WO1996016987A1

WO1996016987A1 - Facteur thrombocytotique

Info

Publication number: WO1996016987A1
Application number: PCT/JP1995/002446
Authority: WO
Inventors: Makoto Kawakita; Hiromitsu Matsuzaki; Kiyoshi Takatsuki; Kazushi Shibuya; Masato Higuchi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1996-06-06
Also published as: EP0801076A1; US5856444A; CA2206496A1; AU3994095A; EP0801076A4

Description

明細書血小板増多因子技術分野

本発明は、巨核球系細胞に作用し、その分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する新規生理活性物質（血小板増多因子）、及び当該生理活性物質を有効成分とする血小板減少治療用医薬組成物に関するものである。本発明の生理活性物質（血小板増多因子）は、巨核球-血小板系に作用し、その分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有するので、化学療法や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬、予防薬の有効成分等として、特に医療の分野において有用なものである。背景技術

生体を構成する体細胞に不可欠な媒質である血液中には、有形成分としての、赤血球、白血球、リンパ球、血小板等の血液細胞が存在し、当該血液細胞は、それぞれ固有の機能を分担して、生体を恒常に保つ役割を担っている。ところで、当該血液細胞の生体内における分化、成熟、及び増殖等の実体を解明することは、血液学分野における長年の研究課題とされてきたが、近年になって、各種の血液細胞は、骨髄中の 1種類の多機能性造血幹細胞より分化、成熟すること、及び、その分化、成熟の過程において各種の生体内液性因子が関与していること等の事実が明らかとなった。

これらの事実から、当該生体内液性因子は、血球系細胞の'减少を伴う疾患の治療薬等の医薬品への応用が期待されており、これまでに、例えば、エリスロポエチン、 G— C S F、 G M— C S F、 M - C S F、インターロイキン等の各種の液性因子が見い出され、その一部は、赤血球系、白血球系、リンパ球系等の血液細胞に対する分化、成熟を促進する作用を有する医薬品として実際に応用されるに至っている。

ところで、血小板は、血液中に存在する直径 2〜 3 i mの無核の細胞であり、生体における止血や血栓の形成に重要な役割を有する血液中の有形成分の一種であるが、当該血小板は、骨髄中の多機能性造血幹細胞から巨核球系前駆紬胞を経て巨核芽球となり、更に成熟した巨核球の細胞質が断片化して生成され、血液中に放出されることが明らかとなっている。

そして、最近になって、巨核球—血小板系についての研究成果種々報告されており、例えは、 1 L一 6力、血小板の前駆 ¾ΠΓ てある巨核球の成熟を促進する作用を有することが報告されている〔丁 o s h i y u k i I s h i b a s h i , e t a 1. , P r o c . a t l . A c a d. S c i . U S A. , V o l . 8 6， 5 9 5 3 - 5 9 5 7 ( 1 9 8 9 ) 、及び丁 0 5 11 1 1] 1^ 1 I s h i b a s h i , e t a 1 . , B l o o d. , V o l . 7 4 , 1 2 1 - 1 2 4 4 ( 1 9 8 9 ) o

更に、これまでの研究によると、骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させるには、 2種類の異なった作用を有する因子があると考えられている〔 W i l l i a m s , N. ， e t a 1 . , J . C e 1 1 P h y s i o l . , 1 1 0 , 1 0 1 ( 1 9 8 2 ) 〕。すなわち、当該因子としては、単独で巨核球コロニーを形成する巨核球コロニー刺激因子 M e g - C S Fと、それだけでは巨核球コロニ—を成させる活性はないか、当該 M e g— C S Fの存在下に巨核球コロニー数を増加させたり、その成熟を促進する活性を有する巨核球増幅因子 M e g— P OTの存在が報告されている。

そして、例えば、ヒトで M e g— C S F活性を有するものとしては、 I L - 3 LT e r a m u r a, M . , e t a 1 . , E x p . H e m a t o に， 1 6. 8 4 3 ( 1 9 8 8 ) 〕や、顆粒球 . マク口ファージコロニー刺激因子 [ T e r a m u r a . M. , e t a 1 . , E x p . H e m a t o l . , 1 7 , 1 0 1 1 ( 1 9 8 9 ) 〕 c - M ρ 1 リガン K 〔 d e S a u v a g e F . J . , e t a 1 . , N a t u r e , 3 6 9 , 5 3 3 ( 1 9 9 4 ) 、 K a u s h a n s k y K. , e t a l . , N a t u r e , 3 6 9 , 5 6 8 ( 1 9 9 4 ) 〕等が報告されている。また、ヒトで M e g — P 〇 T活性を有するものとしては、 I L 一 6 CT e r a m υ r a , M . a n d M i z o g u c h i , H. , I n t . J . C e l l C 1 o n i n g , 8 , 2 4 5 ( 1 9 9 0 ) 〕、 I L - 1 1 C T e r a m υ r a , M. , e t a l . , B l o o d , 7 9， 3 2 7 ( 1 9 9 2 ) 〕、及びエリスロポエチン〔 B r u n o , E . , e t a 1 . , B l o o d , 7 3 , 6 7 1 ( 1 9 8 9 ) 〕等が報告されている o

しかしながら、これらのものの多くは巨核球—血小板系に特異的に作用する因子ではなく、むしろ他の血球系や血球系以外の細胞に対しても作用してその活性を発現することが知られている。従って、仮りに、これらのものを医薬品として巨核球一血小板系への作用を期待して投与した場合、当該活性とは別の活性をも発現してしまうことが危惧される。すなわち、例えば、前記 I L 一 6 は、前記作用以外にも多岐に亘る作用を有しており、その 1 例として、生体内での急性期反応蛋白質として、炎症の惹起に深く関与している二と等が知られていることから示唆されるように、当該 I L — 6 をそのまま医薬品として使用した場合には、強力な副作用を伴うことが危惧される。

このようなことから、巨核球一血小板系に作用する因子については、当該巨核球一血小板系に特異的に作用するものであって、かつ、その分化、成熟を促進する高い活性を有する生理活性物質を見い出すことが重要であり、当業界において、このような生理活性物質を開発することが強く要請されている状況にあった。発明の要約

本発明は、巨核球 -血小板系に作用し、巨核球細胞の分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する生理活性物質を提供することを目的とする。

本発明は、分子中に下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする血小板増多因子、及び当該血小板増多因子を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物、に係る。

Xaa G l y As n Asn As p G l u Ser As n 【l e Ser Phe Ly s G l u し y s Asp l i e

( Xaa は、アミノ酸が特定されていないことを示す）

上記生理活性物質は、化学治療や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬及び予防薬等の有効成分として有用である

発明の開示

二のような状況を踏まえて、本発明者等は、巨核球-血小板系に作用し、その分化、成熟及び Z又は増殖を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する新しい生理活性物質を見い出すことを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、未分化甲状腺癌患者由来の K H M 一 5 M細胞株、シーゼリィ病患者由来の H U T 7 8細胞株等の培養上清中に当該活性を有する物質が存在することを見い出すと共に、更に当該培養上清から、巨核球-血小板系に対する活性を指標として、目標とする生理活性物質を採取し、精製、単離して、その性状を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明は、巨核球 -血小板系に作用し、その分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する新規生理活性物質（血小板増多因子）を提供することを目的とするものである。また、本発明は、巨核球—血小板系に作用し、アセチルコリンェステラーゼ産生を促進する活性を有する新規生理活性物質（血小板増多因子）を提供することを目的とするものである。

また、本発明は、当該生理活性物質（血小板増多因子）を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物を提供することを目的とするものである。

更に、本発明は、当該生理活性物質を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物であって、血小板減少に伴う疾患や、血小板の機能異常を伴う疾患の治療あるいは予防等に有効な医薬組成物を提供することを目的とするものである。

このような課題を達成する本発明は、以下の（ 1 ) 〜（ 2 ) の技術的手段から構成される。

( 1 ) 次の性質；

①げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、ァセチルコリンエステラーゼ産生を促進する活性を有する；

② i n v i t r oにおいて、巨核球の分化、成熟を促進する活性を有する；

③ S D S— P A G Eで測定される分子量が約 4 2 k Dである；

④分子中に下記のァミノ酸配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn 【le Ser Phe し ys Glu Lys

Asp lie

( Xaa は、アミノ酸が特定されていないことを示す）を有する；

ことを特徴とする血小板増多因子。

( 2 ) 前記（ 1 ) に記載の血小板増多因子を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物。

以下に、本発明の内容を詳細に説明する。

本発明の新規生理活性物質（血小板増多因子）は、げっ歯類の巨核球一血小板系に作用し、アセチルコリンエステラーゼ（以後、 A c h E と記載することがある）の産生を促進する活性を有することを特徴とする。しかして、当該アセチルコリンエステラーゼは、げつ歯類の巨核球系細胞の分化及び/又は成熟に伴い産生される酵素であることから、前記 A c h E産生を促進する活性は、本発明の生理活性物質が、巨核球一血小板系に対して作用することを示すものである。

このように、本発明の生理活性物質は、巨核球-血小板系に対する活性を有するが、ここで言う巨核球 -血小板系に対する活性とは、巨核球もしくはその前駆細胞の分化、成熟を促進する、あるいは、巨核球から血小板が生成される過程における血小板の生成を促進する活性を有することを意味する。

次に、本発明の生理活性物質の巨核球 -血小板系に対する前記活性を測定するには、例えば、骨髄細胞や巨核球系細胞を使用し、被実験物質（サンプル）をこれらの細胞に作用させて、巨核球や血小板に特異的な蛋白質や酵素の出現を測定する方法が好適なものとして使用される。

げっ歯類の巨核球系細胞は、その分化、成熟に伴い、ァセチルコリンエステラーゼを産生するので、例えば、細胞を染色して A c h Eを産生する細胞数を測定するか、もしくは産生される A c h E活性を分光光度計で測定すること [T o s h i r o N a g a s a w a等，日本血液学会雑誌， 4 9巻， 1 6 8 8 — 1 6 9 5頁（ 1 9 8 6年）参照〕等により、生理活性物質の巨核球 -血小板系に対する前記活性を測定することができる。

尚、後述するように、本発明の生理活性物質は、当該測定方法によりその活性を測定した結果、巨核球系細胞に作用し、ァセチルコリンエステラーゼ産生を促進する活性を有するものであり、その分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有するものであることが分った。

次に、本発明の生理活性物質は、 S D S - P A G E ( S D S -ボリアクリルアミドゲル電気泳動）で測定される分子量か、約 4 2 k Dであることを特徴とする。一般に、生理活性物質の分子量は、ゲル濾過や S D S— P A G E等の分子量測定方法により測定され、その測定値は、当該測定方法の種類、測定に用いる担体や分子量マーカーの種類、測定条件等によって微妙に変動することがあるか、本発明の生理活性物質は、前記したように、 S D S— P A G Eで測定した場合の分子量が、約 4 2 k Dである。

尚、この場合、後述するように、分子量マ一力一として、フアルマシア L MW k i t E (フアルマシア社製）の 1 4. 4 k D 、 2 0. l k D、 3 0 k D、 4 3 k D、 6 7 k D及び 9 4 k Dの分子量マーカーを使用して測定を行った。

次に、本発明の生理活性物質は、分子中に以下に示すァミノ酸配列を有することを特徴とする。当該アミノ酸配列は、後述するように、プロテインシーケンサ一により、実験的に同定したものである

(配列）

Xaa Gl y Asn Asn Asp Gl u Ser Asn Me Ser Phe し ys G 1 u し ys Asp lie

(Xaa は、アミノ酸が特定されていないことを示す）

次に、本発明の生理活性物質は、その由来として、前記未分化甲状腺癌患者由来の K HM - 5 M細胞株、シーゼリィ病患者由来の H U T 7 8細胞株等が好適なものとしてあげられる力その由来はこれに限定されるものではなく、例えば、本発明の生理活性物質を産生し得るヒト由来細胞の培養上清や、尿等のヒト体液から得たもの、本発明の生理活性物質に対する遺伝子を利用して遺伝子工学的に產生させたもの等であってもよい。

尚、後述するように、本発明の具体的説明においては、 K HM - 5 M細胞株及び HU T 7 8細胞株を使用し、かつ当該 K HM - 5 M 細胞株あるいは H U T 7 8細胞株の培養上清から得られたものを好適な例として開示している。

次に、本発明の生理活性物質の製法について説明すると、本発明の生理活性物質は、例えば、下記の工程により効率よく製造することができる。

( 1 ) K HM— 5 M細胞株等を培養する。

( 2 ) K HM— 5 M細胞株等の培養上清を回収する。

( 3 ) 培養上清を限外濾過膜により濃縮する。

( 4 ) 下記の①〜⑤により精製を行なう。

① D E A E— S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマ卜ケラフィー

②第 1 回目逆相高速液体クロマトグラフィー

③第 2回目逆相高速液体クロマトグラフィー

④ゲル濾過

⑤ S D S - P A G E

本発明では、当該工程による製法が好適なものとしてあげられるが、これに限定されるものではなく、これらの工程に、必要に応じて他の工程を付加した製法も適宜使用される。

次に、前記各工程について説明する。

前記（ 1 ) の K HM - 5 M細胞株等の培養工程は、当該細 11 か ¾ 殖し得る培養条件により適宜実施される。すなわち、 K HM— 5 M 細胞株等を増殖させるのに好適な濃度の血清や増殖因子、例えは、ゥシ胎児血清やインスリン等を含む培地を用いて、 3 7 °Cで培養する。培地としては、一般的に使用されている DME M ( D u 1 b e c c 0 ' s M o d i f i e d E a g l e ' s M e d i u m ) 、 I MDM C I s c o v e ' s M o d i f i e d D u 1 b e c c o ' s M e d i u m) 、及び R P M I - 1 6 4 0等の培地が好適なものとしてあげられる。当該細胞を、その増殖に好適な条件で培養した後、本発明の生理活性物質の回収に適切な条件、例えは、血清等を含まない完全合成培地に移して培養することか好ましい。また、当該細胞を、動物固体を利用して培養することも可能である。すなわち、動物個体内に当該細胞を移植するか、又は動物個体内あるいは個体外に取り付けた拡散チャンバ一内にて、動物の体液を利用して培養することも可能である。更に、動物個体を利用して培養した当該細胞を、動物個体から取り出して分散し、適当な増殖培地にて培養することも可能である。当該細胞を動物個体を利用して培養する場合に使用する動物としては、当該細胞が増殖し得る動物であれば適宜使用可能であり、例えば、胸腺摘出あるいは抗胸腺抗体処理されたマウス、ラット、ノヽムスター、ヌードマウス、ヌ一ドラット等が好適なものとしてあげられる。

次に、前記（ 2 ) の K H M - 5 M細胞株等の培養上清の回収工程は、例えば、前記（ 1 ) により K H M— 5 M細胞株等を培養した培地から、適宜の手段でその培養上清を回収すればよく、 K H M - 5 M細胞株等を培養後、培養容器から培地を取り出し、必要かあれは、遠心分離、據過等の手段により、培地中の当該細胞と培養上清とを分離し、培養上清を回収する。

このように、培養上清は、本発明の生理活性物質を含有する K H M - 5 M細胞株等の培養上清であれば、血清等を含む培地であっても、あるいは動物の体液であってもよい。

次に、前記（ 3 ) の限外據過膜による培養上清の濃縮は、常法により市販の限外濾過膜を利用して実施することにより、適宜のしべルに濃縮し、液体濃縮物を調製すればよく、その手段は、特に限定されるものではない。

尚、本発明の生理活性物質を含有する液体濃縮物としては、前記 1く？1 1^ー 5 1^細胞株、 H U T 7 8細胞株等が好適なものとして使用されるか、その他、本発明の生理活性物質を産生しうる組織ゃ紬^ の培養上清、本発明の生理活性物質を産生し得る細胞や微生物を培養した培地、本発明の生理活性物質を含有する体液等の濃縮物を適宜使用することができる。次に、このようにして得た培養上清の濃縮物から本発明の生理活性物質を精製する方法は、特に限定されるものではなく、塩折、限外濾過、等電点沈澱、ゲル濾過、ィォン交換ク口マトダラフィ —、疎水性クロマトグラフィー、抗体ァフィ二ティークロマトグラフィ一、クロマトフォーカシング、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ一等、多くの成書、例えば、〔生化学実験口座 1 夕ンパク質の科学，日本生化学会編，東京化学同人（ 1 9 7 6年〕等に記載された方法の中から、適宜の方法を選択し、適宜実施すればよいが、特に、前記工程（ 4 ) は、 ① D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマトグラフィー、 ②〜③逆相高速液体ク口マトグラフィー、 ④ゲル濾過、及び⑤ S D S— P A G Eを組み合わせてなる好適な精製ステップであり、当該精製ステップを利用することにより、本発明の生理活性物質を効率よく精製することかできる。

前記工程（ 4 ) において、イオン交換クロマトグラフィーとしては、 D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマ卜グラフィ一が、逆相高速液体クロマトグラフィーとしては、 V y d a c P r o t e i n C 4 R P— H P L Cが、また、ゲル濾過としては、 T S K G 3 0 0 0 S WX L G P Cが好適なものとしてあけられる。

尚、本発明の生理活性物質（血小板増多因子）は、このようにして精製されるが、一旦採取、精製され、その性質が解明された後は、それらの性質を指標として蛋白質の単離、精製に用いられる適当な方法を利用することが可能である。

更に、本発明の生理活性物質を遺伝子工学的手段により製造することも可能である。例えば、上記株化細胞の K HM - 5 M細胞株等から常法に従って m R N Aを単離し、当該 m R N Aを用いて常法により c D N Aライブラリ一を作製することができる。この c D N A ライブラリーをスクリーニングするための D N Aプローブは、例えば、本発明によって明らかにされた部分アミノ酸配列に基づいて設計することができる。あるいは、本発明の生理活性物質を酵素的に又は化学的に切断し、その断片のアミノ酸配列を決定した後、そのァミノ酸配列に基づいて D N Aプローブを設計することもできる。次に、こうして得られた生理活性物質をコードする c D N Aを適宜の発現ベクターに挿入した後、当該発現ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体を培養することにより本発明の生理活性物質を製造することができる。宿主としては、大腸菌の如き原核紬胞、酵母の如き下等真核細胞、哺乳動物細胞の如き高等真核細胞等、常用の宿主を用いればよい。

以下に、前記工程により製造された本発明の生理活性物質（血小板増多因子）の特性を示す。

( 1 ) 分子量

本発明の生理活性物質は、 S D S - P A G Eで測定される分子量が約 4 2 k Dである。

( 2 ) 部分ァミノ酸配列

本発明の生理活性物質は、分子中に以下のァミノ酸配列を有する

Xaa Gl y Asn Asn Asp Gl u Ser Asn lie Ser Phe Lys G 1 u Ly Asp lie

(Xaa は、アミノ酸が特定されていないことを示す）

( 3 ) 血小板増多活性

①げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、アセチルコリンエステラーゼ産生を促進する活性を有する。

② i n v i t r oにおいて、巨核球の分化、成熟を促進する活性を有する。

尚、本発明者等がスクリーニングし、細胞株として樹立した前記未分化甲状腺癌患者由来の K HM— 5 M細胞株は、 1 9 9 4年 1 1 月 2 9 日付で、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所；あて名：日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号（郵便番号 3 0 5 ) に K H M - 5 M , 受託番号： F E R M B P— 4 9 0 1 として寄託（ブダぺス卜条約に基づく国際寄託）されている。尚、後記する実施例 2 に示されるように、上記 K H M— 5 Mは、微生物寄託機関の通告に従って、マイコプラズマを除染した K H M— 5 M細胞株として寄託されている。

次に、本発明の血小板減少治療用医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、本発明の生理活性物質（血小板増多因子 ) を有効成分として含有することを特徴とするものである。当該生理活性物質（血小板増多因子）としては、前記アミノ酸配列をその分子中の N末端もしくは適宜の部位に有するものを使用することかできる。本発明の医薬組成物は、当該生理活性物質（血小板増多因子）を、凍結乾燥、除菌濾過等の製剤学的に必要な工程で処理しただけのものでも充分にその効果を奏することができるものであるが、当該生理活性物質に、製剤学的に許容されうる補助成分を適宜添加し、常法により製剤化し得ることは言うまでもない。

この補助成分としては、基剤、安定剤、防腐剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味剤、着色剤、芳香剤、無痛化剤、賦形剤、結合剤、粘稠剤、緩衝剤等があげられるか、具体的には、例えば、炭酸カルシウム、乳糖、蔗糖、ソルビッ卜、マンニトール、デンプン、アミロぺクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ脂、注射用蒸留水、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル溶液、グルコース溶液、ヒト血清アルブミン（ H S A ) 等があげられる。

これらの補助成分を利用して、本発明の医薬組成物を調製するに際しては、例えば、医薬品添加物一覧表（財団法人東京医薬品工業協会医事法規委員会及び大阪医薬品工業協会医事法規研究委員会発行）にある如く、当該補助成分を適宜選択し、使用すればよい。また、補助成分の使用量は、製剤学的に許容され得る範囲内において、医薬組成物の薬剤形態等に応じて適宜選択すればよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重等に応じて適宜決定される。また、その投与方法は、患者の状態に応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与等の種々の投与方法から適宜選択される。

当該医薬組成物は、化学療法や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患や、巨核球及び Z又は血小板の機能異常を伴う疾患の治療薬や予防薬等として有用なものである。図面の簡単な説明

図 1 は、本発明の実施例 1 の逆相系の高速液体クロマトグラフィ一のモニタリングチヤ一卜を示す。

図 2は、本発明の実施例 1 の第 2回目の逆相系の高速液体クロマトグラフィ一のモニタリングチヤ一トを示す。

図 3は、本発明の実施例 1 の T S K G 3 0 0 0 SWX Lによるゲル濾過の溶出パターンを示す。

図 4 は、本発明の実施例 1 の S D S— P A G E後蛋白質を抽出し、活性を測定した結果を示す。

図 5 は、本発明の実施例 1 の S D S - P A G E後 P V D F膜に転写して蛋白染色したパターンを示す。

図 6 は、 M y c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t により各細胞株のマイコプラズマを検出した結果を示す。

図 7は、ウェスタンプロットにより各細胞株の培養上清中の本発明の生理活性物質の産生を検出した結果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するか、本発明はこれらにより限定されるものではない。尚、以下の記載においては、一部、当該分野における慣用の略号を使用して記載した。

実施例 1

( 1 ) ヒト由来 K HM— 5 M細胞株の継代培養

ヒト由来 K HM— 5 M細胞株は、前記したように未分化甲状腺癌患者由来の樹立された株化細胞であり、当該細胞株の継代培養を以下の方法により行なつた。

先ず、 1 0 %非働化ゥシ胎児血清（ F C S ) を含む R P M I - 1 6 4 0培地 1 0 0 m 1 に、ヒト由来 K HM— 5 M細胞株を植え込み、底面積 1 7 5平方センチメートルの培養フラスコ（ F a 1 c o n 社製）で、 3 7 °Cで 3 日間培養した。

培養終了後、培地を取り除き、 R P M I - 1 6 4 0培地で 2回洗浄した後、 E D TA含有トリプシン溶液約 2〜 5 m l を加えて細胞を剥離せしめ、 1 0 % F C Sを含む R P M I - 1 6 4 0培地を加え、細胞浮遊液を調製し、それを、培養フラスコで、 3 7 °Cで培養した。

以後、同様にして継代培養を行なった。

( 2 ) K HM - 5 M細胞株の培養及び培養上清の調製

K HM— 5 M細胞株を 1 0 %非働化ゥシ胎児血清を含む R P M ！一 1 6 4 0培地 1 0 0 m l を用いて底面積 1 7 5平方センチメ — 卜ルの培養フラスコで、 3 7 °C、 5 % C 02 、湿度 1 0 0 %の条件下で 3 日間培養した。培養終了後、培地を除去し、細胞を I M D M培地にて 3回洗浄し、 I MDM培地 1 0 0 m 1 を用いて更に 3 日問培養した。この培養上清を集め、 8 0 0 0回転で 2 0分間遠心した丄清を、 K HM— 5 M細胞株の培養上清とし、一 2 0でで凍結保存した。

( 3 ) 本発明の生理活性物質（血小板増多因子）の精製

1 ) 限外濾過膜による濃縮

上記の培養上清約 2 0 Lを室温にて融解し、限外濾過膜（アサヒメディカル社製、 PAN 1 2 0 0及びアミコン社製、 PM— 1 0 ) を用いて 5 0 0〜 1 0 0 O m l まで濃縮し、当該濃縮物を凍結保存した。

2 ) D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマトグラフィ一

上記の濃縮した培養上清を 2 0 mMトリスー塩酸緩衝液 p H 7. 4に対して透析した。これを同一の緩衝液で平衡化してある D E A E - S e p h a r o s e F F (ファルマンァ社製）のカラムに吸着させ、 N a C l の濃度を 2 5 0 mM、 l O O O mMと段階的に増加させて溶出させた。以下の精製は、 2 5 0 mMN a C 1 で溶出される画分について行なった。

3 ) V y d a c P r o t e i n C 4 R P - H P L C

次に、上記の 2 5 0 mMN a C l で溶出される画分を、 V y d a c P r o t e i n C 4 (V y d a c社製）のカラ厶を用いた逆相系の高速液体クロマトグラフィーで分画した。すなわち、流速 8 m l /m i nで 4 0 %ァセトニトリルを含む 0. 1 % トリフルォ口酢酸溶液で平衡化してあるカラムに吸着させ、 6 0分間でァセトニトリルの濃度を 8 0 %まで直線的に増加させて溶出した。当該高逨液体クロマトグラフィーによる溶出結果を図 1 に示す。得られた画分の活性を測定した結果、フラクション N o. 1 9— 2 1 に活性か認められた。

4 ) 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P - H P L C 上記の活性画分を、再度、 2回目の V y d a c P r o t e i n C 4 (V y d a c社製）のカラムを用いた逆相系の高速液体クロマトグラフィ一で分画した。すなわち、流速 l m l Zm i nで 4 u %ァセトニトリルを含む 0. 1 % トリフルォロ酢酸溶液で平衡化してあるカラムに吸着させ、 4 0分間でァセトニトリルの濃度を 8 0 %まで直線的に増加させた。当該 2回目の高速液体クロマ卜グラつィ一による溶出結果を図 2に示す。得られた画分の活性を则定し結果、フラクション N o . 7 — 9 に活性が認められた。

5 ) T S K G 3 0 0 0 S WX L G P C

次に、上記の活性画分を、それぞれ、 T S K G 3 0 0 0 S WX L (東ソ一株式会社製）のカラムを用いてゲル濾過に供した。流 ¾ 0. S S m l Zm i nで 4 0 %ァセトニトリルを含む 0 . 1 ¾> トリフルォロ齚酸溶液で平衡化してあるカラムでゲル濾過した。得られた画分の活性を測定した結果、いずれもフラクション N 0. 6 - 9 に活性が認められた。 1 例として 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P— H P L C フラクション N o . 8 を T S K G 3 0 0 0 SWX L G P Cで分画した結果を図 3 に示した。

6 ) S D S - P A G E

上記の T S K G 3 0 0 O SWX L G P Cのそれぞれのフラクシヨンについて活性と相関して S D S — P A G Eで分子量 4 2 k D の銀染色バンドが認められた。この蛋白質が活性本体であることを確認するために S D S — P A G Eを行ない、ゲルからの抽出を行なつた。すなわち、 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P — H P L C フラクション N o . 7を T S K G 3 0 0 0 S WX L G P Cで分画したフラクション N o . 6 について非還元条件（ 4 % S D S、 2 0 %グリセロール、 0 . 1 2 5 M トリス -塩酸緩衝液（ p H 6. 8 ) を 1 0 0 'Cで 3分間処理した直後の溶液をサンプルと 1 ： 1 で混和した）で S D S化を行ない、 S D S — P A G E m i n i ゲル（ T E F C〇社製、 1 0 T %) を用いて定電流（濃縮ゲル： 1 0 m A、分離ゲル： 1 5 m A) で泳動した。

分子量マーカーとしてはフアルマシア社製 L MW k i t Eの 1 4. 4 k D、 2 0. l k D、 3 0 k D、 4 3 k D、 6 7 k D及ひ 9 4 k Dを用いた。泳動後、ゲルを 2 mm間隔にスライスして 0 . 1 % B S Aを含む I MD M培地（ 1 m 1 ) に入れて蛋白質を!'容出させた。ポア一サイズ 0. 2 111フィルター（ニューステラディスク、クラボウ社製）で濾過して活性測定を行なった。その結果、図 4 に示すように分子量 4 2 k D付近（ 4 2 - 4 5 k D ) に活性か認められた。このことから、分子量 4 2 k Dに認められる銀染色バンドが活性本体と考えられた。

( 4 ) 活性（巨核球系細胞に対する作用）の測定

1 ) A c h E A s s a y (アセチルコリンエステラーゼアツセィ）

①活性測定用細胞懸濁液の調製

〇 5 7 8し 6 (： 1"マゥス（ 6〜 1 0週齢）（日本 S L C . 社製 ) の大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を採取し、これを 1 0 % F C S Z I MDM培地に懸濁した。メッシュ径 1 0 0 〃 mのフィルタ一濾.過により、骨片などを除去した後、細胞培養用シャーレに蒔き込み、 3 7 °C、 5 % C 〇 ₂ の条件下で 9 0分間静置した。シャーレに付着した細胞を除去し、非付着性細胞懸濁液に 1 Z 1 0量の K A C 2 ¾ 液（大塚アツセィ研究所製）を添加し、 1 0分間ごとに攪拌しなから 3 7 °Cで 1 時間インキュベートした。

この非付着性細胞懸濁液をリンフォライト M溶液 4 m l 当り 1 0 m l 重層し、遠心分離機を用いて 2 5 °Cにて 1 , 5 0 0回転/分で 3 0分間遠心した。リンフォライト M溶液と培地の界面に存在する非貪食性細胞を集め、 2 , 0 0 0回転/分で 5分間遠心して細胞を沈澱として回収した。このようにして得られた非付着性かつ非貪食性細胞を 0. 1 % B S A/ I MD M培地で 2回洗浄した。

②活性の測定

活性測定用サンプルは 0. 1 % B S A I MD Mで稀釈した。 9 6 穴マイクロプレートを準備し、実験群には上記サンプ儿を、対照群には 0. 1 % B S AZ I MD M培地を、それぞれ 1 0 0 " 1 ノウエルずづ添加した。次に、上述した活性測定用細胞を 1 0 % D F P ( D i i s o p r o p y l F l u o r o P h o s p h a t e ) 処理した F C S 1 0 %を含む I MD M培地に 0. 8 x 1 0 ⁶ 細胞 Z m l となるように懸濁し、これを 1 0 0 /z 1 /ゥュルずつ添加し、 3 7 °Cにて 4 日間培養した。

培養終了後、プレートごと 1 , 5 0 0回転分で 1 0分間遠心し、各ゥヱルより上清 1 5 0 is 1 を除去し、代わりに p H 7. 2 に調製した P B S (—）を 1 5 0 1 ずつ添加した。次に、 3. 1 5 m g /m 1 D T N B Z 1 %クェン酸 N a溶液を 1 % T r i t o n X— 1 0 0溶液で 1 0倍稀釈し、これを 5 0 1 ノゥヱルずつ添加してプレートミキサ一で攪拌し、波長 4 0 5 n mと 6 9 O n mの吸光度差を測定して O m i n における吸光度とした。

次に、 2. 1 7 m g /m l ョー化了セチルチオコリン溶液を 2 0 a 1 ゥヱルずつ添加し、室温にて 3 0分間又は 6 0分間反応させた後、波長 4 0 5 n mと 6 9 O n mの吸光度差を測定し（ 3 0 m i n又は 6 O m i nにおける吸光度）、 AO D ( 3 O m i n 又は 6 0 m i nの吸光度と O m i nの吸光度の差）を求めた。尚、 D T N Bは、 5. 5 ' - d i t h i o b i s - ( 2 - n i t r o b e n z o i c a c i d ) の略称である。

対照群に比較して、明らかに△ 0 Dが高い場合、アセチルコリンエステラーゼ活性が誘導されたものとし、血小板系の造血に対する作用があると判断した。

③結果

前記（ 3 ) の 6 ) で得られた 4 2 k D付近のゲルから溶出させた蛋白質をサンプルとして、前記した方法により A c h E A s s a yを実施した。その結果、対照群に比較して、高いアセチルコリンエステラーゼ活性を有することが確認された。

( 5 ) アミノ酸配列の決定

1 ) 同定方法

前記 2回目の逆相系の高速液体クロマトグラフィー（ V y d a c 社製）で得られた活性画分（フラクション N 0. 8 ) を T S K G 3 0 0 0 S WX Lゲル濾過クロマトグラフィー（東ソ一株式会社製 ) で分画した。活性が認められたフラクション N o . 7 に S D Sを最終濃度 0. 0 4 %になるように添加し N 2 ガスを吹き付け濃縮した。濃縮画分は 0. I N N a OHで中和した後サンプル処理液（ 4 % S D S、 1 0 % 2 - メルカプトエタノール、 2 0 %グリセ口一ル、 0. 1 2 5 M トリスー塩酸緩衝液（p H 6. 8 ) ) と 1 : 1 で混和して 1 0 0てにて 3分間処理した。得られたサンプルは S D S - P A G E m i n i (T E F C〇社製、 1 0 T%) ゲルに添加し、定電流（濃縮ゲル 1 0 m Α、分離ゲル 1 5 mA) で泳動を行なつた。泳動後セミドライブロッティング装置（ B i 0— r a d、 TRANS - B L OT S D S EM I - D R Y T R A N S F E R C E L L) を用いて PVD F膜に 1 4 0 mA、 4 h r転写後クマシーブルー染色液で染色した（図 5 ) 、（平野久著，遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析. p 4 1 〜ρ 7 1 ) 。

この 4 2 k Dのバンドを切り出しモデル 4 7 6 Aプロテインシ一クェンサー（アブライドバイオシステム社製）により分子中の N末端アミノ酸配列を決定した。すなわち、エドマン分解によって遊離した P TH -アミノ酸を紫外部吸収にて検出し予め分離した標準 P T H—ァミノ酸（アプライドバイオシステム社製）の保持時間を基準にしてアミノ酸を同定した。

2 ) 結果

この結果、本発明の生理活性物質（血小板増多因子）は、 N末端に以下のァミノ酸配列を有していることが確認された。

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn lie Ser Phe Lys Glu Lys

1 5 10

Asp lie

15

(Xaa は、アミノ酸が特定されていないことを示す）実施例 2

(本発明の生理活性物質の產生機序）工業技術院生命工学工業技術研究所から寄託した KHM - 5 M細胞株にマイコプラズマが感染していると通告された。そこで、本発明者等は、本発明の生理活性物質の産生機序を明らかにするために、本発明の生理活性物質.（血小板増多因子）の産生に及ぼすマイコプラズマ感染の影響について検討した。

( 1 ) 方法

以下に示される方法の他は、実施例 1 の場合と同様の方法に従つた。

1 ) 細胞株の継代維持及び培養上清の調製

細胞株は 1 0 %牛胎児血清（F B S) を含む R PM I - 1 6 4 0 培地あるいは I MDM培地で継代維持した。本生理活性物質の産生を確認するための試料は、細胞を F B S存在下あるいは非存在下で培養し、遠心で細胞を除いた上清を使用した。

2 ) マイコプラズマの感染

細胞株に感染しているマイコプラズマは大日本製薬の MC - 2 1 0で除去した。 1 0 %牛胎児血清（F B S) を含む R PM I - 】 6 4 0培地又は I MDM培地に最終濃度 0. 5 〃 gノ m l となるように MC— 2 1 0を添加し、 7日から 1 4 日間継代培養した。その後、 M C - 2 1 0を添加していない培地で数回継代して、マイコブラズマを除去した細胞株とした。

3 ) 本生理活性物質の N末端部分のアミノ酸配列を含むペプチド抗体の作成

本生理活性物質の N末端部分のァミノ酸配列を含む 1 9アミノ酸からなるペプチドを MA P法で合成（（株）サヮディ一 · テクノロジー）して抗原とした。この M A Pペプチドをフレンドの完全アジュバントでェマルジヨンとし、ゥサギの皮内に免疫した。このゥサギの血清を抗 S b血清とした。また、一部の抗 S b血清は本生埋活性物質の部分ペプチドを固定化したカラムを用い、ァフィ二ティー精製して使用した（A F抗 S b抗体）。 4 ) 本生理活性物質の検出

本生理活性物質は抗 S b血清あるいは A F抗 S b抗体を使用したウェスタンブロッ卜で検出した。 S D S— P A G Eは L a e mm l i らの方法を部分的に改変して行った。試料は適切な濃度に希釈して TE F C Oサンプルバッファーと 1 ： 1 で混合し、 1 0 0 Cで 3 分間処理した。分子量の推定は T E F C 0分子量マーカー（T E F C O社製）を標準蛋白質として用いた。泳動は T E F C O S D S 一 P A G Em i n i ( 1 0 T%、 1 mm) ゲルで、 B i o— R a d の E 】 e c t r o p h o r e s i s B u f f e r系を用い、定電流 1 8 mAで行った。泳動終了後、ゲル中の蛋白質を B i o - R a d S e m i — D r y T r a n s b l o t装置を使用して P VD F膜に移行させた。 S D S添加 B j e r r u m a n d S c h a f e r - N i e 1 s e n転写バッファ一系で定電圧 1 0 - 2 0 Vで 3 0分間泳動して移行させた。標準蛋白質のレーンは C B B R 2 5 0で蛋白質染色した。試料のレーンは一次抗体として抗 S b血清あるいは A F抗 S b抗体、二次抗体としてアルカリホスファターゼをコンジュゲートさせた抗ゥサギ I g G抗体を使用し、免疫酵素染色した。

5 ) マイコプラズマの検出

マイコプラズマの検出には My c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t ( S TRATAG EN E) を使用した。細胞からの G e n om i c DNAは Q I A am p B L O OD K I T ( Q I A G E N) で調製した。

6 ) マイコプラズマ感染細胞株の作製

感染させるマイコプラズマとしては感染 HUT 7 8及び同様にマィコプラズマが感染していると予想される他の細胞株の培養上清を使用した。これらのマイコプラズマをあらかじめ除染しておいた H U T 7 8細胞株に加えて数回継代維持して感染細胞株とした。

( 2 ) 検討及び結果 1 ) K HM - 5 M紬胞株での本生理活性因子産生に及ほすマイコプラズマ感染の影響

前記実施例 1 で用いた K HM— 5 M細胞株は、前記のように、未分化甲状腺癌患者由来株化紬胞であり、当該 K HM - 5 M細胞株ではマイコプラズマ感染か M y c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t で確認できた。しかし、 K HM - 5 M細胞株に感染していたマイコプラズマを M C— 2 1 0を使用して除去すると、本発明の生理活性物質を検出できなかった。このことは、本生理活性因子の産生にマイコプラズマの感染が寄与している可能性を示唆するものである。

2 ) 各種細胞株での本生理活性因子の産生とマイコプラズマ感染そこで、 K HM - 5 M細胞株以外の本生理活性物質産生細胞株でもマイコプラズマ感染が寄与しているかどうか検討した。検討した細胞株培養上清の中で、本生理活性物質を検出できた細胞株は H U T 7 8のみであった。この HU T 7 8は S e z a r y S y n d r o m e ( シ一ゼリイ病）患者末梢血由来の T紬胞株である。この細胞株でもマイコプラズマ感染が M y c o p 1 a s m a P C R P r i m e r S e tで確認できた。更に、 K H M - 5 M細胞株の場合と同様に、感染しているマイコプラズマを M C— 2 1 0 を使用して除去すると、その培養上清中の生理活性物質を検出できなくなつた。尚、 H U T 7 8 は、市販品として入手することかできる（ A T C C T I B 1 6 1 ) カ^ 本実施例 2で用いた H U T 7 8 は、継代培養中に何らかの形でマイコプラズマ汚染されたものであった。

3 ) マイコプラズマを感染させることによる本生理活性因子の産生上記の結果から、本発明の生理活性物質を産生する細胞株では未分化甲状腺癌患者由来 K HM— 5 M及びシーゼリィ病患者由来 H U T 7 8 ともにマイコプラズマに感染していることが明らかとなった。また、いずれもマイコプラズマを除去すると、ウエスタンブロッ卜で特異的なバンドが検出できなかった。これらのことから、本 4·. 理活性物質の産生にマイコプラズマの感染が関与していると推定した。一方、マイコプラズマに感染している他の細胞株ではこの生理活性物質を産生しないことから、マイコプラズマの種類あるいは細胞株の種類が寄与しているものと考えた。そこで、マイコプラズマを除去した HUT 7 8細胞株に、 HUT 7 8に感染していたマイコプラズマあるいは他の細胞株に感染していたマイコプラズマを感染させ、本生理活性物質が産生されるかどうかウェスタンブロッ卜で解析した。

まず、これら細胞株にマイコプラズマが感染したことを M y c o l a s m a P C R P r i m e r S e tを使用して確認した。その結果を図 6に示す。図中、 1 はマイコプラズマを除染した H UT 7 8、 2はマイコプラズマ感染 HUT 7 8、 3は他の細胞株由来マイコプラズマを再感染させた HUT 7 8、 4は HUT 7 8由来マイコプラズマを再感染させた H U T 7 8、 5は l O O b p L a d d e rマーカー（P h a r m a c i a社製）、をそれぞれ示す。

HUT 7 8細胞株由来のマイコプラズマと他の細胞株由来のマイコプラズマで感染させた H U T 7 8細胞株では、いずれも P C Rでマィコプラズマに特異的なバンドが認められた。しかし、そのバンドのサイズが異なることから、種類の異なるマイコプラズマであると推定した。この HUT 7 8紬胞株由来のマイコプラズマは My c o p 1 a s m a f e r m e n t a n sに類 ί以した泳動ノヽターンを不した。

次に、これらの培養上清中の本生理活性物質の産生をウエスタンプロットで解析したところ、 H U Τ 7 8細胞株由来のマイコブラズマを感染させた細胞の培養上清では特異的なバンドか検出されたか、他の細胞株由来のマイコプラズマを感染させた細胞の上清では検出することができなかった。その結果を図 7に示す。図中、 1 はマィコプラズマを除染した HUT 7 8、 2はマイコプラズマ感染 H U Τ 7 8、 3は他の細胞株由来マイコプラズマを再感染させた HU T 7 8、 4 は HU T 7 8由来マイコプラズマを再感染させた H U T 7 8、 5 は分子量マーカ一（T E F C O社製）、をそれぞれ示す。このことから、本生理活性物質の産生に特定のマイコプラズマによる感染が寄与していると推定した。

産業上の利用可能性

本発明の生理活性物質は、巨核球 -血小板系に作用を示す血小板増多活性を有する因子であり、巨核球細胞の分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する。また、当該生理活性物質を有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、化学治療や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、血小板減少か原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬及び予防薬として有用である。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 1 6

配列の型：アミノ酸（ a m i n o a c i d )

トポロジー：直鎖状（ l i n e a r )

配列の種類：ペプチド（p e p t i d e )

配列の特徴

特徴を表す記号： p e p t i d e

存在位置： 1 . . 1 6

特徴を決定した方法： E

配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn lie Ser Phe Lys CI u Lys

1 5 10

Asp lie

15

Claims

請求の範囲

1 . 次の性質；

( 1 ) げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、アセチルコリンエステラ一ゼ産生を促進する活性を有する；

( 2 ) i n v i t r oにおいて、巨核球の分化、成熟を促進する活性を有する；

( 3 ) S D S— P A G Eで測定される分子量が約 4 2 k Dである； ( 4 ) 分子中に下記のァミノ酸配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn He Ser Phe し ys Glu Ly s Asp lie

ことを特徴とする血小板増多因子。

2. 請求項 1 に記載の血小板増多因子を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物。