WO1996007671A1 - Racemisierungsfreie herstellung von n-aminosäure-derivaten und dipeptiden - Google Patents

Racemisierungsfreie herstellung von n-aminosäure-derivaten und dipeptiden Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of amino acid derivatives and dipeptides which have a protective group on the nitrogen atom of the peptide bond or on the nitrogen atom which is to form the peptide bond.
  • These compounds are particularly useful in solid phase and solution syntheses of peptides, glycopeptides, peptide-nucleotide conjugates and proteins.
  • the dipeptides on the solid phase have hitherto unprecedented coupling kinetics and therefore allow the solid phase reactions under the conditions customary in automated SPPS according to the Fmoc strategy.
  • the backbone modification improves the solvation of the protected target peptides.
  • the invention therefore relates to a process for the preparation of amino acid derivatives and dipeptide derivatives of the formula (I)
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an acyl group, a group serving to temporarily protect the amino group or a free or protected amino acid,
  • RR 7 which may be the same or different, represent a hydrogen atom or a free or conventionally protected (eg protected by t-butoxy, t-butoxycarbonyl, allyl, etc.) amino acid side chain,
  • R ⁇ stands for OH, OR 'or NR , 0 R ⁇ ,
  • R 9 represents an alkyl, benzyl or phenyl group
  • R 10 and R 11 which may be the same or different, represent a hydrogen atom, an alkyl, benzyl or acyl group
  • x and y which can be the same or different, can represent 0 or an integer from 1 to 6,
  • Ar represents a radical of the formula in which
  • R represents an alkyl or alkoxy group which is optionally substituted by OH, NH 2 or NHR 13 , or represents OH or -X-COR 12 .
  • X represents (CH 2 ) m , O or 0 (CH 2 ) m ,
  • n 1, 2, 3 or 4
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6
  • R 12 represents OH, alkoxy, benzyloxy, NH 2 , NHR n or NR 13 R U ,
  • R 13 and R 14 which are the same or different, represent an alkyl, benzyl, amine or amide protective group
  • Ar represents a thiophene, furan or pyrrole radical which is substituted by one, two or three radicals R as defined above,
  • R 2 to R 8 have the meanings given above, in a Mannich reaction with a compound Ar-H, in which Ar has the meanings given above, and then optionally introduces the radical R 1 .
  • the present invention also relates to the dipeptides of the above formula I, in which R 1 stands for a free or protected, peptide-bound amino acid and R 2 to R 8 and Ar have the meanings given above.
  • Both in the context of the process according to the invention and for the dipeptides R 8 according to the invention preferably stands for OH, Oalkyl or OBenzyl.
  • Ar preferably stands for where R is OH or Oalkyl and n is 2 or 3.
  • Ar very particularly preferably represents 2,4,6-trimethoxyphenyl, ie the nitrogen atom has a 2,4,6-trimethoxybenzyl protective group (Tmob).
  • radicals R 2 to R 7 stand for a hydrogen atom or a free or protected amino acid side chain, ie these radicals and x and y are chosen depending on the desired amino acid.
  • alkyl preferably represents a straight-chain or branched C, -C 8 -alkyl group, in particular a C, -C e -alkyl group.
  • alkyl group examples include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • Alkoxy preferably represents a straight-chain or branched C, -C 8 alkoxy group, in particular a C, -C 4 alkoxy group.
  • alkoxy groups are methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, i-butoxy and t-butoxy.
  • Aryl is preferably phenyl and acyl is preferably C ⁇ -C 6 acyl, especially For yl, acetyl or benzoyl.
  • R 1 stands for a group serving for the temporary protection of the amino group
  • a protective group is chosen which protects the amino group in the reaction step concerned.
  • This protective group is then expediently removed before all other protective groups are split off.
  • This protective group together with the nitrogen atom to which it is attached, preferably has a urethane structure, ie the structural element YO-CO-N- is present.
  • Usual protective groups are expediently used, ie 9-fluorenylmethoxycarbonyl (F oc), t-butoxycarbonyl (BOC), benzlyoxycarbonyl (Z), ada antyloxycarbonyl (AdOC), etc.
  • the compounds of the formula II are reacted in accordance with the Mannich reaction with all activated aromatics.
  • the appropriately substituted benzene derivatives or the appropriately substituted thiophene, furan or pyrrole derivatives are preferably used as activated aromatics.
  • the compound of formula II can be used as the hydrochloride, ester, amide or free acid. So far, partial or complete racemization has always been observed in the Mannich reaction of amino acids.
  • the process according to the invention particularly when using the amino acid esters, ie when using compounds of the formula II in which R 8 is OR 9, is free of racemization.
  • reaction is acid-catalyzed, it being possible to use customary acid catalysts, in particular acetic acid or HCl. If the hydrochloride is used as the compound of formula II or if the free amino acid is used, the reaction proceeds autocatalytically.
  • the reaction is expediently carried out in a suitable solvent.
  • Lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol or isopropanol, have proven particularly useful proven.
  • the reaction is advantageously carried out at elevated temperature, generally in the range from ambient temperature to the boiling point of the reaction mixture.
  • the reaction time depends on the reactivity of the reactants, the reaction temperature, the pH, etc., and is generally 1 to 5 hours.
  • the course of the reaction is expediently followed analytically, for example by means of thin layer chromatography.
  • the pH of the reaction mixture is preferably in the range from 4 to 6.
  • the reaction mixture is worked up in a conventional manner.
  • the separation of disubstituted and trisubstituted product as well as the separation of o- and p-product can easily be achieved through the different solubilities.
  • 1,3,5-trimethoxybenzene is used as the activated aromatic
  • the disubstituted product can be separated off particularly easily on account of its lower polarity.
  • the use of compounds of the formula II in the form of the esters is preferred because the Ester reaction product can be more easily separated from the reaction mixture.
  • the benzyl ester which also has the advantage that the benzyl ester group can be converted into the free acid selectively by hydrogenation (Tmob and Fmoc are more stable under these conditions and are not removed).
  • the products obtained after the Mannich reaction are reacted with a reagent for the introduction of an alkyl, aryl or acyl group or for the temporary protection of the Amino group serving group or a free or protected amino acid implemented.
  • the alkyl or aryl group is introduced in a customary manner by alkylation, for example using an alkyl or aryl halide, etc.
  • the group which serves to temporarily protect the amino group or the free or protected amino acid is introduced by a process customary in peptide synthesis.
  • the active ester method which gives low racemization with very high yields, has proven to be particularly useful here.
  • the C-terminal protective group if present, can then be removed, which in the case of the benzyl esters takes place by means of selective hydrogenation.
  • the introduction of a protected amino acid is explained using the following reaction scheme:
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • the acyl group is introduced analogously.
  • these groups can be introduced by reaction with the corresponding acid halides, in particular the acid fluorides.
  • N-Fmoc-protected 2,4,6-trimethoxybenzyl derivatives crystallize particularly well and have excellent solubility in the solvents customary in peptide chemistry.
  • the compounds of the formula I according to the invention are reacted with amino acids, peptides, glycopeptides, nucleotides and proteins under the coupling conditions which are generally customary in peptide synthesis.
  • the use of the dipeptides significantly improves the coupling of N-terminally modified amino acids and peptides.
  • the coupling of the dipeptides to the free N-terminus of solid-phase-bound or otherwise C-terminally blocked amino acids, peptides, glycopeptides, nucleopeptides and proteins takes place as an anhydride, active ester or in another manner customary in peptide chemistry.
  • the coupling according to the active ester method is explained using the formula scheme below: R 3
  • the further construction of the peptide chain is carried out according to the known methods (see, for example, R.B. Merrifield, E. Giralt et al., Synthesis, (1985), 181). Incorporation of the described dipeptides or amino acids at every fourth to eighth position of the peptide sequence reliably prevents the formation of structures during the synthesis.
  • the dipeptides are suitable for the synthesis of any peptides using the coupling methods and protective group strategies known in peptide chemistry.
  • the ArCH 2 groups can be split off in a conventional manner by hydrogenolysis or acidolysis. The conditions for this are milder, the more the ArCH 2 residue is hydroxy- or methoxy-substituted.
  • the particularly suitable 2,4,6-trimethoxybenzyl group can be split off completely with 95% TFA in 1 h.
  • the dipeptides according to the invention thus have decisive advantages: they allow an effective, low-racemization
  • S represents a spacer group, selected from alkylene, -NH-, -NR- or -O- (ester), in the o-, m- or p-position of the adjacent phenyl ring, R 1 , R 2 and R 3 , which are the same as or can be different, represent hydrogen, alkyl, alkoxy, dialkylamino, halogen or nitro,
  • X represents a group suitable for linking, selected from acylamino, acyloxy, amino, halogen, hydroxyl or phosphonate, wherein acyl is the
  • R '' stands for Tmob.
  • the further construction of the peptide chain then takes place according to the methods known in solid-phase peptide synthesis, as explained above.
  • the peptides and glycopeptides are split off under very mild, acetic acid conditions.
  • One achieves this separation z. B. by treatment of the polymer-bound derivatives with 20 to 50% acetic acid in dichloromethane in the presence of a scavenger, such as methanol.
  • the reaction usually took a few hours at room temperature. Due to the extremely mild conditions, even sensitive structures (such as, for example, glycosidic bonds) and protective groups (such as, for example, trityl and BOC groups) are reliably retained in the detached peptide or glycopeptide.
  • the detached products can thus be isolated selectively and partially protected in good yields. They can therefore be used immediately for further syntheses, such as targeted fragment condensation. A complete splitting off of the protective groups is of course also possible.
  • Tmob amino acid derivative (N-Fmoc-Alanyl-N-Tmob-Alanine) per coupling 4 meq DIC per coupling 4 meq HOBT per coupling N, N-dimethylformamide, UV grade
  • the next amino acid was removed with HOBT and DIC in DMF for 3 min. preactivated and in the continuous flow process 12 min. pumped through the reactor column.
  • the peptide resin was washed with DMF. The process was carried out with the other Fmoc amino acids or at the corresponding positions with Fmoc dipeptide (N'-Fmoc-alanyl-N-Tmob-alanine) or Fmoc-protected Tmob-amino acid derivative (N-Fmoc-N-Tmob-alanine) ) each repeated analogously to the finished peptide sequence.
  • the peptide prepared according to Example 4 was treated for 4 hours with a mixture of 9.5 ml TFA and 0.5 ml EDT. The resin was then filtered off, the solvent was removed in vacuo, the acetic acid was distilled off azeotropically in vacuo and the peptide was washed with ether. According to HPLC and lonpray-MS, the product is more than 95% pure. The yield was determined to be 93%.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäurederivaten und Dipeptiden, die eine Schutzgruppe am Stickstoffatom der Peptidbindung oder am Stickstoffatom, das die Peptidbindung ausbilden soll, aufweisen, mittels Mannich-Reaktion. Diese Verbindungen sind insbesondere brauchbar in Festphasensynthesen von Peptiden, Glykopeptiden, Peptid-Nukleotid-Konjugaten und Proteinen.

Description

Racemisierungsfreie Herstellung von N-Aminosäure- derivaten und Dipeptiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäurederivaten und Dipeptiden, die eine Schutzgruppe am Stickstoffatom der Peptidbindung oder am Stickstoffatom, das die Peptidbindung ausbilden soll, aufweisen. Diese Verbindungen sind insbesondere brauchbar in Festphasen- und Lösungssynthesen von Peptiden, Glykopeptiden, Peptid-Nukleotid-Konjugaten und Proteinen.
Die gezielte Synthese von Peptiden gewinnt angesichts der zunehmenden Anforderungen an Pharmaka, Lebensmittelzusatzstoffe und andere Wirkstoffe hinsichtlich der Selektivität der Wirkung, der Verträglichkeit und der biologischen Abbaubarkeit stark an Bedeutung. Trotz der nunmehr hochentwickelten gentechnologischen Techniken gilt dies auch für die chemische Synthese von Peptiden, durch die allein z. B. Peptide mit nicht-natürlichen Strukturelementen zugänglich sind.
Für den chemischen Aufbau von Peptiden bedeutete die Einführung der Festphasensynthese (SPPS) nach R.B. Merrifield (R.B. Merrifield, J. Am. Che . Soc, jJ5_, 2149 (1963)) einen großen Fortschritt. Das gilt trotz der inzwischen erkannten Probleme, die bei diesen Festphasen-Peptidsynthesen hinsichtlich der Reinheit der synthetisierten Produkte immer wieder auftreten.
Eines der Hauptprobleme in diesem Zusammenhang stellt die
Ausbildung von Strukturen während der Peptidsynthese auf dem Träger dar, die zu stark reduzierten Kupplungsausbeuten führen. Ein analoges Problem in der Flüssigphasensynthese sind die im allgemeinen mit zunehmender Kettenlänge abnehmenden Löslichkeiten der Peptide.
Nachdem verschiedene Lösungsmittelsysteme auf ihre Fähigkeit hin untersucht worden sind (R.C. de Milton, S.C.F. Milton, P.A. Adams, J. Am. Chem. Soc. , 112, 6039, (1990); A. Thaler, D. Seebach, Helv. Chim. Acta, 74., 628 (1991) ; E. Bayer, C. Goldammer, in "Peptides: Chemistry and Structure", (Hrsg. J.A. Smith, J.E. Rivier) , Proc. 12th Amer. Peptide Sy p. (1991), ESCOM, Leiden 1992) , apolare oder polare, inter- und intramolekulare Wechselwirkungen zu unterdrücken, muß zusammenfassend festgestellt werden, daß alle derartigen Versuche nur partiellen und auf wenige Peptide beschränkten Erfolg zeigten.
Nachdem diese externen Strategien zu keinem zufriedenstellenden Resultat führten, wurde auch versucht, interne Strategien zu entwickeln, welche die für die Strukturausbildung verantwortlichen Wasserstoffbrücken chemisch blockieren bzw. die Löslichkeit des Peptids durch reversible chemische Modifikation erhöhen sollten.
Entsprechende Derivate waren bereits bekannt. Es handelt sich durchwegs um Nα-Benzyl-Derivate, da die Benzylgruppe nach der Synthese hydrogenolytisch wieder entfernt werden kann. Diese sehr effektive Methode, der Wasserstoffbrückenbildung entgegenzuwirken, wurde jedoch lange vernachlässigt, da die Benzylderivate einerseits schwierig herzustellen sind und andererseits ihre Entfernung Hydrogenolysebedingungen erfordert, die kaum ein Peptid unbeschadet übersteht. Inzwischen wurden Nβ-2-Hydroxy-4-methoxybenzylderivate vorgestellt (T. Johnson, M. Quibell, D. Owen, R.C. Sheppard, J. Chem. Soc, Chem. Comm. , 369, (1993), die nach beendeter Synthese acidolytisch abspaltbar sind. Auch die noch leichter acidolytisch spaltbaren Nα-2,4,6-Trimethoxybenzyl-Derivate sind untersucht worden. Einer breiten Anwendung dieser Derivate stand jedoch entgegen, daß sie nur schwierig über Schiff'sehe Basen herstellbar waren. Die hierfür benötigten Benzaldehyde sind sehr teuer und die Reaktionsprodukte uneinheitlich. Außerdem wurde eine äußerst ungünstige Kupplungskinetik von Aminosäurederivaten auf den N-Benzylterminus in Festphasensynthesen beobachtet, die nur eine sehr eingeschränkte Anwendung der neuen Derivate erlaubte. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Verfahren zur Herstellung von Nn-geschützten Aminosäure- und Dipeptidderivaten zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll die Herstellung racemisierungsfrei erfolgen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst wird, wenn man die Schutzgruppe mittels Mannich-Reaktion einführt.
Weiter wurde gefunden, daß die Dipeptide auf der Festphase bislang unerreichte Kupplungskinetiken aufweisen und daher die Festphaεenreaktionen unter den in der automatisierten SPPS nach der Fmoc-Strategie üblichen Bedingungen erlauben. Daruberhinaus wird durch die backbone-Modifikation eine verbesserte Solvatation der geschützten Zielpeptide erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäurederivaten und Dipeptidderivaten der Formel (I)
R'-N-(CR2R3)X-CR4R5-(CR6R7)y-COR8 CH »,2 (I)
I
Ar
worin
R1 für ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, Arylgruppe, Acylgruppe, eine zum temporären Schutz der A inogruppe dienende Gruppe oder eine freie oder geschützte Aminosäure steht,
R-R7, die gleich oder verschieden sein können, für ein Wasserstoffatom oder eine freie oder in üblicher Weise geschützte (z. B. geschützt durch t-Butoxy, t-Butoxy- carbonyl, Allyl, etc.) Aminosäureseitenkette stehen,
Rβ für OH, OR' oder NR,0Rπ steht,
R9 für eine Alkyl-, Benzyl- oder Phenylgruppe steht, R10 und R11, die gleich oder verschieden sein können, für ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Benzyl- oder Acylgruppe stehen,
x und y, die gleich oder verschieden sein können, für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 stehen können,
Ar für einen Rest der Formel steht,
Figure imgf000006_0001
wobei
R für eine Alkyl- oder Alkoxygruppe steht, die gegebenenfalls durch OH, NH2 oder NHR13 substituiert ist, oder für OH oder -X-COR12 steht.
X für (CH2)m, O oder 0(CH2)m steht,
n für 1, 2, 3 oder 4 steht,
m für 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 steht,
R12 für OH, Alkoxy, Benzyloxy, NH2, NHRn oder NR13RU steht,
R13 und R14, die gleich oder verschieden sind, für eine Alkyl-, Benzyl-, Amin- oder Amidschutzgruppe stehen,
oder Ar für einen Thiophen-, Furan- oder Pyrrolrest steht, der durch ein, zwei oder drei wie oben definierte Reste R substituiert ist,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß
man ein Aminosäurederivat der Formel II:
H2N-(CR2R3)XCR4R5(CR6R7) -COR* (II) worin
R2 bis R8 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in einer Mannich-Reaktion mit einer Verbindung Ar-H umsetzt, worin Ar die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, und anschließend gegebenenfalls den Rest R1 einführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Dipeptide der obigen Formel I, worin R1 für eine freie oder geschützte, peptidisch gebundene Aminosäure steht und R2 bis R8 und Ar die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Vorzugsweise steht sowohl im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als auch bei den erfindungsgemäßen Dipeptiden R8 für OH, OAlkyl oder OBenzyl.
Ar steht vorzugsweise für
Figure imgf000007_0001
worin R für OH oder OAlkyl steht und n für 2 oder 3 steht. Ganz besonders bevorzugt steht Ar für 2,4,6-Trimethoxyphenyl, d.h. das Stickstoffatom weist eine 2,4,6-Trimethoxybenzyl- Schutzgruppe (Tmob) auf.
Die Reste R2 bis R7 stehen für ein Wasserstoffatom oder eine freie oder geschützte Aminosäurenseitenkette, d.h. diese Reste sowie x und y werden je nach der gewünschten Aminosäure gewählt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung steht Alkyl vorzugsweise für eine geradkettige oder verzweigte C,-C8-Alkylgruppe, insbesondere für eine C,-Ce-Alkylgruppe. Beispiele für eine derartige Alkylgruppe sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sek-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl, etc.
Alkoxy steht vorzugsweise für eine geradkettige oder verzweigte C,-C8-Alkoxygruppe, insbesondere für eine C,-C4-Alkoxygruppe.
Beispiele für Alkoxygruppen sind Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i- Propoxy, n-Butoxy, i-Butoxy und t-Butoxy. Aryl steht vorzugsweise für Phenyl und Acyl steht vorzugsweise für Cι-C6-Acyl, insbesondere For yl, Acetyl oder Benzoyl.
Wenn R1 für eine zum temporären Schutz der Aminogruppe dienende Gruppe steht, so ist darunter zu verstehen, daß eine solche Schutzgruppe gewählt wird, welche die Aminogruppe in dem betreffenden Reaktionsschritt schützt. Diese Schutzgruppe wird dann zweckmäßigerweise noch vor Abspaltung aller übrigen Schutzgruppen entfernt. Vorzugsweise weist diese Schutzgruppe zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden ist, Urethanstruktur auf, d.h. es liegt das Strukturelement Y-O-CO-N- vor. Zweckmäßigerweise setzt man übliche Schutzgruppen ein, d.h. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (F oc) , t-Butoxycarbonyl (BOC) , Benzlyoxycarbonyl (Z) , Ada antyloxycarbonyl (AdOC) , etc.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verläuft die Umsetzung der Verbindungen der Formel II gemäß der Mannich-Reaktion mit allen aktivierten Aromaten. Als aktivierten Aromat verwendet man vorzugsweise die entsprechend substituierten Benzolderivate oder die entsprechend substituierten Thiophen-, Furan- oder Pyrrolderivate. Die Verbindung der Formel II kann als Hydrochlorid, Ester, Amid oder freie Säure eingesetzt werden. Bei Mannich-Reaktionen von Aminosäuren war bisher stets teilweise oder vollständige Racemisierung zu beobachten. Im Gegensatz dazu verläuft das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere bei Verwendung der Aminosäureester, d.h. bei Verwendung von Verbindungen der Formel II, worin R8 für OR9 steht, racemisierungsfrei. Die Reaktion verläuft säurekatalysiert, wobei übliche Säurekatalysatoren eingesetzt werden können, insbesondere Essigsäure oder HCl. Wenn als Verbindung der Formel II das Hydrochlorid eingesetzt wird oder bei Verwendung der freien Aminosäure verläuft die Umsetzung autokatalytisch.
Zweckmäßigerweise erfolgt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel. Niedrige Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n- Propanol oder Isopropanol, haben sich als besonders brauchbar erwiesen .
Die Umsetzung wird zweckmäßigerweise bei erhöhter Temperatur, im allgemeinen im Bereich von Umgebungstemperatur bis zum Siedepunkt des Reaktionsgemisches, durchgeführt. Die Reaktionszeit hängt ab von der Reaktivität der Reaktionspartner, der Reaktionstemperatur, dem pH, etc., und sie beträgt im allgemeinen 1 bis 5 Stunden. Der Verlauf der Reaktion wird zweckmäßigerweise analytisch verfolgt, beispielsweise mittels Dünnschichtchromatographie. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches liegt vorzugsweise im Bereich von 4 bis 6.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, Formaldehyd und aktivierten Aromat in geringem Überschuß, beispielsweise in einem Überschuß von ca. 10 %, einzusetzen.
Die Herstellung der Verbindungen der Formel I läßt sich anhand des nachfolgenden Reaktionsschemas beispielhaft veranschaulichen:
Figure imgf000009_0001
Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgt in üblicher Weise. Beispielsweise gelingt die Trennung von disubstituiertem und trisubstituiertem Produkt sowie die Trennung von o- und p- Produkt leicht über die unterschiedlichen Löslichkeiten. Bei Verwendung von 1,3,5-Trimethoxybenzol als aktiviertem Aromat fällt zum einen kaum disubstituiertes Produkt an, und zum anderen läßt sich das disubstituierte Produkt besonders einfach aufgrund seiner geringeren Polarität abtrennen. Generell ist festzustellen, daß die Verwendung von Verbindungen der Formel II in Form der Ester bevorzugt ist, weil sich das Esterreaktionsprodukt leichter aus dem Reaktionsgemisch abtrennen läßt. Dies gilt ganz besonders für den Benzylester, der zudem noch den Vorteil besitzt, daß die Benzylestergruppe durch Hydrierung selektiv (Tmob und Fmoc sind unter diesen Bedingungen stabiler und werden nicht entfernt) in die freie Säure überführen läßt.
Man erhält auf diese Weise 50 bis 80 % des gewünschten Produktes (in reiner Form), wohingegen die Produkte nach den Verfahren des Standes der Technik über die Schiff'sehe Base nur in wesentlich geringerer Ausbeute erhältlich waren.
Falls Verbindungen der Formel I gewünscht sind, bei denen der Rest R1 eine andere Bedeutung als ein Wasserstoffatom besitzt, werden die nach der Mannich-Reaktion erhaltenen Produkte mit einem Reagens zur Einführung einer Alkyl-, Aryl- oder Acylgruppe oder einer zum temporären Schutz der Aminogruppe dienenden Gruppe oder einer freien oder geschützten Aminosäure umgesetzt. Die Einführung der Alkyl- oder Arylgruppe erfolgt in üblicher Weise durch Alkylierung, beispielsweise mit einem Alkyl- oder Arylhalogenid, etc. Die Einführung der zum temporären Schutz der Aminogruppe dienenden Gruppe oder der freien oder geschützten Aminosäure erfolgt nach einem in der Peptidsynthese üblichen Verfahren. Hier hat sich vor allem die Aktivester-Methode als zweckmäßig erwiesen, die bei sehr hohen Ausbeuten geringe Racemisierung ergibt. Anschließend kann die C-terminale Schutzgruppe, falls vorhanden, entfernt werden, was im Falle der Benzylester mittels selektiver Hydrierung erfolgt. Die Einführung einer geschützten Aminosäure wird anhand des nachfolgenden Reaktionsschemas beispielhaft erläutert:
-CCOH
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
DIC = Diisopropylcarbodiimid HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol
Die Einführung der Acylgruppe erfolgt analog. Alternativ können diese Gruppen durch Umsetzung mit den entsprechenden Säurehalogeniden, insbesondere den Säurefluoriden, eingeführt werden.
Die N-Fmoc-geschützten 2,4,6-Trimethoxybenzylderivate kristallisieren besonders gut und besitzen hervorragende Löslichkeit in den in der Peptidchemie üblichen Lösungsmitteln.
Die Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I mit Aminosäuren, Peptiden, Glykopeptiden, Nukleotiden und Proteinen erfolgt unter den allgemein in der Peptidsynthese üblichen Kupplungsbedingungen.
Der Einsatz der Dipeptide verbessert die Kupplungen N-terminal modifizierter Aminosäuren und Peptide entscheidend. Die Kupplung der Dipeptide an den freien N-Terminus von Festphasen- gebundenen oder andersartig C-terminal blockierten Aminosäuren, Peptiden, Glykopeptiden, Nukleopeptiden und Proteinen erfolgt als Anhydrid, Aktivester oder in anderer in der Peptidchemie üblicher Weise. Die Kupplung nach der Aktivester-Methode wird anhand des nachstehenden Formelschemas beispielhaft erläutert: R3
I
Schutzgruppe-NH-CH- H + HjN-CH-COOR4
Figure imgf000012_0001
R1 R3 I I
HOBT; DIC Schutzgruppβ-NH-CH- HN-CH-COOR4
Figure imgf000012_0002
Der weitere Aufbau der Peptidkette wird nach den bekannten Methoden (vergl. z. B. R.B. Merrifield, E. Giralt et al., Synthesis, (1985) , 181) durchgeführt. Ein Einbau der beschriebenen Dipeptide oder Aminosäuren an jeder vierten bis achten Stelle der Peptidsequenz verhindert zuverlässig die Ausbildung von Strukturen während der Synthese. Erfindungsgemäß eignen sich die Dipeptide zur Synthese beliebiger Peptide unter den in der Peptidchemie bekannten Kupplungsmethoden und Schutzgruppenstrategien.
Die Abspaltung der ArCH2-Gruppen kann hydrogenolytisch oder acidolytisch in üblicher Weise erfolgen. Die Bedingungen hierfür sind dabei umso milder, je stärker der ArCH2-Rest Hydroxy- bzw. Methoxy-substituiert ist. Die besonders geeignete 2,4,6-Trimethoxybenzylgruppe läßt sich mit 95 % TFA in lh vollständig abspalten.
Die erfindungsgemäßen Dipeptide haben damit entscheidende Vorteile: Sie erlauben eine effektive, racemisierungsarme
Ankupplung an den freien N-Terminus von Festphasen-gebundenen oder andersartig C-terminal geschützten Peptiden und die Kupplung des freien C-Terminus von Peptiden bzw. von Nβ- geschützten A inoεäurederivaten auf den freien N-Terminus des dipeptidischen Restes unter kinetisch hervorragenden Bedingungen. Die Abspaltung der backbone-ArCH2-Gruppen ist unter milden Bedingungen möglich. Alkylierungen anderer Aminosäuren lassen sich durch geeignete Abspaltbedingungen und Schutzgruppenstrategien vermeiden.
Als besonders bevorzugt hat es sich erwiesen, die Verbindungen der Formel I und insbesondere die Dipeptide der Formel I in Kombination mit einem Festphasensystem zu verwenden, das eine Tritylgruppe umfaßt und der Formel entspricht:
Figure imgf000013_0001
wobei P ein festes Trägermaterial bedeutet,
S eine Spacergruppierung bedeutet, ausgewählt unter Alkylen, -NH-, -NR- oder -O- (Ester), in o-, m- oder p-Stellung des benachbarten Phenylringes, R1, R2 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Dialkylamino, Halogen oder Nitro stehen,
und X eine zur Verknüpfung geeignete Gruppe, ausgewählt unter Acylamino, Acyloxy, Amino, Halogen, Hydroxyl oder Phosphonat, bedeutet, worin Acyl den
Rest einer Carbonsäure darstellt.
Dieses Festphasensystem, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in Festphasenreaktionen sind in der DE-44 31 513.9, auf die hiermit in vollem Umfang bezug genommen wird, beschrieben. Die Ankupplung der C-terminalen Aminosäure erfolgt dabei z. B. gemäß folgendem Reaktionsschema:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
In diesem Reaktionsschema steht R' ' für Tmob.
Der weitere Aufbau der Peptidkette erfolgt dann nach den in der Festphasen-Peptidsynthese bekannten Methoden, wie oben erläutert. Die Abspaltung der Peptide und Glykopeptide erfolgt unter sehr milden, essigsauren Bedingungen. Man erreicht diese Abspaltung z. B. durch Behandlung der polymergebundenen Derivate mit 20 bis 50 %iger Essigsäure in Dichlormethan in Gegenwart eines Scavengers, wie Methanol. Die Reaktion ist bei Raumtemperatur in der Regel in wenigen Stunden abgelaufen. Durch die außerordentlich milden Bedingungen bleiben selbst empfindliche Strukturen (wie beispielsweise glykosidische Bindungen) und Schutzgruppen (wie beispielsweise Trityl- und BOC-Gruppen) im abgelösten Peptid oder Glykopeptid zuverlässig erhalten.
Die abgelösten Produkte können dadurch selektiv und partiell geschützt in guten Ausbeuten isoliert werden. Sie sind deshalb sofort zu weiteren Synthesen, wie gezielten Fragmentkondensationen, einsetzbar. Eine vollständige Abspaltung der Schutzgruppen ist natürlich ebenfalls möglich.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1
Darstellung von N"-(2,4,6-Trimethoxybenzyl)-Alaninbenzylester
Substanzen:
20 g L-Alaninbenzylester-Hydrochlorid (M=215,68; «92,7 mMol) 17,2g 1,3,5-Trimethoxybenzol (M= 168,19; «102 mMol) 3,3g Paraformaldehyd (M= 30,03; « 111,3 mMol) 100ml Methanol
120ml Diethylether 180ml Dichlormethan NaHC03 Na2S04
20 g L-Alaninbenzylester-Hydrochlorid wurden zusammen mit 17,2 g 1,3,5-Trimethoxybenzol und 3,3 g Paraformaldehyd 1 h in 100ml Methanol unter Rückfluß erhitzt. Die DC-Kontrolle mit CHC13 als Laufmittel zeigtze vollständige Umsetzung an. Anschließend wurde die klare Lösung einrotiert, das resultierende Öl wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und 3x mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Man trocknete die gesammelten Extrakte über Na2S04 und entfernte das Lösungsmittel im Vakuum. Es resultierte ein farbloses, DC-reines Öl, das im Kühlschrank aufbewahrt werden kann. Die Rohausbeute betrug 84 %.
Beispiel 2
Darstellung von Fmoc-Ala-(T ob)Ala-Bzl
Substanzen
5 g L-N"-(2,4,6-Trimethoxybenzyl)-Alaninbenzylester (M=2357,41; «13,99 mMol) 4,35g Fmoc-L-Alanin (M= 311,3; «13,99 mMol) 1,89g HOBT (M= 135,13; « 13,99 mMol) 2,63ml DIC (M= 126,2; d= 0,806; « 16,79 mMol) 40ml DMF abs. 50ml Methanol NaHC03 Na2S04
5 g N"-(2,4,6-Trimethoxybenzyl)-Alaninbenzylester wurden in 10 ml abs. DMF gelöst und auf 0°C gekühlt. Eine Lösung von 4,35 g F oc-Alanin, 189 g HOBT und 2,63ml DIC in 30ml abs. DMF wurden tropfenweise unter Rühren und Eiskühlung zugegeben. Nach beendeter Zugabe rührte man noch 30 min. bei 0°C und 1,5 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurde mit 200 ml Diethylether verdünnt, der gebildete Harnstoff wurde abfiltriert und mit Diethylether nachgewaschen. Die etherische Phase extrahierte man so lange mit NaHC03-Lösung, bis die wäßrigen Extrakte farblos waren. Nach Trocknen über Na2S04 und Entfernen des Ethers im Vakuum kristallisierte man aus wenig heißem Methanol um. Die Ausbeute betrug 96 %.
Beispiel 3
Darstellung von F oc-Ala-(T ob)Ala-OH
Substanzen:
5 g Fmoc-Ala-(Tmob)Ala-Bzl (M= 650,1; « 7,69 mMol) 100 ml Toluol
1 1 Dichlormethan 100 ml Methanol H2
5 g des Benzylesters wurden in 100 ml Toluol gelöst, mit Pd/Aktivkohle und 1 ml Eisessig versetzt und 4 h bei Raumtemperatur unter 50 atm H2 hydriert. Die Aktivkohle wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Den Rückstand kristallisierte man aus Dichlormethan/Heptan um. Ausbeute: 80 %. Beispiel 4
Darstellung des Dodecaalanins (Ala)4-(Tmob)Ala-(Ala)3-(Tmob)Ala-(Ala)3-0H
Substanzen:
0,25 g Fmoc-Alanin auf Chlor-trityliertem Polystyrolharz der
Beladung 0,41 meq/g Harz 4 meq Fmoc-Aminosäure (N-Fmoc-Alanin) bzw. Dipeptid (N'- Fmoc-Alanyl-N-Tmob-Alanin) oder Fmoc-geschütztes
Tmob-Aminosäurederivat (N-Fmoc-Alanyl-N-Tmob-Alanin) pro Kupplung 4 meq DIC pro Kupplung 4 meq HOBT pro Kupplung N,N-Dimethylformamid, UV-grade
20 %ige Lösung von Piperidin in DMF zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe
Nach Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe wurde die nächste Aminosäure mit HOBT und DIC in DMF 3 min. voraktiviert und im continuous-flow-Verfahren 12 min. durch die Reaktorsäule gepumpt. Nach jedem Kupplungs- und Abspaltungsschritt wurde das Peptidharz mit DMF gewaschen. Der Vorgang wurde mit den anderen Fmoc-Aminosäuren bzw. an den entsprechenden Positionen mit Fmoc-Dipeptid (N'-Fmoc-Alanyl-N-Tmob-Alanin) oder Fmoc- geschütztem Tmob-Aminosäurederivat (N-Fmoc-N-Tmob-Alanin) jeweils analog bis zur fertigen Peptidsequenz wiederholt. Am Ende der Synthese wurde die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe abgtespalten und das Peptidharz wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt so das über die tritylische Ankergruppierung mit dem Trägerharz verknüpfte Dodecapeptid. Beispiel 5
Abspaltung des Dodecaalanins vom Träger
Das nach Beispiel 4 hergestellte Peptid wurde 4 h mit einer Mischung von 9,5 ml TFA und 0,5 ml EDT behandelt. Anschließend wurde das Harz abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, die Essigsäure im Vakuum azeotrop abdestilliert und das Peptid mit Ether gewaschen. Das Produkt besitzt nach HPLC und lonpray-MS mehr als 95 %ige Reinheit. Die Ausbeute wurde zu 93 % bestimmt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Herstellung von Aminosäurederivaten und Dipeptidderivaten der Formel (I)
R'-N-(CR2R3)X-CR4R5-(CR6R7)y-COR8
CH2 (I) Ar
worin
R1 für ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, Arylgruppe, Acylgruppe, eine zum temporären Schutz der Aminogruppe dienende Gruppe oder eine freie oder geschützte Aminosäure steht,
R2-R7, die gleich oder verschieden sein können, für ein Wasserstoffatom oder eine freie oder geschützte Aminosäureseitenkette stehen,
R8 für OH, OR9 oder NRI0RM steht,
R9 für eine Alkyl-, Benzyl- oder Phenylgruppe steht,
R10 und Rπ, die gleich oder verschieden sein können, für ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Benzyl- oder Acylgruppe stehen,
x und y, die gleich oder verschieden sein können, für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 stehen können,
Ar für einen Rest der Formel steht,
Figure imgf000019_0001
wobei
R für eine Alkyl- oder Alkoxygruppe steht, die gegebenenfalls durch OH, NH2 oder NHR13 substituiert ist, oder für OH oder -X-COR12 steht,
X für (CH2)m, O oder ©(CHj).,, steht,
n für 1, 2, 3 oder 4 steht,
m für 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 steht,
R12 für OH, Alkoxy, Benzyloxy, NH2, NHR13 oder NR13R14 steht,
R13 und R14, die gleich oder verschieden sind, für eine Alkyl-, Benzyl-, Amin- oder Amidschutzgruppe stehen,
oder Ar für einen Thiophen-, Furan- oder Pyrrolrest steht, der durch ein, zwei oder drei wie oben definierte Reste R substituiert ist,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß
man ein Aminosäurederivat der Formel II:
H2N- ( CR2R3) XCR4RS ( CR6R7) y-C0R8 (II)
worin R2 bis R8 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in einer Mannich-Reaktion mit einer Verbindung Ar-H umsetzt, worin Ar die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, und anschließend gegebenenfalls den Rest R1 einführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel II verwendet, worin R8 für OH, OAlkyl oder OBenzyl steht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel II in Form eines Säureadditionssalzes einsetzt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß Ar für )n steht, wobei
Figure imgf000021_0001
R für OH oder OAlkyl steht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der Formel III l,3,5-Trimethoxybenzol verwendet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mannich-Reaktion in einem niedrigen Alkohol als Lösungsmittel durchführt.
7. Dipeptide der Formel I, worin R1 für eine freie oder geschützte, peptidisch gebundene Aminosäure steht, und R2 bis R8 und Ar die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.
8. Dipeptide nach Anspruch 7 der Formel I, worin R8 für OH, OAlkyl oder OBenzyl steht.
9. Dipeptide nach Anspruch 7 oder 8 der Formel I, worin Ar für 2,4,6-Trimethoxypheny1 steht.
10. Verwendung der Dipeptide nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Synthese von Peptiden, Glycopeptiden, Peptid- Nucleotid-Konjugaten oder Proteinen, insbesondere in Festphasenreaktionen.
11. Verwendung nach Anspruch 10 in Kombination mit einem Festphasensystem
Figure imgf000021_0002
wobei P ein festes Trägermaterial,
S eine Spacergruppierung, ausgewählt unter Alkylen, -NH-, -NR- oder -O- (Ester) , in o-, m- oder p- Stellung des benachbarten Phenylringes, R1, R2 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Dialkylamino, Halogen oder Nitro stehen,
und X eine zur Verknüpfung geeignete Gruppe, ausgewählt unter Acylamino, Acyloxy, Amino, Halogen, Hydroxy1 oder Phosphonat, bedeutet, worin Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022566A1 (de) * 1991-06-13 1992-12-23 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Geschützter aminosäurebaustein, herstellung und verwendung

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WO1992022566A1 (de) * 1991-06-13 1992-12-23 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Geschützter aminosäurebaustein, herstellung und verwendung

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