WO1996036714A1

WO1996036714A1 - Molecule d'acide nucleique pour le traitement de tumeurs malignes de lymphocytes b, procede pour la produire et son utilisation.

Info

Publication number: WO1996036714A1
Application number: PCT/JP1996/001258
Authority: WO
Inventors: Nobuhiko Emi; Akihiro Abe
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1995-05-18
Filing date: 1996-05-14
Publication date: 1996-11-21
Also published as: AU5659696A

Description

明細書

B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子、その製造方法および利用発明の技術分野

本発明は、広くは遺伝子治療の分野に関し、特に、 B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子、その製造方法および利用に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞に特異的な免疫グロブリン分子の（H) 鎖可変部領域のイディォタイプ遺伝子を含有する、 B細胞性悪性腫瘍の治療に有用な核酸分子およびその製造方法に関する。また、本発明は該核酸分子を有効成分とする細胞性悪性腫瘍の治療に有用な医薬組成物、該核酸分子のコードするタンパク質にも関する。さらに、本発明は、該核酸分子をそれを必要とする対象に投与することよりなる B細胞性悪性腫瘍の治療方法および細胞性免疫増強方法にも関する。従来の技術

悪性リンパ腫は、リンパ組織に発生する悪性腫瘍の総称であるが、病変部の病理組織学的所見から、ホジキン病と非ホジキンリンパ腫とに大別され、後者を主として悪性リンパ腫として扱っている。悪性リンパ腫のほとんどが B細胞由来であり、これらは B細胞性悪性リンパ腫と呼ばれている。また、白血病の中にも B細胞性白血病は多い。本発明においては、これらの B細胞由来の悪性リンパ腫、白血病等の悪性腫瘍を B細胞性悪性腫瘍と呼ぶ。

これらの B細胞性悪性腫瘍の治療原則は放射線療法と抗癌剤化学療法を組み合わせて治癒を目指すものであり、近年、成績は向上してきているが、低悪性度リンパ腫では第 4ステージで発見されることも多い。低悪性度リンパ腫の完全治癒は困難で、強力な治療を行っても生存率向上に貢献せず、副作用で Quality of Life(QOL) が障害される場合もあり、場合によつては治療しないこともあるとされる。

また、多くの症例において一度は寬解の状態にもっていくことができても、長期的には再発して死亡することが多い。低悪性度リンパ腫の自然歴をみても他の群の悪性リンパ腫より経過が長く、場合によっては十数年かけてゆつくり進行して死に至るものがある。このようなリンパ腫に対して、いくつかの免疫強化療法が検討されている。

Bリンパ球がクローン性に増殖する腫瘍である B細胞悪性リンパ腫および B細胞性白血病では、腫瘍細胞がその腫瘍特異的な免疫グロプリン (Ig) を発現している。この Igは正常細胞にはなく、腫瘍クローンに特有なイディォタイプ（Id) を有しているために、一種の腫瘍特異抗原であると考えられる。この Idに対する抗 Id抗体が、 B細胞リンパ腫に対して有効であることが示されている（Levyら、 Blood, 73, 651— 6 61， 1989) 。すなわち、 B細胞リンパ腫 16例について、症例ごとに抗 Idモノクローナル抗体を作製し、それらを総量 400または 500 mg投与し、完全寬解 1例、部分寛解 7例を得ている。

しかし、抗 I d抗体投与後、 I d陰性の変異細胞が増殖してくる例や、 I d分子が消失する抗原変調が起こることが問題とされている。

また、 Bリンパ腫細胞が分泌する Igをワクチンとして免疫することにより、弱いながらも抗腫瘍効果を誘導できることが報告されている

(Levyら、 N. Engl. J. Med., 327, 1209 - 1215, 19 92) 。すなわち、 Bリンパ腫細胞とマウスミエ口一マ細胞とを融合させ、

- - 得られたハイプリドーマを用いて、 I gを分泌させ、精製後、キャリアータンパクとしてのキーホールリンペットへモシァニン（K L H) と結合させ、アジュバントと共に皮下免疫することにより、ある程度の治療効果を有することを明らかにしている。しかし、症例ごとに異なる I gを産生する融合細胞を作製する必要があり、これらの作業に時間と手間がかかり、現実的でない。また、効果が弱く、有効性において不充分である。

つぎに、免疫ベクターをワクチンとして使用する方法が 8 0年代後半より確立され、改良が行われ、遺伝子治療が現実のものとなってきた。この方法は、ウィルス学的手段、物理的手段および化学的手段に大別される。ウィルス学的手段は、ウィルスの、細胞に感染する生活環を利用して任意の遺伝子を細胞に導入するもので、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベクターなどが代表的なベクタ一である。物理的手段としては、マイクロインジヱクシヨン、パーテイクルガン、エレクトロポレーシヨンなどが挙げられ、これは、直接細胞に遺伝子を入れるので細胞選択性はなく、細胞障害性が強いが、よりよい機器の開発により容易になってきている。化学的手段としては、リピッド、リン酸カルシウム、 D N A—蛋白複合体を用いた方法が発表されており、導入細胞に選択性を持たせる方法も提案されている。最近では、直接 D N Aを生体に投与して遺伝子導入を行う、 Naked D N A transferも提案されている（特表平 4— 5 0 4 1 2 5号）。

I g分子は、同一の 2本の重（H) 鎖と 2本の軽（L ) 鎖からなり、それぞれの N末端約 1 1 0アミノ酸残基から構成される（H ) 鎖可変部領域 ( V _H) と（L ) 鎖可変部領域が抗原結合部位を形成し、イディォタイプを決定している。

近年、 Hawkinsらは B細胞リンフォーマの I gの V _Hおよび V _Lをコードする遺伝子により single chainF _vをコードする遺伝子を作成し、該遺伝子をレトロウィルスベクターに導入し、免疫ベクターを作成している

[ J ournal of I mmunotheraphy. 第 14巻、第 273〜 278頁（19 93) 、 W0 94/08008] 。

—方、 Igの V_Hにおいてァミノ酸変異度が非常に高い領域が 3ケ所認められる。これらの領域は、それぞれ相補性決定領域（CDR) ί、 I I、 I I Iと呼ばれ、抗原との直接の結合部位に当たり、抗原特異性を決定している。

本明細書においては、この Igの V_Hの CDR I I I部分を含有するタンパク質をコードしている遺伝子をイディォタイプ遺伝子と呼ぶ。

Igの V_Hは 3種類の遺伝子領域（Vh、 Dh、 Jh) によってコードされ、 B細胞の分化に伴い、これら 3種の遺伝子断片が再構成を起こすことによつてその多様性、すなわち、抗原特異性を獲得する。 B細胞は分化に伴い、まず、約 30個の Dh遺伝子と 6個の Jh遺伝子のうち、それぞれ 1個の遺伝子断片が選ばれ DhJh結合が起こり、続いて数十から数百個あるといわれる Vh遺伝子のうちの 1個の遺伝子断片が結合し、 VD J再構成を完成させる。これら再構成の過程で、どの Vh、 Dh、 J h遺伝子断片を使用する力、、結合部位における遺伝子末端の多様性、 VhDhおよび Dh J h結合部位への Nヌクレオチド（介在配列）の挿入によって、さらには、再構成完了後に、抗原刺激に基づく変異によって Ig分子の高い多様性が獲得され、その結果が上記の CDR I、 I I、 I I Iの高いアミノ酸変異度へ反映されている。

とりわけ、 CDR I I Iは最も高い多様性を示し、末梢血 B細胞における解析から、少なくとも 30, 000種以上の CDR I I Iシークェンスの存在が示唆されている。したがって、 B細胞リンパ腫は 1個の B細胞由来の単クローン性増殖と考えられることより、この癌化した 1個の B細胞における C D R I I I シークェンスを含有する I gの V _Hが腫瘍特異的遺伝子配列となる。発明の目的

上記の事情に鑑み、本発明は B細胞性悪性腫瘍、すなわち、 B細胞性白血病、 B細胞性悪性リンパ腫の治療に有用な、免疫強化作用を有する核酸分子を提供することを目的とする。発明の概要

B細胞性悪性腫瘍は、 I g遺伝子がその腫瘍特異的に再構成しており、腫瘍特異抗原となっている。本発明者らは、新たにその I gの V _Hの C D R I I I部分を含有する V _Hタンパク質をコードするイディォタイプ遺伝子を単離し、この遺伝子を発現ベクターに連結した核酸分子を調製し、生体に投与したところ、抗イディォタイプ抗体、さらに細胞性免疫を誘導することに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明の第 1の発明は、ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞に特異的な免疫グロブリン分子の V _Hの C D R I I I部分を含有する V _Hタンパク質を発現可能な B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子である。

第 2の発明は該 B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子の製造方法である。第 3の発明は該核酸分子を有効成分として含有する医薬組成物である。また、第 4の発明は該核酸分子が発現するタンパク質である。

また、第 5の発明は該核酸分子の有効量をそれを必要とする対象に投与することよりなる B細胞性悪性腫瘍を治療する方法である。

さらに、第 6の発明は該核酸分子の有効量をそれを必要とする対象に投与することよりなる細胞性免疫增強方法である。図面の簡単な説明

実施例 8の C T L活性測定結果を示すグラフである。発明の詳細な説明

以下、本発明を説明する。

本発明のヒト B細胞性悪性腫瘍細胞に特異的な免疫グロプリン分子の V_Hの CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質を発現可能な B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子は、つぎの工程（a) 〜（e) ：

(a) ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞より核酸を分離する工程、

(b) 得られた核酸を逆転写（RT) し、 cDNAを調製する工程、

(c) 免疫グロプリンの V_Hの CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質をコードするイディォタイプ遺伝子の上流および下流に存在する保存領域の一部を含有する核酸断片をプライマーとして用いて P CRを行い、増幅し、増幅された免疫グロプリン分子の V_Hのイディォタイプ遺伝子を単離する工程、

(d) 単離されたイディォタイプ遺伝子を発現ベクターに連結し、 B細胞性悪性腫瘍治療用 DNA分子を構築する工程、および、要すれば、

(e) B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子を製造する工程、

で製造することができる分子および得られた核酸分子の塩基の 1つ以上が加入、変更および/または削除された所望の活性を保持した核酸分子を包含する。

すなわち、本発明においては、まず、 B細胞性悪性腫瘍細胞特異的な I gの V_Hのイディォタイプ遺伝子を知ることが必要となる。そこで、ェ程（a) でヒト B細胞性悪性腫瘍細胞より核酸を分離し、工程（b) において、得られた核酸から RT反応により cDNAを調製する。

イディォタイプ遺伝子は Dh遺伝子、 VhDhおよび DhJh結合部位によつてコードされているために、イディォタイプ遺伝子両端に位置する Vhおよび J h領域の比較的保たれた塩基配列部を選び、イディォタイプ遺伝子增幅のためのコンセンサスプライマ一を合成し、工程（c) において、これらのプライマーを用い、工程（b) で調製した cDNAから、 PCR法でイディォタイプ遺伝子を増幅後、クローニングベクターに組み込み遺伝子配列を決定することができる。腫瘍特異的ィディオタィプ遺伝子が得られたら、工程（d) において、当該イディォタイプ遺伝子を単離し、発現ベクターに組み込み、 B細胞性悪性腫瘍治療用 DN A分子を構築し、要すれば、工程（e) において、本発明の核酸分子の生産量を増大させる。工程（a) は、例えば、 B細胞性悪性腫瘍の患者より採取した血液、またはリンパ節等の腫瘍中の B細胞より、 RN Aを分離調製する工程であり、種々の公知の方法が採用できる。例えば、血液の場合、フイコール法でリンパ球を分離し、該リンパ球より酸グァニジン ·フヱノールクロ口ホルム (AGPC)抽出法等により RNAを調製してもよく、また、少量の血液から RN Aを調製する方法である陽イオン界面活性剤を使用することもできる。

工程（b) は、工程（a) で分離された核酸を用いて、オリゴ dTをプライマーとし、例えば、モロニ一マウス白血病ウィルス（MMLV) またはトリ骨髄芽球ウィルス（AMV) 由来の酵素のごとき逆転写酵素を用い、 RT反応により cDNAを調製する工程である。

工程（c) は、得られた cDNAを用いて、 2種のプライマ一を組み合わせて P CRを行う工程である。得られた RT- P CR産物を、例えば、フエノール /クロロホルム一ィソアミルアルコールで処理後、 Sal Iや Pstlのような制限酵素で切断し、ァガロースゲル電気泳動後、 Nal法等によりイディォタイプ遺伝子を含有する DN A断片を精製する。この DNA断片とィー · コリ（E. coli) 複製プラスミドを接続し、ィ一 ' コリで增加させ、イディォタイプ遺伝子を単離する。

単離したイディォタイプ遺伝子のシークェンスを行うことにより、ァミノ酸配列が決定できる。例えば、配列表の配列番号 1および 4のプライマ一を用いて 3症例について実施し、配列番号 5〜 7の塩基配列を決定した _c これらの塩基配列より、配列番号 8〜10のァミノ酸配列を決定した。また、配列番号 2および 4のプライマーを用いて 1症例について実施し、配列番号 11の塩基配列を決定した。この塩基配列より、配列番号 12のアミノ酸配列を決定した。また、イディォタイプ遺伝子の増幅は、配列番号 3および 4のプライマ一を使用してもよい。さらに、配列番号 2のミックスプライマーに代え、配列番号 13のプライマーを使用してもよい。また、配列番号 3のプライマーに代え、配列番号 14のプライマーを使用してもよい。

工程（d) は、工程（c) で得られた腫瘍特異的イディォタイプ遺伝子を発現ベクターに組み込む工程である。発現ベクターとしては、例えば、 pRc/CMV, pSinRepS (ィビトロゲン社製）、 SEML I K I FOREST VI RUS BASED VECTORS [Vaccine, 12, 1510-1514(1994)] 、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター由来の発現ベクター等が挙げられ、特に、 LRNL (Virology 171, 331 (1989) ) 、 LNCX、 L X S N等のレトロウイルスベクターが好ましい。例えば、 LRNLを BaniHI、 Sal Iなどの制限酵素で切断し、ァガロースゲル電気泳動後、 Nal法等により精製する。一方、上記のイディォタイプ遺伝子を含有するプラスミド、例えば、 pBSV_Hを同様に BamH I、 S al Iなどの制限酵素で切断し、ァガロースゲル電気泳動後- Nal法等により精製する。そして、両 DNA断片を Takaraライゲーションキット（宝酒造製）等により接続し、イディォタイプ遺伝子を含有する発現用プラスミド pL V_HRNLを構築する。

イディォタイプ遺伝子を発現用プラスミドに組込む際に、イディォタイプ遺伝子にタグ（t ag)配列を付加することにより、発現タンパク質の検出を容易に行うことができる。タグ配列としては例えば配列表の配列番号 15で表されるへマグルチニンべプチドシークェンス（配列番号 16) をコードする DN A配列があり、該ぺプチドを認識する公知の抗体を使用することにより感度よく、発現ポリペプチドを検出することができる。タグ配列としては目的に応じ公知の配列を付加すればよく、特にへマグルチニンべプチドをコ一ドする DN A配列に限定されるものではない。

工程（e) は、工程（d) で得られたベクターを、適当な宿主を用いて増やし、 B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子を含有するべクタ一を単離する工程である。このべクタ一をそのまま裸の（naked) DNAとして、適当な組成物の形で投与しょうとする場合、ィー · コリ（E.coli) K12等の宿主をイディォタイプ遺伝子を含有するベクターで形質転換し、得られた形質転換体を自体公知の方法で培養し、目的のベクターを回収すれば、 B型細胞性悪性腫瘍治療用 D N A分子を製造することができる。

さらに、工程（d) で得られたベクタ一を铸型とし、 in vitro

transcription法にて B細胞悪性腫瘍治療用の m R N Aを製造することができる。

また、ウィルスを用いる場合、レトロウイルス、アデノウイルス等を用いた方法があるが、 ①通常 1コピーのみ宿主細胞の DN Aに組み込まれるため、安定した遺伝子導入ができる、 ②ウィルス自体の細胞障害性が少ない、 ③高カ価のプロデューサー細胞を樹立すれば半永久的に使える等の理由から、レトロウィルスを用いたレトロウィルスベクタ一システムが好ましい。このシステムは、レトロウイルスベクターとヘルパー細胞からなり、上記の LNRLを始めとするベクターにイディォタイプ遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターと、 GP+envAml 2、 PA— 317、 psi— CR I P等のヘルパー細胞が使用される。そして、ヘルパー細胞が作っているウイルス粒子タンパク質にレトロウイルスべクターがパッケージングされたウィルス粒子、すなわちプロデューサー細胞が形成される。このプ口デューサー細胞の培養上清に産生されるレトロウィルスを濃縮すれば、本発明の B細胞性悪性腫瘍治療用の核酸分子を含有するゥィルス粒子を製造することができる。

かくして得られた B細胞性悪性腫瘍治療用の核酸分子は、部位特異的変異誘発法などの自体公知の方法で、所望の活性を損なうことなく、 1っ以上の塩基を加入、変更およびまたは削除することにより改変でき、そのような改変し、かつ所望の活性を示す核酸分子も本発明範囲のものである。この部位特異的変異誘発としは、ギヤプドデュプレックス（gapped duplex) 法 [メソッズインェンザィモロジ一，第 154巻，第 350 〜 367頁（1987) ] 、ゥラシル DN A法 [メソッズインェンザィモロジ一，第 154巻，第 367〜 382頁（1987) ] 、亜硝酸法

[プロシーディングズォブザナショナルアカデミーォブサイエンシーズォブザ U S A ( P roceeding of the National Academy of Sciences of the US A) , 第 79巻，第 7258〜 7262頁（1 982) ] 、さらにカセット変異法 [ジーン（Gene) ，第 34巻，第 3 15〜 323頁（1985) ] が知られている。さらに、得られた DNA分子を哺乳動物に投与し、イディォタイプ遺伝子を発現させるためには、裸の DNAとして投与する方法と、 in vitro transcription 法で得られた mRN Aを裸の RN Aとして投与する方法と、ウィルス粒子にパッケージングさせて、例えば、レトロワクチンの形で投与する方法がある。裸の DNA、裸の RNAとして投与する場合、当然物理学的、化学的手段を組み合わせることもできる。物理的手段としては、パーティクルガン、エレクトロポレーシヨン等が挙げられ、化学的手段としては、リピド等を用いた方法が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、上記のヒト B細胞性悪性腫瘍細胞に特異的な免疫グロブリン分子の V_Hの CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質を発現可能な核酸分子を有効成分とするヒトの B細胞性悪性腫瘍治療用の組成物である。

裸の DNA、または RNAとして投与する場合、組成物は、医薬上許容される賦形剤、希釈剤を用い、投与に適した適宜の形態、例えば、油性または水性の賦形剤において、懸濁液、溶液または乳濁液の形態、また、水のような適当な賦形剤で再形成するために凍結乾燥形態のものでもよい。通常、皮下、皮内または筋肉内投与用のごとき非経口液体投与形態が好ましい。所望により、ショ糖、グリセロール、塩化ナトリウム等の等張化剤、さらにリポフエクチン、ジォレイルホスファチジルエタノールァミンブロマイド等のリピド、リン酸カルシウム等を添加してもよい。さらに、リピドを適当に用いて、リボソーム製剤としてもよい。

裸の DNA、または裸の RNAとして投与する場合、本発明の医薬組成物は、通常、非経口投与、例えば、皮下、皮内または筋肉内に投与される。該有効成分の投与量は、個々の患者、実際の症状、投与経路等により変化する力一般に、皮下投与の場合、核酸量として 1日当たり l/zg〜l 0 mgZkg体重である。

例えば、上記のイディォタイプ遺伝子を pRcZ C MV、レトロウイルスベクター由来の発現ベクター等の発現ベクターに連結して得られた本発明のベクターを裸の D N Aとして、もしくは本発明のベクターにより in vitro transcription 法にて得られた m R N Aを裸の R N Aとして投与することにより、ワクチンとして効果を発揮させることができる。例えば、イディォタイプ遺伝子を L R N Lに挿入し、 pL V _HR N Lを調製し、これをィー · コリに形質転換し、得られた形質転換体を自体公知の方法で培養し、プラスミドを回収精製後、ショ糖溶液のような形で、患者に皮下、皮内または筋肉内に投与すると、患者の血中に抗ィディオタイブ抗体、さらに、細胞性免疫を誘導することができる。

ウィルス粒子として投与する場合、組成物は医薬上許容される陚形剤、希釈剤を用い、投与に適した適宜の形態、例えば、油性または水性の賦形剤において、懸濁液、溶液、または乳濁液の形態、また、水のような適当な賦形剤で再形成するために凍結乾燥形態のものでもよい。通常、投与の際は液体投与形態が好ましい。所望により、ショ糖、グリセロール、塩化ナトリウム等の等張化剤、さらにリポフエクチン、ジォレイルホスファチジルエタノールァミンブロマイド等のリピド、リン酸カルシウム、 polybrene、硫酸ブロタミン等を添加してもよい。

ウィルス粒子として投与する場合、経口投与、非経口投与いずれの方法でもよく、投与量は個々の患者、実際の症状、投与経路等により変化するが、ウィルス粒子中に含まれる本発明の核酸分子、すなわちポリヌクレオチド量として 1日当たり l g l mgZkg体重、また、ウィルス量として 1日当たり 1 0 ³〜1 0 ⁷cf_U/ kg体重である。

例えば、上記のイディォタイプ遺伝子をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター由来の発現ベクター等の発現ベクターに連結して得られた本発明のベクターを、ウィルス粒子に取り込ませ、このウィルス粒子を患者に投与することにより、ワクチンとして効果を発揮させることができる。例えば、レトロウィルスの場合、上記の pL V_HR N Lを

G P +env A ID 1 2等のヘルパー細胞に遺伝子導入、導入細胞より産出される本発明の核酸分子を R N A分子として取り込んだウィルス粒子を集め、投与すればよい。

本発明の核酸分子を裸の D N A、もしくは裸の R N Aとして投与する場合、また、ウィルス粒子として投与する場合において、これらの投与量範囲において、格別な副作用も認められず、良好な治療効果が達成される。患者に本発明の核酸分子を投与した後、ワクチンとしての効果を確認するために、抗ィディオタイブ抗体の産生を誘導できたかどうかを確認する必要がある。そのために、イディォタイプ遺伝子がコードする V _Hタンパク質を用いることにより、抗体の有無を測定し、免疫系を強化できているかどうか診断することができる。

本発明のタンパク質は、かかるタンパク質として使用できる。該タンパク質を調製するには、ィディオタ.イブ遺伝子を、例えば、ィー · コリ用の発現ベクターに組み込み、 V _Hタンパク質を単離することができる。必要に応じてマルトース結合タンパク質や前記へマグルチニンべプチド等とのキメラタンパク質として調製することも可能である。

得られたタンパク質は免疫活性化状態の検査（モニタリング）に有用であり、そのような検査試薬またはキットの一成分として使用できる。

また、前記したことから分かるように、本発明の核酸分子は、それを必要とする対象に投与することにより、 B細胞性悪性腫瘍を治療し、また、細胞性免疫を増強することができ、かかる B細胞性悪性腫瘍の治療方法および細胞性免疫増強方法も本発明の範囲内である。投与に際しては、前記したのと同様の範囲の投与量が用いられる。

本発明の核酸分子は、従来用いられていたヒト B細胞性悪性腫瘍に特異的な免疫グロプリン分子の V_Lをコードする核酸分子を含有しなくても、強いワクチン効果を有する。従って、個々の B細胞性悪性腫瘍に特異性の高い、ワクチンとして有用な核酸分子を極めて簡便に製造することができる。つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例 1

核酸（RNA) の抽出

B細胞性白血病の患者より採取した血液中の B細胞より、 RNAを以下のごとくして分離した。

B細胞性白血病の患者から採血した血液を 0.31%クェン酸ナトリゥム処理し、その処理液 lmlをリン酸緩衝液で 2倍に希釈した後、フイコーノレ（ヒトリンパ球分離用） lmlに重層し、 25°Cで遠心分離を行い、リンパ球層を集めた。リン酸緩衝液で.十分に洗浄した後、細胞にグァニジンィソチオシァネート（またはグァニジンチオシァネート）を加え、細胞を溶解させた。

溶解後の細胞抽出液をフヱノール、クロ口ホルム処理をした後、 2—プロバノール沈殿を行い、 RNAを回収した。該 RNAは一 80°Cにて保存し、使用時に 10 1のトリス · EDT A緩衝液に溶解した。

実施例 2

cDNAの調製実施例 1で得られた RN A (5 ^ ) を水（11 / 1) に懸濁し、 80°C で 3分間保持した後、 5倍濃縮反応緩衝液混合液 10 1に 0.1M DT T (5^1)、 2.5mM dNTP混合液（20 、 1 zgZ^ 1の dT! ₂ -₁₈ (フアルマシア社製）（1 、 RTァーゼ（BRL MMLV20 0U///1) (2〃1) および RNァーゼインヒビター（40U/ /1) (1 H ) を添加し、 37 °Cで 1時間反応させた後、 92 °Cで 5分間加熱し、ついで氷冷し、対応する cDNAを調製した。これを一 20°Cで保存した。実施例 3

イディォタイプ遺伝子の単離

実施例 2で得られた cDNAの 1例に、配列表の配列番号 2 (V_H領域の sense側プライマー）および配列番号 4 ( V_H領域の antisense側プライマ一）で示す 2種のプライマ一を組み合わせて、以下のとおり PCRを行つ十- 実施例 2の cDNA (2 zl) を 10倍濃縮反応緩衝液（ 5 1)、 25 mM MgCl₂ (3 ΐ) . 1.25mM dNT P ( 8 1) 、各プライマー (10 O mol/l/il) (0.5 1ずつ）、 Taq酵素（5ュニット / 1、 0.5 β\) および水（30. δ と合し、 94°Cに 40秒、 62°Cに 40秒ついで 72°Cに 1分の保持.を 35サイクル繰り返した。

得られた RT- P CR産物を、フヱノール Zクロロホルム一イソアミルアルコールで 1回、クロ口ホルム一イソァミルアルコールで 1回処理した後、エタノールを加えて遠心分離し、上清を除き、沈殿物を減圧乾固し、この乾固分を Sal Iおよび P st Iで切断し、 Nal法でイディォタイプ遺伝子を含有する D N A断片を精製した。

—方、ィー · コリ複製プラスミドとして、 Bluescript (SK) 1—1 (ストラタジーン社製）を Sailおよび Pstlで切断し、上記と同様な Na I法により DN A断片を精製した。

この DN A断片を、上記のイディォタイプ遺伝子を含有する DN A断片と Takaraライゲーシヨンキット（宝酒造製）により接続し、ィディオタイブ遺伝子を含有するプラスミド pBSV_Hを構築した。

このプラスミドをィ一 · コリ DH 5 へ形質転換し、得られた形質転換体を Lブロスで 37°C、一晩培養し、プラスミドを回収して、ィディオタィプ遺伝子を含有する pB S V_Hを単離した。

このようにして得たィディ.ォタイプ遺伝子の配列を配列表の配列番号 1 1に示す。また、アミノ酸配列を配列番号 12に示す。

なお、配列番号 1、 2、 3、 13において、開始コドン ATGより下流領域が必須であり、それより上流側（5'側）は制限酵素切断部位があれば特に限定するものではない。また、配列番号 4において停止コドン TC A (TGA) より下流（3'側）は必須であり、上流側（5'側）は制限酵素切断部位があれば特に限定するものではない。

つぎに、配列番号 1および配列番号 4で示す 2種のプライマーを組み合わせて 3症例の B細胞性白血病患者のイディォタイプ遺伝子の CDR I I I部分をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。該遺伝子の塩基配列を配列番号 5〜 7に、そのァミノ酸配列を配列番号 8〜10に示す。

実施例 4

発現べクタ一への連結

LRNLを制限酵素 BamH I、 Sailで切断し、上記と同様に Nal法により精製した。

—方、上記のイディォタイプ遺伝子を含有するプラスミド pBSV_Hを同様に制限酵素 BamH I、 Sailで切断し、 Nal法で精製した。

両 DNA断片を Takaraライゲーシヨンキットにより接続し、イディォ夕ィプ遺伝子を含有する発現用ブラスミド pL V_HR N Lを構築した。

実施例 5

B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子の調製

上記プラスミド pLV_HRNLを、ィ一 ' コリ DH 5 へ形質転換した。得られた形質転換体を Lブロスで 37°Cにて、一晚培養し、プラスミドを回収した。

このようにして B細胞性悪性腫瘍治療用 DN A分子を単離した。

実施例 6

V_Hタンパク質（マルトース結合タンパク（MBP) との融合タンパク）の調製

ィー · コリ発現用ベクター pMAL-c2を制限酵素 Pst I、 Sal Iで切断し、上記と同様に、 Nal法により精製した。

—方、上記のイディォタイプ遺伝子を含有するプラスミド pBSV_Hを同様に制限酵素 Pst I、 Sailで切断し、 Nal法により精製した。

両 DNA断片を Takaraライゲーションキットにより接続し、イディォタイプ遺伝子を含有するィー · コリ発現用プラスミドを構築した。

このプラスミドをィ一 · コリ DH— 5 へ形質転換し、得られた形質転換体を Lブロスで 37°C、一晚培養した。得られた菌体を超音波破碎してタンパク質を抽出し、抽出物よりアミロースレジン（NEB社製）を用いて、 V_H— MBP融合タンパク質を精製した。この融合タンパク質をプロテアーゼ（DENZ YME社製造 Factor Xa) で処理し、精製して V_Hタンパク質部分を単離した。

実施例 7

マウスの免疫

pLV_HRNLの水溶液（100 ) (0.2mg/ml) を DB AZ2マウスに 1週おきに 3回皮内注射し、投与局所に電気パルスを負荷した。最終投与後、 1週間のマウスの眼窩よりキヤビラリー法にて採血し（100〜 200 //1) 、血清を調製し、実施例 6で得られた V_Hタンパク質を用いて、つぎのように免疫活性を測定した。

上記で調製した V_H— MB P融合タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、メンブランフィルターにトランスファーした。つぎにスキムミルクでブロッキング後、上記のようにして得られたマウス血清の 50倍希釈液と 1時間反応させた。洗浄後、二次抗体（horseradish- peroxidase結合 Anti-mouse I g) を加え、 1時間反応後、洗浄し、 E C Lを用いて V_Hタンパク質に特異的な抗 V_H抗体の有無を検出した。ウェスタン ·プロッティング法により、 pLV_HRNL投与群（1群 3匹）の血液中に、 48KDの位置の V_H— MBPに特異的に結合する抗 V_H抗体が誘導できることを確認した。一方、 LRNL投与群の血清中には抗 V_H 抗体は認められなかった。

実施例 8

CTL活性の測定法

1. マウスの免疫

DB A/2マウスへ pLV_HRN.L 20 g (100 1 H₂0) 、コントロール群はサケ DNA20 zgを皮内注射し、これを 1週間おきに 3回繰り返した。 3回目を注射した 1週間後、それぞれのマウスの脾細胞を分離した。

2. ターゲット細胞の調整

GP + E 86細胞へリボフヱクトアミン法により p L V_HRNL 20 g をトランスフユクシヨンした。 12時間後に培養上清を代え、さらに 12 時間後のレトロウイルスを含む培養上清をとり、ポリプレン 5// g/mlとともに P I HTR細胞にレトロウィルスベクター L V_HRNLのィンフエクシヨンを行った。 48時間後より G 418, 500 g/mlの濃度下に培養を行い、 P I HTRZL V_HRNLを樹立した。

3. P I HTR/L V_HRNLによるマウス脾細胞の刺激

上記マウス脾細胞濃度が終濃度 1 X 10 mU 5 OGyの放射線照射を施した P I HTR/L V_HRNLが終濃度 0. 5x 10⁷Zmlになるように調整し、 24穴カルチャープレートにて 5日間共培養した。培養開始後 2 曰目と 4曰目に培養上清の 2 Z 3を新しい培養液と交換した。

4. CTL活性の測定

上記 2で得られた P I HTR/LVHRNL 1 X 10⁶/0.5mlを⁵¹ Cr でラベリングした。 2時間後細胞を洗い、 5mlの培養液に浮遊させた。これを 96穴プレートに 2 X 10⁴Z100 1で分注した。これに、上記 3 にて共培養して得られたマウス脾細胞を 1 X 10⁶/100 1または 2 X 10 VI 00 /1加えた。これらは、それぞれ triplicateで調整した。バックグラウンドぉよび最大放射活性値を測定するため⁵¹ C rでラベリングした P I HTR/L V_HRNLのみ 2 X 10⁴Z200 1で調整したゥェルを、それぞれ 3ゥエルずつ作っておいた。 8時間 37°Cで培養後、培養上清 100〃1をとりバックグラウンドをカウントした。また、最大放射活性値は、細胞をピペッティング後、 100 /1をとつて測定した。

結果を図 1に示す。図 1に示すように、 pL V_HRNLで免疫した系で、エフェクターターゲット（EZT) 比率 10 ： 1、 50 ： 1にて 20〜 25%の killingが特異的にみられた。

実施例 9

遺伝子導入ベクターを投与後、局所に電気パルスを負荷した。導入べクターとしては、 LNRLに LacZ遣伝子を組み込んだ pL ZRNLおよび上記の pL V_HRNLを用いた。マウス（DBAZ2) または KSN ヌードマウスに遺伝子導入ベクターを皮下または皮内に投与して電気パルスをかけた。電気パルスは、 BTX 2000 electroporation unitを用い、電極間の距離を測定し 400〜60 OvZcniの電圧にて 99 //secの間隔で square-wave pulsesで毎秒 1回で 8回連続して負荷した。

このような方法で、 3回免疫し、組織、血清を取って調べた。 pLZR NLを用いた場合においては、導入部位組織を用いて lacZ染色を行い遺伝子の導入された細胞を確認した。 pL V_HRNLを用いる場合においては、 pLV_HRNL20〃gを 1週間ごとに計 3回、 DB AZ2マウスにおける皮下投与、電気パルスを負荷した後、マウス血中の抗 V_H抗体をゥエスタンブロット法により検索した。陽性コントロールとして、上記実施例 6記載の V_Hタンパク質部分、陰性コントロールとして pLRNLを用いた。電気パルス遺伝子導入（PEFGT) の条件としては、電極間の抵抗値は 300〜600Ωで gapは 8〜： L 0 mm、設定電圧は皮下では 200〜 4 00 V、皮内では 400〜600 Vであった。 pLZRNLにおいては、皮内、皮下組織を染色した結果、皮下組織、皮下筋層に青く染色される細胞が見られた。 p L V_HRNLの系においては、 PEFGT法により、マウス血中に抗 V_H抗体を誘導できることを確認し、電気穿孔法による遺伝子導入方法を確立した。また、 Naked D N A法でも同様の結果を得た。以上記載したごとく、本発明によれば、 B細胞性悪性腫瘍の治療に有用な核酸分子が提供される。配列表配列番号： 1

配列の長さ： 26

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA) 配列：

CTGTCGACCA TGGCCGTGTA TTACTG 26 配列番号： 2

配列の長さ： 30

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA) 配列：

AAGTCGACSA GATGCAGCTG STGSAGTCTG 30 配列番号： 3

配列の長さ： 31

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成 D N A )

配列：

AAGTCGACCA TGGTGCAGCT GGTGCAGTCT G 31 配列番号： 4

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A )

配列：

TTCTGCAGTC AGGAGACGGT GACC 24 配列番号： 5

配列の長さ： 153

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CTGTCGACCA TGGCCGTGTA TTACTGTGCA CGGCCGCCAC CGCCCCTCTC AATTGATTAT 60 TGTAGTGGTG GTAGCTTGCC TCTCTCGACG AACAGCTTTG GAGGACTACT CTGGGGCCAC 120 CGCCCCCTGG TCACCGTCTC CTGACTGCAG GAA 153 配列番号： 6

配列の長さ： 101

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CTGTCGACCA TGGCCGTGTA TTACTGTGCG AAAGATCCCC GGGGTAGTAG TACACCTCAG 60 AAGGGCCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCC TGACTGCAGA A 101

配列番号： 7

配列の長さ： 116

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CTGTCGACCA TGGCCGTGTA TTACTGCAAG AGATTAGGGG TAGTGGCTAC GGTCACCTTC 60 TACGGTATGG ACGTCTGGGG CCAAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCTGACT GCAGAA 120 配列番号： 8

配列の長さ： 44

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Ser lie 1 5 10 15

Asp Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Leu Pro Leu Ser Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Gly Gly Leu Leu Trp Gly His Arg Pro Leu Val Thr Val Ser

35 40 配列番号： 9

配列の長さ： 27

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Arg Gly Ser Ser Thr 1 5 10 15

Pro Gin Lys Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 配列番号： 10

配列の長さ： 32

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Leu Gly Val Val Ala Thr Val

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr

20 25 30

Val Ser 配列番号： 11

配列の長さ： 402

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

GTCGACCAGA TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GGAGGCTTGG TACAGCCTGG GGGGTCCCTG 60

AGACTCTCCT GTGCAGCCTC TGGATTCACC TTTAGCAGCT ATGCCATGAG CTGGGTCCGC 120

- 25 - CAGGCTCCAG GGAAGGGGCT GGAGTGGGTC TCAGCTATTA GTGGTAGTGG TGGTAGCACA 180

TACTACGCAG ACTCCGTGAA GGGCCGGTTC ACCATCTCCA GAGACAATTC CAAGAACACG 240

CTGTATCTGC AAATGAACAG CCTGAGAGCC GAGGACACGG CCGTATATTA CTGTGCGAAA 300

GTTGTCCACC TATATTACTA TGATAGTAGT GGTTATTACC CTGGGAACTA CGGTATGGAC 360

GTCTGGGGCC AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTGACTGC AG 402

配列番号： 12

配列の長さ： 128

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45 Trp Val Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys

65 70 75

Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

80 85 90

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Val His Leu Tyr Tyr Tyr Asp

95 100 105

Ser Ser Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

110 115 120 Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

125 配列番号： 13

配列の長さ： 30

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A)

配列：

AAGTCGACCA GATGCAGCTG GTGCAGTCTG 30 配列番号： 14

配列の長さ： 31

配列の型：核酸鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A) 配列：

AAGTCGACSA TGGTGCAGCT GSTGSAGTCT G 31 配列番号： 15

配列の長さ： 27

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A) 配列：

TACCCATACG ATGTTCCAGT TTACGCT 27 配列番号： 16

配列の長さ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5

Claims

請求の範囲

1. ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞に特異的な免疫グロブリン分子の（H) 鎖可変部領域（V_H) の相補性決定領域（CDR) I I I部分を含有する V_Hタンパク質を発現可能な B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子。

2. 下記工程により製造することのできる請求項 1記載の核酸分子。

(a) ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞より核酸を分離する工程、

(b) 得られた核酸を逆転写し、 cDNAを調製する工程、

(c) 免疫グロブリンの V_Hの CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質をコードするイディォタイプ遺伝子の上流および下流に存在する保存領域の一部を含有する核酸断片をプライマーとして用いて PCRを行い、増幅し、増幅された免疫グロプリン分子の V_Hイディォタイプ遺伝子を単離する工程、および

(d) 単離されたイディォタイプ遺伝子を発現ベクターに連結し、 B細胞性悪性腫瘍治療用 D N A分子を構築する工程。

3. CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質が配列番号 8〜10および 12から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項 1 記載の核酸分子。

4. PCRにおいて使用される核酸断片が、配列番号 1および 4、配列番号 2および 4、配列番号 3および 4、配列番号 13および 4、配列番号 14および 4でそれぞれ表される一対の核酸断片から選択される一対の核酸断片である請求項 2記載の核酸分子。

5. 発現ベクターがレトロウィルスベクター由来の発現ベクターである請求項 2記載の核酸分子。

6. ィー · コリ（E. coli) にて生産する請求項 2記載の核酸分子。

7. in vitroにて transcription 法にて生産する請求項 2記載の核酸分子。

8. ウイルス粒子産生細胞にて生産する請求項 2記載の核酸分子。

9. 下記工程からなることを特徴とする B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子の製造方法。

(a) ヒト B細胞性悪性腫瘍細胞より核酸を分離する工程、

(b) 得られた核酸を逆転写し、 cDNAを調製する工程、

(c) 免疫グロブリンの V_Hの CDR I I I部分を含有する V_Hタンパク質をコードするイディォタイプ遺伝子の上流および下流に存在する保存領域の一部を含有する核酸断片をプライマーとして用いて、 PCRを行い、増幅し、増幅された免疫グロプリン分子のイディォタイプ遺伝子を単離する工程、

(d) 単離されたイディォタイプ遺伝子を発現べクタ一に連結し、 B細胞性悪性腫瘍治療用 DN A分子を構築する工程、および

(e) B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子を製造する工程。

10. PCRにおいて使用される核酸断片が、配列番号 1および 4、配列番号 2および 4、配列番号 3および 4、配列番号 13および 4、配列番号 14および 4でそれぞれ表される一対の核酸断片から選択される一対の核酸断片である請求項 9記載の製造方法。

11. 発現ベクターがレトロウィルスベクタ一由来の発現べクタ一である請求項 9記載の製造方法。

12. B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子をィー，コリ（E. coli) で製造する請求項 9記載の製造方法。

13. B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子を in vitro transcription 法にて製造する請求項 8記載の製造方法。

1 4. B細胞性悪性腫瘍治療用核酸分子をウィルス粒子産生細胞にて生産する請求項 9記載の製造方法。

1 5. 請求項 1記載の核酸分子を有効成分とする医薬組成物。

1 6. 請求項 1記載の核酸分子を含有するウィルス粒子を有効成分とする医薬組成物。

1 7. 請求項 1記載の核酸分子が発現するタンパク質。

1 8. 請求項 1記載の核酸分子の、 B細胞性悪性腫瘍治療用医薬組成物の製造における使用。

1 9. 請求項 1 7記載のタンパク質の、 B細胞性悪性腫瘍に対する免疫活性検査用試薬の製造における使用。

2 0. 請求項 1記載の核酸分子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを特徴とする B細胞性悪性腫瘍を治療する方法。

2 1 . 請求項 1記載の核酸分子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを特徴とする細胞性免疫増強方法。