WO1996032412A1 - PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a) - Google Patents

PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a) Download PDF

Info

Publication number
WO1996032412A1
WO1996032412A1 PCT/JP1996/001028 JP9601028W WO9632412A1 WO 1996032412 A1 WO1996032412 A1 WO 1996032412A1 JP 9601028 W JP9601028 W JP 9601028W WO 9632412 A1 WO9632412 A1 WO 9632412A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glu
peptide
ser
amino acid
asp
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/001028
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kouji Matsushima
Yuji Ishikawa
Kouji Kuno
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to US08/930,605 priority Critical patent/US5981486A/en
Priority to AU52895/96A priority patent/AU5289596A/en
Priority to EP96909371A priority patent/EP0867448A4/en
Publication of WO1996032412A1 publication Critical patent/WO1996032412A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to peptides that can suppress phosphorylation of IcB, and more particularly, to peptides useful as anti-inflammatory agents and immunosuppressants.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • B a region consisting mainly of 10 bases, called B, was part of the enhancer. It was found to promote transcriptional activity of the gene. Binding of this region to the transcription regulatory protein, nuclear factor ⁇ B (NF ⁇ factor), promotes transcription of the gene downstream of the B region (Gilmore, T & Morin PJ Trends in Genetics (1993) 9, 427-432) o
  • NF / B is a heterodimeric or homodimeric transcription factor consisting of two subunits (p50, p65) and is induced by various stimulations. To date, it has been presumed to be involved in the transcriptional activation of more than 20 genes (Baeuerle, PA Biochim. Biophys. Acta (1991) 1072, 63-80).
  • NF / c B is available from sites such as Interlokin_8, Interlokin-1S, Tumor Loan Death Factor (TNF)-Interleukin-6, Interleukin-2, etc.
  • cycloxygenase-2 (Ku jububu), an enzyme involved in the synthesis of metabolites of the inflammatory mediator arachidonic acid cascade , DA et al., J. Biol. Chem. (1991) 266, 12866-12872) or 5-lipoxygenase (5-1 ipoxygenase) (Hosh iko, S. et al., Pro Nat. 1. Acad. Sci. USA (1990) 87, 9073-9077, Chopra, A. et al.,
  • NF / cB binds to protein 1cB, which suppresses the function of NF ⁇ B, and its activation is suppressed (Inoue, Jl. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 4333-4337, Hatada, E. et al., EMBO (1993) 12, 2781-2788).
  • IKB does not only suppress the binding of NF / cB to DNA, but also suppresses the translocation of NF / cB into the nucleus (Baeuerle, PA & Baltimore, B. Science (1988) 242, 540-546 ). It has been shown that I / cB ⁇ is phosphorylated in response to a stimulus such as TNFa.
  • NF / cB translocates into the nucleus and binds to the binding site on DNA, The transcription of the downstream gene is activated (Baeuerle, PA Biochim. Biophys. Acta (1991) 1072, 63-80).
  • NFcB the above-mentioned mechanisms are known, but enzymes or sites that phosphorylate NFcB and I ⁇ B ⁇ in vivo are described in more detail. The mechanism was not disclosed. Disclosure of the invention
  • steroid agents have been used as anti-inflammatory agents. Steroids have the risk of inducing susceptibility to infection, diabetes, and cataracts as side effects. Nucleic acid synthesis inhibitors are used as immunosuppressants. Nucleic acid synthesis inhibitors have side effects such as suppression of bone marrow function, liver damage, infectivity, and digestive disorders. Therefore, development of a drug having no such side effects has been desired.
  • the present invention provides a peptide having an amino acid sequence corresponding to the phosphorylation site of Ia, and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the plasmid pGST-MD containing the glutathione-S trans-ferase (GST) gene into which DNA encoding full-length human 1 1Ba has been introduced. is there.
  • GST glutathione-S trans-ferase
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing fusion proteins of various constructed partial deletion 1 / cBa mutants and GST.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the amino acid sequence of the acidic region present at the C-terminus of the mutant having I / cBa and substitution 1 / cB. Each symbol is an amino acid represented by a single letter code.
  • Figure 4 shows the phosphorylation of each fusion protein with GST of the full length 1Ba (wt), mutant de9, del-10, del-1, del-5 and del-4 in the solid phase. It is an electrophoresis diagram examined by Trocainace Atsushi o
  • FIG. 2 is a diagram of electrophoresis examined by vitro kinase assay.
  • Figure 7 shows the degree of phosphorylation of each amino acid-substituted peptide by the partially purified 1 / cB ⁇ phosphatase (Kinase). Relative oxidation (%) is shown for each peptide-added group when the positive control (full-length I / cB ⁇ -added group) is 1003 ⁇ 4.
  • FIG. 8 shows the peptide at the phosphorylation site of I ⁇ (I / cB substrate), the casein kinase substrate (CK11 substrate), and the mapkinase substrate (MAPK).
  • FIG. 6 is a diagram showing gel shift at the time of adding a substrate).
  • the phosphorylation site of 1 / c B is the sequence-Ser (288) -Tyr (289) -Asp (290) of the amino acid sequence of the protein.
  • -It is estimated to be Ser (288), Thr (291) and Ser (293) in Thr (291) -Glu (292) -Ser (293) -Glu (294)-. Therefore, the present invention has an amino acid sequence corresponding to the phosphorylation site of I ⁇ B ⁇ ,
  • the peptide capable of inhibiting the phosphorylation of ⁇ is composed of an amino acid sequence Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser (referred to as “core amino acid sequence”), Alternatively, it comprises the core amino acid sequence.
  • amino acid sequence is extended by an amino acid or a peptide. It is a thing.
  • Amino acids or peptides that extend the N-terminus and the C- or C-terminus are those whose peptides inhibit the phosphorylation of I / cB ⁇ . Any amino acid or peptide may be used.
  • the amino acid or peptide extending the -terminal side and / or the C-terminal side of the core amino acid sequence is one amino acid. In the sequence, it is adjacent to the core amino acid sequence. This means that the peptide consisting of the core amino acid sequence and the terminal amino acid or amino acid sequence extending it forms part of the amino acid sequence of IcB ⁇ . It means that you are doing.
  • the amino acid sequence within 1 / c ⁇ is Met (279) -Leu (280)-Pro (281) -Glu (282)- Ser (283) -Glu (284) -Asp (285) -Glu (286) -Glu (287) -Ser (288) -Tyr (289) -Asp (290) -Thr (291) -Glu (292) -Ser (293) -Glu (294) -Phe (295) -Thr (296) -Glu (297) -Phe (298) -Thr (299) -Glu (300) -Asp (301) -Glu (302) -Leu (303) is a sequence consisting of a part of this sequence and having the following N-terminal and C-terminal.
  • the peptides having the amino acid sequence as described above include, for example, the following peptides.
  • a peptide containing the amino acid sequence Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser (SEQ ID NO: 4)
  • the peptide of the present invention has such advantages that as its size becomes shorter, immunogenicity in a human body decreases, and the peptide becomes more difficult to be degraded by in vivo protease.
  • Met is methionine
  • Leu is leucine
  • Pro proline
  • Glu is glutamic acid
  • Ser is serine
  • Asp is aspartic acid
  • Tyr is tyrosin.
  • Thr is threonine
  • Phe is fenalara
  • the amino acid is in the L-form.
  • the peptide of the present invention may have substitution, deletion and no or insertion of the above amino acid sequence as long as it can suppress phosphorylation of the amino acid.
  • Substitutions, deletions and Zs or insertions are subject to amino acids Tyr, Asp and Glu which are not subject to phosphorylation in the core sequence. Is one or two. It is preferred, however, that no alterations have been made within the core sequence by substitutions, deletions and modifications or insertions.
  • the number of amino acids that can be changed by substitution, deletion, Z or insertion in a portion other than the core sequence is one or more, and preferably, all but the core portion of the peptide. It is less than half the number of amino acids, more preferably less than 303 ⁇ 4, more preferably less than 20X, for example less than 10X.
  • modification refers to modification of the structure of the amino acid itself constituting the peptide, crosslinking between adjacent or non-adjacent amino acid residues in the peptide, modification of the peptide bond, Modification of peptide basic skeleton, introduction of side chain functional group, cyclization, introduction of spacer, etc. (Giannis, A. & Kolter, T. Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. (1993) 32, 1244-1267).
  • the salt of the above peptide may be any of pharmacologically acceptable acid addition salts and base addition salts.
  • the acid (inorganic acid and organic acid) addition salts include inorganic acid addition salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, and nitrate, acetate, benzoate, and maleate. , Fumarate, succinate, tartrate, citrate, oxalate, metasulfonate, toluenesulfonate, aspartate, glutamate, etc.
  • Bases include, for example, sodium salts, potassium salts, calcium salts. Includes inorganic base addition salts such as platinum salt, and organic base addition salts such as pyridine salt, triethylamine salt, and lysine salt.
  • the peptide of the present invention can be used by a method generally used for peptide synthesis, for example, a liquid phase method or a solid phase method (Peptide and Protein Drug Delivery, Shiee, VH, Ed., Marcel Dekker , Inc., U.S.A., Pharmaceutical Biotechnology, Borchardt, RT et al., Ed., Prenum Press, New York and London) 0
  • a method generally used for peptide synthesis for example, a liquid phase method or a solid phase method
  • Peptide and Protein Drug Delivery Shiee, VH, Ed., Marcel Dekker , Inc., U.S.A., Pharmaceutical Biotechnology, Borchardt, RT et al., Ed., Prenum Press, New York and London
  • Two types of fragments that are bisected at any position of peptide bonds using these methods A raw material having a reactive carboxyl group corresponding to one of the above and a raw material having a reactive amino group corresponding to the other fragment are conden
  • protecting groups Functional groups that should not take part in the reaction in this reaction step are protected by protecting groups.
  • the amino-protecting group include benzyloxycarbonyl, tributyloxycarbonyl, p-biphenylisopropoxypyroxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl and the like.
  • the carboxyl group-protecting group include, for example, groups capable of forming an alkyl ester and a benzyl ester.
  • the C-terminal carboxyl group is a chloromethyl resin, an oxymethyl resin, or the like. It is bound to carriers such as P-alkoxybenzyl alcohol resin.
  • an N-protected amino acid active ester or a peptide active ester can be used in the presence of a condensing agent such as carbodiimide.
  • a condensing agent such as carbodiimide.
  • the peptides of the present invention can be produced using genetic engineering techniques (see Peptide and Protein Drug Delivery and
  • an oligonucleotide which encodes a desired amino acid sequence is synthesized by a conventional method. Then, after assembling by PCR or the like, this is introduced into an appropriate expression vector. The appropriate host cells are then transformed with the expression vector.
  • the nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention contains a FLAG peptide (see WO88-04692).
  • ⁇ Human immunoglobulin constant region (W094-28027, Ellison, J. et al., DNA (1981) 1, 11-18, Krawinkel, U. et al., EMBO J. (1982) 1, 403 -407 etc.) may be added and expressed.
  • any expression system eukaryotic cells, eg, animal cells, eg, established mammalian cell lines, fungal cells, and yeast cells, and prokaryotic cells, eg, bacterial cells, eg, E. coli, Cells and the like can be used.
  • the peptides of the present invention are expressed in mammalian cells, eg, COS cells, CH0 cells.
  • conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used.
  • the human cytomegalovirus immediate early promoter promoter can be used.
  • promoters for gene expression in mammalian cells include letrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) and the like.
  • SV40 simian virus 40
  • a promoter derived from a mammalian cell such as the virus promoter of the human polypeptide such as the human polypeptide promoter-la (HEF-1a). I just need.
  • the expression vector was selected as a phosphotransferase ⁇ ⁇ ⁇ (3 ') 11 or 1 (neo) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli, as a selection marker. It can contain xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene, etc.
  • the peptide of the present invention is purified according to a usual method. For example, ion exchange chromatography, reversed-phase liquid chromatography, affinity chromatography, and the like can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the peptide thus obtained can be identified by sequence analysis using a protein sequencer and acid species analysis using an amino acid analyzer.
  • the peptide of the present invention comprises a phosphorylation site such as IcB, and may have amino acid substitutions, deletions and insertions as long as the phosphorylation inhibitory action such as 1cB is maintained.
  • a phosphorylation site such as IcB
  • a lipid-soluble substance such as a steroid compound or a compound having a benzene ring
  • cell membrane permeability can be imparted.
  • the peptide of the present invention can be used by encapsulating it in a ribosome for permeation of the peptide of the present invention into cell membranes (see Peptide and Protein Drug Delivery, Pharmaceutical Biotechnology described above).
  • an oligonucleotide encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention is synthesized by a conventional method, and is introduced into an appropriate expression vector capable of expressing the same.
  • peptide of the present invention in the living body (W094-27643, W092-20316, JP-A-6-303987, US5166320, W092-19749, WO92 -20316 etc.).
  • gene therapy using the peptide of the present invention ex vivo is also possible. That is, blood cells such as lymphocytes are removed from a living body, the cells are transformed with the above expression vector, and the transformed cells are returned to the living body. (See JP-A-6-329559).
  • the peptide of the present invention has an inhibitory effect on phosphorylation, and is considered to suppress the expression of inflammatory site force genes, inflammatory mediator genes, and release of the gene products.
  • the peptide of the present invention targets the suppression of the phosphorylation of I ⁇ present in cells and directs the suppression of the activation of NF / cB, so that the effect is specific. Presumed.
  • the peptide of the present invention can be used as an anti-inflammatory agent to produce various inflammatory diseases such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, psoriasis, gout, nephritis, and inflammation.
  • various inflammatory diseases such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, psoriasis, gout, nephritis, and inflammation.
  • Colitis myocardial infarction, asthma, Mediterranean fever, Crohn's disease, adult respiratory distress syndrome, emphysema, cystic fibrosis, irritable pneumonia, tuberculous pleural effusion, cancerous pleural effusion, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, diffuse It is effective for the treatment of pancreatic bronchiolitis, esophageal cancer surgery, ischemia-reperfusion injury, etc.
  • the peptide of the present invention as an immunosuppressant, it is effective in suppressing rejection during bone marrow transplantation, organ transplantation and the like.
  • the administration route of the peptide of the present invention includes oral administration and parenteral administration. Either one may be used, but parenteral administration is particularly preferred. Parenteral administration includes injection, rectal administration, transdermal administration, and pulmonary administration. The dose of the peptide of the present invention varies depending on the administration method, patient's symptoms, age, etc.
  • the usual daily dose of 0.001-1000 mg, preferably 0.01-10 mg, can be administered in 1 to 4 divided doses per day.
  • the peptide of the present invention is usually administered as a preparation prepared by mixing with a carrier and excipients for the preparation (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA ).
  • a carrier and excipients for the preparation substances that are commonly used in the field of pharmaceutical preparations and do not react with the peptide of the present invention are used.
  • the carriers and excipients for the preparation substances that are commonly used in the field of pharmaceutical preparations and do not react with the peptide of the present invention are used.
  • hydrochloric acid, sodium hydroxide, sodium lactate, an emulsion, monohydrogen phosphate may be used, if necessary.
  • a pH adjuster such as sodium and sodium dihydrogen phosphate
  • a tonicity agent such as sodium chloride and glucose
  • lecithin, polysorbitol 80, polyoxyethylene hardened castor oil and the like can be added and emulsified in water to give an injectable emulsion.
  • a suppository base such as cocoa butter, a fatty acid tri, di, monoglyceride, or polyethylene glycol, in addition to the peptide of the present invention, which is an active ingredient, May be dissolved by humidification and poured into a mold to cool, or may be covered with a gelatin film dissolved in polyethylene glycol, soybean oil, or the like.
  • transdermal preparation In order to manufacture a transdermal preparation, if necessary, in addition to the active ingredient peptide of the present invention, white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol, etc. Or humidify and knead to make an ointment After kneading with a pressure-sensitive adhesive such as rosin, rosin or alkyl acrylate polymer, it is spread on a non-woven fabric such as polyethylene to form a tape.
  • a pressure-sensitive adhesive such as rosin, rosin or alkyl acrylate polymer
  • the peptide of the present invention which is an active ingredient, is dissolved or dispersed in a usual propellant and filled in a pressure-resistant container to prepare an aerosol.
  • a sustained-release preparation can be prepared by using known ribosome technology and the like.
  • the above-mentioned preparations may contain other components that are effective in treating the target disease.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the obtained total RNA was designated as type I, and the above primers GMD5 and GMD3 were ffl-reduced to obtain a reverse transcriptase (reverse transcriptase).
  • the PCR (polymerase chain reacton) method was used to obtain full-length human IcB cDNA.
  • the obtained full-length human 1cBa cDNA was converted to a plasmid vector PGENT2 (Gurakami, S., et al., J. Biol. Che.) Containing a glutathione-S-transferase (GST) gene.
  • PGENT2 Guardami, S., et al., J. Biol. Che.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the plasmid pGST-MD.
  • DNAs encoding the fusion proteins of GST and the six types of partial deletion mutants of B ⁇ were constructed. Each primer has a nucleotide sequence corresponding to each deletion site.
  • the primers GMD5 (SEQ ID NO: 5) and GMD6 (SEQ ID NO: 7) were used to bind to the DNA encoding the mutant de1 consisting of amino acid 1-242 of human I ⁇ , respectively. Designed to define the 3 'side.
  • the primer GMD5 (SEQ ID NO: 5) and the primer GMD7 (SEQ ID NO: 8) are located on the 5 'side of each DNA encoding the mutant de 2 consisting of the amino acid 1-181 of human I ⁇ B ⁇ . And designed to define the 3 'side.
  • Primer GMD52 (SEQ ID NO: 9) and primer GMD3 (SEQ ID NO: 6) were used to encode a DNA encoding a mutant de4 consisting of amino acid 73 (1st ankirin repeat) -317 of human 1 ⁇ - ⁇ . It was designed to define the 5 'and 3' sides, respectively.
  • the primer GMD53 (SEQ ID NO: 10) and the primer GMD3 (SEQ ID NO: 6) are DNAs encoding the mutant deto 5 consisting of human IB human amino acid 182 (3rd ankirin repeat) -317. Each was designed to define the 5 'and 3' sides.
  • Primer GMD5 (SEQ ID NO: 5) and primer GMD9 (SEQ ID NO: 11) are the 5'-side and the 5'-side of the DNA encoding the mutant de 9 consisting of the amino acid 1-295 of human 1B, respectively. Designed to define the 3 'side.
  • Each primer was designed so that a restriction enzyme cleavage site by EcoR I or BamHI was introduced on the 5 'side.
  • PCR was performed using the respective primer pairs defining the 5 ′ and 3 ′ sides.
  • DNAs encoding the obtained mutants were introduced into EcoRl and BamHl cleavage sites of plasmid vector pGENT2.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of each mutant was confirmed using the method of Sanger, F. et al.
  • Figure 2 schematically shows the structure of each mutant.
  • Seran at position 283, serine at position 288, threonine at position 291, serine at position 293, threonine at position 296, and threonine at position 298 in the C-terminal acidic region are all substituted with alanine I / c ⁇
  • An animal cell expression vector pRC / CMV (Ernst, M. ⁇ , et al., Mol. Cell. Biol. (1995) 872-882) containing DNA encoding ⁇ - mtK. Then, PCR was performed using primers GMD5 and GMD3 specific to the base codons near the start codon and the stop codon of iBa cDNA.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the acidic region of I c Ba -mutant K.
  • Each of the expression vectors obtained in (1), (2) and (3) was expressed in Escherichia coli to obtain a GST-I ⁇ fusion protein.
  • E. coli JM109 was transformed with each expression vector, and then cultured in a 2 ⁇ ⁇ culture medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 50 g / ml ampicillin.
  • ImM isopropyl thiogalactoside IPTG, manufactured by Wako Pure Chemical Industries was added to the culture solution, stimulated, and cells were harvested 2-3 hours later.
  • the supernatant was further centrifuged at 18000 xg for 35 minutes at 4 ° C, and the supernatant was dialyzed against 20 mM Tris buffer (pH 7.5) at 4 ° C for 4 hours to obtain a crude fraction.
  • Red-A Sepharose column AMIC0N, bed volume 5 ml
  • NaCl such as 0 M, 0.5 M and 2 M
  • the concentration was increased stepwise and eluted and separated.
  • the fraction eluted with 2M NaCl was dialyzed against 20 mM Tris buffer (pH 7.5) at 4 ° C for 4 hours.
  • Dimethylaminoethyl (DEAE) equilibrated with 20 mM Tris buffer (pH 7.5) 0M, 0.1M, 0.25M in DEAE-Sephacel column, Pharmacia, bed volume 20ral , 0.5M, 2M, etc., the NaCl concentration was increased stepwise and eluted and separated. The fraction eluted with 0.25 M NaCl was diluted with 20 mM Tris buffer (pH 7.5) 4. C. After dialysis for 4 hours, elution was performed at a rate of 1 ml / min by DEAE-HPLC (Bio Gel DEAE-5PW, Bio Rad) equilibrated with 20 mM Tris buffer ( ⁇ 7.5).
  • DEAE-HPLC Bio Gel DEAE-5PW, Bio Rad
  • a linear concentration gradient of 0-0.5M NaCl was applied from 10 minutes to 70 minutes after the start of elution, and fractionation was performed in 2 ml portions.
  • the activity of the obtained kinase was determined by the in vitro kinase assay in a solid phase using glutathione sepharose to which GST-I ⁇ B ⁇ was bound (in vitro kinase assay, see Example 1 (1)).
  • the amount of protein was measured by using Coomassie Protein Reagent (PIERCE), and using serum albumin (BSA) as a standard.
  • PIERCE Coomassie Protein Reagent
  • BSA serum albumin
  • the phosphorylation activity against o to 1 mm was measured by Invitrokine Atsushi.
  • Each fusion protein and glutathione Sepharose beads (Pharmacia) prepared in Reference Example 1 were added at 4 ° C for 2 hours.
  • ICB is not generated due to the presence of a phosphorylation site in the region where the amino acid sequence of mutant de10 and de9 differs, and the amino acid substitution present in the substitution mutant mtK. Is no longer susceptible to phosphorylation.
  • a peptide at the I / cB ⁇ phosphorylation site having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was synthesized using a peptide synthesizer and purified by reverse-phase HPLC. The sequence was confirmed with an amino acid analyzer. Using this peptide,
  • the phosphorylation activity of I ⁇ B ⁇ was measured.
  • the “/ cBa” phosphorylation inhibitory peptide (SEQ ID NO: 1) created in Example 1 (2) was used.
  • the in vitro kinase assay was performed using a peptide in which one amino acid residue was substituted.
  • Unstimulated THP-1 cells were cultured under the conditions described in Test Example 2. According to the method of Sado wski, H. B. et al., (Nature (1993) 362, 79-83), a cytoplasmic fraction and a cell membrane-rich fraction were prepared from THP-1 cells. Both fractions of each 20 / were combined and added with 15 nM 1B a phosphorylation site peptide, 10 mM ATP and 20 g / ml LPS, and stimulated at 30 ° C for 10 minutes.o
  • Figure 8 shows the results of gel shift atssie.
  • the phosphorylation of 1 cB ⁇ was suppressed, resulting in NF / cB No activation was observed.
  • Fig. 9 shows the results of analysis and quantification using an image analyzer. In the group to which the peptide at the I- ⁇ -phosphoryl oxidation site was added, the activation of NF / c B was clearly suppressed.
  • inflammatory diseases such as multiple sclerosis and systemic erythematosus, inflammatory cytokines such as rejection during bone marrow transplantation and organ transplantation, and inflammatory mediators are involved.
  • an anti-inflammatory agent and an immunosuppressant which are effective for treating diseases.
  • the anti-inflammatory agent and the immunosuppressive agent provided by the present invention are transcribed by NF / cB by inhibiting the phosphorylation of IcB ⁇ by a peptide or a salt thereof contained as an active ingredient. By administering this to a patient with the above-mentioned disease to inhibit the activating effect, the disease can be alleviated.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明 細 書
I κ B α リ ン酸化抑制ペプチ ド 技術分野
本発明は I c B のリ ン酸化を抑制し得るペプチ ドに関し、 より 詳しく は、 抗炎症剤、 免疫抑制剤と して有用なペプチ ドに関する。 背景技術
抗体 / 型軽鎖ゃヒ ト免疫不全ウィルス （HIV ) -1のェンハ ンサー 領域におけるタ ンパク結合部位の分析により、 B と呼ばれる、 主 に 10塩基からなる領域がェンハンサ一の一部と して遗伝子の転写活 性を促進することが明らかとなった。 この領域に転写調節タ ンパク であるヌ ク レア一ファクター / c B (nuclear factor κ B: NF κ Β ) が結合すると B 領域の下流に存在する遗伝子の転写が促進される (Gilmore, T. & Morin P. J. Trends in Genetics (1993) 9, 427- 432 ) o
プレ B 細胞系の 70Z/3 細胞およびヒーラ （Hela) 細胞を用いた研 究により、 これらの細胞は細胞質に DNA 結合活性を有さない NF c B を含んでおり、 ホルボールエステルの刺激により、 DNA 結合活性の 抑制が解除され、 核内へ移行することが知られていた （Baeuerle, P. A. & Baltimore, D. Cell (1988) 53, 211-217 ) 。
NF / B は、 二つのサブュニッ ト （p50 、 p65 ) からなるヘテロダ ィメ リ ッ クあるいはホモダイメ リ ッ クな転写因子であり、 種々の刺 激により誘導される。 現在までに、 20以上の遺伝子の転写活性化に 関与していると推測されている （Baeuerle, P. A. Biochim. Biophy s. Acta (1991) 1072, 63-80) 。 NF/c B は、 イ ンタ一ロ イ キン _8、 イ ンタ一ロ イ キ ン- 1 S、 腫瘍壌 死因子 （TNF ) - . イ ンタ一ロイキン- 6、 イ ンターロイキン -2等 のサイ ト力イ ン遺伝子のほか、 炎症性のメディエーターであるァラ キ ドン酸カスケ一 ドの代謝産物の合成系に係わる酵素である シク ロ ォキシ ジ エネ一ス- 2 ( cycl ooxygenase-2) (Ku jubu, D. A. et al. ， J. Biol. Chem. (1991) 266, 12866-12872) あるいは 5-リ ポキシ ジエ ネ一ス ( 5- 1 i poxygenase) ( Hosh i ko, S. et al. , Pro Nat 1 . Acad. Sci. U. S.A. (1990) 87, 9073-9077, Chopra, A. et al. ,
Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 185, 489-495 ) 、 さ ら に ELAM - 1 (endothelial leukocyte adhesion molecule - 1 ) ( Hoof t van Hui jsdui jnen, R. et al. , J. Biol. Chem. (1992) 267, 22 385-22391 ) VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule - 1 ) ( la demarco, . F. et al. , J. Biol. Chem. (1992) 267, 16323-1632 9 ) などの接着因子の遺伝子の上流にも存在し、 これら遺伝子の転 写制御に関与していると考えられる。
現在使用されている抗炎症剤であるステロイ ド （Mukaida, N. et al. , J. Biol. Chem. (1994) 269, 13289-13295) または強力な免 疫抑制剤である FK-506 (Okamoto, S. -i. et al. , J. Biol. Chem.
(1994) 269, 8582-8589) の作用が、 少なく と も NF c B の活性化抑 制に係わるこ とが示唆されている。 細胞質において、 NF/c B は、 NF κ B の機能を抑制するタ ンパク 1 c B と結合して活性化が抑制さ れている （ Inoue, J-l. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 92) 89, 4333-4337 、 Hatada, E. et al. , EMBO (1993) 12， 2781- 2788) 。
Zabel, U. らは、 ヒ ト胎盤から 37kDa の均質タ ンパク と して I κ Β αを単離したこ とを報告し （Cell (1990) 61， 255-265 ) 、 次い で、 ヒ ト 1 B の cDNAが単離された （Sporn, S. A. et al. , J. 1 mmunol. (1990) 144， 4434-4441 、 Haskill, S. et al. , Cell (19 91) 65, 1281-1289 、 WO 92-20795 等参照） 。
I K B なは、 NF/c B の DNA に対する結合を抑制するだけでなく、 NF/c B の核内への移行も抑制する （Baeuerle, P. A. & Baltimore, B. Science (1988) 242, 540-546 ) 。 I /c B αは、 TNF a等の刺 激に反応してリ ン酸化されることが明らカ、にされている。
このような I c B aのリ ン酸化あるいは分解、 または NF B の構 成タ ンパクのリ ン酸化等により、 NF/c B は核内へ移行し、 DNA 上の 結合部位に結合し、 次いで、 下流に存在する遺伝子の転写が活性化 される (Baeuerle, P. A. Biochim. Biophys. Acta (1991) 1072, 6 3-80) 。 NF c B の活性化に際しては、 上記のようなメ カニズムが知 られているが、 NF c B 、 I κ B αを生体内においてリ ン酸化する酵 素群あるいはリ ン酸化部位、 さらにその詳細なメカニズムについて は明らかにされていなかった。 発明の開示
これまで、 抗炎症剤と してはステロイ ド剤等が使用されている。 ステロイ ド剤には副作用と して易感染性、 糖尿病、 白内障などを誘 発する危険性がある。 免疫抑制剤と しては、 核酸合成阻害剤等が使 用されているが、 核酸合成阻害剤には骨髄機能抑制、 肝障害、 易感 染性、 消化器障害などの副作用がある。 従って、 このような副作用 を有さない薬剤の開発が望まれていた。
本発明の目的は、 炎症性サイ トカイ ン、 炎症性メディエーターの 遺伝子発現、 さ らにはそれらの遺伝子産物の遊離を特異的に抑制す るための、 I c Β αのリ ン酸化部位からなる、 I Β な のリ ン酸化 抑制作用を有するペプチ ドを提供することである。
本発明者らは、 NF/c B の活性化のメカニズムを研究する過程にお いて、 I /c B αの部分欠失変異体および置換変異体を用いるこ とに より 1 /c B aのリ ン酸化部位を特定するに至った。 さ らに、 該リ ン 酸化部位に相当するア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドを I B aと共 存させることにより、 I c B aのリ ン酸化が抑制され、 したがって NF/c B の活性化が抑制されることを見出した。
従って本発明は、 I Β aのリ ン酸化部位に対応するア ミ ノ酸配 列を有するぺプチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩を提供す る。 図面の簡単な説明
図 1 は全長ヒ ト 1 Λ B aをコー ドする DNA を導入した、 グルタチ オン- Sトラ ンスフ エ レース （GST ) 遺伝子を含有するプラス ミ ド pG ST-MD を摸式的に表した図である。
図 2 は各種の構築した部分欠失 1 /c B a変異体と GST の融合タ ン パクを摸式的に表した図である。
図 3 は I /c B aおよび置換 1 /c B な変異体の C 末端に存在する酸 性領域のァ ミ ノ酸配列を摸式的に示した図である。 各記号は、 一文 字標記により表されたア ミ ノ酸である。
図 4 は固相において全長 1 B a (wt) 、 変異体 de卜 9 、 del-10 、 del-1 、 del- 5 および del -4 の GST との各融合タンパクのリ ン酸 化をィ ンビ トロカイネースアツセィにより調べた電気泳動の図であ る o
図 5 は液相において全長 I c B (wt) 、 変異体 de卜 9 、 del-10 、 del-1 および置換変異体 （mt- K) の GST との各融合タ ンパクの リ ン酸化をィ ンビ トロカイネースアツセィにより調べた電気泳動の図 である。
図 6 は 1 κ B のリ ン酸化部位のペプチ ド （1 c B カイネース 基質） およびコ ン トロールのぺプチ ドであるカゼィ ンカイネース基 質 （CKII substrate) とマップカイネース基質 （MAPK substrate) を添加した時のイ ンビ トロカイネースア ツセィにおける I Β なの リ ン酸化状態を示す図である。 コ ン ト ロール （ぺプチ ド非添加群） を lOO! こしたときの各処理群のリ ン酸化を相対比で表している （π = 3 )
図 7 は部分精製した 1 /c B αのリ ン酸化酵素 （カイネース） によ る各ア ミ ノ酸置換ペプチ ドの リ ン酸化の程度を示した図である。 陽 性コ ン ト ロール （全長 I /c B α添加群） を 100¾と したときの各ぺプ チ ド添加群のリ ン酸化を相対比 （％) で表している。
図 8 は I κ Β αのリ ン酸化部位のペプチ ド （ I /c B ひカイネース 基質） およびコ ン ト ロールのぺプチ ドであるカゼイ ンカイネース基 質 （CK11 substrate) とマップカイネース基質 （MAPK substrate) を添加した時のゲルシフ トア ツセィを示す図である。
図 9 は I c B なのリ ン酸化部位のペプチ ド （ I A B K ) および コ ン トロールのペプチ ドであるカゼイ ンカイネース基質 （CKII) と マツブカイネース基質 （ MAPK) を添加した時のゲルシフ トア ツセィ をイメ ージアナライザーで解析、 定量した図である。 LPS( + )/ ぺブ チ ド非添加群を 100¾iと したときの各処理群の相対比を示す （n = 4 )
具体的な説明
実施例 1 ( 2 ) から明らかなごと く 、 1 /c B の リ ン酸化部位は 、 該蛋白質のア ミ ノ酸配列の内、 配列- Ser(288)- Tyr(289)-Asp(290 ) - Thr(291)-Glu(292)-Ser(293)-Glu(294)-における Ser(288), Thr( 291)および Ser(293)であると推定される。 従って、 本発明において 、 I κ B αのリ ン酸化部位に対応するア ミ ノ酸配列を有し、 I /c B αのリ ン酸化を阻害するこ とができるべプチ ドは、 ァ ミ ノ酸配列 Se r-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser( 「コアーァ ミ ノ酸配列」 と称する） から成 る もの、 またはこのコア一ア ミ ノ酸配列を含んでなる ものである。 このア ミ ノ酸配列を含んで成る、 とは、 このア ミ ノ酸配列の N— 末端側も し く は C一末端側、 またはその両方が、 ア ミ ノ酸またはべ プチ ドにより延長されたものである。 この N—末端およびノまたは C一末端を延長するア ミ ノ酸またはペプチ ドと しては、 それらを含 んで構成されるペプチ ドが I /c B αのリ ン酸化を阻害する ものであ ればいかなるア ミ ノ酸またはべプチ ドであってもよい。
しかしながら、 本発明の好ま しい態様によれば、 前記のコアーァ ミ ノ酸配列の Ν—末端側および または C—末端側を延長するア ミ ノ酸またはペプチ ドは、 1 Β な のア ミ ノ酸配列にあって前記コア 一ア ミ ノ酸配列に隣接する ものである。 このことは、 コアーァ ミ ノ 酸配列とそれを延長する末端ア ミ ノ酸またはア ミ ノ酸配列との全体 から構成されるペプチ ドが I c B αのア ミ ノ酸配列の 1部分を成し ているこ とを意味する。
この様なア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドと しては、 1 /c Β な中の 了 ミ ノ酸配列を Met(279)-Leu(280)- Pro(281) - Glu(282)- Ser(283)-G lu(284)-Asp(285)-Glu(286)-Glu(287)-Ser(288)-Tyr(289)-Asp(290 )-Thr(291)-Glu(292)-Ser(293)-Glu(294)-Phe(295)-Thr(296)-Glu( 297)-Phe(298)-Thr(299)-Glu(300)-Asp(301)-Glu(302)-Leu(303)と すれば、 この配列の 1 部分からなり、 次の N—末端と C一末端を有 する ものが挙げられる。
Ser(288)-Glu(294), Ser(288)-Phe(295), Ser(288)-Thr(296), S er(288)-Glu(297), Ser (288) -Phe (298) , Ser(288)-Thr(299), Ser( 288)- Glu(300)， Ser(288)-Asp(301), Ser(288)-Glu(302), Ser(288
Figure imgf000009_0001
281)-Glu(300), Pro(281)-Asp(301), Pro(281)-Glu(302), Pro(281 ) - Leu(303)，
Leu(280)-Glu(294), Leu(280)-Phe(295), Leu(280)-Thr(296), L eu(280)-Glu(297), Leu(280)-P e(298), Leu(280)-Thr(299), Leu( 280)-Glu(300), Leu(280)-Asp(301), Leu (280) -G 1 u (302) , Leu(280 )-Leu(303),
Met(279)-Glu(294), Met (279) -Phe(295), Me t (279) -Thr (296) , M et(279)-Glu(297), et(279)-Phe(298), Me t (279) -Thr (299) , Met( 279)-Glu(300), Met(279)-Asp(301), Me t (279) -G 1 u (302) , Met(279 )-Leu(303)。
上記のごときア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドと して、 例えば、 次 のようなべプチ ドが挙げられる。
ァ ミ ノ酸配列 Met- Leu-Pro- Glu- Ser- Glu-Asp-Glu- Glu- Ser- Tyr- As p-Thr-Glu-Ser-Glu-Phe- Thr-Glu- Phe- Thr- Glu-Asp-Glu-Leu (配列 番号 1 ) を含むぺプチ ド
ァ ミ ノ酸配列 Me卜 Leu-Pro- Glu-Ser-Glu- Asp- Glu-Glu-Ser- Tyr- As p-Thr-Glu-Ser-Glu-Phe (配列番号 2 ) を含むぺプチ ド
7 ミ ノ酸配列 Ser- Glu_Asp- Glu- Glu- Ser- Tyr- Asp- Thr- Glu- Ser- G1 u-Phe (配列番号 3 ) を含むペプチ ド
ア ミ ノ酸配列 Ser- Tyr- Asp- Thr-Glu- Ser (配列番号 4 ) を含むぺ プチ ド
本発明のペプチ ドは、 そのサイズが短かく なるに従って、 ヒ ト体 内での免疫原性が低下し、 また体内蛋白質分解酵素により分解され にく く なる、 等の利点を有する。
上記ァ ミ ノ酸配列中、 Met はメ チォニン、 Leu はロ イ シ ン、 Pro はプロ リ ン、 Glu はグルタ ミ ン酸、 Ser はセ リ ン、 Asp はァスパラ ギン酸、 Tyr はチロ シ ン、 Thr はス レオニ ン、 Phe はフ エ二ルァラ ニンを示し、 かかるア ミ ノ酸はいずれも L 体である。
本発明のペプチ ドは、 I なのリ ン酸化を抑制することができ る限り、 上記ア ミ ノ酸配列の置換、 欠失およびノまたは挿入があつ てよい。
置換、 欠失および Zまたは挿入の対象となるのは、 コア一配列中 では、 リ ン酸化の対象とならないア ミ ノ酸 Tyr， Aspおよび Glu であ り、 この対象となるア ミ ノ酸数は 1〜 2個である。 しかしながら、 このコア一配列内においては置換、 欠失およびノまたは挿入による 変更がなされていないことが好ま しい。 コア一配列以外の部分にお いて、 置換、 欠失および Zまたは挿入により変更し得るア ミ ノ酸の 数は、 1 〜複数個であり、 好ま しく は、 当該ペプチ ドのコア一部分 以外の全ア ミ ノ酸数の半分以下、 さらに好ま しく は 30¾ 以下、 より 好ま しく は 20X 以下、 例えば 10X 以下である。
本発明のペプチ ドはまた、 修飾されていてもよい。 ここで修飾と は、 ペプチ ドを構成するア ミ ノ酸自体の構造の修飾、 ペプチ ド中の 隣接する、 または瞵接しないア ミ ノ酸残基間での架橋、 ペプチ ド結 合の修飾、 ぺプチ ド基本骨格の修飾、 側鎖官能基の導入、 環状化、 スぺーサ一 （ s p a c e r ) の導入等である（Gianni s, A. & Kolte r, T. Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. (1993)32, 1244-1267)。
上記ペプチ ドの塩と しては、 薬理学上許容される酸付加塩および 塩基付加塩であればいずれであってもよい。 酸 （無機酸および有機 酸） 付加塩と しては、 例えば、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 硝 酸塩等の無機酸付加塩、 酢酸塩、 安息香酸塩、 マレイ ン酸塩、 フマ ル酸塩、 コハク酸塩、 酒石酸塩、 クェン酸塩、 シユウ酸塩、 メ タス ルホン酸塩、 トルエンスルホン酸塩、 ァスパラギン酸塩、 グルタ ミ ン酸塩等の有機酸付加塩が含まれる。 塩基 （無機塩基および有機塩 基） 付加塩と しては、 例えば、 ナ ト リ ウム塩、 カ リウム塩、 カルシ ゥム塩、 等の無機塩基付加塩、 ピリ ジン塩、 ト リェチルァ ミ ン塩、 リ ジン塩等の有機塩基付加塩が含まれる。
本発明のペプチ ドは、 ペプチ ド合成に通常用いられる方法、 例え ば、 液相法または固相法を使用するこ とができる （Peptide and Pr otein Drug Delivery, し ee， V. H. し編， Marcel Dekker, Inc. 米 国、 Pharmaceutical Biotechnology, Borchardt, R. T. ら編、 Pren um Press, New York and London ) 0 これらの方法を使用 しぺプチ ド結合の任意の位置で二分される 2 種のフラ グメ ン 卜の一方に相当 する反応性カルボキシル基を有する原料と、 他方のフラグメ ン 卜に 相当する反応性ア ミ ノ基を有する原料とをカルポジイ ミ ド法、 活性 エステル法等を用いて縮合させ、 生成する縮合物が保護基を有する 場合、 その保護基を除去させるこ とによって製造するこ とができる o
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、 保護基 により保護される。 ァ ミ ノ基の保護基と しては、 例えばベンジルォ キンカルボニル、 卜ブチルォキシカルボニル、 p-ビフ 二ルイ ソプ 口 ピロォキシカルボニル、 9-フルォレニルメ チルォキシカルボニル 等が挙げられる。 カルボキシル基の保護基と しては、 例えばアルキ ルエステル、 ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられる力く、 固相法の場合は C 末端のカルボキシル基はク ロルメチル樹脂、 ォキ シメ チル樹脂、 P-アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結 合している。 縮合反応は、 カルボジィ ミ ド等の縮合剤の存在下にあ るいは N-保護ァ ミ ノ酸活性エステルまたはべプチ ド活性エステルを 用いることができる。 縮合反応終了後、 保護基は除去されるが、 固 相法の場合はさ らにペプチ ドの C 末端と樹脂との結合を切断する。
他に、 本発明のぺプチ ドは遗伝子工学的手法を使用 して製造する こ と も可能である (上記 Peptide and Protein Drug Delivery およ
l o び Pharmaceutical Biotechnology参照） 0 例えば、 WO 92-20795 に 開示されている I /c B αの塩基配列のうち、 所望のア ミ ノ酸配列を コー ドするオリ ゴヌ ク レオチ ドを常法により合成し、 PCR 法等によ りアセンブリ した後、 これを適当な発現ベクターに導入する。 次い で、 発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。
得られた形質転換細胞を適当な条件で培養することにより、 培養 液中あるいは宿主細胞中にぺプチ ドが産生される。 産生されるぺプ チ ドの単離、 精製を容易にし、 あるいは安定性を増大させるために 本発明のぺプチ ドをコ一ドする塩基配列に、 FLAGぺプチ ド （W0 88- 04692 参照） ゃヒ ト免疫グロプリ ン定常領域 （W0 94-28027 、 Elli son, J. et al. , DNA (1981) 1， 11-18 、 Krawinkel, U. et al. , EMBO J. (1982) 1, 403-407 等参照） をコー ドする塩基配列を付加 して、 これを発現させてもよい。
本発明のぺブチ ドの製造のために任意の発現系、 真核細胞例えば 、 動物細胞、 例えば樹立された哺乳類細胞系、 真菌細胞、 および酵 母細胞、 並びに原核細胞例えば、 細菌細胞例えば、 大腸菌細胞等を 使用することができる。 好ま しく は、 本発明のペプチ ドは哺乳類細 胞、 例えば、 COS 細胞、 CH0 細胞中で発現される。 これらの場合、 哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いるこ とができる。 例えば、 ヒ トサイ トメガロウィルス前期プロモーター ( human cytomegalovirus immediate ear 1 y promoterリ を使用する ことができる。
その他に本発明のために使用することができる哺乳類細胞におけ る遺伝子発現のプロモーターと してはレ トロウ ィルス、 ポリオ一マ ゥ イ ノレス、 アデノ ウ イルス、 シ ミ アンウ ィ ルス 40 ( SV40) などのゥ ィルスプロモーターゃヒ トポリべプチ ドエロ ンゲーショ ンフ ァ ク タ -l a (HEF-1 a ) などの哺乳動物細胞由来のプロモータ一を用いれ ばよい。
複製起源と しては、 SV40、 ポ リオ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ルス 、 牛パピローマウィ ルス等の由来のものを使用するこ とができ、 さ らに、 宿主細胞中での遺伝子コ ピー数を増幅するため、 発現べク タ —は選択マ一カーと してホスホ 卜ラ ンスフ ェラーゼ ΑΡΗ(3' ) 11 ある いは 1 (neo ) 遗伝子、 チ ミ ジンカイネース （TK) 遺伝子、 大腸菌 キサンチ ングァニンホスホ リ ボシル ト ラ ンスフ ェ ラ 一ゼ （ Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （DHFR) 遺伝子等を含むこ とができ
< o
本発明のペプチ ドは通常の方法に従い精製される。 例えば、 ィォ ン交換ク ロマ トグラフ ィ ー、 逆相液体ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフ ィ 一等が挙げられる。 このようにして得ら れたぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列はプロティ ンシークェンサ一により配 列分析、 ァ ミ ノ酸分析計により酸種分析によって特定できる。
本発明のペプチ ドは I c B な リ ン酸化部位からなり、 1 c B なの リ ン酸化抑制作用を維持する限り、 ア ミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入が あってもよ く 、 さ らにべプチ ドの安定性や活性、 半減期、 細胞膜透 過能をより向上させるためにその構造を修飾するこ と も可能である (Giannis, A. & Kolter, T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1993 ) 32, 1244-1267 を参照） 。 ペプチ ドの修飾の一つと しては、 細胞 膜透過能を有するようにするのが好ま しい。
例えば、 本発明のペプチ ドの末端にステロ イ ド化合物またはベン ゼン環を有する化合物等脂溶性の物質を付加するこ とにより、 細胞 膜透過能を付与することができる。 さ らには、 本発明のペプチ ドの 細胞膜透過のために、 本発明のペプチ ドをリ ボ ソームに封入して使 用するこ とができる （上記 Peptide and Protein Drug Delivery 、 Pharmaceutical Biotechnology参照） 。 また、 本発明のぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列をコー ドするオリ ゴヌ ク レオチ ドを常法により合成し、 これを発現し得る適当な発現べクタ 一に導入したものを公知の手法により生体に投与し、 生体内で本発 明のぺプチ ドを発現させることもできる （W0 94-27643 、 W0 92-20 316 、 特開平 6- 303987、 US 5166320、 W0 92-19749 、 WO 92-20316 等参照） 。 または ex vivo で本発明のペプチ ドを使用した遺伝子治 療も可能である。 すなわち、 生体より リ ンパ球等の血液細胞を取り 出して、 上記発現ベクターでこの細胞を形質転換し、 形質転換され た細胞を再び生体へ戻すことにより、 生体内で形質転換細胞に本発 明のペプチ ドを産生させることができる （特開平 6-329559参照） 。 本発明のペプチ ドは、 1 なのリ ン酸化を抑制する作用を有し 、 炎症性サイ ト力イ ン、 炎症性メディエーターの遺伝子の発現、 さ らにはその遺伝子産物の遊離を抑制すると考えられ、 ヒ トをはじめ とする哺乳動物の炎症性疾患の治療、 予防に有効であり、 また、 免 疫抑制剤と しても使用される。 さ らに、 本発明のペプチ ドは、 細胞 内に存在する I αのリ ン酸化抑制を標的と し、 NF/c B の活性化 抑制を指向することで、 その効果は特異的であると推定される。
本発明のペプチ ドは、 抗炎症剤と して使用されることにより、 種 々の炎症性疾患、 例えば、 多発性硬化症、 全身性エリ テマ トーデス 、 関節リ ウマチ、 乾せん、 痛風、 腎炎、 炎症性大腸炎、 心筋梗塞、 喘息、 地中海熱、 クローン病、 成人呼吸促迫症候群、 肺気腫、 囊胞 性線維症、 過敏性肺炎、 結核性胸水、 癌性胸水、 サルコィ ドーシス 、 特発性肺線維症、 びまん性汎細気管支炎、 食道癌手術後、 虚血再 灌流障害等の治療に有効である。 また、 本発明のペプチ ドは免疫抑 制剤と して使用されることにより、 骨髄移植、 臓器移植時等の拒絶 反応の抑制に有効である。
本発明のペプチ ドの投与経路と しては、 経口投与、 非経口投与の いずれでもよいが、 特に、 非経口投与が好ま しい。 非経口投与と し ては、 注射、 直腸内投与、 経皮投与、 経肺投与がある。 本発明のぺ プチ ドの投与量は、 投与方法、 患者の症状、 年齢等により異なるが
、 通常一回 0.001-lOOOmg, 好ま し く は 0.01- 10mg を一日あたり 1 - 4 回に分けて投与するこ とができる。
本発明のペプチ ドは、 通常、 製剤用の担体、 賦形剤と混合して調 製した製剤と して投与される （Remington' s Pharmaceutical Scien ce， latest edition, Mark Publishing Company, Eas ton 、 米国) 。 製剤用担体、 賦形剤と しては、 医薬品の製剤分野において常用さ れ、 かつ、 本発明のペプチ ドと反応しない物質が使用される。 例え ば、 注射剤を製造するには、 有効成分である本発明のペプチ ドの他 に、 必要に応じ、 塩酸、 水酸化ナ ト リ ウム、 乳酸ナ ト リ ウム、 乳剤 、 リ ン酸一水素ナ ト リ ウム、 リ ン酸二水素ナ ト リ ウムなどの pH調整 剤、 塩化ナ ト リ ウム、 ブ ドウ糖などの等張化剤とと もに注射用蒸留 水に溶解し、 無菌漉過してアンブルに充塡するか、 更に、 マンニ ト ール、 デキス ト リ ン、 シク ロデキス ト リ ン、 ゼラチンなどを加えて 真空下凍結乾燥し、 用事溶解型の注射剤と してもよい。
または、 レ シチン、 ポ リ ソルべ ト ール 80、 ポ リ オキシエチ レ ン硬 化ヒマ シ油などを加えて水中で乳化せしめ、 注射用乳剤とすること ができる。 直腸内投与剤を製造するには、 有効成分である本発明の ペプチ ドの他にカカオ脂、 脂肪酸の ト リ、 ジ、 モノ グリ セ リ ド、 ポ リエチレングリ コールなどの座剤用基剤とを加湿して溶解し、 型に 流し込んで冷却する力、、 または、 ポ リ エチレングリ コール、 大豆油 などに溶解したゼラチン膜で被覆してもよい。
経皮投与剤を製造するには、 有効成分である本発明のぺプチ ドの 他に白色ワセ リ ン、 ミ ツロウ、 流動パラ フ ィ ン、 ポ リ エチレングリ コールなどに加えて必要ならば、 加湿して練合し、 軟膏剤とするか 、 ロ ジン、 アク リル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合 した後、 ポリエチレンなどの不織布に展延してテープ剤とする。 経肺投与剤を製造するには、 有効成分である本発明のぺプチ ドを 通常の噴射剤に溶解または分散して耐圧容器に充塡し、 エアゾール 剤とする。
更に、 公知のリボソーム技術等を使用して、 持続性製剤とするこ ともできる。
また、 上記の製剤は対象となる疾患の治療上有効である他の成分 を含有してもよい。
以下に実施例を記載し、 本発明を更に詳しく説明するが、 本発明 はこれら実施例に限定されるものではない。 実施例
参考例 1. グルタチオン- Sトラ ンスフエ レース (glutathione S- tranferase: GST ) -I /c Β α触合タ ンパクの調製 (1) GST-1 κ B a触合タンパクをコー ドする DNA の構築
ヒ ト I c B aの cDNAを単離するために、 Haskill, Sらの報告 （Ce 11 (1991) 65， 1281-1289 ) に基づき、 I /c B a cDNAの開始コ ドン 、 終始コ ドン近傍の塩基配列に特異的なプライマー GMD5 (配列番号 5 ) 、 GMD3 (配列番号 6 ) を各々オリ ゴヌ ク レオチ ドシンセサイザ 一にて合成した。 なお、 プライマー GMD5の 5'側には EcoRI 、 ブライ マー GMD3の 5'側には BamHI による制限酵素切断部位が導入されるよ う設計した。 RNA zolB (Biotex Laboratory 、 Huston. 米国） を使 用し、 リポポリサッカライ ド （LPS ) 剌激ヒ ト末梢血単核球より全 RNA を得た。
得られた全 RNA を铸型と して、 上記プライマー GMD5および GMD3を fflレ、て、 リ ノヽース 卜ラ ンスク リプテース (reverse一 transcriptase ) — PCR (polymerase chain reacton) 法を レ、、 全長ヒ ト I c B な cDNAを得た。 得られた全長ヒ ト 1 c B a cDNAを、 グルタチオン- Sト ラ ンスフ ヱ レース （glutathione S- transferase： GST) 遺伝子を含 有するプラス ミ ドベク ター PGENT2 (Murakami, S. ら、 J. Biol. Che m. (1994) 269, 15118-15123) の EcoRI および BamHI 切断部位に導 入し、 プラス ミ ド pGST-MD を得た。 Sanger, F. らの方法 （Proc. Na tl. Acad. Sci. USA (1977) 74， 5463-5467 ) を用いて全長ヒ ト 1 κ B な cDNAの塩基配列を確認した。 プラス ミ ド pGST-MD の摸式図を 図 1 に示す。
(2) GST-部分欠失 1 c B α変異体融合タ ンパク （deletion mutan t ) をコー ドする DNA の構築
合成プライマーを用い、 GST と 6 種類の】 B αの部分欠失変異 体との各融合タ ンパクをコー ドする DNA を構築した。 各々のプライ マーは、 各々の欠失部位に相当する塩基配列を有する。 プライマー GMD5 (配列番号 5 ) およびプライマー GMD6 (配列番号 7 ：) は、 ヒ ト I κ Β αのァ ミ ノ酸 1-242 からなる変異体 de卜 1 をコー ドする DNA の各々 5'側および 3'側を規定するよう設計された。 ブライマ一 GMD5 (配列番号 5 ) およびプライマー GMD7 (配列番号 8 ) は、 ヒ ト I κ B αのア ミ ノ酸 1-181 からなる変異体 de卜 2 をコー ドする DNA の各 々 5'側および 3'側を規定するよう設計された。
プライマー GMD52 (配列番号 9 ) およびプライマー GMD3 (配列番 号 6 ) は、 ヒ ト 1 Λ Β αのア ミ ノ酸 73 (1st ankirin repeat)- 317 からなる変異体 de卜 4 をコー ドする DNA の各々 5'側および 3'側を規 定するよう設計された。 プライマ一 GMD53 (配列番号 10) およびプ ラィマ一 GMD3 (配列番号 6 ) は、 ヒ ト I B ひのア ミ ノ酸 182 (3rd ankirin repeat)- 317からなる変異体 de卜 5 をコー ドする DNA の各 々 5'側および 3'側を規定するよう設計された。 プライマ ー GMD5 (配列番号 5 ) およびプライマ ー GMD9 (配列番号 11) は、 ヒ ト 1 B なのア ミ ノ酸 1-295からなる変異体 de卜 9 をコ ー ドする DNA の各々 5'側および 3'側を規定するよう設計された。 プ ライマー GMD5 (配列番号 5 ) およびプライマー GMD10 (配列番号 12 ) は、 ヒ ト 1 Λ B なのア ミ ノ酸 1-282からなる変異体 de卜 10をコー ドする DNA の各々 5'側および 3'側を規定するよう設計された。
なお、 各プライマ ーは、 その 5'側に EcoR I または BamH I による制 限酵素切断部位が導入されるよう設計した。 铸型と して全長ヒ ト I κ B な cDNAを含有するプラス ミ ドベクター pGENT2を用い、 5'側およ び 3'側を規定する各々のプライマ ー対を用いて、 PCR 法を行った。 得られた各変異体をコー ドする DNA をプラス ミ ドベクタ一 pGENT2の EcoRl および BamHl 切断部位に導入した。 上記 Sanger, F. らの方法 を用いて各変異体の cDNAの塩基配列を確認した。 各変異体の構造を 摸式的に図 2 に示す。
(3) GST-置換 I /c B な変異体をコー ドする DNA の構築
GST と I B αの C 末端の酸性領域 （acidic region ) にァ ミ ノ 酸の置換変異を有する I Λ B a -mutant K (mt K) との融合タ ンパ クをコ一 ドする DNA を構築した。
C 末端の酸性領域の 283 位のセ リ ン、 288 位のセ リ ン、 291 位の スレオニン、 293 位のセ リ ン、 296 位のスレオニンおよび 298 位の スレオニンが全てァラニンに置換されている I /c Β α -mt K をコー ドする DNA を含有する動物細胞発現ベク ター pRC/CMV (Ernst, M. Κ· ら、 Mol. Cell. Biol. (1995) 872-882 ) を铸型と して、 i B a cDNAの開始コ ドン、 終始コ ドン近傍の塩基配列に特異的なプライ マ 一 GMD5と GMD3を用いて PCR 法を行った。 得られた 1 c B な置換変 異体- mt K をコー ドする DNA はプラス ミ ドベクタ一 pGENT2の EcoRl および BamHI 切断部位に導入した。 上記 Sanger, F. らの方法を用い て変異体 mt Kの cDNAの塩基配列を確認した。 I c B a -mutant K の 酸性領域の摸式図を図 3 に示す。
(4) GST-1 κ Β α融合タ ンパクの調製
前記（1) 、 （2) および（3) で得た各発現ベク ターを大腸菌にて発 現させ、 GST-I κ Β α融合タ ンパクを得た。
各発現べク ターで大腸菌 （JM109 ) を ト ラ ンスフ ォームした後、 50 g/mlア ンピシ リ ンを含む 2χΥΤ培養液 （和光純薬製） 中で、 培養 した。 ImM のイ ソプロ ピルチオガラ ク ト シ ド （ I PTG、 和光純薬製） を培養液に加え刺激し、 2-3 時間後に集菌した。
これを遠心分離した後、 その沈殿を PBS (-) (日水製薬） で洗浄し た。 1¾ Triton X-100 (和光純薬製） を含む PBS (-)中で超音波破砕 し、 遠心分離して上清を回収した。 その後、 各々の融合タ ンパクを IX Triton X-100 w含む PBS(-)中でグルタチオンセフ ァ ロース （Ph armacia ) に結合させ、 同 PBS (-)にて 5 回洗浄後、 5mM グルタチォ ン （和光純薬） 溶液で溶出した （Smith, D. B. & Johnson, K. S. Gene (1988) 67, 31-40 ) 。
参考例 2. 1 κ B α リ ン酸化酵素 （カイネース） の部分精製 ヒ ト単核球細胞株 ΤΗΡ- 1 より、 1 Β なをリ ン酸化するカイネー スを部分精製した。 ΤΗΡ- 1 細胞を 5% ゥ シ胎児血清 （FCS 、 ICN Co rp. ,豪州） 、 100 U/mlぺニシ リ ン （GIBCO BRL ) 、 100 g/mlス ト レブ トマイ シ ン （GIBCO BRL ) および 2mM いグルタ ミ ン （和光純薬 ) を含む RPMI- 1640 培養液 （日水製薬） で、 37°C、 5¾C02 存在下で 培養した。 4xl09 個の THP-1 細胞を 10〃 g/mlの LPS( ^ col i. 055 B5、 DIFC0 ) で 5 分間刺激し、 遠心により集めた。
細胞の沈殿を PBS (-)で 2 回洗浄後、 ImM EGTA、 ImM ジチオス レィ ト ーノレ （DTT ) 、 0.5mM フ エ二ルメ チルスルホニルフルオ リ ド （PM SF) および各 1 〃 g/mlのァプロチニン、 ロイぺプチン、 ぺプスタイ ン （Sigma 製） を含む 20mM へぺス （Hepes ) 緩衝液 （pH 7.9) で 懸濁し、 超音波破砕後、 500xg にて 10分間遠心した。 上清をさ らに 18000xg にて 35分間、 4 °Cで遠心し、 その上清を 20mM Tris 緩衝液 (pH 7.5) で 4 °C、 4 時間透析し、 粗分画を得た。
次いで、 20mM Tris 緩衝液 （pH 7.5) で平衡化した Red-A セフ ァ ロースカ ラ ム (Red-A Sepharose column, AMIC0N, べッ ド容積 5ml ) にて、 0M、 0.5M、 2Mのように NaCl濃度を段階的に上げ溶出分離し た。 2M NaCl で溶出する分画を 20mM Tris 緩衝液 （pH 7.5) で 4 °C 、 4 時間透析した。 20mM Tris 緩衝液 （pH7.5 ) で平衡化したジメ チルア ミ ノ エチル （DEAE) セフ ァセルカ ラ ム （DEAE- Sephacel colu mn, Pharmacia 、 べッ ド容積 20ral) にて、 0M、 0.1M、 0.25M 、 0.5M 、 2Mのように NaCl濃度を段階的に上げ溶出分離した。 0.25M NaClで 溶出する分画を 20mM Tris 緩衝液 （pH7.5 ) で 4 。C、 4 時間透析し た後、 20mM Tris 緩衝液 （ρΗ7· 5 ) で平衡化した DEAE- HPLC (Bio Gel DEAE-5PW、 Bio Rad 社） で lml /分の速度で溶出した。
溶出開始後 10分から 70分まで 0-0.5M NaCl の直線濃度勾配をかけ 、 2ml づっ分画した。 得られたカイネース （kinase) の活性は GST- I κ B αを結合させたグルタチオンセファロースを用いた固相での イ ンビ ト ロカイネースア ツ セィ （in vi tro kinase assay 、 実施例 1(1)参照） により測定した。 タンパク量は、 Coomassie Protein Re agent (PIERCE) を用い、 ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) をスタ ンダ — ドと して測定した。 その結果、 得られた〗 Λ Β ひカイネース部分 精製品の精製度は約 126 倍であった （表 1 参照） 。 1 、 i»r £b|t ste 3=卜p タ ンパク含量 沽 性 比活性 精製度
(mg) ( x 10"ecpm) ( x 10— 6cpm/ (倍）
mg) 粗分画
Figure imgf000022_0001
104.4 0.83 1
Red A-sepharose 9.73 66.7 6.86 8.26 (0.5-2M NaCl)
Figure imgf000022_0002
0.41 41.7 実施例 1. I K B aに対する リ ン酸化活性の測定
(1) GST-I κ B a融合タ ンパクを用いた実験
イ ンビ ト ロカイネースア ツセィにより、 1 Β にo t対する リ ン酸 化活性を測定した。 参考例 1 にて作成した各々の融合タ ンパク とグ ルタチオンセフ ア ロースビーズ （Pharmacia 製） を 4 °C 2 時間に to
CJl て撹拌するこ とにより結合させ、 NP-40 (ナカライテスク） を含 む PBS (-)で 3 回、 PBS (-)で 2 回洗浄した後 PBS (-)に懸濁した。 14pm ole の融合タ ンパクを含む 20 / 1 のグルタチオンセフ ァ ロ一スビー ズと上記参考例 2 で得た細胞質画分由来の精製 I / B αカイネース 2 u 1 を PBS (-)で 400 1 に調整し、 4 °Cにて 3 時間撹拌した。
その後、 1¾ NP- 40を含む PBS (-)で 2 回、 PBS (-)で一回洗い沈殿を 得た。 この沈殿に 5 Ci ( 185kBq) [ γ -32Ρ] ATP (Amersham Jap an, #PB10168 3000Ci/mM ) および 20 / 1 のカイネース緩衝液 （20 mM MgC12 lOmM MnC12を含む 20mM Hepes緩衝液 （pH7.4 ) ) を加え
30°Cで 5 分間ィ ンキュベー ト した。 13.5mM EDTA および NP-40 を含む PBS (-)を加えて反応を停止させ、 1!¾ NP-40を含む PBS (-)で 4 回洗浄して得られた沈殿にソディ ゥム ドデシルスルフュー ト （SDS ) 試料緩衝液 （0.0625M Tris-HCl (pH 6.8) 、 10¾(w/v) グリセ口 ール、 5 (w/v) β - メルカプ トエタノール、 2.3 (w/v) SDS ) を 5 1 加えて沸騰水中でタ ンパクを溶出した。
遠心分離後、 上清を SDS-ポリアク リルア ミ ド電気泳動 （PAGE) に ふした。 SDS- PAGE終了後、 X 線フィ ルムを用いォー トラジオグラフ ィ ーを行った （図 4 参照） 。 この結果、 全長 1 /c B a (wild type; wt) 、 変異体 del-9 、 del-5 または de卜 4 の GST との各融合タ ンパ クを用いた場合には放射活性が検出されたが、 変異体 de卜 10または de卜 1 の GST との各融合タ ンパクを用いた場合には放射活性が検出 されなかった。
また、 一部の実験ではグルタチオンセファロースビーズを使用せ ず、 14pmole の融合タンパクと THP- 1 細胞の細胞質画分由来の部分 精製 1 B αカイネース 2 1 に、 上記カイネース緩衝液を最終濃 度が同等になるように加え、 液相にて前述のとおりアツセィを行つ た （図 5 参照） 。 この結果、 全長 I /c B a (wt) および de卜 9 の GS T との各融合タンパクを用いた場合には放射活性が検出されたが、 変異体 de卜 10、 del- 1 および置換変異体 （m卜 K) の GST との各融合 タ ンパクを用いた場合には放射活性が検出されなかった。 これらの ことから、 変異体 de卜 10と de卜 9 のァ ミ ノ酸配列の相違する領域に リ ン酸化部位が存在することおよび置換変異体 mt Kに存在するア ミ ノ酸置換により I C B ながリ ン酸化を受けなく なることが明らかと
"つた
(2) ぺプチ ドによる リ ン酸化活性の競合的阻害
配列番号 1 のァ ミ ノ酸配列を有する I /c B α リ ン酸化部位のぺプ チ ドをぺプチ ドシンセサイザ一により合成し、 逆相 HPLCにより精製 、 ア ミ ノ酸分析装置でその配列を確認した。 このペプチ ドを用い、
I κ B αのリ ン酸化活性を測定した。
GST と 1 Λ Β a (wt) の融合タ ンパクを使用 し、 これに THP- 1 細 胞の細胞質分画由来の上記精製 I /c B α力イネ一スを同量加え、 2. 7ηΜ のペプチ ド （モル比で 200 倍） を添加し、 上記（1) と同様にァ ッセィを行った。 その結果を図 6 に示す。 I c B α リ ン酸化部位の ペプチ ドを添加するこ とにより、 I c B αのリ ン酸化が抑制された ο
(3) リ ン酸化部位の特定
I κ Β α リ ン酸化抑制ペプチ ドのリ ン酸化部位をさ らに特定する ために、 実施例 1 ( 2 ) で作成した I /c B aの " ン酸化抑制べプチ ド （配列番号 1 ) の一つのア ミ ノ酸残基を置換したペプチ ドを使用 して、 イ ンビ ト ロカイネースア ツセィを行った。
配列番号 1 のア ミ ノ酸配列を有する I c B な リ ン酸化ペプチ ドの ァ ミ ノ酸配列においてリ ン酸化されるァ ミ ノ酸残基と予測される 28 3 位のセ リ ン、 288 位のセリ ン、 291 位のスレオニンまたは 293 位 のセ リ ンをーつづつァラニンに置換したぺプチ ド （各々、 283Ala ( 配列番号 13) 、 288Ala (配列番号 14) 、 291A (配列番号 15) また は 293Ala (配列番号 16) ) を各 15n mole使用 し、 実施例 1 ( 2 ) の ィ ンビ ト ロカイネースア ツセィ と同様の条件で液相にてア ツセィを 行つた（n = 4) 。 なお、 コ ン トロールと して、 全長 1 c B a (wt) 添 加群 （陽性コ ン ト ロール） と I B ひ非添加群 （陰性コ ン ト ロール ) をおいて比較した。
ア ツセィ後、 Tris/Tricine系の緩衝液を使用 して実施例 1 ( 1 ) と同様に SDS ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動を行った。 その結果 をイ メ ージアナライザー （BAS1000， Fuji f ilm Co. ltd) で解析、 定量した。 その結果を図 7 に示す。 この結果、 ペプチ ド 283Alaは リ ン酸化に影響を及ぼさなかった。 一方、 ペプチ ド 293Alaはリ ン酸化 に大き く影響を及ぼした。 また、 ペプチ ド 288Alaおよび 291Alaはリ ン酸化に若干程度の影響を及ぼした。
以上の結果から、 I B α リ ン酸化抑制ペプチ ドのア ミ ノ酸配列 中の 4つのセリ ンまたはスレオニン残基の内、 288 位のセリ ン、 29 1 位のスレオニンおよび 293 位のセリ ンがリ ン酸化に関与している ことが強く示された。
なお、 上述の各々の 1 Λ Β α置換変異体を用いた際にリ ン酸化が 完全に抑制されないのは、 置換したア ミ ノ酸残基以外のセリ ンまた はスレオニン残基がリ ン酸化されたためと考えられた。
実施例 2. I κ Β α リ ン酸化部位のペプチ ドによる NF B 活性に
及ぼす影響
I κ B α リ ン酸化部位のペプチ ドを用いて無細胞系 （Ishikawa, Y. et al.， J. Biol. Chem. (1995) 270, 4158-4164 ) での NF B 活性化に及ぼす影響を調べた。
無刺激 THP- 1 細胞を試験例 2 に記載された条件で培養した。 Sado wski, H. B. et al. , (Nature (1993) 362, 79- 83)の方法に従い、 THP-1 細胞から細胞質分画および細胞膜に富む分画を調製した。 各 20 / の両分画をあわせ、 15nMの 1 B a リ ン酸化部位のぺプチ ド 、 10mMの ATP および 20 g/mlの LPS を加えて 30°Cで 10分間刺激した o
13.5mM BDTA (PH 8.0) を加えて反応停止後、 遠心分離して上清 を得た。 この上清を 6%ポリアク リルア ミ ドゲル （アク リルア ミ ド： ビス =30: 1) を含む 0.25xTBE (最終濃度、 11当たり Tr is塩 （Sigma 製） 13.5g、 硼酸 （和光純薬製） 6.9 g、 EDTA (和光純薬製） 1.1 65g ) において、 IL-8/c B 領域を含む32 P 標識 DNA プローブを用い てゲルシフ トアツセィを行った （Mukaida, N. et al. , J. Biol. C hem. (1994) 269, 13289-13295) 。 その後、 イ メ ージアナライザ一 (BAS 1000、 Fuji film Co. ltd. ) で解析、 定量した。
なお、 コ ン ト ロールと して LPS 非添加群およびペプチ ドのコ ン ト ロールと して各々 15nMのカゼイ ン力イネ一ス 11 (casein kinase II ) 基質 （Kaengel, E. に et al. , J. Biol. Chem. (1987) 262, 91 36-9140 ) (配列番号 17) およびマップカイネース （MAP kinase) 基質 （Dong, Z. et al. , J. Exp. Med. (1993) 177, 1071-1077 ) (配列番号 18) 添加群を設定した。
ゲルシフ トア ツセィの結果を図 8 に示す。 LPS で刺激した THP-1 細胞を用いた系において I Λ Β αのリ ン酸化部位のペプチ ドを添加 した群では、 1 c B αのリ ン酸化が抑制され、 その結果、 NF/c B の 活性化が認められなかった。 さ らに、 イ メ ージアナライザーでの解 析、 定量の結果を図 9 に示す。 I « Β α リ ン酸化部位のぺプチ ドを 添加した群では、 明らかに NF/c B の活性化が抑制された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 多発性硬化症や全身性ェリ テマ トーデスなどの 炎症性疾患、 骨髄移植、 臓器移植時における拒絶反応等の炎症性サ ィ 卜力イ ン、 炎症性メ ディエーターが関与する疾患の治療に有効な 抗炎症剤、 免疫抑制剤が提供される。
本発明により提供される抗炎症剤、 免疫抑制剤はその有効成分と して含有されるペプチ ドまたはその塩が I c B αの リ ン酸化を抑制 する こ とにより、 NF/c B による転写活性化作用を阻害するため、 こ れを上記疾患の患者に投与するこ とにより、 該疾患を軽減するこ と ができる。 配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser Glu
5 10 15
Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu
20 25
配列番号 ： 2
配列の長さ ： 1 7
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser Glu
5 10 15
Phe
配列番号 ： 3
配列の長さ ： 1 3
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe
5 10
配列番号 ： 4
配列の長さ ： 6 配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Ser Tyr Asp Thr Glu Ser
5
配列番号 ： 5
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCGAATTCCA TGTTCCAGGC GGCCGAGCG 29 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCAGGATCCT CATAACGTCA GACGCTGGC 29 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCAGGATCCT CAATCAGCCC CACACHCAA CAG 33 配列番号 ： 8 配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCAGGATCCT CAGTAGTTGG TAGCCTTCAG GAT 33 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCGAATTCCG ACGGGGACTC GTTCCTGCA 29 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCGAATTCCA ATGGCCACAC GTGTCTACAC 30 配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCAGGATCCT CAGAACTCTG ACTCTGTGTC ATA 33 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 DNA
配列 ：
GCAGGATCCT CACTCTGGCA GCATCTGAAG m 33 配列番号 ： 1 3
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ala Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser Glu
5 10 15
Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu
20 25
配列番号 ： 1 4
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ala Tyr Asp Thr Glu Ser Glu
5 10 15
Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu
20 25
配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 2 5 配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Ala Glu Ser Glu
5 10 15
Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu
20 25
配列番号 ： 1 6
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ala Glu
5 10 15
Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu
20 25
配列番号 ： 1 7
配列の長さ ： 1 0
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ペプチ ド
配列 ：
Arg Arg Arg Glu Glu Glu Thr Glu Glu Glu
5 10
配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 9
配列の型 ： ア ミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチ ド ο ε
9
3JV 3JV Αΐο ΛΙΟ OJd jqi 3JV OJd ¾1V
： ½3i
8Z0I0/96dT/XDd ZIWC96 O

Claims

請 求 の 範 囲
1 . I κ Β なのリ ン酸化部位に対応するア ミ ノ酸配列を有するぺ プチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
2. I κ Β ながヒ ト I /c Β αであることを特徴とする請求項 1 の ペプチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
3. 1 κ Β なのリ ン酸化を抑制することを特徴とする請求項 1 ま たは 2 に記載のぺプチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
4. 下記のァ ミ ノ酸配列 ：
Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser- Glu-Phe- Thr- Glu-Phe-Thr-Glu-Asp- Glu-Leu (配列番号 ： 1 )
を含むことを特徴とする請求項 1 〜3 のいずれか 1 項に記載のぺ プチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
5. 下記のァ ミ ノ酸配列 ：
Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-T r-Glu-Ser- Glu-Phe (配列番号 ： 2 )
を含むことを特徴とする請求項 1 〜3 のいずれか 1項に記載のぺ プチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
6. 下記のァ ミ ノ酸配列 ：
Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser-Glu-Phe (配列番 号 ： 3 )
を含むことを特徴とする請求項 1 〜3 のいずれか 1 項に記載のぺ プチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
7. 下記のァ ミ ノ酸配列 ：
Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser (配列番号 ： 4 )
を含むことを特徴とする請求項 1 〜3 のいずれか 1 項に記載のぺ プチ ド、 およびその薬理学的に許容される塩。
8 . 請求項 4 〜 7 に記載のペプチ ド中の 1 又は複数個のア ミ ノ酸 が置換、 欠失および または挿入により変更されており、 且つ 1 κ B なのリ ン酸化を阻害する活性を維持しているペプチ ド、 およびそ の薬理学的に許容される塩。
9 . I κ B αのリ ン酸化部位のペプチ ドが修飾されていることを 特徴とする請求項 4 ないし 7 に記載のペプチ ドおよびその薬理学的 に許容される塩。
10. 請求項 1 〜 9 のいずれか 1 項に記載のペプチ ドを有効成分と して含有することを特徴とする抗炎症剤。
11. 請求項 1 〜9 のいずれか 1 項に記載のぺプチ ドを有効成分と して含有することを特徴とする免疫抑制剤。
12. 請求項 1 〜9 のいずれか 1 項に記載のぺプチ ドを有効成分と して含有することを特徴とする 1 /c B αのリ ン酸化阻害剤。
13. 請求項 1 〜9 のいずれか 1項に記載の 1 c B rのペプチ ドの ア ミ ノ酸配列をコー ドするオリ ゴヌ ク レオチ ドを含み、 該ペプチ ド を発現し得る発現べクター。
PCT/JP1996/001028 1995-04-13 1996-04-12 PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a) WO1996032412A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/930,605 US5981486A (en) 1995-04-13 1996-04-12 Peptide suppressing IκBα phosphorylation
AU52895/96A AU5289596A (en) 1995-04-13 1996-04-12 Peptide suppressing ixbalpha phosphorylation
EP96909371A EP0867448A4 (en) 1995-04-13 1996-04-12 PEPTID which suppresses the 1xBalpha PHOSPHORY READING

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11103395 1995-04-13
JP7/111033 1995-04-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996032412A1 true WO1996032412A1 (fr) 1996-10-17

Family

ID=14550708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1996/001028 WO1996032412A1 (fr) 1995-04-13 1996-04-12 PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a)

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5981486A (ja)
EP (1) EP0867448A4 (ja)
AU (1) AU5289596A (ja)
WO (1) WO1996032412A1 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US8680059B2 (en) * 1998-05-20 2014-03-25 Biotempt B.V. Oligopeptide acetate and formulations thereof
US20050227925A1 (en) * 2004-04-08 2005-10-13 Robbert Benner Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US20040202645A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-14 Khan Nisar Ahmed Administration of gene-regulatory peptides
US6921751B1 (en) * 1998-05-20 2005-07-26 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
US20030220258A1 (en) 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of ischemic events
US6844315B2 (en) 1998-05-20 2005-01-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
US7358330B2 (en) * 2001-03-29 2008-04-15 Biotempt B.V. Immunoregulatory compositions
US7560433B2 (en) 2001-12-21 2009-07-14 Biotempt B.V. Treatment of multiple sclerosis (MS)
US20030220260A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Peptide compositions
US20030220261A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Treatment of iatrogenic disease
US20040013661A1 (en) * 2001-12-21 2004-01-22 Gert Wensvoort Stratification
US7786084B2 (en) * 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
US20030224995A1 (en) * 2001-12-21 2003-12-04 Khan Nisar Ahmed Treatment of burns
US20080318871A1 (en) * 2001-12-21 2008-12-25 Khan Nisar A Treatment of neurological disorders
US7501391B2 (en) * 2001-12-21 2009-03-10 Biotempt B.V. Treatment of transplant survival
US20080242837A1 (en) * 2001-12-21 2008-10-02 Khan Nisar A Peptide compositions
US20030220257A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of trauma
US20090227505A1 (en) * 2004-01-07 2009-09-10 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
WO2007004869A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Biotempt B.V. Treatment of tumors
EP1864692A1 (en) * 2006-06-07 2007-12-12 Biotempt B.V. Use of peptides for the control of radiation injury

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06209778A (ja) * 1992-09-23 1994-08-02 F Hoffmann La Roche Ag ＮＦ−κＢアンチセンスポリヌクレオチド
JPH06508029A (ja) * 1991-05-17 1994-09-14 カイロン　コーポレイション ＮＦ−↓ｋＢ転写活性化物質のインヒビター及びその使用
CA2131587A1 (en) * 1993-09-07 1995-03-08 Yinon Ben-Neriah Method for regulation of nf-kb

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9222931D0 (en) * 1992-11-02 1992-12-16 Sandoz Ltd Organic compounds
EP0779361A3 (en) * 1995-12-15 1999-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Truncated form of inhibitory kappa B protein (1kB), recombinant production and uses thereof
CA2192738A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Gary Allen Peltz Truncated form of inhibitory kappa b protein (lkb), recombinant production and uses thereof
AU1959497A (en) * 1996-02-23 1997-09-10 J. David Gladstone Institutes, The Method for inhibiting nf-$g(k)b activation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06508029A (ja) * 1991-05-17 1994-09-14 カイロン　コーポレイション ＮＦ−↓ｋＢ転写活性化物質のインヒビター及びその使用
JPH06209778A (ja) * 1992-09-23 1994-08-02 F Hoffmann La Roche Ag ＮＦ−κＢアンチセンスポリヌクレオチド
CA2131587A1 (en) * 1993-09-07 1995-03-08 Yinon Ben-Neriah Method for regulation of nf-kb

Also Published As

Publication number Publication date
EP0867448A1 (en) 1998-09-30
US5981486A (en) 1999-11-09
AU5289596A (en) 1996-10-30
EP0867448A4 (en) 2000-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1996032412A1 (fr) PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a)
JP4540728B2 (ja) Ｖｈｌ腫瘍サプレッサーと低酸素誘導因子との相互作用、およびそれに関するアッセイ法
Purdue et al. Mistargeting of peroxisomal L-alanine: glyoxylate aminotransferase to mitochondria in primary hyperoxaluria patients depends upon activation of a cryptic mitochondrial targeting sequence by a point mutation.
US20060188959A1 (en) Crystal structure of worm NitFhit reveals that a Nit tetramer binds tow Fhit dimers
JP7144402B2 (ja) Ｍｇ５３突然変異体、その作製方法、およびその使用
JPH08509119A (ja) Ｔａｔａ結合蛋白関連因子、ｔａｆをコードする核酸および使用方法
US5925547A (en) Nucleic acid encoding novel protein domain which binds tyrosine phosphorylated proteins
US5527690A (en) Methods and compositions relating to sterol regulatory element binding proteins
US8440788B2 (en) N-terminal VDAC variants and uses thereof
US5872206A (en) Compositions and methods for interfering wtih hepatitis B virus infection
WO1999066038A1 (en) Angiostatin-binding protein
JP7531931B2 (ja) Ｖｇｌｌ１ペプチドを含む癌治療用組成物
US20090075948A1 (en) Compositions and methods for regulating cellular protection
KR101783030B1 (ko) C형 간염 바이러스 감염 또는 감염과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물
JP2006503553A (ja) 神経保護ポリペプチドとその使用法
AU733462B2 (en) CYP7 promoter-binding factors
JPH08337599A (ja) Ｉ κＢ αリン酸化抑制ペプチド
JP2001054391A (ja) 小胞体ストレス転写因子
WO2003080662A1 (en) Protein kinase c modulators, their aminoacid and nucleotide sequences and uses thereof
JP2005192567A (ja) チロシンキナーゼ遺伝子およびその遺伝子産物
WO2003066652A2 (en) Jlp cytoplasmic scaffolding protein and nucleic acids encoding it
JPWO2004073742A1 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の分解阻害剤
IL194466A (en) Variants of the V-N terminal of VDAC and their use
JPH11235187A (ja) Ｃｙｐ７プロモーター結合因子
WO2013028527A1 (en) Compositions and methods for treating cancer

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BB BG BR BY CA CH CN CZ DE DK EE ES FI GB GE HU IS KE KG KR KZ LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK TJ TM TR TT UA UG US UZ VN AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): KE LS MW SD SZ UG AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08930605

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1996909371

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1996909371

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1996909371

Country of ref document: EP