WO1996004006A1 - UTILISATION DE LA β2-GLYCOPROTEINE I SOUS AU MOINS UNE DE SES FORMES COMME AGENT ANTI-INFECTIEUX ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CORRESPONDANTE - Google Patents

UTILISATION DE LA β2-GLYCOPROTEINE I SOUS AU MOINS UNE DE SES FORMES COMME AGENT ANTI-INFECTIEUX ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CORRESPONDANTE Download PDF

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WO1996004006A1
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infectious
infectious agent
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Elie Stefas
Marcel Rucheton
Hubert Graafland
Francisco Veas
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Institut Français De Recherches Scientifiques Pour Le Developpement En Cooperation- Orstom
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to the use of a plasma protein as an anti-infective agent and to an injectable pharmaceutical composition containing said protein.
  • ⁇ 2-glycoprotein I is a plasma glycoprotein, the sequence of which was notably indicated in the articles by J. LOZIER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. ISA, Vol. 81, pages 3640-3644, July 1984 and of T. KRISTENSEN et al., FEBS Letters, Vol. 289, 1991, pages 183-186.
  • ⁇ 2GPI is also called Apolipoprotein H. It has been observed that this protein has a polymorphism: the name ⁇ 2GPI will hereinafter be considered as generic for all forms.
  • WO 94/18569 a method for detecting and / or assaying viral compounds, in which the viral compounds (VIC) are fixed using ⁇ 2'GPI.
  • the ⁇ 2'GPI is therefore added to the VICs contained in a biological material, so as to separate the VICs thus captured in order to then detect and / or measure them.
  • ⁇ 2-glycoprotein I has an anti-infectious effect in vivo and in vitro on infectious agents.
  • An object of the invention is therefore the use of ⁇ 2GPI for the preparation of medicaments intended for fight infectious agents.
  • the applications of the method according to the invention are advantageous in human or veterinary medicine.
  • the B2GPI can be of animal origin or, can be produced by genetic and / or synthetic means.
  • B2GPI can be used in the form of ⁇ 2'GPI defined above. It can be used in the form of a protein composition, preferably the aqueous protein composition obtained by eluting an affinity chromatography column in the process for purifying human albumin described in FR-A-2 690 444. It can be used purified or mixed; it can be used independently and / or successively with at least one injectable and / or biological compound.
  • infectious agent is meant here, in general, an infectious compound, in particular of biological origin or produced by a genetic and / or synthetic route, capable of causing disorders in vivo and / or in vitro, in particular infectious diseases.
  • infectious compounds are hereinafter, abbreviated, as "CI”.
  • ICs in particular for the in vivo effect, are both compounds, in particular proteins, constitutive of an infectious agent, as well as structures which comprise infectious compounds.
  • These structures are, in particular, or endogenous or exogenous infectious agents, complete or incomplete, their metabolites or alternatively assemblies containing compounds constituting these infectious agents, assemblies which exhibit certain properties of said infectious agents, in particular the property of being detected by certain antibodies specific for infectious compounds.
  • the ICs can also be compounds specifically induced in the organism by the ICs defined above, or by the expression of genes expressing themselves in an abnormal manner. For example a synthetic nucleic acid can transfect an animal cell and is therefore is a CI.
  • B2GPI can be used for the treatment of an infectious disease included in the group formed by hepatitis B, herpes simplex, the immune deficiency generated by HIV1, HIV2 or SIV, leishmaniasis, the malaria, toxoplasmosis, amoebiasis, candidiasis, aspergillosis, borellioses, leukemias and myelomas.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one anti-infectious agent characterized in that it contains, as anti-infectious agent, an active amount of ⁇ 2GPI in at least one of its forms.
  • a total dose of 8 to 80 mg of active protein per kg of subject treated is suitable in an injection treatment.
  • higher doses may be used as long as no undesirable effects are observed.
  • LMA Leishmania Mexicana Amazonensis
  • a human plasma fractionated according to the method described by KISTLER AND NITSCHMAN (VOX Sang. 7, 414-424 (1962)), which is a method derived from that of COHN, is used as starting material.
  • the supernatant IV which comprises 40% (by volume) of ethanol and which has a pH of 5.85 ⁇ 0.05
  • the supernatant is diluted by half with a NaCl solution at 7 g / 1.
  • the pH is adjusted to 7.45 ⁇ 0.05 with an IN sodium hydroxide solution.
  • Albumin is preconcentrated up to 90 g / l in an "Omega" type ultrafiltration cassette (Filtron) used in a "Minisette SS Cell NPT Cell” ultrafiltration system (Filtron Techn. Corp.).
  • This cassette has a filtering surface of 0.07 m 2 and a retention threshold of 30 KDa. Circulation is ensured by a peristaltic pump at a pressure which varies from 2 x l ⁇ 5 Pa at the start of the operation to 5 x 10 ⁇ Pa at the end.
  • a solution of NaCl at 9 g / l is added to the albumin solution and the dialysis is continued at constant volume until an ethanol level is obtained. less than 0.1% by volume.
  • the dialysis is continued by concentrating the solution up to 200 g of albumin per liter. The pH is adjusted to 7.10 ⁇ 0.05 with an IN hydrochloric acid solution.
  • the albumin solution thus prepared from the supernatant IV is then sterile filtered ("Millex-GS" 0.2 micron filter (Millipore)).
  • the crude aqueous albumin solution obtained is first subjected to affinity chromatography. This chromatography is carried out in a 50 ml (2.5 cm ⁇ 10 cm) column (Biorad), loaded with a particulate material sold by the company "SIGMA” under the trade name "DEXTRAN BEADS SULFATED". The column is previously balanced by passing 3 volumes of physiological saline column through the bed. The albumin solution is then sent to this column.
  • the progress of the chromatography is followed by measuring the optical density at 280 nm of the fractions at the column outlet.
  • the flow rate of the column is 16 cm / hour; the chromatography is carried out between 20 and 25 ° C.
  • the affinity column is washed with a buffer consisting of mono- and disodium phosphates at 0.01 mol / l, and sodium chloride at 0.15 mol / l having a pH of 7.00 ⁇ 0.05 until the optical density of the effluent is less than 0.1.
  • the proteins fixed on the affinity column are then eluted, increasing the ionic strength, by passing a 2 M NaCl solution. Washing and elution are carried out at room temperature, the washing and elution rates being 16 cm / h.
  • the ⁇ 2'GPI is then separated and purified in the following way: the protein composition obtained by elution from the affinity chromatography column using a saline solution of NaCl at 2 moles / liter, is diluted 10 times in a buffer consisting of mono- and disodium phosphates, in particular at 0.01 mole / liter, in proportions giving a pH of 6.8 ⁇ 0.05. It then undergoes chromatography on phosphate gel. This chromatography is carried out in a column of 50 ml (2.5 cm x 10 cm) (Biorad), loaded with a particulate material sold by the company "BIO-RAD" under the trade name "BIO-GEL HTP".
  • the column is beforehand balanced by passing through the bed 3 volumes of buffer column consisting of mono- and disodium phosphates, in particular at 0.01 mol / liter, in proportions giving a pH of 6.8 ⁇ 0.05.
  • the protein eluate from the previous chromatography, diluted, is then sent to this column. Chromatography is carried out with a flow rate of approximately 15 cm / hour at a temperature of 20 ° C.
  • the effluent is removed and the chromatographic support is then washed using a phosphate buffer, identical to that having used to balance the column. The washing is maintained as long as the optical density of the effluent is greater than a predetermined value, for example 0.1 UDO (unit of optical density).
  • the ⁇ 2'GPI which binds to the phosphate gel, is then eluted by increasing the ionic strength, in particular by means of a KCl solution having a concentration close to 1M.
  • This elution solution consists of mono- and disodium phosphates, in particular at 0.01 mole / liter, in proportions giving a pH of 6.8 ⁇ 0.05 and KCl 1 mole / liter.
  • the progress of the chromatography is followed by measuring the optical density at 280 nm of the fractions at the column outlet.
  • the column balancing, loading, washing and elution flow rate is 16 cm / h. Chromatography is carried out at 20 ° C.
  • the eluate is recovered, then dialyzed, preferably in injectable water.
  • the isolated ⁇ 2 '-glycoprotein I is then lyophilized and stored at -25 ° C. At the time of use, the desired dose is dissolved in physiological saline (0.15 M NaCl).
  • Candida krusei Aspergillus fumigatus positive up to the concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • B2GPI intervenes in the defense of the organism, its plasma concentration being able to be reduced during infection, in particular during viral hepatitis (MOZER and others, Eur. J. of Pediatria ( 1978), J2S, p. 123-128).
  • MOZER and others Eur. J. of Pediatria ( 1978), J2S, p. 123-128).
  • children who die from malaria have a very low level of ⁇ 2GPI (JAKOBSEN et al., Infection and Immunity, October 1994, p. 4374 - 4379).
  • HSV Herpes Simplex virus
  • Epstein-Barr virus functions as a receptor for the 3rd complement component (MOLD et al., J. Exp. Med. (1988), i ££, P-949-969).
  • Herpes Virus Saimiri codes for a protein called CCPH (Complement Control Protein Homolog) which shows significant sequence homology with regulatory proteins known to interact with C3b and C4b; this virus also codes for another protein which shows 48% homology with a protein regulating the action of C9 (Hu CD 59) (ROTHER et al., J. of Virol. (1994), ££, p. 730 -737).
  • Virokine is known to be an important component for in vivo virulence (CHANG et al., Microbiol. Pathogenesis (1992), 12., pp. 49-59). Its action is, at least partially, explained by the sequence homologies (38%) with the first half of the C4BP gene and by its bond with C3b and C4b which causes, in vitro, inhibition of the action of complement (Me KENZIE et al., J. of Infect. Dis. (1992), 166, p. 1245-1250). The sequence homology between the virokine and the ⁇ 2GPI could also explain this virulence if the latter has a role in the defense of the organism.
  • the anti-infective effect could be due to its affinity for phosphorylated lipids. Indeed, in Malaria, the phospholipids released by Plasmodium would have a hypoglycaemic toxic action and would be capable of inducing the release by macrophages of "tumor necrosis factor” (TNF). B2 '-glycoprotein I is capable of binding these phospholipids, inhibiting their harmfulness (TAYLOR et al., Clin. Exp. Immunol. (1992), 2 ⁇ , p. 1-5).
  • the anti-infective effect could be due to the interaction of B2GPI on Heparane sulfate.
  • the increase in production of Heparane sulfate in tissues in a state of chronic inflammation can provoke the production by the macrophages of prostaglandin E2 (PG E2) or other substances likely to slow down the immune reaction (IHRCKE and others , Immunol. Today (1993), 14, p. 500-505); however, it has been described that ⁇ 2-glycoprotein I is capable of binding to Heparane sulfate (PLZE, and others, Int. J. of Biochem (1979), U, p. 265-270). Inhibition of the action of Heparane sulfate by ⁇ 2GPI is therefore possible and could account for the anti-infectious action of this protein.
  • the anti-infective effect could be due to the interaction of B2GPI on lysozyme.
  • the Applicant Company observed an interaction between ⁇ 2GPI coupled to alkaline phosphatase and, on the one hand, lysozyme in a Wostern-blot technique, (with 50 mM acetate / acetic acid buffer, pH 5.8 ⁇ 0, let 0.5% of "Triton X100") and, on the other hand, the granulations and cytoplasm of neutrophils and / or their precursors (myelocytes and metamyelocytes) present in samples of human bone marrow, or blood from various animal species (mice, rabbits), using the technique described to demonstrate the interaction between ⁇ 2GPI coupled to alkaline phosphatase and parasites.
  • an uninfected control mouse receives 30 ⁇ l of a solution of ⁇ 2'GPI in the physiological saline in the right hind paw.
  • Example 2 It is the same as in Example 1, except that: a) the infection was carried out by injecting 10 million promastigotes of LMA into each hind paw of 10 young adult male BALB / C mice; 2 control mice were not infected. b) ⁇ 2'GPI was injected intraperitoneally in variable concentrations in a constant volume of 250 ⁇ l of physiological saline.
  • mice received 1 mg of ⁇ 2'GPI, each in two intraperitoneal injections, at 55 and 66 days after infection with AML,
  • mice received 0.5 mg of ⁇ 2'GPI in 14 daily intraperitoneal injections of 35 ⁇ g from 55 days after infection,
  • mice did not receive ⁇ 2'GPI.
  • JPI Day post infection
  • D dose of ⁇ 2 '-glycoprotein
  • I n number of mice
  • mice treated with doses of 1 mg and 0.5 mg and the untreated or treated mice at low dose (0.1 mg) 91 days after infection between the mice treated with doses of 1 mg and 0.5 mg and the untreated or treated mice at low dose (0.1 mg),
  • Lymphocytes from healthy subjects have been isolated conventionally by density gradient and centrifugation through a solution marketed under the name of "Ficoll”. After washing in "RPMI" medium, the cells were suspended at the rate of 2 ⁇ 10 6 per ml in RPMI medium and then 50 ⁇ l were distributed in the wells of a culture plate. 50 ⁇ l of ⁇ 2'GPI, at different doses (50; 5; 0.5 ⁇ g) were preincubated at 4 ° C, for 30 minutes, with 100 ⁇ l of RPMI medium containing 100 infectious units (called "TCID 50 ”) of HIV1 strain LAI.
  • TCID 50 infectious units
  • the mixture was then added to the cells in the wells of the culture plate, then completed in RPMI to 200 ⁇ l containing 10% of fetal serum.
  • the cultures were finally incubated at 37 ° C.
  • the culture supernatant was changed every 3 days and the infectivity was measured on the 17th day of post-infection, by the assay of the enzyme reverse transcriptase (RT) according to the protocol described in "Current protocols in Immunology ", COLIGAN et al., ( NIH), vol.2, 12-5-8.
  • RT reverse transcriptase
  • FIG. 3 shows the activity of RT in counts per minute (cpm), corresponding to tritiated thymidine incorporated into nucleic acid, as a function of the dose of ⁇ 2'GPI.
  • the response of lymphocytes in the absence of virus (negative control) is shown by the dashed baseline.
  • the non-shaded histograms represent the RT activity for the indicated amounts of ⁇ 2'GPI. Standard deviations are shown.
  • the histograms shaded in black correspond to the addition of CL.

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Abstract

Utilisation de la β2-glycoprotéine I sous au moins une des ses formes pour l'obtention d'un agent anti-infectieux destiné au traitement des maladies infectieuses et susceptible d'être mis en ÷uvre in vitro et in vivo. L'utilisation in vivo fournit un médicament anti-infectieux pour usage en médecine humaine ou vétérinaire.

Description

UTILISATION DE LA β2-GLYCOPROTEINE I SOUS AU MOINS UNE DE SES FORMES COMME AGENT ANTI-INFECTIEUX ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CORRESPONDANTE.
L'invention concerne l'utilisation d'une protéine plasmatique comme agent anti-infectieux et une composition pharmaceutique injectable contenant ladite protéine.
On sait que la β2-glycoprotéine I, ci-après en abrégé "β2GPI", est une glycoprotéine plasmatique, dont la séquence a été notamment indiquée dans les articles de J. LOZIER et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. ISA, Vol. 81, pages 3640-3644, Juillet 1984 et de T. KRISTENSEN et coll., FEBS Letters, Vol. 289, 1991, pages 183-186. La β2GPI est également appelée Apolipoprotéine H. Il a été constaté que cettre protéine présente un polymorphisme : la dénomination β2GPI sera ci-après considérée comme générique pour toutes les formes.
Dans la demande internationale WO 94/18569, on a indiqué que certains composés viraux se fixaient de façon spécifique sur une forme de β2GPI, à savoir celle décrite dans la demande de brevet français 2 701 263, que cette forme de β2GPI soit à l'état pur ou dans une composition protéinique la contenant ; cette forme de B2GPI est isolée à partir du résidu fixé sur la (les) colonne(s) de chromatographie d'affinité utilisée(s) dans le procédé de purification de l'albumine du plasma sanguin décrit dans FR-A-2 690 444 ; elle a un poids moléculaire de 50 000 ± 3 000 daltons ; dans le cadre de la présente demande de brevet, cette forme de β2GPI a été désignée en abrégé par "β2'GPI". On a donc proposé dans WO 94/18569 un procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux, dans lequel on fixe les composés viraux (CIV) à l'aide de β2'GPI. Dans un tel procédé, on ajoute donc la β2'GPI sur des CIV contenus dans un matériau biologique, de façon à séparer les CIV ainsi capturés pour ensuite les détecter et/ou les doser.
Selon la présente invention, on a maintenant trouvé que, de façon inattendue, la β2-glycoprotéine I a un effet anti-infectieux in vivo et in vitro sur les agents infectieux. Un objet de l'invention est donc l'utilisation de la β2GPI pour la préparation de médicaments destinés à combattre les agents infectieux. Les applications du procédé selon l'invention sont avantageuses en médecine humaine ou vétérinaire.
De façon générale, pour la mise en oeuvre du procédé, selon l'invention, la B2GPI peut être d'origine animale ou, peut être produite par voie génétique et/ou synthétique. La B2GPI peut être utilisée sous la forme de β2'GPI définie ci-dessus. Elle peut être mise en oeuvre sous forme d'une composition protéinique, de préférence la composition protéinique aqueuse obtenue par élution d'une colonne de chromatographie d'affinité dans le procédé de purification de l'albumine humaine décrit dans FR-A-2 690 444. Elle peut être utilisée purifiée ou en mélange; elle peut être utilisée indépendamment et/ou successivement avec au moins un composé injectable et/ou biologique.
Par agent infectieux, on entend ici, de façon générale, un composé infectieux, notamment d'origine biologique ou produit par voie génétique et/ou synthétique, susceptible de provoquer des désordres in vivo et/ou in vitro, notamment des maladies infectieuses. Les composés infectieux sont désignés ci-après, en abrégé, par "CI".
Ces CI, notamment pour l'effet in vivo, sont aussi bien des composés, en particulier protéiniques, constitutifs d'un agent infectieux, que des structures qui comprennent des composés infectieux. Ces structures sont, notamment, ou bien des agents infectieux endogènes ou exogènes, complets ou incomplets, leurs métabolites ou encore des assemblages contenant des composés constitutifs de ces agents infectieux, assemblages qui présentent certaines propriétés desdits agents infectieux, notamment la propriété d'être détectés par certains anticorps spécifiques de composés infectieux. Les CI peuvent être aussi des composés spécifiquement induits dans l'organisme par les CI précédemment définis, ou par l'expression de gènes s 'exprimant de façon anormale. Par exemple un acide nucléique synthétique peut transfecter une cellule animale et est donc est un CI.
On a, notamment, constaté que l'on pouvait utiliser la B2GPI pour le traitement d'une maladie infectieuse incluse dans le groupe formé par l'hépatite B, l'herpès simplex, la déficience immunitaire générée par HIV1 , HIV2 ou SIV, la leishmaniose, le paludisme, la toxoplasmose, l'amibiose, la candidose, l'aspergillose, les borellioses, les leucémies et les myélomes.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant, dans un support pharmaceutiquement acceptable, au moins un agent anti-infectieux caractérisé par le fait qu'elle contient, comme agent anti-infectieux, une quantité active de β2GPI sous au moins une de ses formes.
Dans le cas du traitement des mammifères, en particulier l'homme, une dose totale de 8 à 80 mg de protéine active par kg de sujet traité est convenable dans un traitement par injection. Cependant, des doses supérieures peuvent être utilisées dans la mesure où on n'observe pas d'effet indésirable.
Les exemples donnés ci-après montrent l'effet anti¬ infectieux de la B2GPI. Dans certains, on a suivi in vivo l'infection de souris BALB/C par Leishmania Mexicana Amazonensis, ci-après désigné par LMA, parasite humain infectant les macrophages (Me ELRATH M.J., KAPLAN G., MUSVAT A. and COHN, Z.A. Cutaneous Leishmaniasis. The defect in T. cell influx in BALB/c mice. J. Exp. Med (1987) 165 p. 546). Préparation de la β2'GPI
On utilise, comme matière première de départ, un plasma humain fractionné selon le procédé décrit par KISTLER ET NITSCHMAN (VOX Sang. 7, 414-424 (1962)), qui est une méthode dérivée de celle de COHN. On part du surnageant IV, qui comprend 40 % (en volume) d'éthanol et qui a un pH de 5,85 ± 0,05, on dilue de moitié le surnageant avec une solution de NaCl à 7 g/1. Le pH est ajusté à 7,45 ± 0,05 avec une solution de soude IN. On préconcentre l'albumine jusqu'à 90 g/1 dans une cassette d'ultrafiltration de type "Oméga" (Filtron) mise en oeuvre dans un système d'ultrafiltration "Minisette SS Cell NPT Cell" (Filtron Techn. Corp.). Cette cassette a une surface filtrante de 0,07 m2 et un seuil de rétention de 30 KDa. La circulation est assurée par une pompe péristaltique à une pression qui varie de 2 x lθ5 Pa au début de l'opération à 5 x 10^ Pa vers la fin. Lorsque l'on a atteint la concentration de 90 g/1 en albumine, on ajoute à la solution d'albumine une solution de NaCl à 9 g/1 et on continue à dialyser à volume constant jusqu'à obtenir un taux d'éthanol inférieur à 0,1 % en volume. Lorsque l'éthanol a été ainsi éliminé, on poursuit la dialyse en concentrant la solution jusqu'à 200 g d'albumine par litre. On ajuste le pH à 7,10 ± 0,05 avec une solution d'acide chlorhydrique IN. La solution d'albumine ainsi préparée à partir du surnageant IV est alors filtrée stérilement (filtre "Millex-GS" de 0,2 micron (Millipore)).
La solution aqueuse brute d'albumine obtenue subit d'abord une chromatographie d'affinité. Cette chromatographie est réalisée dans une colonne de 50 ml (2,5 cm x 10 cm) (Biorad), chargée avec un matériau particulaire vendu par la société "SIGMA" sous la dénomination commerciale "DEXTRAN BEADS SULFATED". La colonne est préalablement équilibrée en faisant passer dans le lit 3 volumes de colonne de sérum physiologique. La solution d'albumine est alors envoyée sur cette colonne.
Le déroulement de la chromatographie est suivi en mesurant la densité optique à 280 nm des fractions en sortie de colonne. Le débit de la colonne est de 16 cm/heure ; la chromatographie est effectuée entre 20 et 25° C. Après passage de la solution d'albumine, la colonne d'affinité est lavée avec un tampon constitué de phosphates mono- et disodique à 0,01 mole/1, et de chlorure de sodium à 0,15 mole/1 ayant un pH de 7,00 ± 0,05 jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent soit inférieure à 0,1. Les protéines fixées sur la colonne d'affinité sont alors éluées, en augmentant la force ionique, par passage d'une solution 2 M de NaCl. Le lavage et l'élution sont effectués à température ambiante, les débits de lavage et d'élution étant de 16 cm/h.
On a effectué, sur la solution obtenue, une éiectrophorèse dénaturante SDS-Page. On a obtenu une composition aqueuse contenant 55 % en poids de β2'GPI par rapport aux protéines totales.
La β2'GPI est ensuite séparée et purifiée de la façon suivante : la composition protéinique obtenue par élution de la colonne de chromatographie d'affinité à l'aide d'une solution saline de NaCl à 2 moles/litre, est diluée 10 fois dans un tampon constitué de phosphates mono- et disodique, notamment à 0,01 mole/litre, dans des proportions donnant un pH de 6,8 ± 0,05. Elle subit alors une chromatographie sur gel phosphaté. Cette chromatographie est réalisée dans une colonne de 50 ml (2,5 cm x 10 cm) (Biorad), chargée avec un matériau particulaire vendu par la société "BIO-RAD" sous la dénomination commerciale "BIO-GEL HTP". La colonne est préalablement équilibrée en faisant passer dans le lit 3 volumes de colonne de tampon constitué de phosphates mono- et disodique, notamment à 0,01 mole/litre, dans des proportions donnant un pH de 6,8 ± 0,05. L'éluat protéinique de la précédente chromatographie, dilué, est alors envoyé sur cette colonne. La chromatographie est effectuée avec un débit d'environ 15 cm/heure à une température de 20° C. L'effluent est éliminé et le support chromatographique subit ensuite un lavage effectué à l'aide d'un tampon phosphaté, identique à celui ayant servi à équilibrer la colonne. Le lavage est maintenu tant que la densité optique de l'effluent est supérieure à une valeur prédéterminée, par exemple 0,1 UDO (unité de densité optique). La β2'GPI, qui se fixe sur le gel phosphaté, est alors éluée en augmentant la force ionique, notamment au moyen d'une solution de KCl ayant une concentration voisine de 1M. Cette solution d'élution est constituée de phosphates mono- et disodique, notamment à 0,01 mole/litre, dans des proportions donnant un pH de 6,8 ± 0,05 et de KCl 1 mole/litre. Le déroulement de la chromatoεraphie est suivi en mesurant la densité optique à 280 nm des fractions en sortie de colonne. Le débit d'équilibrage de la colonne, de charge, de lavage et d'élution est de 16 cm/h. La chromatographie est effectuée à 20° C.
L'éluat est récupéré, puis dialyse, de préférence dans de l'eau injectable. La β2' -glycoprotéine I isolée est alors lyophilisée et conservée à -25°C. Au moment de l'emploi, la dose voulue est dissoute dans du sérum physiologique (NaCl 0,15 M).
On peut suggérer diverses explications sur l'origine de l'effet anti-infectieux inattendu de la β2'GPI, étant entendu que ces hypothèses ne peuvent, en aucun cas, être considérées comme susceptibles de limiter l'invention.
On peut, en premier lieu, penser à une reconnaissance du non-soi. Celle-ci pourrait être confirmée par le lien de la B2GPI avec des composés viraux qui est décrit dans la demande de brevet français 93/01 400. La liaison entre β2GPI et l'antigène de surface de HBV a été confirmée (HAIDER MEHDI, M. J. KAPLAN, F.Y. ANLAR, X. YANG, R. BAYER, K. SUTHERLAND and M. E. PEEPLES, Hepatitis B Virus Surface Antigen Binds to Apolipoprotein H. J. of Virol (1994) ££, p. 2415-2424).
On a testé, par ailleurs, la fixation de la β2'GPI sur un certain nombre d'agents pathogènes fixés sur lame par acétone à froid. Dans chaque cas, la lame subit un lavage au tampon PBS, après quoi on met la préparation en contact avec une β2'GPI marquée par un composé fluorescent. Ce contact est maintenu pendant 30 mn à température ambiante et il est effectué avec des compositions aqueuses contenant respectivement 2 μg/ml, 20 μg/ml et 100 μg/ml de protéine. On effectue ensuite deux lavages de 5 mn chacun au tampon PBS et on observe au microscope à ultra-violets les lames ainsi obtenues. On constate que des résultats positifs sont obtenus avec les agents infectieux suivants : 4 protozoaires Entamoeba hystolitica, Toxoplasma gondji,
Plasmodium falciparum, tous trois positifs jusqu'à la concentration de
20 μg/ml ; Leishmania infantum positif jusqu'à la concentration de
2 μg/ml.
2 souches de champignons : Candida krusei, Aspergillus fumigatus positifs jusqu'à la concentration de 100 μg/ml.
Cette expérience montre le lien de la β2'GPI avec des structures du non-soi autres que les virus et permet de considérer que l'activité anti-infectieuse observée ci-après avec les Leishmanies s'étend à d'autres agents pathogènes tels que ceux cités ci-dessus. Dans une demande internationale PCT déposée le même jour que la présente demande par le même déposant en revendiquant les priorités françaises n° 94-09528 et 94-09529 du 1/08/94, on a montré l'influence des détergents et de la cardiolipine sur la fixation de la β2GPI à des protéines de HIV1 et HIV2, de la toxine anatétanique, et d'autres protéines de bactéries ou de mycoplasme.
De plus, on a observé que différents détergents ou phospholipides usuels modulent différemment la fixation de β2GPI, couplée à la phosphatase alcaline, notamment sur les protéines de HIV1 ou HIV2. Par exemple : la ρ26 de HIV recombinant (TRANSGENE) est fortement reconnue en présence de cardiolipine, du détergent commercialisé sous le nom "Tween 80", et faiblement en présence de détergent commercialisé sous le nom "Triton X100". Les résultats obtenus indiquent le rôle primordial de ces composés, et notamment des phospholipides. Ainsi il peut y avoir des cas pathologiques où la B2GPI existe chez le malade mais où l'injection d'une substance, qui se fixe sur β2GPI, par exemple de la cardiolipine ou du dextran sulfate, provoquerait l'effet anti-infectieux, en la stimulant, de la β2GPI.
On peut, en second lieu, penser que la B2GPI intervient dans la défense de l'organisme, sa concentration plasmatique pouvant être diminuée lors de l'infection, notamment au cours des hépatites virales (MOZER et autres, Eur. J. of Pediatria (1978), J2S, p. 123- 128). Mais aussi il est connu maintenant que les enfants qui meurent de malaria ont un taux très faible de β2GPI (JAKOBSEN et autres, Infection and Immunity, octobre 1994, p. 4374 - 4379).
Par ailleurs, elle présente une homologie de séquence avec la "virokine", dite aussi "protéine majeure sécrétoire" du virus de la vaccine (KOTWAL et autres, Nature (1988) 335, p. 176- 178). Plusieurs articles ont montré que certaines protéines virales étaient des facteurs de virulence car elles ont un effet de blocage des défenses non spécifiques de l'organisme. Ainsi, la glycoprotéine Cl du virus de l'Herpès Simplex (HSV) fonctionne comme un récepteur du C3b sur les cellules infectées par le virus et inhibe la lyse par le complément (HARRIS et autres, J. Infect. Dis. (1990) 162, p. 331- 337). De même, le virus de Epstein-Barr (EBV) fonctionne comme un récepteur du 3ème composant du complément (MOLD et autres, J. Exp. Med. (1988), i££, P- 949-969). Herpès Virus Saimiri code pour une protéine dénommée CCPH (Complément Control Protein Homolog) qui montre une homologie de séquences significative avec des protéines de régulation connues pour interagir avec le C3b et le C4b ; ce virus code aussi pour une autre protéine qui montre 48 % d'homologie avec une protéine régulatrice de l'action du C9 (Hu CD 59) (ROTHER et autres, J. of Virol. (1994), ££, p. 730-737). La virokine est connue pour être un composant important pour la virulence in vivo (CHANG et autres, Microbiol. Pathogenesis (1992), 12., p. 49- 59). Son action est, au moins partiellement, expliquée par les homologies de séquences (38 %) avec la première moitié du gène de la C4BP et par sa liaison avec C3b et C4b qui provoque, in vitro, l'inhibition de l'action du complément (Me KENZIE et autres, J. of Infect. Dis. (1992), 166, p. 1245-1250). L'homologie de séquence entre la virokine et la β2GPI pourrait aussi expliquer cette virulence si cette dernière a un rôle dans la défense de l'organisme. En troisième lieu, l'effet anti-infectieux pourrait être dû à son affinité pour les lipides phosphorylés. En effet, dans la Malaria, les phospholipides libérés par le Plasmodium auraient une action toxique hypoglycémiante et seraient capable d'induire la libération par les macrophages de "tumor necrosis factor" (TNF). La B2' -glycoprotéine I est susceptible de lier ces phospholipides, inhibant leur nocivité (TAYLOR et autres, Clin. Exp. Immunol. (1992), 2Ω, p. 1-5).
En quatrième lieu, l'effet anti-infectieux pourrait tenir à l'interaction de la B2GPI sur l'Heparane sulfate. En effet, l'augmentation de production d'Heparane sulfate dans les tissus en état d'inflammation chronique peut provoquer la production par les macrophages de prostaglandine E2 (PG E2) ou d'autres substances susceptibles de freiner la réaction immune (IHRCKE et autres, Immunol. Today (1993), 14, p. 500-505) ; or, il a été décrit que la β2- glycoprotéine I est susceptible de se lier à l'Heparane sulfate (PLZE, et autres, Int. J. of Biochem (1979), U, p. 265-270). Une inhibition de l'action de l'Heparane sulfate par la β2GPI est donc possible et pourrait rendre compte de l'action anti-infectieuse de cette protéine.
En cinquième lieu, l'effet anti-infectieux pourrait tenir à l'interaction de la B2GPI sur le lysozyme. En effet, la Société déposante a observé une interaction entre la β2GPI couplée à la phosphatase alcaline et, d'une part, le lysozyme dans une technique de Wostern-blot, (avec 50 mM de tampon acétate/acide acétique, pH 5,8 ± 0,let 0,5 % de "Triton X100") et, d'autre part, les granulations et le cytoplasme des polynucléaires neutrophiles et/ou de leurs précurseurs (myélocytes et métamyélocytes) présents dans des prélèvements de moelle osseuse humaine, ou du sang de diverses espèces animales (souris, lapins), et ce en utilisant la technique décrite pour la mise en évidence de l'interaction entre la β2GPI couplée à la phosphatase alcaline et les parasites. L'observation d'une liaison entre agents pathogènes β2GPI et lysozyme peut correspondre à un phénomène de "focalisation" de l'activité protéolytique lysozomiale sur les agents pathogènes, par l'intermédiaire de la β2GPI, et donc la destruction de ces derniers.
EXEMPLE I Protocole expérimental On injecte par voie sous-cutanée dans les coussinets des pattes de souris BALB/C une dose d' amastigotes de LMA obtenus par culture in vitro selon l'article de Me ELRATH et coll. cité ci-dessus. La dose d' amastigotes est mélangée à 25 μl de milieu de culture RPMI 1640. Le diamètre des pattes, qui augmente avec la progression de l'infection, est mesuré à différents temps, à l'aide d'un pied à coulisse. On a observé 4 souris BALB/C femelles âgées de 5 semaines ayant un poids compris entre 10 et 25 g :
- une souris témoin (ST) n'est ni infectée ni traitée par la β2'GPI
- une souris contrôle (SD) non infectée reçoit dans la patte arrière droite 30 μl d'une solution de β2'GPI dans le sérum physiologique à
1 mg/ml (soit 30 μg),
- une souris (SL) reçoit dans chacune des deux pattes arrière 500 000 amastigotes de LMA,
- une souris (SDL) reçoit simultanément : - dans la patte arrière gauche (SDL/PG) 500 000 amastigotes de LMA et 30 μl de sérum physiologique, - dans la patte arrière droite (SDL/PD) 500 000 amastigotes de LMA et 30 μl d'une solution de β2'GPI à 1 mg/ml (soit 30 μg). Résultats Les diamètres des pattes, mesurés en mm, sont donnés dans le tableau I ci-après. La figure 1 annexée montre l'évolution dans le temps du diamètre moyen des pattes arrière pour chacune des souris ST, SD et SL. L'évolution du diamètre de chaque patte arrière de la souris SDL est donnée pour la patte droite SDL/PD et pour la patte gauche SDL/PG. TABLEAU 1
Figure imgf000012_0001
Les résultats montrent : 1) qu'il n'y a pas de différence significative entre les diamètres des pattes des souris ST et SD, ce qui montre que la β2'GPI seule ne provoque pas d'inflammation mesurable ; 2) une augmentation croissante du diamètre des pattes de la souris SL infectée et non traitée par la β2'GPI, ce qui montre l'infectiosité de l'inoculum de LMA utilisé ; 3) une faible augmentation du diamètre de la patte droite de la souris
SDL (SDL/PD), notamment après le 54ème jour ; 4) une augmentation du diamètre de la patte gauche de la souris SDL
(SDL/PG) qui est nettement plus faible que dans le cas de la souris
SL, ce qui montre que la B2'GPI injectée uniquement dans la patte droite (SDL/PD) a diffusé et a agi à distance sur le foyer infectieux de la patte gauche (SDL/PG). Pour confirmer la diffusion de la β2' -glycoprotéine I, on a réalisé une injection intrapéritonéale de 500 μg de β2'GPI dans la souris
SDL 71 jours après infection. Un phénomène de nécrose localisée et bien délimitée de la patte droite (SDL/PD) a été observé après 4 jours, suivi d'une rétraction de la zone nécrosée après 6 jours. Au l lème jour, le tissu cicatriciel sous-jacent était visible, le diamètre de la patte droite se réduisant (2,8 mm au 86ème jour). L'injection péritonéale de β2'GPI a donc agi sur l'infection au niveau de la patte droite.
Protocole expérimental
Il est le même que dans l'exemple 1, sauf que : a) l'infection a été effectuée par injection de 10 millions de promastigotes de LMA dans chaque patte arrière de 10 souris BALB/C mâles jeunes adultes ; 2 souris témoins n'étaient pas infectées. b) la β2'GPI était injectée par voie intrapéritonéale en concentrations variables dans un volume constant de 250 μl de sérum physiologique.
1) 2 souris ont reçu 1 mg de β2'GPI, chacune en deux injections intrapéritonéales, à 55 et 66 jours après infection par LMA,
2) 1 souris a reçu 0,5 mg de β2'GPI en une injection intrapéritonéale à 55 jours, 3) 1 souris a reçu 0,1 mg de β2'GPI en une injection intrapéritonéale à 55 jours,
4) 1 souris a reçu 0,5 mg de β2'GPI en 7 injections quotidiennes intrapéritonéales à partir de 55 jours après l'infection par LMA,
5) 3 souris ont reçu 0,5 mg de β2'GPI en 14 injections intrapéritonéales quotidiennes de 35 μg à partir de 55 jours après l'infection,
6) pour un contrôle positif de l'infection, 2 souris infectées n'ont pas reçu de β2'GPI,
7) pour un contrôle négatif, 2 souris non infectées n'ont pas reçu de β2'GPI.
L'augmentation du diamètre moyen des pattes à partir du jour de la première injection de β2'GPI, soit 56 jours après l'infection par LMA, ainsi que les écarts-type, sont donnés dans le tableau II ci- après. La figure 2 annexée montre les courbes correspondantes et les écarts-type correspondants. D désigne ci-après la dose de β2'GPI utilisée. Cet essai ayant montré que l'on obtient des résultats identiques pour les injections de 0,5 mg en petites doses séquentielles pendant 7 ou 14 jours ou en dose unique, les résultats ont été reportés dans la même colonne du tableau II (D = 0,5 mg) ci-après. Par ailleurs, on n'a observé aucun effet néfaste pour les doses les plus fortes (D = 1 mg) qui correspondent pourtant à environ 5 fois la quantité de B2GPI circulante chez une souris.
TABLEAU II
JPI D= l mg D=0,5 mg D=0,1 mg D=0 Con¬ n=2 n=5 n= l n=2 trôles
56 0 0 0 0 0
66 0,09 ± 0,17 0,02 ± 0,05 0,75 ± 0,49 0,05 ± 0,10 0
78 0,08 ± 0,26 0,04 ± 0,09 1,10 ± 0,28 0,053 ± 0,19 0
84 0,09 ± 0,27 0,03 ± 0,10 1 ,85 ± 0,35 0,75 ± 0,26 0
91 0,13 ± 0.32 0,01 ± 0,013 2, 15 ± 0,07 0,93 ± 0,05 0
JPI = Jour post infection D = dose de β2' -glycoprotéine I n = nombre de souris
Ce tableau montre :
1) une augmentation nettement plus faible du diamètre des pattes à 84 et
91 jours après l'infection entre les souris traitées par des doses de 1 mg et 0,5 mg et les souris non traitées ou traitées à dose faible (0,1 mg),
2) l'existence, dans cet exemple, d'une dose d'efficacité maximale de 0,5 mg par souris. EXEMPLE 3
Infection de lymphocytes de donneur sain par le virus de l'immunodéficicience humaine HIV-1 en présence de β2'GPI et/ou de cardiolipine (CL)
Des lymphocytes de sujet sain ont été isolés classiquement par gradient de densité et centrifugation à travers une solution commercialisée sous le nom de "Ficoll". Après lavage en milieu "RPMI", les cellules ont été suspendues à raison de 2 x 10 6 par ml dans un milieu RPMI puis 50 μl ont été distribués dans les puits d'une plaque de culture. 50 μl de β2'GPI, à différentes doses (50; 5; 0,5 μg) ont été préincubés à 4°C, pendant 30 minutes, avec 100 μl de milieu RPMI contenant 100 unités infectieuses (dites "TCID 50") de HIV1 souche LAI. Le mélange a ensuite été ajouté aux cellules dans les puits de la plaque de culture, puis complété en RPMI à 200 μl contenant 10 % de sérum foetal. Les cultures ont enfin été incubées à 37°C. Le surnageant de culture a été changé tous les 3 jours et la mesure de l'infectivité a été réalisée au 17ème jour de post-infection, par le dosage de l'enzyme transcriptase reverse (RT) selon le protocole décrit dans "Current protocols in Immunology", COLIGAN et autres, (NIH), vol.2, 12-5-8.
Pour l'étude de l'influence des phospholipides sur l'infection en présence de β2'GPI, 20 μg de cardiolipine (CL) ont été préincubés avec 0,5 μg et avec 5 μg de β2'GPI avant de les ajouter au virus. La figure 3 montre l'activité de la RT en coups par minute (cpm), correspondant à de la thymidine tritiée incorporée en acide nucléique, en fonction de la dose de β2'GPI. La réponse des lymphocytes en absence de virus (contrôle négatif) est figurée par la ligne de base en pointillés. Les histogrammes non ombrés représentent l'activité RT pour les quantités indiquées de β2'GPI. Les déviations standard sont figurées. Les histogrammes ombrés en noir correspondent à l'addition de CL. On a observé environ 50 % d'inhibition de l'activité RT témoignant de l'infection virale pour les doses de 5 μg et 50 μg de β2'GPI par essai. A la dose de 0,5 μg, il y a peu d'inhibition sans CL mais, il y a environ 80 % d'inhibition en présence de CL, donc pour un rapport pondéral CL/β2'GPI de 40.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Utilisation de la B2GPI sous au moins une de ses formes pour l'obtention d'un agent anti-infectieux destiné au traitement des maladies infectieuses.
2 - Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée par le fait que la B2GPI est utilisée comme agent anti-infectieux in vitro. 3 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la β2GPI est utilisée pour l'obtention d'un médicament de médecine humaine ou vétérinaire.
4 - Utilisation selon la revendication 3 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement d'une maladie infectieuse incluse dans le groupe formé par l'hépatite B, l'herpès simplex, la déficience immunitaire générée par HIV1, HIV2 ou SIV, la leishmaniose, le paludisme, la toxoplasmose, l'amibiose, la candidose, l'aspergillose, les borellioses.
5 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que l'on met en oeuvre une B2GPI purifiée ou en mélange, cette mise en oeuvre pouvant se faire indépendamment et/ou successivement avec au moins un autre composé injectable et/ou biologique.
6 - Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par le fait que les composés sont choisis dans le groupe formé par les détergents, les lipides et les phospholipides.
7 - Utilisation selon la revendication 4, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de la leishmaniose.
8 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que l'on met en oeuvre la β2GPI sous sa forme β2'GPI.
9 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait que l'on met en oeuvre la β2GPI sous forme d'une composition aqueuse. 10 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait que l'on utilise une β2GPI extraite du plasma sanguin humain.
11 - Composition pharmaceutique contenant, dans un support pharmaceutiquement acceptable, au moins un agent anti¬ infectieux, caractérisée par le fait qu'elle contient, comme agent anti¬ infectieux, une quantité active de β2GPI sous au moins une de ses formes.
12 - Composition selon la revendication 11 , caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'une composition aqueuse administrable par injection à une dose totale de 8 à 80 mg de β2GPI par kg de sujet traité.
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