる。このセノレ 4 2 に送液管 4 3 と排液管 4 5が接続され、図示しない送液手段によって測定液がセル 4 2内に導入される。セル 4 2内に導入される測定液は、上記工程（ 7 ) において作られた測定液、即ち、抗体結合磁気ビーズ 2 と標識抗体 3を用いてサンドイツチ形成させられた抗原 1 を含む電解質からなる測定液である。

セル 4 2の底面 4 4に電気化学発光を発生させる際に陽電極となる作用電極 4 6が設けられ、セル 4 2の上面 4 8に電気化学発光を発生させる際に負電極となる対抗電極 4 7が設けられる。これら作用電極 4 6 と対抗電極 4 7の間に所定の電位差の電圧を印加することによってセル 4 2内において電極反応が行われる。そして、この電極反応において、陽電極となった作用電極 4 6の面上で電気化学発光が発生する。

セル 4 2の上面 4 8は、例えばァクリルゃガラスなどの光を透過させる部材で構成される。そして、この上面 4 8の上方には、測定液が電極反応することによって作用電極 4 6の面上に生ずる電気化学発光を検出して電気信号に変換する光検出器としての光電子倍増管（ P M T ) 5 0 が近接して配置される。

排液管 4 5の途中には、作用電極 4 6 と測定液との電位差を検出するための第三の電極である参照電極 5 1が設けられる。ここで、参照電極 5 1 として ¾も一般的に用いられている ^一塩化銀電極についてそ造を説明すると、参照電極〔； 1の内部には塩化銀電極 5 2があ、一の化銀電極 5 2 と排液管 4 5 中の定液が、 ¾絡部多孔質隔壁） 5 3、塩 ½ ( K C 1溶液） 5 5、液絡部（細 5 C、及び電解液（K C 1溶液）

5 7を介して連絡している。以上のように構成された電気化学発光検出装置 4 0において、セル 4 2に送液管 4 3を介して測定液が導入された状態で、セル 4 2の底面 4 4に設けられた作用電極 4 6 と対抗電極 4 7の間に所定の電位差の電圧が印加され、セル 4 2内において電極反応が行われる。そして、この電極反応により、陽電極である作用電極 4 6の面上で電気化学発光が発生する。こうして発生した光はセル 4 2の上面 4 8を通過し、光電子倍増管 5 0で検出されて電気信号に変換され、処理される。かくして、電気化学発光によって発生する光の量が測定液中の抗原 1 の量に比例することから、測定液を電極反応させて光らせてその光を検出すれば、測定液に含まれた抗原 1を検出、定量することが可能となる。

[技術的課題]

ところで、以上のような電気化学発光を利用した定量を実施するにあたっては、電気化学発光の発生条件を所定のものとして、各測定毎に得られた検出値同士を比較できるようにしなければならない。そのためには測定液中で行われる電極反応を制御し、作用電極 4 6 と対抗電極 4 7 の間で再現性ある電解が行われるようにしなければならない。

以上のような電極反応は目的とする反応が行われる電極と溶液との界面で行われる。そこで、先に挙げた特表平 2 - 5 0 1 7 4 9号ゃ特公平 7 - 6 9 1 3号等の先行技術においては、これら電極と溶液との界面の電位を制御するために、図 1 8に示すように、参照電極 5 1 を用いて測定液と作用電極 4 6 との電位差を検出し、制御しており、それによつて一応の成果を達成している。.

ところが、この参照電極を用いて電位差を制御する方法は、従来の一般的な電気化学的分析とは大きく手法を異にしている。即ち、従来の一般的な電気化学分析法では、電極反応によって変化する化学種の質や量を、電極電位や電極に流れる電流、もしくはそれらの時間的変化などに基づいて分析している。（なお、 K. Y a m a s i t a、他らによる J . A n a l C h e m V o l 6 3、 N o. 9、 8 7 2 — 8 7 6、 1 9 9 1には、分析物を電気化学的作用により直接変化させて発光を見ようとする E C Lが開示されている。また、 E g a s h i r a N. 他らによる A n a l S c i . V o l 6 N o. 6、 9 0 3 - 9 0 4、 1 9 9 0には、ラベルしないフリーの R u錯体を用いて電解液中のペルォキソ硫酸塩や蓚酸を定量するための E C Lが開示されている。）しかし、特表平 2 - 5 0 1 7 4 9号ゃ特公平 7— 6 9 1 3号等の E C Lでは、微量の分析物を検出するために、 R u標識した分析物に対して著しく大量の電気化学発光補助物質（T P A) を用いる。この T P Aの濃度は、例えば 1 0— 程度である。これに対して、その存在量を検知しょうとするラベルされた R u化合物の存在濃度範囲は高々 1 0— ⁸〜 1 0— ¹²Mにすぎない。従って、電極反応の殆どは T P Aの酸化に費やされ、 R u化合物を二価から三価へ酸化させる電極反応は、（その反応自体は重要ではあるものの）電極反応の中心ではない。このように、分析対象物である R u化合物を電解する電気量は、その量の 1千万倍以上の圧倒的量の T P Aを酸化させる電気量に隠れてしまうことになる。先に挙げた特表平 2 - 5 0 1 7 4 9号ゃ特公平 7— 6 9 1 3号等の先行技術においては、再現性を得るためには、電解液中に多量に含まれている T P Aを、測定の都度均一に、しかも効率良く酸化させるといった、従来の電気化学分析的方法では行なわれていない制を行うゼ、要があるが電を制御する方;去 'は、電流量はその時の電極セ ^ 状態に左もされるため、厳密な再現性を得難い。また、多量の電気量を必要とする E C Lでは流れる電流量も多く、溶液の持つ抵抗成分によって電王ドロップか起き溶液内で電位勾配が発生する。そして、電流が流れていいか、あるいは流れていても電位勾配の発生が無視できるような場合は別として、電位差を制御する方法では、対抗電極 4 7や作用電極 4 6の配置や、電極の構造の違い、運転状態や電極の局部状態による電位分布の変化に起因して、再現性を得るためには電極の運転サイクル全体にわたる電位の設定に高度な調整と熟練が必要となってしまう。

また、先に挙げた特表平 2 - 5 0 1 7 4 9号ゃ特公平 7 - 6 9 1 3号等のような電位を制御する方法は、参照電極 5 1、特に参照電極 5 1 内の電解液 5 7の損耗といった解決課題も有している。即ち、図 1 7において説明したように、参照電極 5 1内の電解質 5 7 とセル 4 2内の測定液とは塩橋 5 5を介して繋がっており、このため、参照電極 5 1 内の電解液 5 7が少しづつではあるが漏失してしまう。この問題を防ぐために、塩橋 5 5に寒天を加えるなどといった改良策もあるが、漏失を完全には防ぐことはできない。

その他、参照電極 5 1は電位を検出するものであって、参照電極 5 1 には電流が流れないとされているものの、様々な要因により塩化銀電極 5 2に微弱電流が流れることを完全には防止できない。従って、長い間検出を行っていると塩化銀電極 5 2表面の塩化銀皮膜が消失し、基準電位を検出できなくなる。このため、安定した検出を長期間に渡って保証するためには、電解液 5 5の補充、消失した塩化銀の塩化銀電極 5 2表面への再付着、または参照電極 5 1 自体の交換といったメンテナンスが必要になるといった課題もある。

本発明の目的は、従来必須とされていた参照電極を用いずに、再現 t生の高い電気化学発光検出方法と装置を提供することにある。

[発明の開示]

かかる課題を解決するために、本発明においては、電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液をセル内に導入して電極反応させ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法において、測定液に供給する電流の電流値を制御することを特徴とする電気化学発光検出方法が提供される。

また、この方法を実施するための好適な手段として、電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液が導入されるセル内に電極が設けられ、該セル内における電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出するための光検出器を備えるものであって、測定液に供給する電流の電流値を制御するための制御手段を備えていることを特徴とする電気化学発光検出装置が提供される。

なお、電気化学発光物質は、次式（ 1 ) または（ 2 ) で示される Ru (bpy) 3 ²—、次式（ 3 ) で示される Re錯体（ここで、（ 3 ) 式中、 nは整数であって好ましくは 2または 3、 mは 1、 2または 3であって好ましくは 1、 Wは C H O、 C〇〇H、 NH₂または Br、 Rは陰イオンである）、次式（ 4 ) で示されるオスミウム（Os) 錯体などが適に用いられる。

- 1

3

また、電気化学発光補助物質は、 TP A (Tripropylamine) や T E A (Triethyl amine) など- 好' s ^いられる。

また、光検出器は、光電子倍増 ·ゃホトダイオードなとが好適にいられる。

以上のような本発明によれば、電気化学発' を発生させる際の電極反応を制御するために従来必須とされていた参照電極を取り去ることができ、また、ブランク発光を低減した分析が可能となる。

[図面の簡単な説明]

図 1 は、本発明にかかる電気化学発光検出装置の説明図である。図 2 は、本体の分解図である。図 3は、本体を構成する底面の断面図である ₍ 図 4は、本体を構成する上面の断面図である。図 5は、電流値を制御する場合の測定回路図である。図 6は、実験例 1 において電位差を制御した場合の発光強度の経時的変化を示すグラフ図である。図 7は、図 6の低レベル域における電解液のブランク発光の状態を拡大して示したグラフ図である。図 8は、実験例 1 において電流値を制御した場合の発光強度の経時的変化を示すグラフ図である。図 9は、図 8の低レベル域における電解液のブランク発光の状態を拡大して示したグラフ図である。図 1 0は、実験例 1 において電流値を制御した場合の時間に対する電流値の変化の一例を示すグラフ図である。図 1 1は、実験例 1 において電位差を制御した場合の時間に対する電位差の変化の一例を示すグラフ図である。図 1 2は、実験例 1 において電位差を制御した場合における制御電圧と、測定された電流値の関係を示すグラフ図である。図 1 3は、電気化学発光を利用して抗原を検出する方法の基本原理の説明図である。図 1 4は、電気化学発光を利用して抗体を検出する方法の基本原理の説明図である。図 1 5は、電気化学発光を利用した検出方法の工程説明図である。図 1 6は、電気化学発光の発生原理の説明図である。図 1 7は- 従来の一般的な電気化学発光検出装 E 構成の概略図である。図 1 8は、参照電極を利用した測定回路図である。

[発明を実施するための最良の形態]

図 1 は、本発明の方法を実施するために好適に利用される電気化学発光検出装置 6 0を例示している。該装置 6 0において、本体 6 1 の内部にセル 6 2が設けられる。なお、この本体 6 1 の分解図を図 2に示す。本体 6 1は、中央に平面視で木の葉形状をした空間部（セル） 6 2を有するスぺ一サ 6 5.と、このスぺーサ 6 5の上面に密着してセル 6 2の上方を塞ぐ上面 6 6 と、スぺーサ 6 5の下面に密着してセル 6 2の下方を塞ぐ底面 6 7 とを供える。底面 6 7には、セル 6 2 内に測定液を流通させる接続口 6 9 a、 6 9 bが形成されている。そして、これらスぺ一サ 6 5、上面 6 6、及び底面 6 7 とを重ねることによりセル 6 2が構成される。

セル 6 2には、底面 6 7に形成された接続口 6 9 a、 6 9 bを介して送液管 6 8 と排液管 1 0が接続され、排液管 7 0にはポンプ 7 1が装着される。ポンプ 7 1 は例えばチューブポンプで構成され、このポンプ 7 1 の稼働によって測定液が送液管 6 8からセル 6 2内に導入され、また、セル 6 2内の測定液が排液管 Ί 0から排出される。セル 6 2内に導入される測定液は、先に図 1 5で説明した工程（ 7 ) において作られた測定液、即ち、抗体結合磁気ビーズ 2 と標識抗体 3を用いてサンドィツチ形成させられた抗原 1を含む電解質からなる測定液である。

セル 6 2の底面 6 7には陽電極である円板形状の作用電極 7 2が設けられる。図 3に示すように、底面 6 7の上面中央に形成された凹部 7 2 a に作用電極 7 2を上から嵌入して、作用電極 7 2を固定している。作用電極 7 2は、金、白金、ニッケル等の金属、炭素などの導電材料からなる。また、この作用電極 7 9の下方にお面 6 7の下面に形成された部了 r bには、図 1 に示すように、アーム 7 3の先端に取り付けられた^石 7 5が嵌入自在である。アーム 7 3は軸 7 6を中心に回動し、アーム 7 3が上昇すると磁石 7 5が作用電極 7 2下方の凹部 7 2 t に嵌入した状態となり、アーム 7 3が下降すると磁石 7 5が作用電極 7 2下方の凹部 7 2 bから退避した状態となる。

セル 6 2の上面 6 6 には、作用電極 7 2の上方において左右両側に位置する一対の対抗電極 7 7が設けられる。図 4に示すように、対抗電極 7 7は、上面 6 6·の下面に形成された凹部 7 9にそれぞれ嵌入固定される。この対抗電極 7 7 も、作用電極 7 2 と同様に導電材料からなる。この対抗電極 7 7 と上記作用電極 7 2の間に給電装置 7 8によって電圧が印加され、セル 6 2内の測定液に所定の電流値の電流が流れることにより、電極反応が行われる。そして、この電極反応が行われる際に陽電極となる作用電極 7 2の面上で電気化学発光が発生する。セル 6 2内の測定液中を流れる電流の電流値は、抵抗 Rを流れる際に測定され、給電装置 7 8に入力される。また、給電装置 7 8には、セル 6 2内の測定液中に流す電流の電流値を制御するための制御信号が入力される。

セル 6 2の上面 6 6中央は、例えばァクリルゃガラスなどの光を透過させる部材で構成され、作用電極 7 2の面上で発生した電気化学発光は、左右一対の対抗電極 7 7の間からセル 6 2の上面 6 6 中央を介して上方に透過される。そして、この上面 6 6の中央上方には、測定液が電極反応することによって作用電極 7 2の面上に生ずる電気化学発光を、対抗電極 7 7からセル 6 2の上面 6 6中央を介して検出し、電気信号に変換する、光検出器としての光電子倍増管（ P M T ) 8 0が近接して配置される。なお、セル 6 2を構成する他の部材であるスぺーサ 6 5及び底面 6 7などは、上面 6 6 中央と同様にァクリルゃガラスなどで構成しても良いが、スぺ一サ 6 5及び底面 6 7は光透過性は要求されないので、テフロンなどの汚れ難い材料で構成しても良い。

また、図示はしないが、本体 6 1全体は暗箱などの遮蔽手段によって覆われており、セル 6 2内の電気化学発光て発生した光以外の光は、光電子倍増管 8 0には一切入らないように構成してある。さて、以上の如く構成された検出装置 6 0においては、先ず測定に先立って、セル 6 2内にクリーニング液（アルカリ液）が導入される。このクリ一ニング液の導入は、クリ一ニング液が入つた図示しない容器等に送液管 6 8の先端を投入した状態でポンプ 7 1を稼働することにより行われる。これにより、セル 6 2の内面が洗浄されると共に、セル 6 2 の底面 6 7に設けられた作用電極 Ί 2の表面と、セル 6 2の上面 6 6に設けられた対抗電極 7 7の表面が洗浄され、後の電極反応が良好に行われるようになる。

洗浄終了後、先ずセル 6 2内のクリーニング液が電解液と入れ替えられて、アーム 7 3が上昇し、磁石 7 5が作用電極 7 2の下方に嵌入した状態となる。そして、ポンプ 7 1が稼働してセル 6 2内へ一定量の測定液が電解液と共に導入される。

ポンプ 7 1 の稼働によって測定液は電解液と共に送液管 6 8からセル 6 2内に導入され、更に排液管 7 0から排出される。こうして、抗原 1 を含んでいる測定液が電解液と共にセル 6 2内を連続的に流動されると- 抗体結合磁気ビーズ 2が磁石 7 5の磁力で吸着されることにより、測定液中に含まれている抗原 1は作用電極 Ί 2の表面に捕集される。こうして、所定量の測定液がセル 6 2内を通過したら、ポンプ 7 1 の稼働を停止させ、電解液の導入を終了させる。次いで、アーム 7 3が下降して磁石 7 5が作用電極 7 2の下方から退避した状態となる。

こうして、セル 6 2内は測定液である電解質によって満たされ、かつ、定量の測定液中に含まれていた抗原 Iか作用電極 Ί 2の衷 Ϊに捕集さた状態となる。

この状態において、給電装置 7 8によって作用電極 7 2 と対抗電極 7 7 との間に電が印加され、セル 6 2内の測定液に、制御信号に基づく所定の電流値の ¾流が流されて電極反応が開始する。また、セル 6 2内の測定液中を流れる電流の電流値は、抵抗 Rを流れる際に測定され、給電装置 7 8に入力される。

ここで、セル 6 2内の測定液中を流れる電流の電流値の制御は図 5に示すようにして行われる。即ち、セル 6 2内を流れる電流の電流値を抵抗 Rにより電圧として検出し、増幅器 8 1 を介してその出力を誤作動増幅器 8 2の反転入力側に導き、制御信号と対比することにより、測定液中に流す電流値を制御する。例えば抵抗 Rの抵抗値が 1 0 Ωで、増幅器 8 1 の増幅度が 1 0倍の場合に、制御したい電流値が 1 m Aであれば、制御信号として 1 0 0 m Vを設定する。また、 — 1 0 0 m Vの制御信号を与えることにより、測定液中に流す電流値を一 1 m Aとすることもできる。

かくして、測定液中に所定の電流値の電流が流されることにより制御された電極反応が行われ、セル 6 2内において、先に図 1 6で説明した反応が生じて、陽電極である作用電極 7 2の近傍で電気化学発光が発生する。こうして発生した光はセル 6 2の上面 6 6を通過し、光電子倍増管 8 0で検出されて電気信号に変換され、処理される。電気化学発光によつて発生する光の量が測定液中の抗原 1 の量に比例することから、測定液を電極反応させて光らせてその光を検出すれば、測定液に含まれた抗原 1を検出、定量することが可能となる。なお、こうして電気化学発光を利用した検出、定量が終了した後、再び、ポンプ 7 1 の稼働によつてセル 6 2内にクリーニング液（アルカリ液）が導入され、セル 6 2内の洗浄が実施される。

[実施例]

次に、実際に電気化学発光を利用して抗原の検出を行い、本発明に従つて測定液中の電流値を制御した場合と、従来例のように参照電極と作用電極の間の電位差を制御した場合を比較した。以下に、その実験結果を示す。

(検出装置の構成）

電極は、先に図 2において示したものの他に、作用電極として 6 x 6 mmおよび 6 X 8 m mの白金板からなる電極をセルの下面に配置した。対向電極は、 6 x 3 mmの白金板をセルの天井面に作用電極の両側に位置する様に配置した。セルの天井面は、アクリル樹脂板を用い、スぺ一サは厚さ 0. 5 mmのテフロン製のものとした。作用電極の表面に抗体を捕集させる磁石は 0 5 x 4 mmの単極磁石を用いた。送液管 6 8は、内径 1. O mmのテフロン製チューブを用い、吸引液量は、 0. 0 1〜 5 ミリリットルの範囲で可変なものとした。光電子倍増管（ P MT ) は、

「ルミノメーター」（ハマホト製 R— 1 1 0 4型 P MTを用いたルミノメーター、ゲインが高く、赤色に敏感な光電子増幅管、 P MT電圧は、 5 0 0〜 1 , 1 0 0ボル卜で可変）を用いた。なお、従来例の比較実験を行うため、銀ノ塩化銀からなる参照電極を設けた。また、セル内の電流値および電位差は、マイクロプロセッサーを用いて所定の値に制御して検出を行った。

(検出に用いた試薬素材）

電気化学発光物質：次式（ 1 ) で示される Ru (bpy) 3²一

電解液： 1 1 2 mM KH₂P〇 8 8 mM Κ₂Η Ρ〇4 · 3 Η₂〇、 5 0 Μ Ν a C 1 , 6. 5 mM Ν a Ν 3 , 0. 8 w Μ トライトン X— 1 0 0、 0. 4 m Μ トウィーン 2 0、および 1 0 0 m Μ トリプロピ一ルアミンの水溶液。

クリーニング液（アルカリ液）： 0. 5 ^1の〇 11、 1. 2 5 % トラィトン X— 1 0 0を含む水溶液。

Ru (bpy) 3 _ NH S ：ルテニウム（ 2 , 2 ' —バイピリジル） 2 ( 4— [ 3— （ 1， 3—ジォキソラン一 2—ィル）プロピル] — 4 ' 一メチル一 2， 2—バイピリジン） ²_

ダイナール粒子：日本ダイナ一ル社から入手した直径 4. 5 ./ mの磁気ビーズ。

(電流値制御による E C L測定）

電流値制御による E C L測定周期は、次の三段階からなる。即、 ( 1 ) 測定前条件化、（ 2 ) 測定、および（ 3 ) 洗浄である _e その測定前条件化段階では、電流を 0. 0 mAから + 8. 0 m Aを経て— 5. 0 mA から + 0. 1 mAへと電流矩形波を適用する操作を含んでいる。また、その測定段階では、 .1 0 mA/秒の割合で、 + 0. 1 111 から + 8111 - を経て、 + 0. 2 m Aへと電流三角波を適用する操作を含んでいる。最後の洗浄段階では、 + 0. 0 m Aから + 8 · 0 m Aを経て、 — 5. 0 mAから 0. 0 m Aへと電流矩形波を適用する操作を含んでいる。すべての電流は 6 X 5 mm寸法の作用電極に流れる電流値に対するものであり、 6 >、' 8 m mに対する電流値は 1. 6倍その値を大きくした。

(電位差制御による E C L測定）

電位差制御による E C L測定周期も同様に、次の三段階からなる。即ち、（ 1 ) 測定前条件化、（ 2 ) 測定、および（ 3 ) 洗浄である。その測定前条件化段階では、 2. 0 VZ秒の割合で、電圧を 0. 0 Vから + 2. 2 Vを経て一 1. 0 Vから + 0. 6 Vへと電圧三角波を適用する操作を含んでいる。また、その測定段階では、 1. 0 VZ秒の割合で、 + 0. 6 V から + 2. 8 Vを経て、 + 2. 0 Vへと電圧三角波を適用する操作を含んでいる。最後の洗浄段階では、 + 0. 0 から + 3. 0 'を経て、 — 0. 5 Vから 0. 0 Vへと電圧矩形波を適用する操作を含んでいる。すべての電圧は、銀 Z塩化銀の参照電極に対するものである。

(実験例 1 )

標識し磁気粒子（感作磁気粒子、即ちサンドイッチ形成された状熊の抗原のモデル粒子）を用いて、電流値を制御した場合の E C L発光と、電位差を制御した場合の E C L発光の比 K測定を行つた。

感作磁気粒子は、次のようにして作した即ち、アンコートの M— 4 5 0ダイナビ一ズ（日本ダイナ -ル社） 3 0 m g ： 1 ミリリットル）を、 1 5 0 mMの燐酸緩衝液（ p H 7. 5 ) 2 ミリリットルを用いて磁気分離法で 2回洗浄。その後、 0. 0 5 %チメ口サール含有の燐酸緩衝食塩水（ P B S ) 1 ミリリットル中に R u ( b p y ) z ²—で標識した M o u s e I g G (自社エーザィ製）を 1 5 0 gを含む溶液を加え、一昼夜、室温で回転混合しながら反応させた。その後溶液と粒子とを磁気的に分離させて、磁気粒子以外の溶液は除去した。さらに、粒子表面に未反応部分がないようにするため、 0. 0 5 % のアジドナトリウム含有の 3 % 牛血清アルブミン（ B o v i n e S e r u m A 】 u b m i n e ; B S A) Z P B Sを 1 ミリリツトル加え、室温で 2時間にわたつて反応させた。感作粒子は、一回 2 ミリリットルの洗浄液を用いて、五回洗浄し、最後に、保存するために、同じ緩衝液 1 , 0 0 0 ミリリットル中に再懸濁させ感作磁気粒子を得た。

E C L発光の測定は、次のように行った。即ち、ポンプの稼働によつて感作粒子懸濁液 2 0 0マイクロリツ卜ルをセル中に引き入れるに当つて、作用電極の表面に感作粒子を補足するために、作用電極下部の磁石を押し上げ、試料が電解液と共に電極セル部に送り込まれた時点で磁石アームを待避させ、電極に計測ステージの電位を印加し、光電子増幅管を用いて発光強度を計測した。

電流値を制御した場合と電位差を制御した場合のそれぞれについて、感作粒子（サンドィツチ形成された状態の抗原）による発光カウント力くほぼ等しくなるように条件を調整し、それぞれの場合において発光のピ —クが認められた時間を中心としてその前後 2 0区間（前後で合計 4„1 区間）の発光強度を積算した値を表 1に示す。 - 表 1

計測された発光パターンを図 6〜 9に示す。先ず、電位差を制御して測定した E C L発光の発光パターンの制御電位差と発光強度の関係を、図 6に経時的に示した。図 7は、低レベル域における電解液によるブランクの発光の状態を拡大して示したものである。図示のように、電位差制御による場合は、ブランク発光は電位変化に追従する様な発光が認められた。

次に、電流値を制御して測定した E C L発光の発光パターンの制御電流値と発光強度の関係を、図 8に経時的に示した。図 9は、図 7 と同様に、低レベル域における電解^によるブランクの ¾光状^を拡大して示したわである。電流制御の場合におも、電位差制:卸による場合と同様な強度の E C L発光が認められた。しかしながら、図 9に不す如く、ブランクの癸光は非常に低値で、しかも、電位差制御の場合に見られた単峰性のノィズ発 ¾ つピークは、電流値制御の場は全く ¾められなかった。

感作粒子の発光カウントの再現性（ C V ) においては、電位制御 1 . 0 6 %に対して電流制御した場合は 0 . 5 5 %と約 2倍の改善がなされ. また、計測液のブランク発光は電流値を制御した場合の方が極端に少なく、正規信号に対するノイズの割合（ S / N比）では、電位差を制御した場合は 2 2 0倍であるのに対して、電流を制御した場合は 1 3 0 2倍と、約 6倍も S / N比を向上させる効果が認められた。

図 1 0は、電流値を制御した場合の時間に対する電流値の変化の一例

2

を示すものであり、図 1 1 は、電位差 4 を制御した場合の時間に対する電位差の変化の一例を示すものである。また、図 1 2に、電位差を制御した場合における制御電圧と、測定された電流値の関係を示した。なお、これら図 1 0〜 1 2において、区間 1は測定前の条件化を行っている状態、区間 2は測定を行っている状態、区間 3は電極の洗浄を行っている状態を示す。図 1 0に示されるように、電流値を制御した場合は、電流の最高値は高々 8 m Aであった。これに対して、電位差を制御した場合は、図 1 2に示されるように、過渡的に 1 7 m Aと、電流値を制御した場合の二倍強の大きな電流値が示されていることが分かった。電位差を制御した場合に現れるこうした過渡電流は電極面での電界条件が厳密には制御されていないことが示される。また、運転サイクル毎に幾度も流れるこうした過渡電流は電極のェッジ部分に集中する性質を持っているので、過渡電流は電極の磨耗劣化を引き起こし、電極の耐久性が劣るものと予想される。

(実験例 2 )

電極間の距離を変えた場合の E C L発光の電気化学的特性を、電位差を制御した場合と電流値を制御した場合とで比較した。対向電極の雷極間隔を 6 m m、 8 m m及び 1 0 m mと変化させ、それぞれの場合に発光のピークを与える電位差や電流値がどの様に変わるかを比較検討した。実験例 1 と同様の感作磁気粒子を用い、電位差を制御した場合は発光のピークを与える電位差を、電流値を制御した場合は発光のビークを与える電流値を求め、比較した。表 2にその結果を示す。表 2

2

5

電位差を制御した場合は、対向電極の間隔が変わると電位差も変化したが、電流値を制御した場合は各電流値は変化しなかった。

(実験例 3 )

作用電極の面積を変えた場合の E C L発光の電気化学的特性を、電位差を制御した場合と電流値を制御した場合とで比較した。作用電極の幅 6 m mのものと幅 8 m mのものについて、電極間隔 1 0 m mの対極電極を用い、実験例 1の感作粒子を用いて発光のピークを与える電極ドライブ条件を、電位差を制御した場合と電流値を制御した場合とで比較した < 表 3に示す如く、何れの場合 i、作用 ' ；： ¾積が ¾化することによて電極のドライブ条件は変化したが、電流値を制「した ¾合は、電流値が電極面積に比例した値であることが分かつた。表 3

( )内の値は電極面積關 ²当たりの電流量 mA

[産業上の利用可能性]

本発明によれば、電気化学発光を発生させる際の電極反応を制御するために従来必須とされていた参照電極を取り去ることができるばかりでなく、ブランク発光の少ない良質な E C L発光を実現できるようになるしかも、電位制御では避けられなかった過渡電流を発生させることがないので.、電極の損耗も少ない。加えて、参照電極の交換も不要となり、メンテナンス性に優れた装置を提供できる。

Claims

請求の範囲

1. 電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液をセル内に導入して電極反応させ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法において、測定液に供給する電流の電流値を制御することを特徵とする電気化学発光検出方法。

2. 電気化学発光物質は、次式（ 1 ) または（ 2 ) で示される Ru (bpy) 3 ² 次式（ 3 ) で示される Re錯体（ここで、（ 3 ) 式中、 nは整数であって好ましくは 2または 3、 mは 1、 2または 3であって好ましくは 1、 Wは C H〇、 C O OH、 1^11₂または81：、 Rは陰イオンである）、および次式（ 4 ) で示されるオスミウム（Os) 錯体の何れかもしくはそれらの任意の組合わせである請求項 1に記載の電気化学発光検出方法。

3. 電気化学発光補助物質は、 T P. A (Tnpropylamine) および/または T E A (Triethyl amine) である請求項 1または 2に記載の電気化学発光検出方法。

4. 電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液が導入されるセル内に電極が設けられ、該セル内における電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出するための光検出器を備えるものであって、測定液に供給する電流の電流値を制御するための制御手段を備えていることを特徴とする電気化学発光検出装置。

5. 電気化学発光物質は、次式（ 1 ) または（ 2 ) で示される Ru (bpy) ₃ ²—、次式（ 3 ) で示される Re錯体（ここで、（ 3 ) 式中、 nは整数であって好ましくは 2または 3、 mは 1 、 2または 3であって好ましくは 1、 W，ま C ：■{ 0、 C〇 0 H、 N H ₂また ^ r、 P.は陰イオンである、 . および次式（ 4 ) で示されるオスミウム（ Os).错体の何れかもしくはそれらの任意の組合わせである請求項 4に記載の電気化学発光検出装置。 3

o

(2)

6. 電気化学発光補助物質は、 T P A (Tripropylamine) および/または T E A (Tri hvl amine) である請求^ 4または 5に記載の '気化学発光検出装置。

7. 光検出器は、光電子倍増管および/またはホトダイオードである請求項 4〜 6の何れかに記載の電気化学発光検出装置。