WO1996029426A1

WO1996029426A1 - Anticorps catalytique qui hydrolyse des esters d'acides amines d'une maniere enantioselective

Info

Publication number: WO1996029426A1
Application number: PCT/JP1995/000462
Authority: WO
Inventors: Ikuo Fujii; Fujie Tanaka; Keiko Kinoshita
Original assignee: Protein Engineering Research Institute
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1996-09-26
Also published as: EP0765940A1; US5885816A; EP0765940A4

Description

明細書アミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体産業ヒの利用分野

本発明は光学活性アミノ酸の合成技術の分野に属する。詳細には、本発明は触媒抗体を利用することによって、ェナンチォ選択的な加水分解反応を行う方法に関する。より詳細には、ラセミ体のアミノ酸エステル誘導体を触媒抗体によってェナンチォ選択的に加水分解し、ァミノ酸ラセミ体を光学分割する方法、及び光学活性アミノ酸を調製する方法に関するつ本発明によれば、種々の置換基を有する光学活性アミノ酸が極めて簡便に合成できるので、生体機能に関する基礎的な研究、構成成分として光学活性アミノ酸を含有する新しい医薬品の開発、および光学活性ァミノ酸を合成過程で利用する種々の光学活性生理活性物質または機能性化合物の合成のための方法論の開発に貢献することができる。

従来術および明が解決しょうとする課穎

生体の主要成分であるタンパク質は光学活性ァミノ酸で搆成されており、生体内はキラルな環境となっている。そのため、医薬品をはじめとする生理活性物質の多くは光学活性体であり、ェナンチォマー（鏡像異性体）の一方のみに生物活性が認められたり、ェナンチォマ一間で生物活性が異なることが知られている。従って、光学活性体を得るための方法論の開発は研究の的となっている _c

光学活性ァミノ酸を得るための最も簡単で一般的に行われる方法はラセミ体アミノ酸の光学分割である。光学分割の手法としては、酵素を用いる方法 (例えば、アミノアシラーゼ、リパーゼ等による速度論的光学分割)、ジァステレオマーを形成する方法などが行われている力'、種々の置換基を有するどのァミノ酸についても共通して有効な方法はなく、個々のァミノ酸によつて、方法を選ぶ必要がある。

そこで、本発明者らは、いずれのアミノ酸についても有効な、触媒抗体を利用するラセミ体ァミノ酸の光学分割方法を案出した。触媒抗体による反応は、一般的に、基質特異性が狭く応用性に欠けるという欠点を持っている力 ^s'、本発明では、この欠点を克服し、どのようなアミノ酸のラセミ体であっても、そのエステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解し、対応する光学活性ァミノ酸を生成させる触媒抗体を見い出した。

明の概要

本発明は、ァミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体を用いることを特徴とする、アミノ酸ラセミ体の光学分割を行う方法に関する

また、本発明は別の態様として、アミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体を用いることを特徴とする、アミノ酸ラセミ体から光学活性ァミノ酸を調製する方法に関する

これらの本発明方法は L一体および D—体の光学活性ァミノ酸の合成の両者に適用可能であり、以下に示す各々 2つの工程から成る 2方法を包含し得る：

( 1 ) ラセミ体アミノ酸のエステル誘導体を調製し、

( 2 ) 触媒抗体によって、 L一体アミノ酸のエステル誘導体のみをェナンチォ選択的に加水分解する。；および

( 1 ) ラセミ体アミノ酸のエステル誘導体を調製し、

( 2 ) 触媒抗体によって、 D—体アミノ酸のエステル誘導体のみをェナンチォ選択的に加水分解する。ここに使用される触媒抗体は典型的には、下記式 3で示される誘導体をノ、プテンとして哺乳動物を免疫することによって作製される。

[式中、 C B Zはべンジルォキシカルボニルである]

式中、 C B Zはァミノ保護基である力 C B Zに代えて他のアミノ保護基、例えばトリクロロアセチル、ベンジル、 t —ブトキシカルボニル、 9—フルォレニルメトキシカルボニル、または C B Zのフエニル基に低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ等の置換基を有しているもの等、当業者に周知の通常のァミノ保護基も適用可能である。また、上記式 3で示される誘導体は 4—二トロべンジルエステル体である力 \ ベンジル基のフエニル基に低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、ハロゲン等の中から選ばれる置換基を一つまたは二つ有しているべンジルエステルであってもよい。これらのハプテンによって得られる触媒抗体は、それぞれに対応するアミノ酸エステル誘導体を加水分解することができる。従って、これらも潜在的ハプテン物質である。

本発明はひとつの態様として、 N—べンジル才キシカルボニルァミノ酸のエステル誘導体の L一体および D—体についてェナンチォ選択的な加水分解を触媒する抗体を目的とする。 N—ベンジルォキシカルボニルァミノ酸はぺプチド合成に汎用される N—保護アミノ酸である。かかる抗体は以下の反応式 1に示されるような加水分解反応を触媒する。なお、以下の説明は上記式 3により得られる触媒抗体に関する説明である力⁵'、先に記載した潜在的ハプテン物質により得られる触媒抗体であっても以下の説明が妥当することは本明細書全体の記載から照らして当業者ならば明らかであろう。

D-1 D-2

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルであり、

Rは実質的にどんな置換基でもよく、典型的にはヒドロキシ、ァミノ、ァルキルチオ、ァシルォキシもしくはフエニルによって置換されていることあるアルキル基またはフエニル基であり、より典型的には CH ₃—、

p hCH₂ -、（CH₃)₂CHCH₂ -、 CH₃(CH₂)₃ -、

CH₃ S CH₂CH₂—、（CH₃)₂CH—、 p h—、 4一 HOp h—である] なお、 p h_はフヱニル基を、アルキルは典型的には直鎖または分枝鎖状 C 1— C 1 0アルキル基を、ァシルォキシは式： RC 00— （ここに、 Rはアルキル基である）で示される基を、それぞれ意味している:

明の詳しい説明

上記の抗体は触媒抗体 (Lerner, R. A.らサイエンス (Sceience), 252, 659 ( 1991)) の技術を使って作製される。すなわち、本発明の抗体は下記式 3で示される加水分解反応の遷移状態アナログであるホスホン酸エステル誘導体をハプテンとして哺乳動物を免疫することによつて作製される。

ハプテンの調製

上記のホスホン酸エステル誘導体は例えば、下記反応式 2に示す合成経路に従って合成することができる。

N0₂

N - ヒドロキシ

スクシイミド

市販の 6—ヒドロキシへキサン酸ェチルを PDC (ピリジニゥムジクロメ一ト）で酸化して得た化合物（4)を系中でベンジルァミンのィミンとし、これをトリエチルホスフアイトと反応させて、化合物（5)を得る。化合物（5)の接触還元による脱べンジル化、続いて、ァミノ基のベンジルォキシカルボ二ル化を行い、ジェチルホスホネ一トのブロモトリメチルシランによる脱ェチル化の後、得られたホスホン酸を DCC (ジシクロへキシルカルボジィミド）、 1H—テトラゾールの存在下、 4一二ト口べンジルアルコールと反 £、させて、化合物（6)を得る。化合物（6)のェチルエステルをアルカリ加水分解し、ハプテン（3)を得る。ハプテン（3)をヒドロキシスクシンイミドの活性化エステル（7) とし、 KLH (Keyhole limpetへモシァニン）と反応させ、免疫抗原（8) を得る。

触媒杭体の調製

次に、 BALBZcマウスを上記免疫抗原（8 ) で免疫し、モノクローナル抗体を入手する。

BALBZcマウス（ 1匹、雌 4週齢）を抗原（8 ) で免疫し、 4回の免疫の後に脾臓細胞を摘出する。常法に従い細胞融合を行い、形成したハイプリドーマを酵素標識抗体測定法（E L I S A ) を用いてスクリーニングし、ハプテン結合性の抗体を産生するハイプリドーマを得る。限界希釈法によるクローニングを橾り返し、単クローン I g G産生ハイプリドーマを得、それらの培養上清を（N H ₄ ) ₂ S 0 ₄沈殿して得られる粗抗体を、陽イオン交換クロマトグラフィ一とプロテイン Gァフィ二ティ一クロマトグラフィーによって精製する。

角虫のま

次に、得られた抗体の触媒活性をスクリーニングする。簡便に短時間で触媒活性をスクリ—ニングするため、加水分解の進行を蛍光強度の変化の測定により追跡できる以下の反応式 3に記載のエステル化合物（し一 10) および（D— 10)を基質として用いる。エステル化合物 (L一 10)および (D— 10)はアントラニル酸構造単位の蛍光が分子内に存在する 4—二ト口べンジル基によりクェンチングされており、加水分解によりそのクェンチングが解消されると蛍光強度が強くなる。つまり、以下の反応式 3における化合物 L—1 1及び L— 10がそれぞれ蛍光発色化合物である。

反じ、式 3

なお、化合物（L—10)と化合物（D— 10)とを等量混合して得られる蛍光基質（DL— 10) を調製し、まずこれを触媒活性のスクリーニングに使用する。初めに、蛍光基質（DL—10) を用いて、得られた精製抗体の蛍光強度の変化を 10分間、 /l ex 340 nm、ス em 415 nmで追跡する。この操作により、蛍光基質を加水分解する抗体が特定される。次に、蛍光基質（L一 10) または (D - 10) のいずれかを用いて同様の操作を行い、各抗体のェナンチォ選択性を評価する _c

発明の作用および効果

上記のようにして入手した、 L一体に対して選択的に触媒活性を有する抗体および D—体に対して選択的に触媒活性を有する抗体について、種々の Ύミノ酸エステル誘導体に対する基質特異性およびェナンチォ選択性を H P L C分析により検討する。

L—体に対して選択的に触媒活性を有する抗体 7G 12 (実施例参照）は、ァラニン、フエ二ルァラニン、ロイシン、ノルロイシン、メチォニン、ノリン、フエニルグリシン、 4—ヒドロキシフエニルグリシン、リジンに由来する基質化合物の L一体（L一 1 )の加水分解を触媒した。また、抗体 7G12は、対応する化合物（D— 1 )の加水分解を触媒しなかった。すなわち、抗体 7G12は、種々の基質の加水分解をェナンチォ選択的に触媒した。

D—体に対して選択的に触媒活性を有する抗体 3G2 (実施例参照）は、ァラニン、フエ二ルァラニン、ロイシン、ノルロイシン、メチォニン、ノリン、フエ二ルグリシン、 4ーヒドロキシフエ二ルグリシンに由来する基質化合物の D—体（D—1)の加水分解を触媒した。また、抗体 3G2は、対応する化合物（L一 1 )の加水分解を触媒しなかった。すなわち、抗体 3G2は、種々の基質の加水分解をェナンチォ選択的に触媒した _c

以上のことから、ホスホン酸エステル（3)をハプテンとして得られる本発明抗体は、種々のアミノ酸エステル誘導体の加水分解をユナンチォ選択的に触媒することが判明した。

本発明抗体が抗体でありながら、このような基質の非特異性を示す理由は、次のように考えられる。ハプテンと抗体との最大総接触面積は 7 0 0— 8 0 0 Α 2であり、低分子（分子量〜 3 5 0 ) のハプテンと抗体との接触面積は 2 5 0 - 4 0 0 Α ²であること力⁵'知られているこれは抗体の認識部位がこの大きさであることを意味する。上記ハプテン 3から誘導される抗体がハプテン 3の C B Z基、 4—ニトロべンジルアルコール、ホスホン酸エステルおよび a位の立体化学を認識すれば、抗体の認識部位は充分に満たされ、 "位の置換基（R ) は認識部位の外に出ると推定される：従って、本発明抗体がァミノ酸エステル誘導体基質の加水分解を触媒する場合、その基質の _ff —置換基（R ) は外側に出てしまうので、アミノ酸エステル誘導体の"一置換基 ( R ) がどのような置換基であつたとしても、抗体が認識するハプテンの一方のェナンチォマーと同一の立体化学をそのァミノ酸エステル誘導体が有していれば、その加水分解反応を触媒すると予測される。

実際、抗体 7G12および 3G2はこのデザィンに従って幅広い基質に対してェナンチォ選択的加水分解反応を触媒した（試験例参照）。従って、抗体の認識部位に相当する大きさを有する構造単位と、認識部位の外に出るような構造単位との組み合わせにかかるハプテンを用いて免疫を行えば、抗体の高い分子認識能に基づき立体特異的な反応が行えかつ幅広い基質に対して触媒することが可能である触媒抗体を得ることができることが実証された。

上記のように、本発明の抗体はアミノ酸ラセミ体から光学活性アミノ酸を調製する方法に利用できる。かかる方法は詳細には、

a ) ラセミ体のアミノ酸をエステル形成反応に付し、

b ) アミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体を用いることによって、エステル誘導体の D体又は L体の任意の立体異性体を選択的に加水分解し、そして

c ) 得られた混合物を常法により処理し、例えば得られた混合物を酸性又は塩基性にし、有機溶媒抽出して、水層を入手することにより、加水分解された立体異性体を単離すること、を特徴とする、光学活性アミノ酸の調製方法である。

以下に実施例、試験例を記載し、本発明をさらに詳しく説明する力これれらは本発明の範囲の限定を意図するものではない: ハプテン G)の合成

NO

CH₂C1₂-ピリジン

1.化合物（4)の合成

市販の 6—ヒドロキシへキサン酸ェチル（2.83 g， 17.7 mmol)の塩化メチレン（70 mL)溶液に PDC(ピリジニゥムジクロメート）（9.95 g, 26.4 mmol)を室温で加えた。 5時間报拌後、反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ一（酢酸ェチル /へキサン = 1/2 ) で精製し、化合物（4)

( 1.1276 g, 40%)を得た。

!H - NMR (500 MHz, CDC1₃): δ 9.78 (t, J = 1.4 Hz, 1H), 4.14 (q， J = 7.2

Hz, 2H), 2.50- 2.46 (m, 2H)， 2.37 - 2.30 (m, 2H), 1.71— 1 ,63 (m, 4H)， 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

2.化合物 (5)の合成

化合物（4) ( 1.1276 g, 7.13 mmol)のエタノール（2,5 mL)溶液にベンジルァミン（1.56 ml, 14.3 mmol)、トリェチルホスファイト（2.44 mL, 14.2 mmol)を室温で加えた。室温で 17.5時間、 40 で 6時間报拌した。溶媒を溜去後、残渣シリ力ゲルフラッシユカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル /'ィソプロパノール = 20/1 )で精製し、化合物 (5) ( 1.1276 g, 40%)を得た。

!H - NMR (500 MHz, CDC1₃): S 7.35 - 7.23 (m, 5H), 4.21 - 4.09 (m, 6H),

3.97 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.88 (dd, J = 13.1 Hz, 1.3 Hz, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.30 - 2.25 (m， 2H), 1.83 - 1.53 (m， 6H)， 1.34 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.25 (t， J = 7.1 Hz, 3H).

FBMAS (fast atom bonbardment mass) m/z: 386 (M+ + H).

HR - FABMAS (high resolution-FABMAS): C ₁₉H₃₃0₅NP (M+ + H)として、理論値： 386.2132, 実測値： 386.2092.

3.化合物 (6)の合成

化合物 (5) (473.0 mg, 1.23 mmol)のメタノール (3.0 mL)—ギ酸 (0.40 mL)溶液に 10% Pd— C (4.6 mg)を加え、水素気流下、室温で 2.5日攪拌した。反応混合物を濾過し、逾液を減圧下に濃縮して無色の残渣を得た。この残渣を THF (5.0 mL)に溶かし、塩化力ルボベンゾキシ（700 μ L, 4.90 mmol)とトリェチルァミン（1.71 mL, 12.3 mmol)を室温で加えた時間攪拌後、 1 N塩酸を加えて、酢酸ェチルで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を溜去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ一（酢酸ェチル）で精製し、無色のガム（120.5 mg)を得たつこのガム ( 120.5 mg)を塩化メチレン（0.5 mL)に溶かし、室温でブロモトリメチルシラン（222 _μし， 1 .68 mmol)を加えた。 35 で 2時間攪拌後、溶媒を溜去し、残 ϋにァセトニトリル（l .O mL)と水（0.2 mL)を加えた c 12時間後、溶媒を溜去し、残渣を乾燥した。この残渣の塩化メチレン（l .O mL)—ピリジン（0.5 mL)溶液に 4—二トロべンジルアルコール（61.2 mg， 0.40 mmol)、 1 H—テトラゾ一ル（9.7 mg, 0.14 mmol)、 DCC (261.5 mg, 1.27 mmol)を加え、 35°Cで 5時間攪拌した。溶媒を溜去後、残渣にァセトニトリルを加えて濾過し、濾液を HPLC ( YMC A - 323: C - 18, φ 10 mm x 250 mm,ァセトニトリル/ 0.1% トリフルォロ酢酸水溶液 = 50/50, 3.0 mL/min, 254 nm)で精製し、化合物（6) (34.5 mg,化合物（5)から 6%)を得た。

!H - NMR (500 MHz, CDC1₃): δ 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.62 (d J = 8.6 Hz, 2H), 7.38— 7.28 (m, 5H), 5.18 (ABX, J_AB = 13.5Hz, J_AX=J_BX=7.4 Hz, 厶

=16.2 Hz, 2H)， 5.1 1 (AB J = 12.6 Hz, Δ = 20.2 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H)， 4.06 (m, 1H), 2.33 (t, J = 7.3 Hz, 2H)， 1.95— 1.37 (m, 6H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

FABMAS m/z: 509 (M⁺ + H).

HR一 FABMAS: C₂₃H₃₀O₉N₂P (M+ + H)として、理論値： 509.1689, 実測値： 509.1688.

4.化合物 (3)の合成

化合物 (6) ( 15.0 mg, 0.0295 mmol)のメタノール (0.2 mL)—水 (0.2 mL)溶液に IN NaOH (0.1 mL, 0.1 mmol)を室温で加えた。 6.5時間後、反応混合物にトリフルォロ酢酸を加えて酸性にし、 HPLC (YMC A— 323: C— 18 , 10 mm x 250 mm,ァセトニトリル /0.1 % トリフルォロ酢酸水溶液 = 50/50, 3.0 mL/min, 254 nm)で精製し、化合物（3) ( 14.0 mg 99%)を得た

Ή-NMR (500 MHz, CD^OD): δ 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.37 - 7.28 (m, 5H 5.18 (ABX, J_AB = 13.5Hz, J_Ax=J_BX=7.4 Hz, △ =16.7 Hz, 2H), 5.1 1 (AB J = 12.5 Hz Δ = 26.6 Hz, 2H), 4.07 (m, I H), 2.32 (t J = 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.38 (m, 6H).

FBMAS m/z: 503 (M⁺ + Na), 481 (M⁺ + H).

HR - FABMAS: C₂₁H₂₅0₉N₂PNa (M+ + Na)として、理論値： 503.1 196，実測値： 503.1202.

実施例 2

ハプテンと担体タンパク gとの縮合

8 (X = KLH)

9(X =BSA)

5.化合物 (7)の合成

化合物（3)(6.4mg， 0.013 mmol)のァセトニトリル（0.3 mL)溶液に N—ヒドロキシスクシンイミド（2.5 mg, 0.022 mmol), WSC水溶性力ルボジイミド（ WSC) (8.3 mg, 0.043 mmol)およびジメチルァミノピリジン（DMAP) (0.1 mg, 0.0008 mmol)を加え、 2時間搜拌した。反応混合物を HPLC (YMCA- 323: C-18， φ 10 mm X 250 mm,ァセトニトリル /0.ド /。トリフルォロ酢酸水溶液 = 50/50, 3.0 mL/min, 254 nm)で精製し、ィヒ合物（7) (6.1 mg.79%)を得た。

!H-NMR (500 MHz, CD₃OD): 0 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.7

Hz, 2H), 7.38-7.27 (m, 5H)， 5.19 (ABX, J_AB = 1 .4 Hz, J_AX=J_BX=7.5 Hz, △ レ

=15.9 Hz, 2H)， 5.11 (AB J = 125 Hz, Δ 16.4 Hz.2H), 4.08 (m, 1H), 2.85 (s, 4H)， 2.66 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.97—1.43 (m, 6H). 6. KLH縮合体（8)の合成

ィ匕合物（7) (2.5 mg, 0.0043 mmol)の DMF (60 μ L)一 200 mM Na₂HP0₄— NaH₂P0₄, pH 7.4 (0.5 mL)溶液に KLHの 10 mM Na₂HP0₄— NaH₂P0₄， pH 7.4

(11.3mg/mL,442 / ）溶液を室温で加えた。 21時間後、反応混合物をセフアデックス G— 25M (フアルマシア， PD— 10)(PBS緩衝液）で精製し、 KLH 縮合体（8)を得た。 KLH縮合体（8)のタンパク濃度は Bradford法により決定した（1.3 mg/mL)o

7. BSA縮合体（9)の合成

化合物 (7) (3.0 mg, 0.0052 mmol)の DMF (40 μ L)溶液に BSA (6.0 mg)の 200 mM Na₂HP0₄— NaH₂P0₄, pH 7.4 (0.5 mL)溶液を室温で加えた。 12時間後、反応混合物をセフアデックス G— 25M (フアルマシア， PD— 10)(PBS緩衝液）で精製し、 BSA合体（9)を得た。 BSA縮合体（9)のタンパク濃度は Bradford法により決定した (1.3 mg/mL)₀ 化合物 (9)は ELISA実験に用いた。

.

免疫

実施例 2により製造した抗原（ K L H縮合体）の 50 g Z 50 L生理食塩水溶液を等量の完全フロイントアジュバントと混合し、その混合液を BALBZcマウス（4週齢、雌）に腹腔内注射したつ 10日後、抗原 50 g/50 _μ Lの生理食塩水溶液と等量の不完全フロイントアジュバントとの混合液で追加免疫を行い、さらに 10日後、同混合液で追加免疫を行つた ₌ その 7日後にマウスの尾静脈より採血し、抗体価を B S A—縮合体を用いた酵素標識免疫吸着アツセィ（EL I SA) 法（二次抗体ピオチン化抗マウス I gG抗体、アビジン、ピオチン化ペルォキシダ一ゼ）により測定し、 2. 5 X 10⁵抗体価の値を得た。 2回目の追加免疫より 1力月後に抗原 100 g / 1 00 Lの生理食塩水溶液を尾静脈より投与（最終免疫）した。ハイブリドーマの作製最終免疫より 3日後にマウスから脾臓を摘出し、次いで 1. 9 X 1 0⁸個の脾臓細胞と 2. 7 X 1 0⁷個のミエ口—マ細胞（X 63ZA g 8. 65

3) とをポリエチレングリコールを用いて細胞融合し、 6 X 1 0⁵/ゥエルのフィーダ一細胞（マウス胸腺細胞）を含む HAT選択培地（0. I mMヒポキサンチン、 0. 4 Mアミノプテリン、 0. 0 1 6mMチミジン、 1 0%ゥシ胎児血清RPMI培地）を加えた 96ゥエルプレート 1 0枚を用いて、得られた融合体の選別を行った（37 1 0%炭酸ガス）。 8— 14日後にコロニーが現れてきたゥエルより上清を取り、 E L I S A法によりスクリーニングを行った結果、 1 1 1個の陽性ゥエルが見られ、その内 57ゥェルよりクローニングを行い、 39株のクローンを得た。抗マウス I gG H 鎖抗体を用いて E L I S A法を行った結果、 39種全てのクローンが I g G を産生していた

麵 5

モノクローナル抗体の調製

実施例 4にて調製した 39種のハイプリドーマを完全培地（ 1 0%ゥシ胎児血清 R P M I培地）においてそれぞれ約 7日間培養した。その培養上清を等量の硫酸ァンモニゥム飽和溶液で硫安沈殿し、次いで S—セファロースカラムによる陽イオン交換カラムクロマトグラフィ一及びプロティン Gカラムによるァフィ二ティ一クロマトグラフィーを行い、それぞれ精製抗体 10—

2 Omgを得た。製造例 1

蛍光某哲（し 10)の合成

し 13 (28%)

1. 化合物（12)の合成

市販のアントラニル酸（1.3737 g， 10.0 mmol)の 0.5N水酸化ナトリウム

(20.0 mL)—ジォキサン（10.0 mL)—ァセトニトリル（2.0 mL)溶液にジー t—ブチルジカーボネート（3.124 g, 14.3 mmol)を 0 °Cで加えた：室温で 8時間攪拌後、揮発性溶媒を減圧下に溜去し、反応混合物に氷と 10% クェン酸溶液を加えて、酢酸ェチルで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を溜去し、酢酸ェチルーへキサンから結晶化し、 t一ブトキシカルボ二ルアントラニル酸（1.71 g, 72%)を得た：

1H - NMR (500 MHz, CDC1₃): S 10.1 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.09

(dd, J = 8.0 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.56 (dt, J = 8.0 Hz, 1.4 Hz, 1 H). 7.04 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 1.54 (s, 9H).

t—ブトキシカルボ二ルアントラニル酸は既知である（Nishino, N.; Powers, J. C. J. Biol. Chem. 1980, 255, 3482)₀ t一ブトキシカルボ二ルアントラニル酸（378.9 mg， 1.60 mmol)の塩化メチレン（2.5 mL)溶液に N_ヒドロキシスクシンイミド（225.9 mg, 1.96 mmol)、 WSC (565.9 mg, 2.95 mmol), DMAP (4.7 mg， 0.04 mmol)を室温で加え、 1時間攪拌した。反応混合物に 1 % クェン酸溶液を加えて、塩化メチレンで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗诤し、乾燥後、溶媒を溜去し、酢酸ェチルーへキサンから結晶化し、化合物 (12) (199.7 mg, 30%)を得た。

^ NMR (500 MHz, CDC1₃): $ 9.49 (s, 1H), 8.51 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 8.17 (d， J

= 8.0 Hz, 1H), 7.63 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.93 (s, 4H), 1.52 (s, 9H).

2. 化合物（L一 13)の合成

化合物（12) (67.3 mg, 0.201 mmol), N。一ベンジルォキシカルボ二ルー L— リジン（56.4 mg, 0.201 mmol)、ジイソプロピルェチルァミン（0.04 ml, 0.230 mmol)の混合物を DMF (0.2 mL)—メタノ一ル（0.2 mL)—酢酸ェチル（0.1 mL) 一水 (O.l mL)中、室温で 16時間攪拌した。揮発性溶媒を減圧下に溜去し、シリ力ゲルフラッシユカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル Zィソプロパノール/水 = 9/1/0—8/2/0.2— 5/3/1 )で精製し、残渣 22.2 mg)を得た。この残渣（122.2 mg)の塩化メチレン（l.O mL)—ァセトニトリル（0.1 m 溶液に 4 —ニトロべンジルアルコール（34.9 mg, 0.228 mmol), WSC (58.6 mg, 0.306 mmol), DMAP ( 1.4 mg, 0.01 1 mmol)を室温で加え、 4時間攪拌した。反応混合物をシリ力ゲルフラッシユカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチルダへキサン = 1/1.1 )で精製し、化合物（L一 13) (35.7 mg，化合物（12)から 28%)を得た

Ή- NMR (600 MHz, CDC1₃): δ 10.1 (s, 1H), 8.33 (d， J = 8.0 Hz, 1 H), 8.20 (d, J = 8.0 Hz, 2H)， 7.52 (d， J = 8.0 Hz, 2H), 7.44- 7.38 (m, 2H), 7.35— 7.28 (m， 81

° cc^ ^ ^ o I - T f H 4^ WN— Hi 0 ΐ -0 ：軍

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Z9P00/S6dr/13d 9ZP6Z/96 OM. A法

NO，

B法

化合物（し一 nおよび (D— ηの一合成

次に示す A法または B法に従って、種々のアミノ酸エステル誘導体を合成した。

A法：市販の L— または D—カルボべンゾキシァミノ酸（l eq)、 4—ニトロベンジルアルコール（1.1 eq)、 WSC ( 1.3 - 1.6 eq) , DMAP (0.01 eq)の塩化メチレン溶液を室温で 1時間撹拌した。溶媒を減圧下に溜去し、残渣に氷と 1N塩酸を加えて、酢酸ェチルで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥後、溶媒を溜去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ一で精製し、化合物（L一 1 )または（D— 1 )を得た c

B法：市販の L— または D—カルボベンゾキシァミノ酸（1 eq>、 4—二ト口ベンジルブロミド（ 1.5 eq)、トリェチルァミン（ 1.5 eq)の酢酸ェ千ル溶液を 2 時間加熱還流した：反応混合物を冷却し、氷と 1 N塩酸を加えて、酢酸ェチルで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗诤し、乾燥後、溶媒を溜去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（L

- 1 )または（D— 1 )を得た。 1 . N—（ベンジルォキシカルポ'ニル）ァラニン 4一二トロべンジルエステル (R = CH₃)の合成

A法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル Zへキサン = 2/3)で精製し、酢酸ェチルーへキサンから結晶化した。

一 NMR (500 MHz, CDC1₃): δ 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H)， 7.49 (d， J = 8.0 Hz,

2H), 7.37 - 7.30 (m, 5H)， 5.26 (s， 2H)， 5.24 (brd, I H), 5.12 (s, 2H), 4.47 (m, I H), 1.45 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

FABMAS m/z: 359 (M⁺ + H).

HR— FABMAS: C₁₈H₁₉0₆N₂ (M⁺ ₊ H)として、理論値： 359.1244, 実測値： 359.1244.

2 . N—（ベンジルォキシカルボニル）フエ二ルァラニン 4—二トロべンジルエステル（R = PhCH₂)の合成

A法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル /へキサン = 2/3)で精製し、酢酸ェチル一へキサンから結晶化した _c

Ή - NMR (600 MHz, CDC1₃): o 8. 17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38 - 7.23 (m, 10H), 7.08 (m， 2H), 5.23 (brd, J = 7.5 Hz, 1 H)， 5.19 ( s, 2H). 5.09 (s, I H). 4.92 (m, I H), 3.12 (d, J = 6.8 Hz, 2H).

3 . N— (ベンジルォキシカルボニル）口イシン 4一二トロベンジルエステル (R = (CH₃),CHCH₂)の合成

A法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル /へキサン = 1/2)で精製した： !H-NMR (600 MHz, CDCI3): S 8.22 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz,

2H)， 7.40-7.30 (m, 5H)， 5.25 (AB, J = 13.4 Hz, Δ v = 11.8 Hz, 2H), 5.11 (AB, J = 11.4 Hz, 厶レ =6.1 Hz, 2H), 5.13-5.11 (IH), 4.46 (m, IH), 1.74-1.52 (m, 3H), 0.95 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

4. N— (ベンジルォキシ力ルボニル）ノルロイシン 4—ニトロベンジルエステル（R = CH₃CH_?CHXH₂)の合成

B法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル Zへキサン =2/5)で精製し、酢酸ェチルーへキサンから結晶化した。

'H-NMR (500 MHz, CDC1₃): S 8.22 (d， J = 8.5 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.5 Hz,

2H)， 7.38-7.30 (m, 5H)， 5.26 (s, 2H), 5.20 (brd, J = 7.9 Hz, 1H)， 5.12 (s, 2H), 4.43 (m, IH), 1.85 (m, 1H)， 1.68 (m, 1H)， 1.37- 1.23 (m, 4H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H).

5. N—（ベンジルォキシカルボニル）メチォニン 4一二トロべンジルエステル（R = CH₃SCH,CH,)の合成

A法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル /へキサン =2/3)で精製した。

^-NMR (600 MHz, CDC )： d 8.22 (d， J = 8.0 Hz, 2H), 7. 1 (d, J = 8.0 Hz,

2H), 7.39-7.32 (m, 5H), 5.42 (brd, J = 7.1 Hz, 1H)， 5.27 (AB, J = 12.9 Hz, Δ ン = 12.4 Hz, 2H), 5.12 (s， 2H), 4.59 (m, 1H)， 2.53 (t， J = 7.1 Hz, 2H), 2.19 (m, IH), 2.07 (s, 3H), 2.01 (m, IH).

6. N— (ベンジルォキシカルボニル）パリン 4—二ト口ベンジルエステル（R = (CH,)_?CH)の合成

4.2 Hz, 2H), 5.11 (AB， J = 12.0 Hz, Δ レ = 21.1 Hz, 2H), 5.10 (s, IH).

9. N a一（ベンジルォキシカルボニル）一Νε —（tert—ブトキシカルボニル）リジン 4_ニトロベンジルエステルの合成

No一（ベンジルォキシカルボニル）一N e _(tert—ブトキシカルボニル）リジンを用レ、 B法に従って合成し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル Zへキサン =2/3)で精製し、酢酸ェチルーへキサンから fa曰曰 ^ [しした 0

一 NMR (600 MHz, CDC1₃): S 8.22 (d, J = 8.3 Hz, 2H)， 7.50 (d, J = 8.3 Hz,

2H, 7.38-7.30 (m, 5H)， 5.40 (brd, J = 6.6 Hz, IH), 5.25 (AB， J = 12.6 Hz, △ v = 8.1 Hz, 2H), 5.11 (AB, J = 12.2 Hz, Δ レ = 12.0 Hz, 2H), 4.55 (m, IH), 4.41 (m, 1H)， 3.12-3.07 (m, 2H), 1.88 (m, IH), 1.72 (m, IH), 1.60— 1.31 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).

1 0. N a一（ベンジルォキシカルボ二ル）一 D—リジン 4—ニト口べンジルエステル（ R = H₂NCH,CH₂CH,CH, )の合成

N a—(ベンジルォキシ力ルボニル)一 N ε -(tert -ブトキシカルボニル）一 D —リジン 4一二トロべンジルエステル（210.5 mg, 0.408 mmol)のクロ口ホルム（l.OmL)溶液にトリフルォロ酢酸（0.3 mL)を室温で加え、 8時間攪拌した。溶媒を減圧下に溜去し、酢酸ェチルーへキサンから結晶化した。

'H-NMR (500 MHz, CDC1₃— CD3OD): δ 8.22 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.51 (d, J

= 8.5 Hz, 2H), 7.40-7.26 (m, 5H), 5.27 (AB, J = 13.3 Hz, △ = 19.9 Hz, 2H)， 5.11 (AB, J = 12.3 Hz， △ レ = 19.1 Hz, 2H), 4.35 (m， IH), 2.87 (t， J = 7.2 Hz, 2H)， 1.88 (m, 1H)， 1.77—1.56 (m, 3H), 1.50-1.37 (m.2H). 觀例 ί

触媒活性を有するモノクローナル抗体の特定

1.蛍光測定による加水分解活性を有するモノクローナル抗体の特定

実施例 5にて調製した 39種の精製抗体の 50 mM トリス緩衝液、 pH 8.0溶液（360 _μし）に、製造例 1および 2にて製造したそれぞれ化合物（ L— 1 0 ) および（ D— 1 0 ) の等量混合物（Dし 10)の 150 a M DMSO溶液（40 μ L)を 25でで加え、振とう混和し、抗体濃度 1.5 _μ Μ、基質濃度 15 Μの反応溶液とした。ただちに、この反応溶液の蛍光強度の変化を 10分間、ス ex 340 nm, ス em 415 nmで追跡した。 10分間の蛍光強度の変化量から触媒活性を有する 14種の抗体を特定した。得られた結果を以下の表 1に示す。抗体 10分間の光強度の変化量

7G12 12.54

10C8 9.40

6C4 8.00

6B 12 7.20

10B2 7.10

7H 1 6.40

2E1 5.04

4G9 4.08

8H 10 3.49

8A11 3.40

5Η2 2.88

3G2 2.31

9F9 2.20

6G 10 2.08 2.蛍光測定による触媒抗体のェナンチォ選択性の特定

触媒抗体と特定された 14種の抗体の 50 mM トリス緩衝液、 pH 8.0溶液（360 L)に、製造例 1および 2にて合成した化合物（し 10)または化合物（D-10) の 150 M DMSO溶液（40 μ L)を 25でで加え、振とう混和し、抗体濃度 1.5 μ Μ、基質濃度 15 μ Μの反応溶液とした。ただちに、この 2種の反応溶液の蛍光強度の変化をそれぞれ 10分間、 A ex 340 nm、 A em 415 nmで追跡した。 10分間の蛍光強度の変化量からし体に対して選択的に触媒活性を有する 10種の抗体および、 D-体に対して選択的に触媒活性を有する 4種の抗体を特定した = 得られた結果を以下の表 2および表 3に示す。

¾ 2

レ iH护、 S勺^ [ 10 の ^: Itの化t

し- 10 D-10

7G12 23.29 0.80

10C8 30.45 0.48

6C4 10.4 0.77

6B12 9.67 0.90

10B2 7.90 0.96

7H1 8.00 1.03

2E1 7.80 1.28

4G-9 5.67 1.12

8H 10 5.05 0.72

6G10 3.00 0.62 表 3

D-体選択的抗体 10分間の ¾光強度の变化量

レ 10 D-10

3G2 0.38 4.32 5H2 0.40 5.16 8A11 0.30 4.62 9F9 0.48 4.44

抗体 7G12を産生するハイプリドーマをハイプリドーマ ZAA7G12、抗体 3G2を産生するハイプリドーマをハイプリドーマ ZAA3G2と命名した。ハイプリドーマ 7G12とハイプリドーマ 3G2は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタぺスト条約の下、工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ受託番号 FERM BP-4 94 7, FERM BP— 4 9 46として寄託されている（寄託日は共に平成 6年（ 1 994 ) 1 2月 2 1 曰）。

抗体 7G12および抗体 3G2の抗原結合部位である可変領域の D N A塩基配タ' IJは DyeDeoxy Terminator cycle Sequencingャット（ Applied Biosystems ) ¾用レて決定した。また、これに対応してアミノ酸配列を決定した c

抗体 7G12については、重鎖の可変領域における DN A塩基配列及びァミノ酸配列をそれぞれ配列番号 1及び 2に、軽鎖の可変領域における DN A塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 3及び 4に示す：また、抗体 3G2について、重鎖の可変領域における DN A塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 5及び 6に、軽鎖の可変領域における DN A塩基配列及びァミノ酸配列をそれぞれ配列番号 7及び 8に示す _c 隱

触媒活性を有するモノクローナル杭体の暂特異性およびェナンチォ選択十牛

1. HPLCによるモノクローナル抗体 7G12の基質特異性およびェナンチォ選択性の測定

抗体 7G12の 50 mM トリス緩衝液、 pH 8.0溶液（90 μ L)に、製造例 3で合成した基質化合物 Ν— (ベンジルォキシカルボ二ル）一 L—フエ二ルァラ二ン 4—ニト口べンジルエステル（L— l) (R = PhCH₂)の 2 mM DMSO溶液（10 / L)を 25で加え、振とう混和し、抗体濃度 10.8 μ Μ、基質濃度 200 Μの反応溶液とした。 HPLC (YMC AM— 303: C— 18， <j> 10 mm x 250 mm,ァ七ト二トリル Z0.1% トリフルォロ酢酸水溶液 = 35/65 (0- 7分)， 35/65— 90/10 (7— 15分)，90/10 (15—17分)，1.0 ₁11し/111^1, 278 0₁^にょり、反応溶液中の生成した 4—二トロべンジルアルコール（保持時間 5.9分)の量を経時的に追跡し、カロ水分解反応初速度を求めた。次に、 Ν—（ベンジルォキシカルボ二ル）— L— フエ二ルァラニン 4一二ト口べンジルエステル（L— l ) (R = PhCH₂)の代わりに N— (ベンジルォキシカルボニル）一 D—フエ二ルァラニン 4一二トロべンジルエステル（D— l ) (R = PhCH₂)を用いて同じ方法で反応を追跡し、加水分解反応初速度を求めた。また、抗体 7G12を加えない反応溶液中の自然分解により生成した 4一二ト口べンジルアルコールの量からバックグラウンドのカ口水分解反応速度を決定した。

抗体 7G12を用いた場合の L—体および D—体の基質化合物（R = PhCH₂)についての加水分解反応初速度からバックグラウンドの加水分解反応速度を差し引いて抗体 7G12の正味の加水分解反応初速度を決定した。抗体 7G12は D—体の基質化合物（D_ 1) (R = PhCH₂)の加水分解を触媒しなかつた。すなわち、抗体 7G12は、この基質の加水分解をェナンチォ選択的に触媒した。抗体 7G について、同じ方法で基質特異性およびェナンチォ選択性を検討した結果、製造例 3 で合成した、ァラニン、ロイシン、ノルロイシン、メチォニン、 ·ίリン、フエニルグリシン、 4ーヒドロキシフエニルグリシン、リジンに由来する基質化合物の L_体の加水分解をェナンチォ選択的に触媒した。 L—体の基質についての加水分解初速度およびバックグラウンドの反応速度定数を以下の表 4に示す。

¾4 抗体 7G 12による L-ァミノ酸エステル誘導体（L-1)の加水分解反応基質バックグランドの反応濃度初速度

反応速度定数

L-1 u neat 抗体 7G12 L-1 V

( -) (min- 1 ) (μΜ) (μΜ) (μΜ/min)

CH3- 1.06 x 10-4 10 200 3.49 χ 10-1

(CH3)2CHCH2- 1.26 x H)--5 10 200 6.20 χ 10-1

CH₃(CH₂)3- 1.71 x 10-5 5 100 3.74 χ 10-2

CH3SCH2CH2- 3.83 x 10-5 10 200 7.73 χ 10-1

PhCH2- 2.24 x Η)ό 10 200 3.85 χ 10-1

(CH₃)2CH- 6.47 10-6 5 100 5.54 χ 10-3

Ph- 5.62 χ 10-3 5 100 7.83 χ 10-1

4-HOPh- 1.84 χ 10-4 5 200 3.33 χ 10-l^a)

H₂N(CH₂)4- 1.40 χ 10-4 5 100 4.36 x 10-1 a)

D L-1を基質として反応した

2. HPLCによるモノクロ一ナル抗体 3G2の基質特異性およびェナンチォ選択性の測定

抗体 3G2について、抗体 7G と同じ方法で基質特異性およびェナンチォ選択性を検討した結果、製造例 3で合成した、ァラニン、フヱニルァラ二ン、シン、ノルシン、メチォニン、リン、フエニルダリシン、 4 —ヒドロキシフヱ二ルグリシンに由来する基質化合物の D—体の加水分解をェナンチォ選択的に触媒した。 D—体の基質についての加水分解初速度を以下の表 5に示す。なお、バックグラウンドの反応速度定数は表 4に示す値と同じである。 5 抗体 3 G 2による D-アミノ酸エステノレ誘導体（D-1)の加水分解反応

o ϋ o

基質反応度初速度

D-1 抗体 3G2 D、-1 V

( -) (μΜ) (μΜ) (μΜ/min)

CH3- 9. 1 x】0-2

(CH3)2CHCH2- 1.16 x 10-1

CH₃(CH₂):v 9.12 !0-2

4-HOPh- OS x 10-

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 6 4 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

配列

10 20 30 40 50 60 70

CTCGAGTCTG GGACTGAACT GGCAAAACCT GGGGCCTCAG TGAAGATGTC CTGCAAGGCT TCTGGCTACA GAGCTCAGAC CCTGACTTGA CCGTTTTGGA CCCCGGAGTC ACTTCTACAG GACGTTCCGA AGACCGATGT

80 90 100 110 120 130 140

CCTTCACTAG CTACTGGATA CACTGGGTAA AACAGAGGCC TGGACAGGGT CTGGAATGGA TTGGATACAT GGAAGTGATC GATGACCTAT GTGACCCATT TTGTCTCCGG ACCTGTCCCA GACCTTACCT AACCTATGTA

150 160 170 180 190 200 210

TAATCCTAGT ACTGATTATA CTGAGTACAT TCAGAAGTTC AAGGACAAGG CCACATTGAC TGCAGACAAA ATTAGGATCA TGACTAATAT GACTCATGTA AGTCTTCAAG TTCCTGTTCC GGTGTAACTG ACGTCTGTTT

220 230 240 250 260 270 280

TCCTCCAGCA CAGCCTACAT GCAACTGAGC AGCCTGACAT CTGAGGACTC TGCAGTCTAT TACTGTGTAA AGGAGGTCGT GTCGGATGTA CGTTGACTCG TCGGACTGTA GACTCCTGAG ACGTCAGATA ATGACACATT

290 300 310 320 330 340 350

TGAAGGACTA CTGGGGTCAA GGAACTTCAG TCACCGTCTC CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA ACTTCCTGAT GACCCCAGTT CCTTGAAGTC AGTGGCAGAG GAGTCGGTTT TGCTGTGGGG GTAGACAGAT

360 370 380 390 400 410 420

TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT AGGTGACCGG GGACCTAGAC GACGGGTTTG ATTGAGGTAC CACTGGGACC CTACGGACCA GTTCCCGA A 430 440 450 460 470 480 490

TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG AAGGGACTCG GTCACTGTCA CTGGACCTTG AGACCTAGGG ACAGGTCGCC ACACGTGTGG AAGGGTCGAC

500 510 520 530 540 550 560

TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC AGGACGTCAG ACTGGAGATG TGAGACTCGT CGAGTCACTG ACAGGGGAGG TCGTGGACCG GGTCGCTCTG

570 580 590 600 610 620 630

CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GCAGTGGACG TTGCAACGGG TGGGCCGGTC GTCGTGGTTC CACCTGTTCT TTTAACACGG GTCCCTAACA

640

ACTAGT TGATCA

配列番号： 2

配列の長さ： 2 1 2

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Leu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys MET Ser Cys

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp l ie Hi s Trp Val Lys Gin Arg

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp l ie Gly Tyr l i e Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr

Glu Tyr l ie Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr MET Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

Tyr Cys Val MET Lys Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin

Thr Asn Ser MET Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Thr Ser

配列番号： 3 配列の長さ： 6 4 0 配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA 配列 10 20 30 40 50 60 70

GAGCTCGTGA TGACCCAGAC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACC ATGACCTGCA

CTCGAGCACT ACTGGGTCTG AGGTCGTTAG TACAGACGTA GAGGTCCCCT CTTCCAGTGG TACTGGACGT

80 90 100 110 120 130 140

GTGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGC ACCCCCCCCA AAAGATGGAT

CACGGTCGAG TTCATATTCA ATGTACGTGA CCATGGTCGT CTTCGGTCCG TGGGGGGGGT TTTCTACCTA

150 160 170 180 190 200 210

TTATGGCACA TCCAAACTGA CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTTT

AATACCGTGT AGGTTTGACT GAAGACCTCA GGGACGAGCG AAGTCACCGT CACCCAGACC CTGGAGAAAA

220 230 240 250 260 270 280

TCTCTCACAA TCAGCAGCAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA CTTATTACTG CCATCAGCGG AGTAGT ACC

AGAGAGTGTT AGTCGTCGTA CCTCCGACTT CTACGACGGT GAATAATGAC GGTAGTCGCC TCATCAATGG

290 300 310 320 330 340 350

CGACGTTCGG TGGAGGCACC AAGCTGGAAA TCAAACGGGC TGATGCTGCA CCAACTGTAT CCATCTTCCC

GCTGCAAGCC ACCTCCGTGG TTCGACCTTT AGTTTGCCCG ACTACGACGT GGTTGACATA GGTAGAAGGG

360 370 3 80 390 400 410 420

ACCATCCAGT GAGCAGTTAA CATCTGGAGG TGCCTCAGTC GTGTGCTTCT TGAACAACTT CTACCCCAAA

TGGTAGGTCA CTCGTCAATT GTAGACCTCC ACGGAGTCAG CACACGAAGA ACTTGTTGAA GATGGGGTTT

430 440 450 460 470 480 490

GACATCAATG TCAAGTGGAA GATTGATGGC AGTGAACGAC AAAATGGCGT CCTGAACAGT TGGACTGATC

CTGTAGTTAC AGTTCACCTT CTAACTACCG TCACTTGCTG TTTTACCGCA GGACTTGTCA ACCTGACTAG

500 510 520 530 540 550 560

AGGACAGCAA AGACAGCACC TACAGCATGA GCAGCACCCT CACGTTGACC AAGGACGAGT ATGAACGACA

TCCTGTCGTT TCTGTCGTGG ATGTCGTACT CGTCGTGGGA GTGCAACTGG TTCCTGCTCA TACTTGCTGT

570 580 590 600 610 620 63 0

TAACAGCTAT ACCTGTGAGG CCACTCACAA GACATCAACT TCACCCATTG TCAAGAGCTT CAACAGGAAT

ATTGTCGATA TGGACACTCC GGTGAGTGTT CTGTAGTTGA AGTGGGTAAC AGTTCTCGAA TGTCCTTACT

640 650

GAGTGTTAAT TCTAGA GTCACAATTA AGATCT 配列番号： 4

配列の長さ： 2 1 3

配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Glu Leu Val MET Thr Gin Thr Pro Ala lie MET Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr MET Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser lie Ser Tyr MET His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Pro Pro Lys Arg Trp lie Tyr Gly Thr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr lie Ser Ser MET Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp l ie Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser MET Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro lie Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys . Phe . 配列番号： 5

配列の長さ： 6 5 6

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

配列

10 20 30 40 50 60 70

CTCGAGTCTG GACCTGAGCT GGTGAAGCCT GGGGGCTCAG TGACGATTTC CTGCAAAGCT TCTGGCTACG

GAGCTCAGAC CTGGACTCGA CCACTTCGGA CCCCCGAGTC ACTGCTAAAG GACGTTTCGA AGACCGATGC

80 90 100 110 120 130 140

GATTCACTAC CTCTTGGATG AACTGGGTGA GGCAGAGGCC TGGACAGGGT CTTGAGTGGA TTGGACGGAT

CTAAGTGATG GAGAACCTAC TTGACCCACT CCGTCTCCGG ACCTGTCCCA GAACTCACCT AACCTGCCTA

150 160 170 180 190 200 210

TTATCCTGGA AGTGGGGATA ATAATTACAA TGGGAAGTTC AAGGTCAAGG CCACATTGAC TGCAGAGAGA

AATAGGACCT TCACCCCTAT TATTAATGTT ACCCTTCAAG TTCCAGTTCC GGTGTAACTG ACGTCTCTCT

220 230 240 250 260 270 280

TCCTCCACCA CAGTCTACCT GCACCTCAGC AGCCTGACCT CTGTAGATTC TGCGGTCTAT TTCTGTGCAA

AGGAGGTGGT GTCAGATGGA CGTGGAGTCG TCGGACTGGA GACATCTAAG ACGCCAGATA AAGACACGTT

290 300 310 320 330 340 350

GATTTCACTA TGATTATCGT CGTTCCTATG CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACTTCAG TCACCGTCTC

CTAAAGTGAT ACTAATAGCA GCAAGGATAC GATACCTGAT GACCCCAGTT CCTTGAAGTC AGTGGCAGAG

360 370 380 390 400 410 420

CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GAGTCGGTTT TGCTGTGGGG GTAGACAGAT AGGTGACCGG GGACCTAGAC GACGGGTTTG ATTGAGGTAC

430 440 450 460 470 480 490

GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC CACTGGGACC CTACGGACCA GTTCCCGATA AAGGGACTCG GTCACTGTCA CTGGACCTTG AGACCTAGGG 500 510 520 530 540 550 560

TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC

ACAGGTCGCC ACACGTGTGG AAGGGTCGAC AGGACGTCAG ACTGGAGATG TGAGACTCGT CGAGTCACTG

570 580 590 · 600 610 620 630

TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG

ACAGGGGAGG TCGTGGACCG GGTCGCTCTG GC AGTGGACG TTGCAACGGG TGGGCCGGTC GTCGTGGTTC

640 650 660

GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT ACTAGT CACCTGTTCT TTTAACACGG GTCCCTAACA TGATCA

配列番号： 6

配列の長さ： 2 1 0

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Val Thr l ie Ser Cys Lys

Al a Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Thr Ser Trp MET Asn Trp Val Arg Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp l ie Gly Arg li e Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Asn Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Arg Ser Ser Thr Thr Val Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe His Tyr Asp Tyr Arg Arg Ser Tyr Ala MET Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser

Ala Ala Gin Thr Asn Ser MET Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser V l Thr Val Pro Ser

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

Lys Val Asp Lys Lys He Val Pro Arg Asp Cys Thr Ser

配列番号： 7

配列の長さ： 6 5 2

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

配列

10 20 30 40 50 60 70

GAGCTCGTGA TGACCCAGAC TCCATCTTCC ATGTATGCAT CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA

CTCGAGCACT ACTGGGTCTG AGGTAGAAGG TACATACGTA GAGATCCTCT CTCTCAGTGA TAGTGAACGT

80 90 100 110 120 130 140

AGGCGAGTCA GGACATTAAT ATCTATTTAA GTTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTAAGGCCCT

TCCGCTCAGT CCTGTAATTA TAGATAAATT CAACCAAGGT CGTCTTTGGT CCCTTTAGAG GATTCCGGGA 150 160 170 180 190 200 210

GATCTATCGT ACAAACGGAT TGGTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGCAAGAT CTAGATAGCA TGTTTGCCTA ACCATCTACC CCAGGGTAGT TCCAAGTCAC CGTCACCTAG ACCCGTTCTA

220 230 240 250 260 270 280

TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAATAT GAAGATATGG GAATTTATTA TTGTCTACAG TATGATGAGT ATAAGAGAGT GGTAGTCGTC GGACCTTA A CTTCTATACC CTTAAATAAT AACAGATGTC ATACTACTCA

290 300 310 320 330 340 350

TTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT AAGGCATGTG CAAGCCTCCC CCCTGGTTCG ACCTTTATTT TGCCCGACTA CGACGTGGTT GACATAGGTA

360 370 380 390 400 410 420

CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC GAAGGGTGGT AGGTCACTCG TCAATTGTAG ACCTCCACGG AGTCAGCACA CGAAGAACTT GTTGAAGATG

430 440 450 460 470 480 490

CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA GGGTTTCTGT AGTTACAGTT CACCTTCTAA CTACCGTCAC TTGCTGTTTT ACCGCAGGAC TTGTCAACCT

500 510 520 530 540 550 560

CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG ACGAGTATGA GACTAGTCCT GTCGTTTCTG TCGTGGATGT CGTACTCGTC GTGGGAGTGC AACTGGTTCC TGCTCATACT

570 580 590 600 610 620 630

ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC TGCTGTATTG TCGATATGGA CACTCCGGTG AGTGTTCTGT AGTTGAAGTG GGTAACAGTT CTCGAAGTTG

640 650

AGGAATGAGT GTTAATTCTA GA TCCTTACTCA CAATTAAGAT CT 配列番号： 8

配列の長さ： 2 0 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド 6£

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Claims

請求の範囲

1. アミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体を用いることを特徴とする、アミノ酸ラセミ体の光学分割を行なう方法。

2. アミノ酸エステル誘導体が 4—二ト口べンジルエステル体である請求項 1に記載の方法。

3. アミノ酸エステル誘導体がアミノ保護されている請求項 1又は 2に記載の方法。

4. アミノ酸エステル誘導体が式：

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルであり、

Rは、ヒドロキシ、ァミノ、アルキルチオ、ァシルォキシもしくはフエルによって置換されていることあるアルキル基またはフエニル基である] で表される化合物である請求項 1〜 3までのいずれかに記載の方法。

5. アミノ酸エステル誘導体が式：

.CBZ

HN

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルであり、

Rは CH₃—、 p h CH CH₃)₂CHCH₂—、 CH₃(CH₂)₃—、 CH₃ S CH₂CH₂—、（CH₃)₂CH—、 p h—、 4— HOp h—である] で表される化合物である請求項 4に記載の方法。

6. アミノ酸エステル誘導体が式：

[式中、 CB Zおよび Rは請求項 4における定義と同意義である] で表される化合物である請求項 1〜 3までのいずれかに記載の方法 _c 7. アミノ酸エステル誘導体が式：

D-1

[式中、 CB Zおよび Rは請求項 5における定義と同意義である] で表される化合物である請求項 6に記載の方法。

8. 触媒抗体が式：

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルである]

で表される化合物をハプテンとする抗原刺激によって生成されるものである請求項 1〜 7までのいずれかに記載の方法。

9. 触媒抗体がハイプリドーマ Z AA 7G12から産生されるものである請求項 1〜8までのいずれかに記載の方法。

1 0. 触媒抗体がハイプリド—マ Z A A 3G2から産生されるものである請求項 1〜 8までのいずれかに記載の方法。

1 1. a ) ラセミ体のアミノ酸をエステル形成反応に付し、

b) アミノ酸エステル誘導体をェナンチォ選択的に加水分解する触媒抗体を用いることによって、エステル誘導体の D体又は L体の任意の立体異性体を選択的に加水分解し、そして

c) 得られた混合物を常法により処理して、加水分解された立体異性体を単離すること、を特徴とする、光学活性アミノ酸の調製方法。

1 2. 工程（c) において、得られた混合物を酸性又は塩基性にし、有機溶媒抽出して、水層を入手する、請求項 1 1に記載の方法。

1 3. アミノ酸エステル誘導体が 4—二ト口ベンジルエステル体である請求項 1 1又は 1 2に記載の方法。

1 4. アミノ酸エステル誘導体がァミノ保護されている請求項 1 1又は 1 2に記載の方法。

1 5. アミノ酸エステル誘導体が式：

[式中、 C B Zは N-ベンジルォキシカルボニルであり、

Rは、ヒドロキシ、ァミノ、アルキルチオ、ァシルォキシもしくはフユルによって置換されていることあるアルキル基またはフエニル基である] で表される化合物である請求項 1 1〜 1 4までのいずれかに記載の方法。

1 6. アミノ酸エステル誘導体が式

.CBZ

HN

[式中、 C B Zは N—ベンジルォキシカルボニルであり、

Rは CH₃—、 p hCH₂_、（CH₃)₂CHCH₂_、 CH₃(CH₂)₃—、 CH₃ S CH₂CH₂—、（CH₃)₂CH—、 p h―、 4一 H〇p h—である] で表される化合物である請求項 1 5に記載の方法。

1 7. アミノ酸エステル誘導体が式：

D-1

[式中、〇82ぉょびは請求項1 5における定義と同意義である] で表される化合物である請求項 1 1〜 1 4までのいずれかに記載の方法 _c

1 8. アミノ酸エステル誘導体が式：

D-1

[式中、 CBZおよび Rは請求項 1 6における定義と同意義である] で表される化合物である請求項 1 7に記載の方法：

1 9. 触媒抗体が式：

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルである]

で表される化合物をハプテンとする抗原刺激によって生成されるものである請求項 1 1〜 1 8までのいずれかに記載の方法。

20. 触媒抗体がハイプリドーマ ZAA7G12から産生されるものである請求項 1 9に記載の方法。

2 1. 触媒抗体がハィブリド―マ ZAA 3G2から産生されるものである請求項 1 9に記載の方法。

2 2. 式：

[式中、 CB Ζは Ν—べンジルォキシカルボニルである]

で表される化合物をハプテンとする抗原刺激によって生成される抗体 _c 23. ノヽイブリドーマ ZAA7G12から産生される請求項 22に記載の抗体 _c 24. ハイプリドーマ ZAA3G2から産生される請求項 22に記載の抗体。

2 5. 式：

[式中、 CB Zは N—ベンジルォキシカルボニルである]

で表される化合物をハプテンとする抗原刺激によって生成される触媒抗体を産生するハイプリドーマ。

26. ハイプリドーマ ZAA7G12である請求項 2 5に記載のハイプリドーマ ₍ 2 7. ハイプリドーマ ZAA3G2である請求項 2 5に記載のハイプリドーマ。