WO1996008581A1 - Element analytique monobloc multicouche pour le titrage de l'acide biliaire a conjugaison sulfate - Google Patents

Element analytique monobloc multicouche pour le titrage de l'acide biliaire a conjugaison sulfate Download PDF

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Hiroshi Tamura
Satoshi Chosa
Satoshi Yonehara
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Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd.
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements
    • G01N33/526—Multi-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
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    • Y10T436/145555—Hetero-N
    • Y10T436/146666—Bile pigment

Definitions

  • the present invention relates to an integrated multi-layer analytical element for analyzing sulfate-conjugated bile acids in an aqueous liquid sample, and more particularly, to biological fluids such as blood ft (whole blood, plasma, serum),
  • the method of measuring sulfate-conjugated bile acids is the solution method.
  • No. 45183 discloses that sulfate-conjugated bile H "acid is first converted to 3 ⁇ 5-hydroxybile acid by using a sulfate-conjugated bile acid desulfate sulfate (hereinafter, abbreviated as” BSSJ ").
  • BSSJ sulfate-conjugated bile acid desulfate sulfate
  • 39-HSDJ 3-hydroxysteroid dehydrogenase
  • NADs nicotinamide adenine dinucleotides
  • NADPs nicotinamide dodenine dinucleotide phosphates
  • a method for measuring the amount of NAD PHs (reduced NADPs) is disclosed.
  • a desulfating enzyme fog is generated in the process of forming a solution net, and a uniform solution cannot be prepared because the solution is not uniformly separated, resulting in a measurement error.
  • the present invention is intended to solve these problems and to enable the production of an integrated multi-layer analysis method for the measurement of sulfate-conjugated bile acids, which enables highly sensitive quantification.
  • the present invention comprises a support, a drug layer on the support, and a porous spreading layer on the S reagent layer, wherein at least one of the drug layer and the spreading layer contains a sulfate-conjugated bile.
  • Sulfuric acid containing acid desulfuric acid, 3 ⁇ -hydroxysteride dehydrogenase and thio NAD + and reduced NADs, or «formula NADPs
  • the reagent layer comprises a water-soluble polymer, a sugar alcohol or Mn 2+ , or both thereof, and a buffer for a sulfate-conjugated bile K analysis.
  • the reagent layer comprises a water-soluble polymer, a sugar alcohol or Mn 2+ , or both thereof, and a buffer for a sulfate-conjugated bile K analysis.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Example 1.
  • a mouthpiece with buffering capacity in the pH range of 4 to 10 is required as a buffer.
  • a mixed buffer of biverazine and glycyl glycine is employed as such a buffer.
  • water-soluble polymer a water-soluble synthetic polymer or a water-soluble B-enzyme is desirable, and examples thereof include polyvinylpyrrolidone and burlan.
  • water-soluble synthetic polymers or water-soluble S-enzyme substances are used.
  • the coloring of the background which may be due to the coloring of Tio NA D (Tio NA DH), is resolved.
  • sugar alcohols is not particularly limited. If sugar alcohols are not used, the sulfuric acid will cause sticking during the process of producing the solution, and the storage stability of the composition in the test paper will be significantly reduced.
  • sugar alcohols examples include D-sorbitol, D-mannitol and the like.
  • compounds structurally similar to sugar alcohols, such as sucrose, glycerol, and boroyl such as polyethylene glycol can also be used.
  • ⁇ is supplied from a manganese salt.
  • a manganese salt a water-soluble salt, for example, manganese chloride, manganese nitrate, manganese sulfate, manganese phosphate, manganese phosphate, manganese acetate and the like are preferably used.
  • a piperazine-glycylglycine wet buffer is used as a buffer as described above.
  • a buffer is used as a buffer commonly used by those skilled in the art.
  • An agent may be used.
  • BB S. 3JS HSD, NADHs, Thio NAD + , water-soluble polymer, sugar alcohol or Mn, and the mutual quantitative M of the buffer are as follows: BBS: 20-200 U / nl, preferably 50-100 U / ml
  • Water-soluble polymer 6-12% (ww), preferably 8-10% (wZw) Sugar alcohol: 1-5% (WZW), preferably 2-3% (w / w) Manganese: 30-300 # M Preferably 50-; 150 M ft opponent: 100-500 mM, preferably 200-30 OmM
  • any material can be used as the material of the support.
  • PET polyethylene terephthalate
  • polycarbonate polycarbonate
  • polystyrene polystyrene
  • cellulose ester any material can be exemplified. Any of sheet-like and film-like polymers commonly used for this type of test piece may be used.
  • the drug layer can be formed by applying a solution containing the above ⁇ drug on a support material and drying the solution, or by applying the solution to a suitable base material (eg, waste paper, nonwoven fabric, woven fabric, pain) Material, glass fiber a paper, etc.) or by impregnating and drying.
  • a suitable base material eg, waste paper, nonwoven fabric, woven fabric, pain
  • Material glass fiber a paper, etc.
  • the porous spreading layer is a three-dimensional grid consisting of «paper, non-woven fabric, woven fabric, knitted fabric, glass fiber a paper, membrane filter, and Bolimar microbeads. It is made from materials commonly used for such specimens, such as structures.
  • a method for producing the integrated multilayer analytical element of the present invention will be described.
  • thio NAD + and NADH required for enzymatic cycling reaction in a buffer solution in advance.
  • a solution of a water-soluble polymer previously dissolved in a buffer solution of the same type as above and the enzyme solution are mixed and thoroughly stirred.
  • the mixed solution is uniformly spread on a support and dried to form a reagent layer.
  • the developed layer is laminated, and further dried.
  • undesired coloring may occur and the background may increase, but the use of water-soluble polymers, especially highly purified polyvinylpyrrolidone and phenol or burlan, will increase the background. Can be suppressed.
  • test specimen raw material thus obtained is cut, adhered to a support with an adhesive tape, and cut to obtain a test specimen for measurement.
  • the rise of a blank can be suppressed and the aggregation of nitrogen can be prevented at the time of conversion of the solution used at the time of forming a reagent layer.
  • Laminate the spread layer by placing the paper impregnated with 0 »paper on top and applying pressure to adhere. Then, the raw test piece is obtained by drying. After applying a double-sided adhesive tape to the PET side of the obtained test piece raw material, it was cut into a predetermined size, and attached to a support (PET plate) with a double-sided adhesive tape to obtain a test piece.
  • Each test piece prepared as described above was subjected to a K test using litcholylglycine 3-sulfate (hereinafter, abbreviated as “GLCAJ”) as a sample, for 110 seconds.
  • GLCAJ litcholylglycine 3-sulfate
  • the change in reflectivity afterward is measured using a special reflectometer (Spotke). M (Manufactured by Kyoto Dai-ichi Gaku Co., Ltd.).
  • the unit of KZS is used, but this is the unit used to convert the reflectance to density. If the reflectance is R,
  • This KZS ⁇ indicates a large value when the concentration of the substance to be measured contained in the sample is high, and a small value when the concentration is low.
  • Example 1 the background was lowered, and sufficient sensitivity for measurement was obtained in proportion to the GLC A concentration.
  • Figure 1 shows the change of the blank value at g. In Example 1, the value is found to be stable.
  • PVP indicates polyvinylpyrrolidone.

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Description

明 細 書
硫»抱合型胆汁酸測定用一体型多層分析要素
発明の分野
本発明は、 水性液体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を分析する一体型多層分 析要素に関し、 更に詳しくは生物体液、 例えば血 ft (全血、 血漿、 血清)、
I»液、 リンパ液、 唾液、 尿等の水性液体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を定量 分析する為の、 乾式操作可能で e床的に有用な一体型多層分析要紫に関す る c
従来の技術
硫酸抱合型胆汁酸の測定法としては、 溶液法ではあるが、 待開平 2— 1
45183号公報が、 硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸鰺素（Bileacid Sulfate Sulfatase。 以下、 「BSSJ と略記する。 ）を用いて硫酸抱合型胆 H"酸 をまず 3 ^5—ヒドロキシ胆汁酸とし、 これに 3 —ヒドロキシステロィ ド デヒドロゲナーゼ (以下、 「3 9— HSDJ と略記する。 ）と、 補酵紫とし てニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド類（以下、 「NAD類」 と略 S己 する。 ）またはニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン酸類（以下、 「N ADP類」 と略記する。 ）を反応させて、 硫酸抱合型胆汁酸量に比例して 生成する N A DH類 (¾元型 NAD類)量または NAD PH類 (還元型 N A D P類)量を測定する方法を開示している。
ところが、 この方法は発色系にテトラゾリゥム塩類を用いるため、 乾式 分析に適用するには発色 Sが低すぎるという問 S点があった。
また、 胆汁酸の高感度定 *法の一つに、 酵紫的サイタリングを用いて測 定を行う方法がある（特開平 3— 224498号公報参照)。 この方法では、 α— H S Dを用いて、 a一型胆汁酸の高感度定量を液系で行つている。 そこで、 上記 2つの方法を組み合わせた形で、 BS Sにより脱硫酸され た 3 /9—ヒドロキン胆汁酸を基質とし、 3 /9— 11 5 0にょって基¾の定量 を試みたところ、 比較的単純な S薬組成でチォー NA D Hの着色を促える ことが可能であることか判った。
ところが、 液系での測定は ffl雑さを伴うので、 簡便かつ高感度な乾式の 一体型多層分析要素の出現が ¾まれていた。
»*的サイクリング法を用いた乾式の一体型多層分析要衆を、 単純に従 来の乾式 KJK紙の製造方法で作製しょうと試みると、 以下のような問題が 生じる：
( 1 )製造通程で還元型チォー NA D (チォ一 N A D H)の発色によると思 われるバックグラウンドの発色が起こるために、 充分な測定レンジが得ら れない。
( 2 )溶液網製の過程で脱硫酸酵 ¾か»りを生じ、 溶液中に均一に分敝さ れないために均一な溶液を作成できず、 測定誤差の原因となる。
(3 )検体が尿の場合、 尿の pHに捆人差があり、 pHは 4〜9という広い 領域に渡るので、 この幅を锾衝可能で、 かつ乾式へ応用可能な緩衝剤が容 易に入手できない。
従って、酵素的サイクリングに高感度定 Jt性を保持したまま、 上記溶液 法の試薬系をそのまま乾式分析要素へ適用することは困雜であった。
本発明は、 これらの問題点を解決し、 高感度定量が可能な硫酸抱合型胆 汁酸の測定用一体型多層分析要索の作製を可能にしょうとするものである。
発明の概要
そこで本発明は、 支持体、該支持体上の弒薬層及び S試薬層上の多孔性 展開層を有して成り、 該轼薬層及び該展開層の少なくとも一方に、 硫酸抱 合型胆汁酸脱硫酸眯素、 3 ^—ヒドロキシステロィドデヒ ドロゲナーゼ並 びにチォー N A D+及び還元型 N A D類、 叉は «元型 N A D P類を含む硫 酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析要素において、 該試薬層が、 水溶性 高分子、 糖アルコール類又は Mn2+、 若しくはその両者、 及び緩衝剤を含 有する硫酸抱合型胆汁 K分析用一体型多層分析要素を提供する。
図面の ffi単な 明
図 1は、 実施例 1の結果を示すグラフである。
発明の詳細な 明
検体試料が尿の場合には、 先にも述べたように尿の pHの個人差が大き いために、 緩衝剤として pH 4〜l 0の領域に緩衝能を有する緩銜剤が必 要である。 このような緩衝剤として、 本発明では、 ビべラジンとグリシル グリシンの混合緩衝剤を採用する。
水溶性高分子としては、 水溶性合成高分子又は水溶性 B酵粘物質が望ま しく、 例としてはポリビニルピロリ ドン又はブルランが挙げられる。 これ ら水溶性合成高分子又は水溶性 S酵粘物質を用いると。 チォー N A D (チ ォー NA DH) の発色によると思われるバックグラウンドの着色が解決で さる。
また、 糖アルコール類の種類は特に制限されない。 もし糖アルコールを 用いなければ、 溶液通製の過程で脫硫酸 »素が «りを生じる上に、 試験紙 中の組成物の保存安定性が格段に低下する。
糖アルコールの例としては、 D—ソルビトール、 D—マンニトール等が 挙げられる。 また、 糖アルコールに構造的に類似な化合物、 例えばスクロ ース、 グリセロール、 ポリエチレングリコール等のボリオールも使用でき る。
Μπ は、 マンガンの塩から供辁され、 マンガンの塩としては、 水溶性 の塩、 例えば塩化マンガン、 硝酸マンガン、 硫酸マンガン、 リン酸マンガ ン、 ほう »マンガン、 酢酸マンガン等が好ましく用いられる。 尿が検体試料の埸合には、 緩衝剤として上記のようにピぺラジンーグリ シルグリシン濕合緩衝剤を用いるが、 尿以外の検体 β料の場合には、 緩衝 剤は当業者が通常用いる緩銜剤を用いてもよい。 もちろん、 ピぺラジン一 グリシルグリシン ¾合«銜剤を用いても、 尿以外の検体 Κ料の ρΗを «銜 できることは言うまでもない。
BB S. 3JS— HSD、 NADH類、 チォー NAD+、 水溶性高分子、 糖アルコール又は Mn 、 緩衝剤の相互の量的 M係は以下の通りである： BBS： 20〜200U/nl、 好ましくは 50〜 100 U/ml
39-HSD： 5〜； L00UZnl、 好ましくは 20〜40 UZal NADH： 0.5〜5mM、 好ましくは 2〜3mM
チォー NAD+ : l〜5mM、 好ましくは 1.5〜3mM
水溶性高分子： 6〜12¾(w w)、 好ましくは 8〜10%(wZw) 糖アルコール： 1〜5%(WZW)、 好ましく 2〜3% (w/w) マンガン ： 30〜300#M、好ましくは 50〜； 150 M ft衝剤： 100〜500mM、 好ましくは 200〜30 OmM
支持体の材料としては、 いずれの材料でも用いることができる。 特に、 ポリエチレンテレフタレート （PET) 、 ポリカーボネート、 ポリスチレ ン、 セルロースエステルが例示できる。 この種の試驗片に普通に使用され る、 シート状 ·フィルム状のポリマーであればいずれでも良い。
a薬層は、 上記 κ薬を含む溶液を支持体材料上に塗布し、 乾燥すること により形成することができる、 あるいはその溶液を適当な基材 （例えば、 滅紙、 不織布、 織物生地、 痛み物生地、 ガラス繊維 a紙など） に塗布又は 含浸し、乾燥することにより作成することができる。
多孔性展開層は、 «紙、 不繊布、 織物生地、 編み物生地、 ガラス繳維 a 紙、 メンブレンフィルター、 ボリマーミクロビーズから成る三次元格子状 構造物などの、 この種の試驗片に普通に使用される材料から作成する。 以下、 本発明の一体型多層分析要素の製造方法の一例を説明する。
脱硫黢に必要な B S S、 並びに酵素的サイクリング反応に必要な 3 5— H S D、 チォー NA D+及び NA D Hをあらかじめ、 緩衝剤溶液に溶解す る。 その瞧、 糖アルコール又は Mn2+の少なくとも一方を緩衝剤溶液中に 添加することによって、 溶液中に生じる菊りの発生を抑制することができ る C
次にあらかじめ上記と同種の緩衝剤溶液に溶解した水溶性高分子の溶液 と、 上記酵素溶液とを混合してよく搜拌する。 この混合溶液を、 支持体上 に均一に展開させた後乾燥して試薬層を形成し、 その後展開層をラミネ一 卜し、 更に乾燥する。 この 2段階の 爆中に望ましくない着色が生じ、バツ クグラウンドが上昇することがあるが、 水溶性高分子、 特に精製度の高い ポリビニルピロリ ドン及びノ又はブルランを用いることによってバックグ ラウンドの上昇を抑えることができる。
このようにして得られた試験片原反を裁断し、 粘着テープで支持体上に 接着し、 裁断して測定用試験片を得る。
発明の効果
本発明によれば、 ブランク埴の上昇を抑制でき、 試薬層作成の際に用い る溶液の翻製時に ¾素の凝集を防止することができる。
実施例
実施例 1
試験片の作成：
処 方
B S S (マルキン »油株式会社製） 1 . 3 3 nkat/1
( 8 O Uml) 3 — H S D (マルキン餐油株式会社製） 0.33 mkat/1
(2 OUml)
NADH (オリエンタル醇母株式会社製） 3.0 Bmol/1 チォー NAD + (オリエンタル酵母株式会社製） 2.5 aaol/1 トウィーン（Tween)20(ナカライテスク社製） 0.5 重量％ バインダー（ポリビニルビロリ ドン） 9.0 重量％
(塗工液全重量に対する）
[コリ ドン（Kollidon)90F(BASF社製)]
ί¾街剤ビペラジンーグリシルグリシン 200 nmol/1 (ρΗ7.0)
[和光純薬株式会社製ピぺラジンと
ナカライテスタ社製のグリシルダリシンとを
モル比 1 ： 1で混合]
D—ソルビトール（ナカライテスク社製） 3.0 %
上記処方の成分を混合し、 得られた溶液を、 PETフィルムの表面に塗 布し、 温度 40でにて約 10分 ra乾燥する。 0.01%トリ トン X— 10
0を含浸させた »紙を上にのせ、 圧力をかけて密着させることにより、 展 開層をラミネ一卜する。 そして乾燥させることにより、 試験片原反を得る。 得られた試験片原反の P E T側に両面接着テープを貼付した後、 所定の寸 法に裁断し、 両面接着テープにより支持体（P E T板）に貼付して試験片を 得た。
測定
以上のようにして作製した各試験片にリ トコリルグリシン（ L it ocholi lglycine)3—スルフ —ト（以下、 「GLCAJ と略称する。 ：)を検体と して K験を行い、 1 10秒後の反射率の変化を専用反射率計 （スポッ トケ ム。 株式会社京都第一枓学製） により測定した。
なお、 表中では KZSという単位を使用しているが、 これは反射率を濃 度換算する際に使用する単位であり、 反射率を Rとすれば、
K/S*(1-R)V2R
で表される。 そしてこの KZS值は、 検体中に含まれる被測定対象物質の 濃度の高いときは大きい値を、 濃度の低いときは小さい値を示す。
実施例 1の結果を表 1に示す。
表 1
(単位： K/Sffi)
Figure imgf000009_0001
実施例 1ではバックグラウンドが低下したことにより、 GLC A濃度に 比例して測定に充分な感度が得られた。
また、 ブランク値の g時変化を図 1のグラフ示す。 実施例 1では値が安 定していることが判る。
H中、 PVPはポリビニルピロリ ドンを示す。
実施例 2
10 aolZ!lの G L C Aを含み、 1 N塩酸又は 1 N水酸化ナトリウムに より表 2に示す p Hに拥整した尿検体各 5 μ 1を S験片に点着した。
点着した尿検体の pHをコンパクト pHメータにより測定した。 結果を 表 2に示す。
表 2
Figure imgf000009_0002
この桔果から、 広範囲の pHの尿検体に対して充分な緩衝能を有してい ることが判る。

Claims

講 求 の 範 囲
1. 支持体、 》支持体上の試薬層及び 薬層上の多孔性展開層を有し て成り、 《薬層及び垓展開層の少なくとも一方が、
硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸眯素、
3 S—ヒドロキシステロィドデヒドロゲナーゼ
並びに
チォー NAD^及び «元型 NAD類、 又は «元型 NADP類
を含む硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析要紫において、 該試薬層が 水溶性高分子、
糖アルコール類又は Mn 、 若しくはその両者
及び
緩衝剤
を含有する硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析要素。
2. 水溶性高分子が、 水溶性合成高分子又は水溶性 ¾»粘物質である铕 求項 1に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多)！分析要索。
3. 試薬層中に含有された緩衝剤が、 pH4〜l 0の領域に緩衝能を有 する緩衝剤である «求項 1または 2に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体 型多層分析要素。
4. 緩衝剤がビぺラジンーグリシルグリシン緩衝剤である讃求項 3に記 載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多暦分析要素。
5. 該試薬層及び垓展開層の少なくとも一方が、 硫酸抱台型胆汁酸脱硫 酸 »素 20〜200Uノ ml： 3^9—ヒ ドロキシステロイ ドデヒ ドロゲナー ゼ 5〜100U/nl;チォー NAD，及び «元型 NAD¾B、 又は還元型 N ADP類 0.5〜5mM：チォー NAD* 1〜5mM；水溶性高分子 6〜1 2% (wZw)；糖アルコール： l〜5%(w/w)： Mn2+30〜300 M；及び緩衝剤 1 0 0〜5 0 O mMを含有する »求項 1に記載の硫酸抱合 型胆汁酸分析用一体型多層分析要素。
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