WO1996008724A1

WO1996008724A1 - Verfahren zur bestimmung von freiem apoprotein (a)

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Publication number: WO1996008724A1
Application number: PCT/EP1995/003591
Authority: WO
Inventors: Stephan Kiessig; Kai Wolter; Josef Friedrich; Renate Spohn
Original assignee: Immuno Gmbh
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 1996-03-21
Also published as: DE4432905C2; JPH10505897A; DE4432905A1; EP0781416A1; ATA152695A; AT406713B

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, beschrieben, wobei man an (a) das an Lipide gebundene Apo(a) abtrennt und danach das freie Apo(a) nach an sich bekannten Methoden bestimmt, oder (b) das freie Apo(a) in einer Immunreaktion mit Antikörpern bestimmt, die gegen das freie, aber nicht gegen das gebundene Apo(a) gerichtet sind. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine aussagekräftige Beurteilung von Lipoproteinstoffwechselstörungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos vornehmen.

Description

Verfahren zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a)

B E S C H R E I B U N G

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) (Apo(a)). Apoprotein (a) spielt bei der Inhibierung von Plasminogen und anderen fibrinolytisch wirkenden Proteasen sowie bei der Einlagerung von Cholesterolestern und anderen Lipiden in die Intima arterieller Gefässe bei der Atherogenese eine wichtige Rolle.

Apoprotein (a) (Apo(a)) bildet gemeinsam mit dem Apoprotein B 100 (Apo B-100) und einem Lipidanteil das Lipoprotein (a) (Lp(a)). Der Lipidanteil besteht aus einem Oberflächenfilm aus polaren Lipiden, der einen mit Cholesterol gefüllten Innenraum umgibt. Der Lipidanteil mit dem assoziierten Apo-B- 100 entspricht dem low-density Lipoprotein (LDL) (Berg et al. Acta Path 59(3) (1963) 369). Lp(a) gilt als unabhängiger Risikofaktor bei der Entstehung von Atherosklerose (Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 51) , wobei die Einflüsse der einzelnen Apoproteine nicht geklärt sind. Das Apo(a) ist ein hochglykosyliertes Protein, von dem angenommen wird, das es mit dem Apo-B-100 über eine oder mehrere Disulfidbrücken verbunden ist (Utermann et al, J. Clin. Invest. 80 (1987) 458; Gaubatz et al, J. Biol. Chem 258 (7) (1983) 4582; Gaubatz et al, J.D.J. Lipid Res, 28 (1987) 69; Utermann et al, W.FEBS Lett. 154 (2) (1983) 357; Seman et al, W.C. Biochem. Cell Biol. 64 (1986) 999; Fless et al., J. Biol. Chem 261 (19) (1986) 8712; Kraft et al., C.J. Clin. Invest. 80 (1987) 458) . Seman et al, I.e. fanden für das Apo(a) einen Kohlenhydratanteil von 22,5 % und Fless et al., I.e. einen solchen von 54,1 %.

Das Apo(a) ist mit dem Plasminogen eng verwandt. Die Homologie konnte durch Proteinsequenzierung und cDNA- Klonierung bewiesen werden (McLean et al, Nature 300 (1987) 132) . Das Proenzym (Zymogen) Plasminogen enthält 5 cysteinreiche Sequenzen von je 80-114 Aminosäuren, den sogenannten "Kringles", die von I bis V numeriert sind. Es handelt sich dabei um Proteinstrukturen, die durch drei interne Disulfidbrücken zwischen dem ersten und sechsten, dem zweiten und vierten und dem dritten und fünften Cystein stabilisiert werden. Zusätzlich ist nach dem Kringle V, dem C-terminalen Ende folgend, eine Serin-Protease-Domäne enthalten (Utermann et al, I.e.) . Die im Plasminogen enthaltende Signalsequenz, der Kringle IV, der Kringle V und die Proteasedomäne sind auch im Apo(a) mit grosser Sequenzhomologie zu Plasminogen vorhanden.

Kringle V des Plasminogens kommt in Apo(a) einmal und Kringel IV in 10 verschiedenen Varianten (Kringle 1-10 im Apo(a)) vor. Der Apo(a) -Kringle 2 kommt seinerseits wieder in identischen Kopien unterschiedlicher Anzahl (n=l bis ca. 28) vor. Die hieraus resultierenden Unterschiede im Molekulargewicht führen zur Einteilung des Lp(a)- und/oder Apo(a) -Moleküls in Isoformen (Utermann et al, I.e.; Eaton et al., Proc. Natl. Acad Sei USA 84 (1987) 3224). Je nach Nomenklatur wird heute zwischen 6 und 37 Isoformen unterschieden (Lackner et al., J. Clin. Invest. 87 (1991) 2153-2161) .

Die vorletzte Kopie des Kringle IV enthält einen weiteren Cystein-Rest, der wahrscheinlich die Brücke zu Apo-B-100 bildet (Eaton et al. I.e.). Aufgrund der grossen Homologie zwischen den Apo(a) -Kringeln und Kringle IV des Plasminogens wird angenommen, dass auch Apo(a) Lysin-Bindungsstellen besitzt. Dies konnte mittels Säulenchromatographie über Lysin-Sepharose bestätigt werden.

Die Kringle-Domänen des Plasminogens enthalten spezifische Bindungsstellen für Fibrin, 2-Antiplasmin und Lysin. Kringle I bis V binden Lysin, wobei Kringle I und IV die grösste Affinität zeigen (Eaton et al, I.e.). Kringle- Strukturelemente sind in einer Reihe weiterer Proteine, wie z.B. t-PA, Urokinase, Thrombin, Faktor XII, usw. enthalten.

Das Apo(a) enthält eine komplette Protease Domäne. Diese ist enzymatisch inaktiv bzw. kann nicht durch Streptokinase, Urokinase oder t-PA wie vergleichbares Protein gespalten werden. Im Falle des Plasminogens wird dies durch Spaltung bei Arginin560 (Arg560) erreicht. Im Apo(a) ist jedoch der für die Spaltung essentielle Arginin-Rest durch Serin ersetzt (Eaton et al. , I.e.) .

Der Kohlenhydratanteil des Apo(a) ist für die hydrophilen Eigenschaften des Proteins verantwortlich. Mit ca. 45 % ist er im Vergleich zum Plasminogen (5 %) wesentlich höher und bedingt einen wichtigen Teil der antigenen Eigenschaften dieses Proteins. Es lassen sich vorwiegend Hexosen (Galaktose und Mannose) sowie N-Acetyl-D-Galaktosamin (GalNAc) und N- Acetyl-D-Glucosamin nachweisen. Im Apo(a) sind die Anteile der Hexosen etwa gleich gross, während im LDL der Gehalt an Mannose grόsser als der von Galaktose ist. GalNAc ist im LDL etwa sechsmal häufiger vertreten als im Apo(a) . Der Neuraminsäureanteil lässt sich durch Behandlung mit Neuraminidase abspalten, wodurch das Molekulargewicht des Moleküls deutlich sinkt (Kraft et al., I.e., Utermann et al., J. Clin. Invest. 80 (1987) 458).

Die räumliche Struktur von Apo(a) ist noch nicht endgültig aufgeklärt. Untersuchungen biophysikalischer Art liegen erst über rekombinantes Apo(a) (r-Apo(a)) vor. Wie Philips et al, Biochemistry 32 (1993) 3722 an rekombinante Apo(a) (nach Koschiensky et al, Biochemistry 30 (1991) 5044) zeigten, handelt es sich um ein Protein mit einem Stokesradius von 94 A, das sehr asymmetrisch oder ein random coil zu sein scheint. Im Elektronenmikroskop konnte es als lange hochflexible Kette visualisiert werden, die grosse offenspiralige Domänen bildet. Dabei liegen ca. 10 % des Proteins als polymeres Aggregat vor. Das Molekulargewicht des r-Apo(a) lag bei 500 kD (Koschinsky et al, I.e.); das Molekulargewicht von humanem Apo(a) liegt, je nach Isoform, zwischen 280 und 800 kD. Das monomere Gesamtmolekül hat eine Länge von ca. 800 A und besteht aus einer Kette von 19 flexibel verbundenen Domänen mit einer durchschnittlichen Grosse von jeweils 42,1 A. Ein Vergleich mit der t-PA- Kringlestruktur, die röntgenkristallographisch aufgeklärt wurde, lässt vermuten, dass es sich bei den Apo(a) -Domänen ebenfalls um oblate Ellipsoide mit einer ungefähren Dimension von 28 x 30 x 11 A handelt, die durch Ketten mit einer ungefähren Länge von 36 Aminosäuren verbunden sind, die die Flexibilität des Moleküls gewährleisten (vgl. Philips et al, Biochemistry 22 (1993) 3722, mit bildlicher Darstellung der Struktur von Lp(a)) . Wie schon in anderen Arbeiten gezeigt (Chiesa et al, J. Biol. Chem. 34 (1992) 24369, Lawn et al., Nature 360 (1992) 670, Breslow et al, Proc. Natl Acad. Sei USA 90 (1993) 8314) gelingt es auch hier, eine nicht kovalente Bindung von Apo(a) und Apo-B-100, bzw. dem ganzen LDL-Molekül zu zeigen. So ist r-Apo(a) mit mindestens einem Kringle, wahrscheinlich allerdings einigen, an LDL fixiert und ragt in kompakter Form in den umgebenden Raum. Diese Bindung kann mit 50 mM 6-Aminohexansäure aufgehoben werden und ist somit nicht kovalent. Vielmehr scheint sie prinzipiell ionischer Natur zu sein, denn die Affinität nimmt mit steigender Salzkonzentration ab. Eine kovalente Bindung, wie sie in vivo als Disulfidbrücke vorliegt, scheint sich aber in vitro nicht einzustellen (Philips et al, I.e.).

Der repetitive Kringle 2 weist, wie die Kringle 10 bis 1, eine hohe Homologie zum Kringle IV des Plasminogens auf. Kringle 11 ist im Gegensatz zu den übrigen dem Kringle V des Plasminogens ähnlich (Eaton et al. , I.e.).

Aus dieser Homologie lässt sich ableiten, dass freies Apo(a) bzw. Lp(a) ins fibrinolytische System eingreifen kann (Harpel et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 86 (1989) 3847-3851; Loscalzo et al, Ateriosclerosis 10 (1990) 240-245) .

Obwohl die Plasmakonzentration von Lp(a) genetisch determiniert ist und sich somit weitgehend der medikamentösen und diätetischen Beeinflussbarkeit entzieht (Berg et al., Series Haematologica I (1968) 111) , ist die Bestimmung der Plasmakonzentration trotzdem von grossem diagnostischen Interesse, weil Konzentrationen von über 300 μg/ml ein erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheiten (KHK) darstellen

(Berg et al, Clin Genetics 8(6) (1974) 230; Berg et al. , Clin Genetics 16 (1979) 374; Kostner et al, Atherosklerosis 38

(1981) 151) und somit eine genauere Begutachtung der klassichen Risikofaktoren für KHK erfordern. Das Auftreten von freiem Apo (a) in Kδrperflüssigkeiten wäre ein überraschender Befund. Apo (a) ist über eine oder mehrere Disulfidbrücken an Apo B 100 gebunden. Diese Disulfidbrücken werden aber nur in hepatitischen Zellen geschlossen und definitionsge äss (Alberts et al., The Cell (1983) 113-114) nicht extrazellulär gelöst.

Nach bekannten Verfahren wird die Lp(a) -Bestimmung praktisch ausschliesslich mittels immunologischer Methoden durchgeführt. Hierbei steht für die quantitative Messung ein Enzymimmunoassay (EIA) , neben RIA, radialer Immundiffusion und Nephelometrie, im Vordergrund. Darüberhinaus kann ein qualitativer Nachweis von Lp(a) mit einem Immunblot (Western Blot) geführt werden. Hierbei wird zunächst das An igen über eine Gelelektrophorese (z.B. mit 4 bis 15 % Polyaerylamid auf Trägerfolie (Molinari et al., Lp(a) Phenotyping of the Phast System-Pharmacia,* 55 th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (EAS) , Brügge, Belgium, May 17-19, 1990) ,^• oder mit 4 % Polyaerylamid/ EG (modifiziert nach Righetti et al. , Electrophoresis 13 (1992) 587) aufgetrennt. Anschliessend werden die auf dem Gel befindlichen Proteine auf eine geeignete Membran (z.B. Nitrocellulose) transferiert (Towbin et al, Proc. Natl. Acad Sei USA 76 (1979) 4350). Die dort immobilisierten Proben können dann mit einem geeigneten Antikörper-Enzym-Konjugat spezifisch nachgewiesen werden. Prinzipiell eignen sich für die Detektion zwei im Lp(a) vorhandene Antigene, Apo(a) und Apo B-100. Die dabei resultierenden Festphasen-Testsysteme gestatten somit bei einer Kombination von anti-Apo(a) -Antikörpern im Konjugat und an der festen Phase die Bestimmung von Lp(a) und dem gleichzeitig vorhandenen freien Apo(a), nicht aber die Differenzierung zwischen beiden Apo(a) -Formen und die Bestimmung des freien Apo(a) . Wird dagegen ein Apo B- Antikörper im Konjugat verwendet, ist nur Lp(a) nachweisbar. Eine umgekehrte Konstellation, d.h. anti-Apo B an der festen Phase und anti-Apo(a) im Konjugat, ist für den Lp(a) -Nachweis nur bedingt geeignet, da der Überschuss von Apo B im LDL zur Kompetition um die Bindung am Festphasenantikörper führt.

Einphasensysteme wie die Nephelometrie oder Turbidimetrie führen durch den Zusatz von anti-Apo(a) -Antikörpern zur Bildung von messbaren, lichtstreuenden oder lichttrübenden Immunkomplexen und könnten somit auch nicht zwischen freiem und an Lp(a) gebundenem Apo(a) unterscheiden.

Damit lässt sich unter der Einbeziehung der vorstehenden Ausführungen, wonach anzunehmen ist, dass freies Apo(a) in die Pathogenese der Atherosklerose eingreift, auch die Diskrepanz zwischen dem gebundenen Lp(a) -Spiegel und dem relativen Risiko der Sclerosierung arterieller Gefässe erklären. Wie bereits vorstehend angesprochen ist aber für den Nachweis von freiem Apo(a) bisher keine Bestimmungsmethode bekannt.

Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) in einer menschlichen Kδrperflüssigkeit.

Diese Aufgabenstellung wird mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das gebundene Apo(a) abtrennt und das freie Apo(a) dann mittels einer dafür an sich bekannten Methode bestimmt.

Zweckmässige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 6.

In dem erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit wird das an Lipide gebundene Apo(a) nach an sich bekannten Methoden, die auf Unterschieden in den physikalischen, physikochemischen und/oder chemischen Eigenschaften des an Lipide gebundenen Apo(a) gegenüber freiem Apo(a) beruhen, abgetrennt, und vorzugsweise nach einer der folgenden Methoden: durch Gelchromatographie (aufgrund des höheren Molekulargewichts des an Lipide gebundenen Apo(a)), durch Bindung an einen Affinitätsträger (aufgrund der von freiem Apo(a) verschiedenen Bindungsfähigkeit von an Lipide gebundenen Apo(a) an einem Affinitätsträger), und z.B. nach an sich bekannten Affinitätschromatographieverfahren. Als Affinitätsträger werden in diesen Verfahren insbesondere immobilisiertes Lysin, immobilisierte Proteine mit entständigem Lysin, immobilisierte, z.B. chemisch an einen Träger gebundene Aminocarbonsäuren, insbesondere ε- Aminocarbonsäuren, Amine und/oder Heparin verwendet.

Zur Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo(a) kann es auch zweckmässig sein, ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Trennmethoden, insbesondere eine oder mehrere der vorstehend als bevorzugt genannten Trennmethoden, miteinander zu kombinieren.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Korperflussigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das freie Apo(a) in einer Immunreaktion mit Antikörpern bestimmt, die gegen das freie, aber nicht gegen das gebundene Apo(a) gerichtet sind.

Zweckmässige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 8 und 9.

Die Immunreaktion mit den Antikörpern kann dabei auf eine für derartige Immunreaktionen an sich bekannte Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Immunreaktion mittels eines Immunoassays unter Verwendung von geeigneten markierten Antikörpern durchgeführt.

Die Antikörper sind vorzugsweise durch Enzyme, Antigene, Radionuklide, Fluorogenen oder Luminogene markiert.

Je nach der verwendeten Markierung der Antikörper kann der Immunoassay deshalb z.B. nach einem allgemein üblichen Enzymimmunoassay (EIA) , insbesondere ELISA, oder einem Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden.

Als immunologische Technik zur Durchführung der erfindungsgemässen Immunreaktion mit Antikörpern hat sich insbesondere auch die Methode des Immun-Blot (Western Blot) erwiesen, nach der Proteine aus einem Elektrophorese-Gel, z.B. nach der Auf rennung in einer Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese, auf eine immobilisierende Matrix (z.B. Nitrocellulose-Filter) übertragen werden, was in erster Linie durch Elektrotransfer erfolgt, und anschliessend durch eine immunologische Reaktion (z.B. durch radioaktiv oder Enzym¬ markierte Antikörper) nachgewiesen werden.

Die erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) eignen sich zur Bestimmung von rekombinantem, modifiziertem und/oder synthetischen freiem Apo(a), sowie auch zur Bestimmung dieser in Form von Aggregaten vorliegenden Apo(a) 's.

Die erfindungsgemässen Verfahren, mit denen freies, in einer menschlichen Korperflussigkeit vorhandenes Apo(a) bestimmt werden kann, eignet sich zur Verwendung für eine aussagekräftige Bestimmung von

LipoproteinstoffWechselStörungen und Beurteilung des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos. Es ist anzunehmen, dass freies Apo(a) in die Pathogenex der Atherosklerose eingreift, was die Diskrepanz zwischen dem gebundenen Lp(a) -Spiegel und dem relativen Risiko der Sklerosierung arterieller Gefässe erklärt. Auf der Grundlage der Bestimmung des in einer menschlichen Korperflussigkeit vorhandenen freien Apo(a) ist gegenüber bekannten Bestimmungsverfahren eine aussagekräftigere Beurteilung möglich. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteinstoffwechselstorungen bzw. des bei_ einem Patienten vorliegenden artherogenen Risikos, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer dem Patienten entnommenen Korperflussigkeit vornimmt.

Als Körperflüssigkeit wird vorzugsweise eine Blut-, Serum¬ oder Plasmaprobe verwendet.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne den Rahmen der Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken.

Beispiele

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Verfahren die auch den Beispielen zugrundeliegen, für die Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo(a) sowie für die Bestimmung des freien Apo(a) , und bevorzugte Kombinationen dieser Verfahrensstufen, beschrieben.

Zum Nachweis von freiem Apo(a) wird. das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies wird vorzugsweise über Festphasentechniken (Bindung an einem Antikörper, der nur freies Apo(a) erkennt) oder aber durch Trennung auf der Basis des verschiedenen Molekulargewichts, der verschiedenen Ladung und anderer physikalisch-chemischer Eigenschaften vorgenommen.

Zur Abtrennung auf der Basis verschiedener Ladungen eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken, nach denen, wie z.B. bei der SDS-Elektrophorese, nach Molekulargewicht, oder, wie z.B. bei der Agar-Gelelektrophorese, nach elektrophoretischer Mobilität getrennt werden kann.

In einer zweiten Schritt wird dann das freie Apo(a) nachweisbar gemacht. Dies geschieht insbesondere mittels geeigneter immunologischer Methoden. Mit einem modifizierten Western Blot (Towbin et al, I.e.) wird z.B. die Immobilisierung aller Proteine auf einer Nitrocellulosemembran durchgeführt; dann kann z.B. ein Antikörper verwendet werden, der sowohl das freie als auch das im Lp(a) gebundene Apo(a) erkennt. Ist dieser Antikörper direkt markiert (z.B. mit einem Enzym), so können durch eine Farbreaktion die Stellen auf der Membran sichtbar gemacht werden, an denen Apo(a) als Antigen erkannt wird. Durch den Vergleich mit der Reaktion mit einem anti-Apo B-Antikörper (die entweder ebenfalls direkt, aber mit einem anderen Markerenzym markiert durchgeführt werden kann, oder auch auf einem parallelen Blotstreifen) lässt sich dann das freie Apo(a) feststellen und, wenn erwünscht, durch eine an sich bekannte Methode auch quantitativ erfassen.

Zur Abtrennung der Lipoproteine aus dem Plasma ist insbesondere eine Lipidelektrophorese mit Lipidophor (Immuno AG; vgl. Seidel et al., Clin. Chem.. Acta 19/7 (1973) 737-739; Hieland et al., Clin. Chem. Acta 19/10 (1973 1139-1141; Heck et al., Clin. Chem. Acta 23/78 (1977) 1296-1300; Wieland et al., Innere Medizin (1978 190-300)) geeignet. Nach dieser Methode wandert das Lp(a) mit dem LDL. ES hat sich herausgestellt, dass freies Apo(a) eine höhere elektrophoretische Immobilität besitzt und deshalb vor dem Lp(a) erscheint. Der Nachweis beider Apo(a) -Formen ist nach einem (elektrophoretisehen) Transfer auf eine proteinbindende Membran, die vorzugsweise eine Nitrocellulose-Membran ist, mit einem Enzym-markierten Anti-Apo(a) -Antikörper möglich. Dieser setzt an den Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im Kontrollblot wird das Apo B analog mit einem anti-Apo B- Antikörper dargestellt. Der Vergleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstellbaren Proteinen und einen weiteren, an dem nur eine Reaktion des anti-Apo(a) - Antikörpers auftrat.

Beispiel 1

Durchführung der Lipidelektrophorese

100 μl Plasma werden mit der gleichen Menge Agarmedium gemischt und 10 μl des Gemisches auf das Gel aufgetragen. Anschliessend wird die Auftragstelle mit einem Tropfen Agar verschlossen. Nach Einlegen der Gele in die mit Elektrophoresepuffer (62,1 % 5,5*Diethylbarbitursäure Natriumsalz; 29,2 % Natriumacetat, 8,7 % Citrat, pH 8,6) gefüllte Elektrophoresekammer läuft die Trennung 180 min mit 15 mA const./Gel. Je Probe müssen zwei Auftragsstellen befüllt werden.

Transfer

Die in Blottingpuffer (25 mM Tris/HCl, 0,2 mM Glycin, 20 % v/v Methanol) benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt trocken bei 70 °C innerhalb einer Stunde.

Entwicklung

Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3 % TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in l % TBS/BSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo(a) - bzw. Anti-Apo B- 100-Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD) - markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo(a) und Apo-B-100 Blots zeigt das freie Apo(a) an.

Ergebnisse

Der Western Blot der Lipidelektrophorese zeigt für einen KHK- Patienten (Nr. 8) eindeutig zwei und für einen gesunden Plasmaspender (Q 10027) nur eine mit dem anti-Apo(a) darstellbare Bande. Mit dem anti-Apo B können die LDL und das Lp(a) angefärbt werden. Dabei entspricht die untere Anfärbung mit anti-Apo(a) und anti-Apo B dem Lp(a), die obere Anfärbung dagegen dem freien Apo(a) . Das Blotmuster des Plasmaspenders (Q10027) weist in der Region des LDL (anfärbar mit anti-Apo B) keine Apo(a)-Bande auf, woraus zu schliessen ist, dass in Lipidophor® das freie Apo(a) etwa die gleiche elektrophoretische Mobilität wie LDL besitzt (Fig. l) . Die Darstellung der beiden Lipoproteine nach dem Western Blot aus Lipidophor® unter reduzierenden Bedingungen zeigt, dass die Doppelbandigkeit (ohne ß-Mercaptoethanol) aufgehoben wird. Dabei bleiben die LDL (Anfärbung mit anti-ApoB) unbeeinflusst. Auch dies kann als Nachweis für freies Apo(a) gewertet werden (Fig. 2) .

Beispiel 2

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, wird das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies kann durch Trennung nach Molekulargewicht vorgenommen werden. Hierfür eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken wie die SDS- Elektrophorese. Auch hier wird nach der Trennung das Lipoprotein durch Transfer auf eine proteinbindende Membran immobilisiert um dann wiederum immunologisch nachgewiesen zu werden.

Die SDS-Elektrophorese ist als Methode geeignet, um Lipoproteine aus dem Plasma nach Molekulargewicht aufzutrennen. Dabei wandert das Lp(a) mit LDL. Freies Apo(a) besitzt eine höhere elektrophoretische Mobilität und ist somit vor Lp(a) zu finden. Der Nachweis beider Apo(a) -Formen ist nach einem (elektrophoretisehen) Transfer auf eine proteinbildende (Nitrocellulose) -Membran mit einem Enzym¬ markierten anti-Apo(a) -Antikörper möglich. Dieser setzt an den Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im Kontrollblot wird das ApoB analog mit einem anti-Apo B -Antikörper dargestellt. Der Vergleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstellbaren Proteinen und einen weiteren, an dem nur der anti-Apo(a) -Antikörper reagiert hat.

Durchführung der Elektrophorese

Die Trennung der Proben erfolgt in einem Polyacrylamidgel (T 4,2 % , C 0,8 %) dem Agaroselδsung (60 %, 1,22 g in 100 ml) zugesetzt ist. 750 mg Agarose werden in 25 ml Trenngelpuffer (0,4 % SDS, 1,5 mol/1 Tris/HCl, Ph 8,8) und 62,5 ml Aqua dest. im Wasserbad (kochend) geschmolzen und nach Zugabe von 12,5 ml monomerer Stammlösung (Acrylamid 30 %, N,N- Methylenbisacrylamid 0,8 %) auf 60 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 150 μl TEMED und 2,5 ml einer 10 %igen

Ammoniumpersulfatlδsung wird die Lösung blasenfrei zwischen zwei vorgewärmte Borsilikatglasplatten gegeben. Die Polymerisation findet innerhalb von 5-60 min statt. Zur Herstellung des Sammelgels werden 0,5 ml monomere Stammlösung, 1,25 ml Sammelgelpuffer (0,4 % SDS, 0,5 mol/1 Tris/HCl, pH 6,8), 3,25 ml Aqua dest., 12 μl TEMED und 150 μl einer 10 %igen Ammoniumpersulfatlösung gemischt, um damit das Trenngel zu überschichten. Das maximale Probenvolumen beträgt bei einer Geldicke von 2,25 mm ca. 100 μl. Die Elektrophorese findet ca. 5 h unter 25 mA const./Gel in einem 25 mmol/1 Tris/HCl, 0,2 mol/1 Glycin, 0,1 % SDS, pH 8,0 Elektrophoresepuffer statt. Alternativ zu diesen SDS-PAGE können die Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS- PAGE (modifiziert nach Righett et al. , Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden.

Transfer

Der Transfer erfolgt hier vorzugsweise im Tankblot (25 mmol Tris/HCl, pH 8,3, 20 % v/v Methanol, 16 h, 15 °C) . Die in Blottingpuffer benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt in anodischer Richtung.

Entwicklung

Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3 % TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1 % TBS/BSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo(a) - bzw. Anti-Apo B- 100-Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD) markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo(a) und Apo B-100 Blots zeigt das freie Apo(a) an.

Ergebnisse

Die hochmolekulare antigene Bande, die mit dem anti-Apo(a) und dem anti-Apo B-Antikδrper erhalten wird, entspricht dem Lp(a) . Beide Proteine sind über eine Disulfidbrücke verbunden, die sich unter reduzierenden Bedingungen mit ß- Mercaptoethanol spalten lässt. Auch mit dieser Methode wird mit dem anti-Apo(a) -Antikörper wieder unterhalb des Lp(a) eine weitere antigene Bande sichtbar. Diese entspricht dem im Plasma vorhandenen freien Apo(a) .

Beispiel 3

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, lassen sich auch die unter Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Techniken zu einer zweidimensionalen Elektrophorese kombinieren. Dabei wird in der ersten Dimension mit Lipidophor® nach elektrophoretischer Mobilität getrennt und in der zweiten Dimension nach Molekulargewich . Der Nachweis des freien Apo(a) erfolgt wieder wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.

- Lipidelektrophorese mit Lipidophor® in Kombination mit SDS-PAGE

Die Lipidelektrophorese mit Lipidophor® wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die SDS-Elektrophorese werden die Gele in Probenpuffer durch 2 x 5 minütiges Einlegen umgepuffert. Nachdem überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, können die Gele auf den wie beschrieben vorbereiteten SDS- Gelen im Sammelgel einpolymerisiert werden. Alternativ zu der vorstehend beschriebenen SDS-PAGE können die Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS-PAGE nach Righetti (modifiziert nach Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden. Hier wird dann statt der Agarose 1 % PEG 20000 zur Stammlösung zugegeben. Gleichermassen wird mit dem Sammelgel verfahren. Die Elektrophorese sowie der Transfer und der Nachweis des freien Apo(a) erfolgen wie vorstehend beschrieben.

Entwicklung

Die vom Gel befreite Membran wird lh in 3 % TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1 % TBS/BSA mit einem polyklonalen POD-markierten Kaninchen Anti-Apo(a) - bzw. AP- markierten Anti-Apo B-100-Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA erfolgt die Anfärbung des AP-markierten Antikörpers mit Neufuchsin oder Nitrotetrazoliumblau (0,05 % v/v 2 mol/1 MgCl2, 0,001 % v/v Nitrotetrazoliumblau, 0,002 % v/v 5-Bromo-4-chloro-3- indoxylphosphat Na-Salz; (BCIP, Merck AG, Darmstadt, BRD) in 200 mmol/1 1 % TBS/BSA oder 0,04 % v/v Levamisol, 0,02 % v/v NaN02, 0,05 % v/v Naphthol-As-Bis-Triphosphat in DMF, 0,005 % v/v Neufuchsin in 0,1 mol/1 Tris/HCl pH 8,8). Nachfolgend kann dann der POD-Anteil wie oben beschrieben nachgewiesen werden. Diese Technik gestattet den Nachweis beider Proteine in einem Schritt. Freies Apo(a) ist dort nur mit der POD- Reaktion nachzuweisen. Doppelfärbungen an einem Spot weisen auf das Vorhandensein beider Proteine (Apo(a) und Apo B) hin.

Ergebnisse

Nach der zweidimensionalen Elektrophorese werden mit dem anti-Apo(a) -Antikörper drei Spots angefärbt. Dabei entsprechen die anodisch (1. Dimension = Lipidophor®) gewanderten, immunologisch angezeigten Proteine dem Lp(a) mit dem höchsten Molekulargewicht, und die mit geringerem

Molekulargewicht als deutliche Doppelbande den beiden

Isotypen des freien Apo(a) . Die kathodisch anfärbbaren

Apo(a) -Spots verfügen über kein darüber liegendes Lp(a), so dass diese eindeutig als freies Apo(a) identifiziert werden könne .

Hier kann festgestellt werden, dass das Apo(a) einerseits frei im Plasma vorkommt, andererseits aber auch eine Form existiert, die dem Apo(a) zusammen mit dem Apo B (ohne kovalente Bindung an letzteres) die gleiche elektrophoretische Mobilität in Lipidophor® verleiht. Durch Reduktion der Proteine nach der Trennung in Lipidophor® (Fig. 3) verschwindet der Lp(a)-Spot und es wird ausschliesslich Apo(a) und Apo B in den für das jeweilige Molekulargewicht typischen Spots sichtbar (Fig. 4) .

Beispiel 4

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, wird das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Molekulargewicht mittels Gelfiltration. Das freie Apo(a) besitzt ein geringeres Molekulargewicht und eluiert somit unter geeigneten Chromatographiebedingungen (Superdex® 200 XK, Flussrate 7,5 ml/cm2/h (200 mmol/1 Tris/HCl, pH 8,0) später als das im Lp(a) befindliche Apo(a) . Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, wobei sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat ein anti-Apo(a) -Antikörper (IMMUNOZYM® Lp(a) der Fa. Immuno) verwendet werden kann.

Durchführung der Gelfiltration

Die Gelfiltration der Proben erfolgt über Superdex® 200 XK (Pharmacia, Uppsala, Schweden) . Entsprechend der Säulengrösse (26/70) werden ca. 2,5 ml Probe aufgetragen. Die Trennung erfolgte mit einer Flussrate von 7,5 ml/cm2/h in einem 200 mmol/1 Tris/HCl Puffer, pH 8,0.

Nachweis im EIA

Die quantitative Bestimmung von Lp(a) erfolgt mit einem kommerziellen IMMUNOZYM® Lp(a)ELISA (IMMUNO GmbH, Heidelberg, BRD). Mit einem Anti Apo(a) -Fab-POD-Konjugat wird Apo(a) detektiert. Die fünf verwendeten Kalibratoren weisen Konzentrationen von 0, 150, 300, 500 und 800 μg/ml Lp(a) auf, die internen Qualitätskontrollen von 320-480 und 160-250 μ g/ml. Die Standards und Kontrollen liegen als Lyophylisat vor und müssen mit Inkubations-/Waschpuffer rekonstituiert werden. Ein Tris/HCl-Puffer pH 8,4 mit Pluronic® als Detergens bildet den Inkubations-/Waschpuffer. Der für die Substratreaktion verwendete Puffer ist ein Acetatpuffer (pH 5,0) mit H202. Als Substrat benutzt man Tetramethylbenzidin in Ethanol/DMSO. Die Reaktion wird mit 2 mol/1 Schwefelsäure gestoppt. Anschliessend werden die Extinktionen mit einem ELISA-Reader ermittelt und am angeschlossenen Computer ausgewertet.

Ergebnisse

Sowohl im Ausschlussvolumen als auch im inneren Volumen eluiert Protein, das im EIA Apo(a) -Antigenität besitzt. Das komplette Lp(a) kann bei der verwendeten Trennmatrix nur im Aussehlussvolumen zu finden sein. Somit liegt nahe, dass das Apo(a) -Antigen als freies oder ungebundenes Apo(a) vorliegt (Fig. 5) .

Beispiel 6

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, muss das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt werden. Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Lysinbindungsfähigkeit. Das freie Apo(a) besitzt die Fähigkeit Lysin zu binden, was seinen Ausdruck in der Bindung von Apo(a) an Lysin-Sepharose® findet. Unter geeigneten Chromatographiebedingungen (0,05 mol/1 PB, pH 7,5, Elution mit einem linearen ε-Aminocapronsäuregradienten) eluiert freies Apo(a) später als das im Lp(a) befindliche Apoprotein. Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, die sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat einen anti-Apo(a) -Antikörper (IMMUNOZYM® Lp(a) der Fa. Immuno AG) verwenden können.

Durchführung der Affinitätschromatographie

Die Lp(a) -haltige Probe wird vor dem Auftrag auf die Säule (Lysin-Sepharose®, 4B, C 16/40, Pharmacia, Gelvolumen 16ml) mit Auftragspuffer verdünnt (1:5) . Nach Waschen mit Auftragspuffer wird mit einem linearen ε-

Aminocapronsäuregradienten (ε-ACA) eluiert. Die Regeneration erfolgt mit mindestens 3 Säulenvolumina Waschpuffer (1 mol/1 NaCl, 0,5 mol/1 ε-Aminocapronsäure, 0,05 mol/1 PB, pH 7,5). Die Flussrate beträgt 30 ml/cm2/h. Der Verlauf der Chromatographie wird mit einem Durchflussphotometer mit angeschlossenem Schreiber verfolgt.

Nachweis im EIA

Der Nachweis im EIA erfolgt wie im Beispiel 4 beschrieben. Ergebnisse

Unter geeigneten, wie vorstehend beschriebenen Auftragsbedingungen bindet das im Lp(a) gebundene Apo(a) nicht an Lysin-Sepharose® und ist im Durchlauf mittels EIA nachweisbar. Mit ε-ACA ist dann freies Apo(a) eluierbar (Fig. 6) .

Beispiel 6

Ew wird der spezifische Nachweis von Apo(a) ohne vorherige Abtrennung von Lp(a) im Enzymimmunoassay beschrieben. Dazu wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, welcher in der Lage ist, zwischen beiden Formen zu differenzieren. Ein solcher Antikörper kann nur Regionen am Apo(a) erkennen, die beispielsweise nach der Bindung von Apo(a) an Apo B verändert oder sterisch nicht mehr zugänglich sind. Im Test ist es ausreichend, wenn ein Antikörper mit diesen Eigenschaften an der festen Phase verwendet wird.

Antikörpergewinnung

Antikörper, die spezifisch freies Apo(a) erkennen, können beispielsweise durch gezielte Immunisierung mit Proteinfragmenten erzeugt werden. Die Proteinfragmente können durch enzymatischen oder chemischen- Abbau von Apo(a) durch gentechnologische Expression oder in Form synthetischer Peptide gewonnen werden. Solche Antikörper können auch durch sorgfältige Reinigung eines polyklonalen Anti-Apo(a) -Plasmas über Affinitätschromatographie erhalten werden. Dabei werden alle Antikörper, die Lp(a) erkennen, entfernt und Antikörper, die freies Apo(a) erkennen, angereichert.

Testaufbau

(a) Quantitative Bestimmung von freiem Apo(a)

Für die quantitative Bestimmung von freiem Apo(a) werden

Mikrotiterplatten mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch freies Apo(a) und kein Lp(a) erkennt. Der Test kann als simultaner oder sukzessiver Zweiseitenbindungsassay- aufgebaut werden. Als Konjugat wird ein Anti-Apo(a) - Antikörper eingesetzt, der neben Apo(a) auch Lp(a) erkennen darf.

(b) Bestimmung des Lp(a)/Apo(a)-Verhältnis Für eine quantitative Bestimmung des Verhältnisses von gebundenem zu freiem Apo(a) werden Mikrotiterplatten mit einem Anti-Lp(a) -Antikörper beschichtet, der beide Formen erkenn . Nach der Probeninkubation wird mit zwei verschiedenen Konjugaten und ihren entsprechenden Substraten detektiert, und zwar mit einem Anti-Apo B-AP-Konjugat zur Quantifizierung von komplettem Lp(a), und mit einem Anti- Apo(a) -POD-Konjugat zur Quantifizierung von freiem Apo(a) .

In den Figuren bedeuten:

Figur l Western Blot aus der Lipidophor®-Darstellung von Apo B und freiem Apo(a) bei einem KHK-Patienten (Nr. 8) und Spender (Q10027) (siehe Beispiel 1) ;

Figur 2 bedeutet Western Blot aus Lipidophor®; Darstellung des Apo (a) und Apo B aus Plasma des Spenders (Q10027) unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen;

Figur 3 stellt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese dar: Erste Dimension Lipidophor®, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter nicht reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK Patienten (Nr. 8)) ;

die Figur 4 zeigt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese. Erste Dimension Lipidophor®, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK-Patienten (Nr. 8)) ;

die Figur 5 zeigt ein Elutionsdiagramm der Lp(a) -Isolierung über Gelfiltration mit Superdex® 200 XK mit Plasma eines Spenders (Q10027) , und zwar den Verlauf des Apo(a) -Gehalts nach der Isolierung eines Ultrazentrifugats; und

die Figur 6 zeigt das Elutionsdiagramm der

Affinitätschromatograpie des Ultrazentrifugats aus

Spenderplasma (Q10027) über Lysin-Sepharose®.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E

Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Korperflussigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebundene Apo(a) abtrennt und das freie Apo(a) mittels einer an sich bekannten Methode bestimmt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das an Lipide gebundene Apo(a) nach einer Methode auf Molekulargewichts-Basis.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des an Lipide gebundenen Apo(a) durch Gelchromatographie erfolgt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des an Lipide gebundenen Apo(a) durch Bindung an einen Affinitätsträger auf der Basis der von freiem Apo(a) verschiedenen Bindungsfähigkeit erfolgt.

Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung durch Affinitätschromatographie erfolgt.

Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das an Lipid gebundene Apo(a) durch Binden an immobilisiertes Lysin, immobilisierte Proteine mit endständigem Lysin, immobilisierte an einen Träger gebundene Aminocarbonsäuren, Amine und/oder Heparin erfolgt.

Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man das freie Apo(a) in einer Immunreaktion mit Antikörpern bestimmt, die gegen das freie, aber nicht gegen das gebundene Apo(a) gerichtet sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennezeichnet, dass man die Immunreaktion mittels eines Immunoassays unter Verwendung von geeigneten markierten Antikörpern durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antikörper mit Enzymen, Antigenen, Radionukliden, Fluorogenen oder Luminogenen markiert.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man rekombinantes, modifiziertes und/oder synthetisches freies Apo(a) bestimmt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man aggregiertes Apo(a) bestimmt.

12. Verfahren zur Bestimmung von

Lipoproteinstoffwechselstorungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit gemäss einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 11 mit einer dem Patienten entnommenen Korperflussigkeit vornimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit eine Blut-, Serum- oder Plasmaprobe ist.