WO1996004558A1

WO1996004558A1 - Systeme de mesure fonctionnant avec du sang entier

Info

Publication number: WO1996004558A1
Application number: PCT/JP1995/001510
Authority: WO
Inventors: Nobuhiro Hoshino; Michiko Kawamoto; Mitoshi Shimamoto
Original assignee: Iatron Laboratories, Inc.
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1996-02-15
Also published as: EP0722087A1; DE69534294D1; EP0722087B1; EP0722087A4; ES2243939T3; US6143510A; DE69534294T2

Description

明細書

全血を用いる測定方法

技術分野

本発明は、全血被検試料をそのまま用いてその全血被検試料中の測定対象物質を検出する方法に関する。すなわち、患者などから採取した全血から血清や血漿を調製することなく、全血をそのまま被検試料として用いて、全血被検試料中に含まれる測定対象物質を測定する方法に関する。背景技術

被検試料中の測定対象物質、とりわけ生体試料中の微量成分の測定に免疫学的測定方法が利用されて久しい。これら微量成分の大部分は、一般に被検試料には Zm 1のオーダー又はそれ以下の量で含まれているに過ぎず、例えば、抗原抗体反応により生成する複合体を免疫拡散法やレーザーネフェロメトリーにより直接的に測定する方法では検出感度に限界があるため、抗原か抗体の一方を好適な物質で標識し、それに基づく信号を検出する方法、いわゆる標識免疫測定法などの手段によつて、生体試科中の微量成分をより高精度に測定することができる。標識免疫測定法は種々の方法により実施されるが、例えば、測定対象物質の第 1の免疫学的パートナ一で被覆された不溶性担体と被検試料を接触させ、続いて洗净し、又はしないで、不溶性担体上に担持された第 1の免疫学的パ一トナーと測定対象物質との複合体に、標識化された第 2の免疫学的パートナーを接触させた後、生成した不溶性担体 ·第 1の免疫学的パートナー ·測定対象物質 .標識化された第 2の免疫学的パートナーからなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出するフォヮ一ドサンドィツチ法又はディレイド 1ステツプサンドィツチ法、測定対象物質の第 1の免疫学的パ一トナ一で被覆された不溶性担体と被検試料及び標識化された第 2の免疫学的パートナ —を同時に接触させた後、生成した不溶性担体 ·第 1の免疫学的パートナー ·測定対象物質 ·標識化された第 2の免疫学的パートナーからなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識に由来する信号を検出する 1ステップサンドィツチ法、標識化された測定対象物質の第 1 の免疫学的パートナーと被検試料を接触させ、続いて標識化された第 1の免疫学的パートナーと測定対象物質との複合体に、不溶性担体に担持された第 2の免疫学的パートナーを接触させた後、生成した標識化された第 1の免疫学的パートナー ·測定対象物質 ·第 2の免疫学的パートナー ·不溶性担体からなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出するリバースサンドィツチ法、また測定対象物質に対する標識化された免疫学的パートナー（抗体の場合は好適にはモノクローナル抗体）と被検試料を接触させ、続いて不溶性担体上に担持された測定対象物質と同様の作用をする物質（又は不溶性担体上に担持された測定対象物質に対する免疫学的パートナ ―) を接触させ、生成した標識化された免疫学的パートナー ·測定対象物質と同様の作用をする物質 ·不溶性担体からなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出する免疫阻害法、更に、測定対象物質の免疫学的パートナーで被覆された不溶性担体と被検試料及び測定対象物質と同様の作用をする標識された物質を競合的に接触させ、生成した不溶性担体 ·免疫学的パートナー ·測定対象物質と同様の作用をする標識された物質からなる複合体とその複合体を含まない部分に分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出する競合法等が挙げられる。更に、標識免疫測定法は、用いる標識物質から区分された方法として、例えば、酵素を標識して用いる E I A法、赤血球やラテックス粒子等を担体として用い凝集塊を肉眼等で判定する免疫凝集法、ァイソトーブを標識物質として用いる R I A法等が挙げられる。これらの方法においては、被検試料と測定対象物質に対する免疫学的パートナーとの接触時間は平衡すなわち時間の経過とともにそれらの複合体が形成される量が増加してくるので、通常、複合体の量が変化しなくなる長時間が選択される。

前記の方法のうち、 R I A法は特別な設備を必要とすることや、放射性物質廃棄の問題があることから徐々に E I A法等に置き換えられているが、上記のいずれの方法においても、血液を試料とする場合には、採取した全血をそのまま使用せずに、その全血から血清又は血漿を調製し、それらを被検試科として分析を実施していた。これらの測定法に限らず、一般に不溶性成分例えば血球等を含んでいる全血を被検として用いると、それらの不溶性成分が測定値に種々の干渉を及ぼす可能性がある。例えば、 BZF分離を行わない均一系の測定法において標識物質に由来する検出信号を可視領域で測光する場合、測定値に正の誤差を与えることがある。また、凝集反応においては、目的の免疫反応とは関連の無い濁りの要因（血球等）が存在するため、正確な測定が困難である。一方、 B / F分離を行う測定においては、不溶性担体に固定化した抗体などと全血を反応させた後に、全血を洗浄してから標識抗体などと反応させることにより、測定を行うことができる。しかし、血球成分が多 fiに含まれるため、この方法で得られた測定結果と、血清を検体とした場合の測定結果に違いがでてしまい、更に血球量は個人によって異なるため、一定の係数をかけても補正することはできない。このようなことから、全血を測定して診断基準となる結果を得るためには、その血液のへマトクリット値を測定し、全血測定値を補正する必要があり、その手間を考えると B Z F分離を行う系でも、全血検体は血清又は血漿に分離してから測定に用いられてきた。

—方、不溶性成分の影響を排除する試みも種々行われ、例えば、特公平 0 2— 5 1 1 5 0号公報には凝集反応に先だって予め溶血剤を全血に加え不溶性成分の影響を排除する方法、特開平 0 1— 2 3 7 4 5 4号公報には酵素による消化又は温和な酸に対する曝露を利用して阻害物質を除くと共に、全血中の結合サイトを露出させて検出感度を向上させる方法、特開平 0 1— 1 6 5 9 6 4号公報には全血をノィラミニダーゼで処理し、潜在腫瘍関連抗原を完全に遊離させることにより、不溶性成分の影響を極力低減させる方法が開示されている。また、不溶性成分を除去せずに測定する試みとして、例えば、特開昭 6 4 — 6 3 8 6 8号公報には乾燥濾紙血による肝炎ウィルスの検出方法が開示されている。ここでは、血液を付着させた滤紙を自然乾燥し、測定時には乾燥血液が付着した攄紙の所定面積を切り取り、この濂紙と據紙に付着した血液成分を抽出するための緩衝液と表面に抗体をコーティングしたビーズを 2 0時間程度反応させている。しかしながら、この方法では、攄紙に吸着させた血液を自然乾燥させるという操作、攄紙を切り取る前処理が必要であり、更に滤紙から血液成分を抽出しており、全血をそのまま被検試料として用いているとはいい難い。

また、上記のような液相で免疫反応を行う系以外に、ドライケミストリーと称される乾式免疫分析要素を用いる方法（例えば特開平 0 1— 1 1 2 1 5 9号公報）、いわゆるバイオセンサーを用いる方法（例えば特表平 0 4— 5 0 2 6 7 1号公報）、又は免疫クロマトグラフィー試験を用いる方法（例えば特開平 0 6— 9 4 7 1 8号公報）は、全血をそのまま被検試料として用い、目的物質の検出を行うことができる。

しかしながら、液相で免疫反応を行う前記の従来法においては、所望の免疫反応を実施する前に、更に一段階の追加操作（前処理）カ^?必要であり、分析操作が繁雑となる力、、又は多くの場合、多検体、多項目処理に適していなかった。一方、全血を直接被検試料として用いる乾式免疫分析要素法は、測定精度の面で不充分であつた。更に、バイオセンサーや免疫クロマトグラフィー試験を用いる方法は、特殊な器具を用いる必要があった。

従って、本発明の目的は、全血を前処理せずにそのまま被検試料として使用し、その全血被検試料中の測定対象物質を迅速に測定することのできる分析手段を提供することにある。即ち、全血を被検試料としたときに発生する問題、例えば不溶性成分と可溶性成分の存在割合が変動するという不都合が生じても、全血を用いたときの測定対象物質の測定結果が、血清あるいは血漿といった従来の試料を用いたときの測定結果と一致する測定手段を提供することで、従来の採取全血を前処理する操作等を省略して緊急検査を可能にするだけでなく、一般の検査においても大幅な省力化を達成することにある。発明の開示

本発明方法では、簡便、迅速な測定方法（特に免疫学的測定方法）を用いて、全血被検試料中の測定対象物質の濃度を、血清や血漿を被検材料とした場合と同じく得ることができる。これによつて血清や血漿分離にかかる時間が不要になり、更に、本発明方法では特異的結合パートナー（特に免疫学的パートナー）で被覆された不溶性担体と全血被検試料を短時間で接触させることを特徴としているため、結果的には測定結果を迅速に得ることができる。

前記の目的は、本発明による、測定対象物質と特異的に桔合する第 1のパートナ一で被覆された不溶性担体と充分な量の^ ώι被検試料とを短時間接触させ、続いて、不溶性担体上に担持された第 1のパートナーと測定対象物質との複合体に、測定対象物質と特異的に結合し、標識化された第 2のパートナーを接触させた後、生成した不溶性担体 ·第 1のパートナー ·測定対象物質 ·標識化された第 2のパ—トナーからなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出することを特徴とする測定対象物質の測定方法によって達成することができる。この際、第 1のパートナーと第 2 のパートナーは同じであっても異なっていてもよく、測定対象物質に対応して適宜選択することができる。図面の簡単な説明

図 1は、 H B s抗原を測定する被検試料として、血清を用いた場合と全血を用いた場合との相関図である。

図 2は、 H B s抗体を測定する被検試料として、血淸を用いた場合と全血を用いた場合との相関図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、任意の方法（例えば採血）により患者などから得られた全血及び人工的に作られた測定対象物質あるいはその類似体を含む試料を被検試料とし、この被検試料中の測定対象物質を免疫学的な方法で測定することを含んでなる。ここで「全血」被検試料とは、患者などから採血された血液に含まれている不溶性成分を除去する処理を実施しておらず、不溶性成分を含有している試料を意味する。従つて、血清試料や血漿試料は含まれないが、患者などから採血した血液それ自体の他に、採血した血液に、例えば、抗凝固剤（例えば、 E D T A、クェン酸ナトリウム、へパリン、フッ化ナトリウム又はシユウ酸ナトリウム）及び又は血液保存剤（例えば、クェン酸ナトリウム、クェン酸、ブドウ糖及びリン酸二水素ナトリウムからなる C P D ) などを添加した試料は前記の「全血」被検試料に含まれる。また、患者などから採血した血液を、例えば、抗凝固作用を有する緩衝液で希釈した試料も、本発明の全血被検試料に含まれる。更に、患者などから採血した血液を、上記の処理などを施した後、長期間〔例えば、血液保存剤による有効期間（4〜 6 ）である 2 1日以上〕放置した試料も本発明の全血被検試料に含まれる。また、「人工的に作られた測定対象物質あるいはその類似体を含む試料」とは、本発明を定量化するため、あるいは正確性を管理するために主に使用される物質であり、天然あるいは人工の不溶性成分、例えば血球、ラテックスビーズ等を含んでいてもいなくてもよいが、操作性からは不溶性成分を含んでいない方が好ましく、更には、測定対象物質と相関関係を示す物質であれば、必ずしも測定対象物質あるいはその類似体を含んでいる必要はない。

本発明方法において測定対象物質とは、血液中に一般に含まれている成分（特に成分）であれば特に制限されないが、例えば、各種タンパク質、多糖類、脂質、ハブテン、核酸及びそれらの複合体又は断片等が挙げられる。より詳細には、 H B s抗原、 H B s抗体、 H I V— 1抗体、 H I V— 2抗体、 11丁しー 1抗体、トレポネーマ抗体等の感染症関連マーカー、 A F P、 C R P、 C E A等の腫瘍関連抗原、ブラスミノーゲン、アンチトロンビン一 ΠΙ、 D—ダイマ一、トロンビン一アンチトロンビン ΠΙ複合体等の凝固線溶マーカー、ホルモン、サイト力イン、酵素等や杭てんかん薬及びジゴキシン等の各種薬剤等を挙げることができる。また、特定の配列を有する D N Α若しくは R N A又はそれらの一部からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。

また、その測定対象物質と特異的に桔合するパートナーとは、前記の測定対象物質と免疫学的に特異的に結合するパートナー、すなわち免疫学的パートナー、例えば、前記各種タンパク質、多糖類、脂質、核酸及びそれらの複合体又は断片等と特異的に結合することのできる免疫学的物質（すなわち、抗原又は抗体）である。例えば測定対象物質が H B s抗原であるときの H B s抗体、測定対象物質が H I V 一 1抗体であるときの H I V— 1抗原等の感染症関連マ一力一に対する抗原又は抗体、腫瘙関連抗原に対する抗体等を挙げることができる。また、測定対象物質と特異的に結合するパートナーとしては、測定対象物質が核酸であれば、それに対する抗体の他に、測定対象核酸の塩基配列と相補的な配列の少なくとも 1部分好ましくは全部を有する相補核酸、例えば、相補的 D N A若しくは R N A又はそれらを制限酵素等で処理した断片又は合成ボリヌクレオチド等を挙げることができる。更に、免疫学的パートナーとして、抗体を用いる場合には、モノクローナル抗体でもポリクロ一ナル抗体でもよく、それらを酵素などで処理した断片でもよい。従って、未処理あるいは酵素などで処理した免疫グロブリン〔I g Gやそれをペプシン消化した F ( a b ' ) ₂等〕を用いることができる。抗原の場合は、ウィルスライゼート等を常法、例えば密度勾配遠心法等により得たもの、また、抗原の 1部に相当するぺブタイド及び組み換え蛋白質等を使用することができる。これらの特異的結合性パ一トナーの内、標識を付してないものを不溶性担体に固定して第 1の特異的結合性パ一トナーとし、標識を付したものを第 2の特異的結合性パートナーとして用いる。以下、特異的結合性パ—トナーとして免疫学的パートナーを用いる場合について説明するが、とくに不都合がないかぎり、それらの説明はそのまま相補核酸にもあてはまるものと理解されたい。

本発明方法を実施する場合には、まず、測定対象物質に対する第 1の免疫学的パ一トナーを不溶性担体に被覆する。不溶性担体に免疫学的パートナーを被覆する方法としては、例えば「酵素免疫測定法」（医学書院）に記載されているような物理的吸着あるいは共有結合等の従来公知の方法によって被覆することができる。具体的には、不溶性担体と免疫学的パートナーを含む溶液を室温で数時間接触させた後、適当な緩衝液で洗浄し、必要に応じて風乾することにより調製することができる。このとき、必要に応じて、従来公知の手段で免疫学的パートナーを被覆した後、ゥシ血清アルブミンあるいはスキムミルク等で、又は、化学結合における過剰の官能基をリジン等でブロッキングすることにより、測定対象物質以外の成分が非特異的に不溶性担体に吸着することを防止することができる。こうして得た免疫学的パートナー被覆不溶性担体は、そのままの状態で保存しても、あるいは適当な緩衝液 (例えばリン酸緩衝液）等で湿潤させた状態で保存してもよい。

上記不溶性担体としては、従来公知の不溶性担体、例えばチューブ、プレート、メンブレン、フィルム又はビーズ等を用いることができ、それらの材料は、天然又は合成された物質、例えばセルロースあるいはナイロン、ポリスチレン、ボリェチレン等及び担体として適度な強度を得るために、それらを組み合わせた物質、またそれらに無機物例えば鉄等を含んでいる物質が用いられる。これらの不溶性担体は被検試料中の測定対象物質以外の成分あるいは標識された免疫学的パートナー力 ^?非特異的に吸着しないように従来公知の手段により表面処理、例えば担体表面に適当なァニオン基を導入したもの等また、測定対象物質に対する免疫学的パートナーを不溶性担体に被覆しやすいように適当な官能基、例えば、カルボキシル基、ァミノ基等を従来公知の手段により担体表面に導入したもの等が好適に用いられる。更に不溶性担体がビーズの場合には多孔性であってもなくてもよいが、洗浄効率が良好な多孔性でないものが好ましく、直径が 0 . l / m〜7 mm、より好適には、フィルター等を用いた滤過方式又はノズル等での吸引方式で洗浄を行う場合には全血被検試料中の不溶性成分の直径よりも大きな直径を有するビーズ、例えば直径が 1 0 以上のビーズが用いられる。しかし、ビーズにフェライト等の磁性体成分が含まれている場合には、フィルタ一等を用いず、磁石でビーズを集めて洗诤を行うことができるため、直径が 1 0 _μ m以下のもの、好ましくは 0 . 1 〜 5 mのものを用いることができる。

このように構成された免疫学的パートナー被覆不溶性担体と全血被検試料とを接触させ、測定対象物質と不溶性担体上の免疫学的パートナーとの複合体を形成させる。本発明方法において、この際、多量の液性物質、例えば検体希釈用緩衝液を含まない方が好ましい。

長時間免疫反応を行う測定系は、一般にエンドポイント法と言われ、反応系に加えた検体中の測定対象物質全て力 ^?免疫反応を起こすことを原理としている。この場合、へマトクリット値 3 0 %の全血を検体とすると、そこに含まれる測定対象物質は、血清を同量用いた場合の 7 0 %となり、測定結果も 7 0 %の値となる。更にへマトクリット値 5 0 %の全血では、測定結果が血清を同量用いた場合の 5 0 %となり、へマトクリット値補正を行わないと、血清を用いて得られた測定結果と互換性が得られない。

これに対し本発明は、全血被検試料と免疫学的パートナー被覆不溶性担体を、反応初期から短時間だけ接触させ、ェンドボイントに達する前の時点で反応を停止する（測定する）ことを特徴としている。これにより全血被検試料の全ての測定対象物質が不溶性担体上の免疫学的パートナーと反応するのではなく、限られた時間内に測定対象物質の濃度に依存した量だけが濃度に比例して反応することになる。この場合、全血中と血清中の測定対象物質濃度は同一であることから、血球成分の存在は測定桔果に何の影響も及ぼさず、これまで予想もできなかつた程度に全血を用いた測定結果と血清を用いた測定結果の一致が見られた。

具体的な接触時間は、測定対象物質の種類及び全血被検試料中の濃度、用いる免疫学的パートナーの種類、更には、不溶性担体の表面積などにより変化するが、全血被検試料を用いる場合の測定結果が、その全血被検試料から得られる血清又は血漿被検試料を用いる場合の測定結果と一致する時間带は、簡単なパイロット試験を実施することにより容易に決定することができる。

また、免疫学的パートナーで被覆された不溶性担体と接触させる全血被検試料の量は、例えば不溶性担体がビーズの場合、そのビーズが自由に動き回れる程度であればよく、この量は以下の実験により決定することができる。

測定対象物質に抗原、その免疫学的パ—トナーに抗体を用いる場合、一定量の抗体を例えば直径 1 0 0 /z mのボリスチレンビーズに被覆し、試験あたりの一定のビーズ量に対し、全血被検资料の量と反応時間を変化させ、血清で得られた測定結果と同じ結果が得られる条件を採用すればよい。

例えば、測定対象物質として H B s抗原を用い、第 1及び第 2の免疫学的パートナ一として抗 H B sゥサギ特異抗体 F ( a b ' ) ₂をそれぞれ 1 . 7 μ gヒ 0 . 1 2 ； gを用い、不溶性担体として直径 1 0 0 mのポリスチレンビーズ 5 m g (表面積 = 2 . 5 c m ² ) を用いる場合には、前記の接触時間は、 2 4時間以内、好ましくは 3 0秒〜 3 0分間、より好ましくは 1〜 1 0分間であることができる。

前記の接触により、全血被検試料中の測定対象物質と不溶性担体上の第 1の免疫学的パートナーとの複合体を形成させた後、必要に応じてリン酸緩衝液等で洗浄操作を行う。この洗浄工程は実施しなくてもよいが、実施する方が好ましい。なぜなら、次工程の標識化された第 2の免疫学的パートナーを加える時、標識化された第 2の免疫学的パートナーを含む緩衝液が存在すると、全血被検試料が、この緩衝液により希釈されるため、実質的に被検試料量の変動を生じる。しかしながら、標識化された第 2の免疫学的パートナ一を含む他の液性成分が存在しても、前工程と異なり、その影響を非常に小さいものにすることができる。例えば、被検試料中の測定対象物質と不溶性担体上に被覆された免疫学的パートナーが、平衡近くに達した後に標識化された第 2の免疫学的.パートナーを含む緩衝液を加える、又は、全血被検試料量に比べ、少量（好ましくは 5 0 %以下）の標識化された第 2の免疫学的パ一トナーを含む緩衝液を加えることであるが、これら 2法を組合せると、緩衝液等の液性成分が存在する影響をより小さくすることができる。当然のことながら、標識化された第 2の免疫学的パートナーが、例えば、粉末であったり、カプセル等に粉末状態で含まれている場合は、洗浄工程は実施しなくてもよレ、。また、洗浄ェ程を実施すれば、次工程の標識化された第 2の免疫学的パートナーを加える時、標識化された第 2の免疫学的パートナーを含む緩衝液が存在しても、全血被検試料を用いる場合の測定結果と、その全血被検試料から得られる血清又は血漿被検試料を用いる場合の測定結果を一致させることになんら影響しない。続いて、適当な標識物質で標識化された第 2の免疫学的パートナーを添加して、先の複合体と接触させる。免疫学的パートナー被覆不溶性担体と測定対象物質の複合体と、標識化された第 2の免疫学的パートナーとの接触時間は特に限定されるものではなく、従来公知の方法で実施されている数時間以内であればよい。迅速測定の観点からは、この接触時間は 1時間以内、好ましくは 3 0分以内、より好ましくは 1 0分以内が好適である。この工程により、不溶性担体に被覆された免疫学的パ一トナ一/測定対象物質標識化された第 2の免疫学的パートナーとの結合体を形成させ、適当な緩衝液で洗浄操作を行い、未結合の標識化された第 2の免疫学的パ —トナーを取り除く。

本発明方法では、従来公知の標識物質を用いることができる。例えば、標識物質として、ペル才キシダーゼ、アルカリホスファタ一ゼ等の酵素、ルシフェリンールシフヱラーゼ等の生物発光物質、ルミノール、ァクリジン誘導体、ァダマンタン誘導体等の化学発光物質、フルォレセインイソチアネート等の蛍光物質、金コロイド等の金属、 ^{3 2} P等の放射性物質等を用いることができる。また、標識物質を酵素サイクリング等で増感して用いてもよい。好ましくはルミノール、ァクリジン誘導体、ァダマンタン誘導体等の化学発光物質を用いる。

前記の標識物質を公知の手段によって、第 2の免疫学的パ—トナーに標識化することができる。例えば、直接両者を混合する物理的結合法、好ましくは適当なリンカー剤を介して結合させるグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル 'ジスルフィド法、アビジンとピオチンを介する方法等によって標識物質を第 2の免疫学的パートナーに結合させることができる。こうして得た標識化物質は、適当な溶液、好ましくはリン酸緩衝液等中に保存し、そのまま、あるいは更に希釈して、必要量を先に形成した複合体に添加する。この時、必要に応じて、従来公知のブロッキング剤（例えばゥシ血清アルブミン、スキムミルク等）や、防腐剤 (例えばアジ化ナトリウム等）や信号増強剤（例えば p—ョードフヱノール等）を含ませることができる。

前述の工程で得られた、不溶性担体に被覆された免疫学的パートナー Z測定対象物質 Z標識化された第 2の免疫学的パートナーとの桔合体を、適当な緩衝液で洗浄して桔合体を含む部分（洗浄残渣）と、その結合体を含まない部分（洗浄液）とに分離し、こうして分離されたいずれか一方の部分、好ましくは桔合体を含む部分 (洗浄残渣）に含まれる標識物質に由来する信号を検出することにより、被検試料中に含まれていた測定対象物質を定性的に、あるいは定量的に測定することができる

標識物質が酵素の場合は、基質及びクロモジェン等を添加して一定時間反応させた後、その発色強度を分光学的に検出すればよい。また、標識物質が化学発光物質、例えばァクリジン誘導体の場合には、ァクリジン誘導体の発光を発現させる過酸化水素及びアルカリ性溶液を同時又は別個に添加して一定時間反応させた後、その発光量を発光検出器によって検出すればよい。この時、必要に応じて信号増強剤（例えば塩酸等）を過酸化水素及びアルカリ性溶液の添加前、又は過酸化水素等に含ませ、添加することができる。このようにして得られる、標識物質由来の信号を検出することで、全血被検試料中の測定対象物質を短時間に検出することができる。以上のように、本発明方法によれば、全血を前処理せずにそのまま被検試料として使用し、その全血被検試料中の測定対象物質を迅速に測定することができる。更に、被検試料と免疫学的パートナーとの接触時間を極端に短くすることができ、しかもその接触時間と、被検試料の量、及び不溶性担体の量（担体の表面積や免疫学的パートナーの被覆量）などを或る好適な条件にすれば、全血を用いたときの測定対象物質の測定結果が、血清又は血漿といった従来の試料を用いたときの測定結果と相関関係を有するという驚くべき効果も得ることができる。従って、本発明方法は、採取全血を前処理する従来法の必須の操作等を省略し、前記の接触時間を短くすることができるので、緊急検査への対応や一般の検査においても大幅な省力化が可能になる。本発明方法は上記の,フォワードサンドイッチ法及びディレイド 1ステツブサンドイッチ法に限らず、標識免疫測定法全般で実施できるものであり、例えば前述の 1ステップサンドイッチ法、リバースサンドイッチ法、競合法等にも適用することができる。また、被検試料としては全血に限らず、他の体液成分、例えば血清、血漿、尿、髄液等にも適用することができる。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

塞施例 1 ： H B s抗体コートビーズの調 M HB s抗原をゥサギに免疫して得られた抗血清を以下の方法で精製した。すなわち、 HB s抗原固定化セファローズ 4 Bカラムで抗血清を処理し、結合しなかった血清成分を、 0. 1 51^1食塩を含む 117. 0の 2 OmMリン酸緩衝液（以下、 P BSという）で充分に洗浄した。続いて、 3Mチォシアン酸ナトリウムを含む P B Sで特異抗体を溶出し、 5 OmM醉酸緩衝液（pH4. 5) に対して透析した。この特異抗体に、抗体の 2%重量のペプシンを加え、 37でで 1 6時間消化した。そこに 1 Mトリス溶液を加えて p H 8として反応を停止した後、セフアクリル S— 2 00カラム（PBS平衡化）で F (a b' ) ₂を分画した。得られた抗 H B s特異抗体 F (a b' ) ₂画分を PB Sで 10 O gZm 1に調整し、抗体液 1 m 1に対し直径 1 00 mのポリスチレンビーズ 0. 35 gを加え、 37でで 4時間ローテ一夕 —で混和してコートした。 PBSで 3回洗浄後、 PB S中に 1 0%懸濁液として保存した。

実施例 2 ：ァクリジニゥムエステル標識 HB s抗体の調製

実施例 1に従って調製した抗 HB s抗体 F (a b' ) ₂画分を 0. 1Mリン酸緩衝液（pH8. 0) で 0. 25mg/m 1に調整した。その抗体液 1 m 1に、ジメチルホルムアミドで 0. 1 25mgZm 1に調製した発光物質である 1 0—メチル一 9— |4 - 〔2— （スクシンィミジルォキシカルボニル）ェチル〕フエ二ルォキシカルボニル 1 ーァクリジニゥムフルォロスルホネート溶液 50 1を加えた。室温で 30分間振盪反応した後、ブロック剤として 0. 2 Mグリシン緩衝液（pH8. 0) 0. 5m lを加えて、更に 1時間振盪反応した。この反応液を生理:^水で平衡化した PD— 1 0カラム（フアルマシア社）に通し、余分な低分子発光物質を除去した。

実施例 3 ：全血中の H B s抗原の測定

実施例 1で調製した HB s抗体コートビーズ懸¾液から前記ビーズ 5 m g相当量をピペットにより反応容器に分注し、 EDTA添加全血試料 1 00 1を加え、 3 7でで振盪しながら 3分間反応させた。次いで、洗浄液（0. 1 5M食塩及び 0. 1 %Twe e n 20を含む pH7. 0の 1 OmMリン酸緩衝液）で 4回洗浄後、実施例 2で調製した発光物質標識 HB s抗体を前記の洗浄液で 1 00倍に希釈したもの 100 1と希釈液（0. 05%Tw e e n 20を含む PB S) 200 1をカ[] え、 37でで振盪しながら 5分間反応させた。続いて洗浄液で 4回洗浄した後、 0. 1 N塩酸水溶液 1 00 1を力 Πえ、更にそこに 2 OmM過酸化水素を含む 0. 1M 水酸化ナトリウム溶液 3 0 0 μ Iを加えて発光させた。その発光量をフォトマルチプライヤーで測定した。

また、対照として、前記で用いた全血斗から分離した血清試料を同様に操作し、その発光量を測定した。血清試料と全血試料の相関を図 1に示した。 2 8 7例での相関係数は 0. 99 5 8、回帰式は y = 0. 9863 x + 1 1 4 (x ：血清、 y ：全血）と両者の発光量は良く一致した。

実施例 4 ：全血静置時間による H B s抗原量の変動

H B s抗原が陰性であることが既知である患者と H B s抗原が陽性であることが既知である患者から、 EDTA加採血管〔テルモ（株）〕で採血した全血試科を試験管に各 5 m 1分取し、各々について採血直後、 1 5分後、 3 0分後、 6 0分後に、実施例 3に記載の操作に従い、 HB s抗原に由来する発光量を測定した。なお、全血試料の拢拌は試験管に分取した直後に実施したが、その後は室温に静置した。結果を表 1に示す。

¾1

発光量（カウント）

採血直後 —1 5分後 3 0分後 60分後

HB s抗原陰性検体 2,185 2,159 2,226 2,148

HB s抗原陽性検体 46,666 _ 46^270 46J36 47._253 全血試料を試験管に分取した後の静置時間が長くなるにつれて血球が沈降していく様子が目視でも確認されたが、静置時間による発光量の差は認められなかった。なお、分析操作時の検体 1 00^ 1の採取は液面の 3 mm下から行った。

実施例 5 ： HB s抗原コートビーズの調製

HB s抗原陽性ヒト血漿を、セシウムクロライドの密度が 1. 04から 1. 2 0 の範囲で 4 8000 r pm、 2 1 0分間の密度勾配超遠心法で分画し、ウィルス粒子を得た。このウィルス粒子を Tw e e n 80で可溶化して H B s抗原の材料として用いた。この可溶化 HB s抗原は電気泳動の結果、分子量 2 4 000と 2 700 0の HB s抗原タンパク質を主に含んでいることが確認された。この HB s抗原を 4 O gZm 1 となるように 0. 1 Mグリシン一 N a OH緩衝液で調整し、この液 1 m 1に対して直径 1 00 mのスチレンビーズを 0. 35 g加え、 37 で 1 6 時間攪拌して抗原をコートした。このビーズを PB Sで 5回洗浄し、 PB S中に 1 0%懸濁液として保存した。

実施例 6 ：ァクリジニゥムエステル標識 HB s抗原の調製

実施例 5に記載の方法に従って調製した HB s抗原を 0. 1Mリン酸緩衝液（p H8. 0) で 0. 25mgZm lに調整し、その抗原液 lm lに、ジメチルホルムアミドで 0. 125mgZm 1に調整した発光物質である 1 0—メチル一 9一 |4 一〔2— （スクシンィミジルォキシカルボニル）ェチル〕フエニルォキシカルボ二ル I 一ァクリジニゥムフルォロスルホネート溶液 50 μ 1を加えた。室温で 30分間振盪反応した後、ブロック剤として 0. 2Μグリシン緩衝液（ρ Η 8. 0) 0. 5m lを加えて、更に 1時間振盪反応した。この反応液を生理食塩水に対して 3回透析し、発光物質標識 HB s抗原とした。

実施例 7 ：全血中の H B s抗体の測定

実施例 5で調製した H B s抗原コートビーズ懸濁液から前記ビーズ 5 m g相当量をピペットにより反応容器に分注し、 EDTA添加全血試料 1 00 1を加え、 3 7でで振盪しながら 5分間反応させた。次いで、実施例 6で調製した発光物質標識 HB s抗原を前記の洗浄液で 1 00倍に希釈したもの 50// 1を力 Πえ、振盪しながら更に 5分間反応させた。洗诤液で 4回洗浄した後、 0. 1 N塩酸水溶液 1 00_Λ 1を加え、そこに 2 OmM過酸化水素を含む 0. 1 N水酸化ナトリウム溶液 300 μ 1を加えて発光させた。その発光量をフォトマルチブライヤーで測定した。また、対照として前記全血試料から分離した血清試料も同様に操作し、その発光量を測定した。血清試料と全血試料の相関を図 2に示した。 286例での相関係数は 0. 9927、回帰式は y= l. 01 7 x + 207 (x ：血清、 y ：全血）と両者の発光量は良く一致した。

実施例 8 ： HB s抗体コート磁性体ビーズの調製

磁性ビーズ（トシル活性化ダイナビーズ，粒径 5 m) 2m lを専用磁石 (MPC) で集め、上清を吸引除去した。 50mMホウ酸緩衝液（pH9. 5) 4 m lを加えて洗浄した後、 MP Cでビーズを集め、上清を吸引除去した。このビーズに上記緩衝液 1 m 1を加えて懸濁液とした。実施例 1で調製した抗 HB s特異抗体 F (a b' ) ₂画分を 5 OmMホウ酸緩衝液

(pH9. 5) に透析した後、 0. 5mgZm 1に濃度を調製した抗体液 1 m 1中に上記ビーズ懸濁液を滴下混和し、 37 のフラン器中で 24時間ゆつくり攪拌した。 MP Cでビーズを集めた後、上清を吸引除去した。ここに、 0. 15Mの食塩を含む 2 OmM憐酸緩衝液（pH 7. 0) で 1 m gZm 1に調製した牛血清アルブミン（BSA) 液 4 m lを加え、 4 :で一夜攪拌して過剰の反応基をブロックした。 PBSを用いて上記の方法に従い 4回洗浄操作を行った後、 0. 05%アジ化ナトリウムと 1 mgZm Iの B S Aを含む PB S 2m 1中にビーズを保存した。

実施例 9 ：反応時間と H B s抗原の測定値

実施例 1で調製した H B s抗体コートビーズ懸濁液から前記ビーズ 5 m g相当量をピペットにより反応容器に分注し、 E D T A添加全血試料（ H B s抗原 25 U / m lの試料） 100/ 1をカ11ぇ、 37 で振盪しながら 1分間、 3分間、 5分間、 15分間、 30分間、 1時間、 3時間、 7時間、 24時間、 48時間反応させた。次いで、洗浄液（0. 15 M塩化ナトリウム、 0. 1 %Twe e n 20を含む pH 7. 0の 1 OmMリン酸緩衝液)で 4回洗诤後、実施例 2で調製した発光物質標識 H B s抗体を前記の洗浄液で 100倍に希釈したもの 10 O 1と希釈液（0. 05 %Tw e e n 20を含む PBS) 200 ^ 1を加え、 37でで振盪しながら 5分間反応させた。続いて前記洗浄液で 4回洗浄した後、 0. 1 N塩酸水溶液 100 1 を加え、更にそこに 2 OmM過酸化水素を含む 0. 1M水酸化ナトリウム溶液 30 0^ 1を加えて発光させ、その発光量をフォトマルチブライヤーで測定した。

また、対照として、全血試料から分離した血清試料を用いて同様の操作を行い、結果を表 2に示す。表 2から明らかなとおり、 EDTA添加全血試料と、全血試料から分離した血清試料との間で、試料と H B s抗体ビーズとの接触時間が 1分間〜 30分間の範囲で両者の測定値（発光量）はほぼ同じ値であった。表 2

時間全血血清

1分間 6 1 14 5850

3分間 1 6026 1 6 1 64

5分間 25060 24940

1 5分間 52368 53 1 76

30分間 79953 87234

1時間 92035 1 2 1 869

3時間 108694 145286

7時間 1 13945 1 69346

24時間 1 1 6523 1 72345

48時間 1 18692 1 76692

(数字は癸光カウント）実施例 1 0 ：へマトクリツト値による HB s抗原量の変動

HB s抗原が陽性であることが既知の患者から EDT A加採血管〔テルモ（株）〕で採血し、その全血試料のへマトクリツト値を 70%に調整後、同一患者から得られた血漿でへマトクリット値が 096、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 6096、 709 になるように希釈した。各々について実施例 3に記載の方法に従レ、、 HB s抗原に由来する発光量を測定した。その結果を表 3に示す。なお、へマトクリット値が 70%以上の全血被検試料は、その液性から被検試料としての採取が困難であったため測定には使用しなかった。

実施例 1 1 ：検体希釈よる HB s抗原量の変動

実施例 1で調製した HB s抗体コートビーズ懸¾液から前記ビーズ 5mg相当量をピぺットにより反応容器に分注した。実施例 1 0と同様の方法で、各々のへマトクリット値となるように希釈した全血試料 1 0 O 1と、実施例 3で使用した洗浄液 100 1を、前記ビーズが入っている反応容器に加えた。以後、実施例 3に記載の方法に従い、 HB s抗原に由来する量を測定した。その結果を表 3に示す。実施例 1 2 ：一次洗诤を行わない場合の HB s抗原量の変動一 1

実施例 1で調製した H B s抗体コートビーズ懸¾液から前記ビーズ 5 m g相当量をピぺットにより反応容器に分注し、実施例 1 0と同様の方法で、各々のへマトクリット値になるように希釈した全血試料 1 00^ 1を加え、 37でで振盪しながら 5分間反応させた。次いで、実施例 2で調製した発光物質標識 HB s抗体を実施例 3で使用した洗诤液で 1 00倍に希釈したもの l O O lと希釈液（ 0. 05 % T we e n 20を含む PBS) l O O lを力！]え、 3 7 で振！:しながら 5分間反応させた。以後、実施例 3に従い HB s抗原に由来する発光量を測定した。その結果を表 3に示す。

実施例 13 ：一次洗浄を行わない場合の HB s抗原量の変動一 2

実施例 1で調製した H B s抗体コートビーズ懸濁液から前記ビーズ 5 m g相当量をピぺットにより反応容器に分注し、実施例 1 2で得られた各々のへマトクリツト値になるように希釈した全血試料 1 00 1をカロえ、 37でで振盪しながら 5分間反応させた。次いで、実施例 2で調製した発光物質標識 HB s抗体を実施例 3で使用した洗诤液で 27. 5倍に希釈したもの 1 O 1を加え、 37 で振盪しながら 5分間反応させた。以後、実施例 3に記載の方法に従い、 HB s抗原に由来する発光量を測定した。その結果を表 3に示す。表 3

へマトクリツト値実施例 1 0 実施例 1 1 実施例 1 2 実施例 13

0% 1 7764 1 7566 1 6486 1 81 82

1 0% 1 7506 1 6376 1 6284 1 8286

20% 1 7682 1 5250 1 5752 1 7978

80% 1 7340 14 122 1 5426 18000

40% 1 7982 12874 14876 1 7620

50% 1 7860 1 1 700 1 4720 1 7782

60% 1 7886 10258 1 4450 1 7894

70% 1 7368 7974 13 1 18 1 7460

(数字は発光カウント）以上の実施例 1 0〜 13の結果から、 HB s抗原を含む全血被検試料と HB s抗体コートビーズを接触させるときに、他の液性成分が存在しないとへマトクリット C 9 1510

—18— 値による差は見られない（影響を受けない）ことが確認された（実施例 1 0) 。更に、 HB s抗原を含む全血被検試料と HB s抗体コートビーズを接触させた後、洗诤しないで被検試料量の 1ノ1 0容のァクリジニゥムエステル標識 HB s抗体を加えても、へマトクリツト値の差による測定値の変動は非常に少ないことも確認された（実施例 1 3) 。これは、ァクリジニゥムエステル標識 HB s抗体が加えられるまでに、全血被検試料中の H B s抗原と H B s抗体コートビーズの複合体形成が進行しているためであり、へマトクリツト値から計算された被検試料量の変化が測定結果に及ぼす影響に比べ非常に少ないことを示唆している。

実施例 1 4 ：磁性体ビーズを用いた全血中 HB s抗原の測定

実施例 8で調整した HB s抗体コート磁性体ビーズ懸濁液 5 0^ 1を反応容器に取り、 MPCでビーズを吸引し、液成分を吸引除去した後、 EDTA添加全血試料 1 00^ 1を加え、 3 7 で振盪しながら 3分間反応させた。次いで、実施例 3と同じ洗浄液で 4回洗诤後、実施例 2で調製した発光物質標識 HB s抗体を洗诤液で 1 00倍に希釈したもの 1 00 1と実施例 3と同じ希釈液 2 00 ^ 1を加え、 3 7 で 5分間振！:反応させた。洗浄液で 4回洗浄した後、 0. 1 N塩酸水溶液 1 0 O 1を加え、更に、 2 OmMの過酸化水素を含む 0. 1M水酸化ナトリウム溶液 3 μ 1を加えて発光させ、その発光量をフォトマルチブライヤーで測定した。また、対照として全血から分離した血清を同様に操作し、その発光量を測定した。血清と全血の 50例による相関係数は、 0. 9 8 92、回帰式は y = 0. 9 73 9 x + 1 8 9と両者の発光量はよく一致した。産業上の利用可能性

本発明方法によれば、全血を前処理せずにそのまま被検試料として使用し、その全血被検試料中の測定対象物質を迅速に測定することができるので、従来の採取全血を前処理する操作等を省略して緊急検査を可能にするだけでなく、一般の検査においても大幅な省力化を達成することができる。

以上、本発明を特定の実施態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . 測定対象物質と特異的に結合する第 1のパートナーで被覆された不溶性担体と充分な量の全血被検試料を短時間接触させ、続いて、不溶性担体上に担持された第

1のパートナーと測定対象物質との複合体に、前記の測定対象物質と特異的に結合し、標識化された第 2のパートナーを接触させた後、生成した不溶性担体 ·第 1のパートナー ·測定対象物質 ·標識化された第 2のパートナーからなる複合体とその複合体を含まない部分とに分離し、こうして分離されたいずれか一方に含まれる標識物質に由来する信号を検出することを特徴とする測定対象物質の測定方法。

2 . 第 1のパートナーで被覆された不溶性担体と全血被検試料とを接触時間が 3 0 分間より短い請求項 1に記載の方法。

3 . 測定対象物質と特異的に結合する第 1のパートナー及び測定対象物質と特異的に結合する第 2のパートナー力それぞれ免疫学的パートナーである、請求項 1に記載の方法。

4 . 免疫学的測定法である、請求項 3に記載の方法。

5 . 免疫学的測定法が化学発光免疫測定法である、請求項 4に記載の方法。

6 . 免疫学的測定法が酵素免疫測定法である、請求項 4に記載の方法。

7. 測定対象物質が H B s抗原である、請求項 1〜 6のいずれか一項に記載の方法。