FR2692898A1 - Procédé d'obtention de protéines membranaires, et utilisation de ces protéines dans un but de diagnostic ou de vaccination. - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un procédé de lyse de microorganismes, tels que les virus, notamment aux fins d'obtention et, le cas échéant de purification des protéines à localisation membranaire chez ces microorganismes, ce procédé permettant de maintenir sous forme oligomérique celles des protéines susceptibles d'être présentes sous une telle forme dans ces micro-organismes tout en détruisant l'activité biologique des protéines, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de traitement de ces micro-organismes à l'aide d'une composition contenant une association d'au moins deux molécules différentes au caractère amphipathique. L'invention vise également l'utilisation des protéines oligomériques obtenues par ce procédé pour la mise en uvre de méthodes de diagnostic, ou dans des compositions vaccinantes.
Description
L'invention a pour objet un procédé d'obtention de protéines oligomériques, et plus particulièrement celles à localisation membranaire dans les cellules, microorganismes (notamment les virus) ou hôtes cellulaires
Infectés par ces micro-organismes, ce procédé permettant le maintien de ces protéines sous forme oligomérique.
Infectés par ces micro-organismes, ce procédé permettant le maintien de ces protéines sous forme oligomérique.
L'invention a également pour objet les utilisations de ces protéines oligomériques ainsi obtenues, notamment pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic de pathologies causées par l'infection d'un individu par des micro-organismes porteurs de telles protéines, ou encore dans le cadre de la vaccination contre ce type d'infection.
De nombreuses protéines à localisation membranaire dans les cellules ou les micro-organismes sont sous forme oligomérique. A titre illustratif, on peut citer parmi les micro-organismes susceptibles de posséder des protéines oligomériques membranaires, le virus du SIDA.
Dans le cas de la recherche d'une infection par HIV, une sérologie trouvée positive au dépistage, généralement par des tests de diagnostic de type ELISA, ne permet pas, à elle seule, d'affirmer la contamination par le virus.
Deux méthodes concurrentes sont utilisées pour la confirmation. La première, réputée la plus performante, est connue sous l'abréviation de RIPA ("radio-immuno precipitation assay") car elle fait appel à 1 'immuno- précipitation des protéines virales préalablement marquées par un isotope radioactif (ici la 35S-cystéine).
La seconde méthode est désignée par l'expression "western blot". En pratique, elle met en oeuvre l'immuno-détection par les anticorps du sérum à analyser, des protéines virales séparées par électrophorèse et transférées sur une feuille de nitrocellulose ou tout autre support équivalent. Dans les deux cas, il faut cultiver le virus comme source d'antigène mais, le RIPA n'est réalisable qu'en laboratoire spécialisé ayant à sa disposition l'équipement et la structure permettant la culture et le marquage du virus en conditions réglementées, tandis que le "western blot" peut être utilisé dans n'importe quel laboratoire auquel est fourni la membrane portant les protéines antigéniques virales déjà séparées par électrophorèse.
La glycoprotéine de l'enveloppe de HIV-1 est codée par le gène env', et la traduction de l'ARNm correspondant donne une protéine glycosylée, gp160, sous forme d'un précurseur dont la masse moléculaire est de 160 kDa. La gap160 est clivée à l'intérieur de la cellule pour donner, au niveau de la membrane cytoplasmique lors du bourgeonnement du virus en cours de formation, d'une part la gp120 que l'on retrouve à l'extérieur de la cellule et du virus, et, d'autre part, la gp41, partie transmembranaire de la glycoprotéine, qui correspond à l'extrémité carboxy-terminale du précurseur.Une fois la particule virale libérée, la gp41 seule protéine transmembranaire, présentera son extrémité carboxyterminale tounée vers l'intérieur du virus et son extrémité amino-terminale faisant saillie à l'extérieur, se maintenant associée de façon non covalente à la gp120.
La gp120 se comporte comme une molécule bi-fonctionnelle.
Par son extrémité amino-terminale, elle est fixée à la gp41 alors que son extrémité carboxy-terminale reconnaît la région située entre les résidus 32 et 47 de la molécule CD4 (spécifique des lymphocytes T4 auxiliaires, macrophages...). La liaison de la gap120 au CD4 permet d'exposer la membrane de la cellule cible à la partie hydrophobe amino-terminale de la gp41, ce qui semble induire le mécanisme de fusion des membranes du virus et des cellules, cette fusion étant à l'origine de la pénétration du virion dans la cellule cible lors de l'infection (pour revues, voir Evans et Levy, 1989; Wong
Staal et Haseltine, 1992).
Staal et Haseltine, 1992).
Ce processus de reconnaissance du recepteur viral, suivi de la fusion des membranes grâce à l'interaction de l'extrémité amino-terminale de la protéine de fusion avec la membrane de la cellule cible, n'est pas un mécanisme propre à HIV. Il est possible grâce à la présence, sous forme oligomérique, des glycoprotéines trans-membranaires du virus. Des pontages par agents chimiques ont permis de mettre en évidence des trimères au niveau des glycoprotéines de l'enveloppe de MuLV (Takemoto et col., 1978; Pinter et Fleissner, 1979), de MuMTV (Racevskis et
Sarkar, 1980). Il a aussi été montré que la protéine de l'envelope de RSV forme des oligomères retrouvés dans les cellules infectées et les particules virales (Einfeld et
Hunter, 1988). Le virus de l'influenza exprime également à sa surface une hémagglutinine sous forme trimérique (Doms et Helenius, 1986).Dans ce dernier cas, la forme multimérique est nécessaire au transport intracellulaire de la protéine (Copeland et col., 1986; Gething et col., 1986). L'influenza exprime aussi à sa surface une neuraminidase sous forme de tétramère (Varghese et col., 1983). Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) exprime également une glycoprotéine sous forme oligomérique et, dans ce cas, l'association des monomères est indispensable au transport de la protéine du réticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi (Kreis et Lodish, 1986). L'oligomérisation de la glycoprotéine transmembranaire se retrouve également dans les paramyxovirus, tel que le virus de Sendaï et dans le virus des oreillons.
Sarkar, 1980). Il a aussi été montré que la protéine de l'envelope de RSV forme des oligomères retrouvés dans les cellules infectées et les particules virales (Einfeld et
Hunter, 1988). Le virus de l'influenza exprime également à sa surface une hémagglutinine sous forme trimérique (Doms et Helenius, 1986).Dans ce dernier cas, la forme multimérique est nécessaire au transport intracellulaire de la protéine (Copeland et col., 1986; Gething et col., 1986). L'influenza exprime aussi à sa surface une neuraminidase sous forme de tétramère (Varghese et col., 1983). Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) exprime également une glycoprotéine sous forme oligomérique et, dans ce cas, l'association des monomères est indispensable au transport de la protéine du réticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi (Kreis et Lodish, 1986). L'oligomérisation de la glycoprotéine transmembranaire se retrouve également dans les paramyxovirus, tel que le virus de Sendaï et dans le virus des oreillons.
La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs qu'il est possible, dans des conditions bien déterminées, et même en conditions dénaturantes, d'isoler des formes oligomériques de cette gp41 de HIV-1 (et plus particulièrement un trimère de 120kDa et un tétramère de 160kDa) qui sont donc des protéines différentes des gp120 et gap160 sus-mentionnées.
Les structures oligomériques des protéines, et plus particulièrement des protéines membranaires, représentent des formes moléculaires caractéristiques de certaines catégories de cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, et sont par conséquent des composants particulièrement avantageux à utiliser:
- dans le cadre d'un dépistage de pathologies causées par l'infection d'un individu par ces microorganismes (notamment par détection d'anticorps dirigés contre ces protéines dans les sérums des individus infectés), et plus spécifiquement dans le cadre d'un test de confirmation des méthodes classiques de dépistage de ces infections,
- ou encore dans le cadre de la vaccination destnée à prévenir de telles infections.
- dans le cadre d'un dépistage de pathologies causées par l'infection d'un individu par ces microorganismes (notamment par détection d'anticorps dirigés contre ces protéines dans les sérums des individus infectés), et plus spécifiquement dans le cadre d'un test de confirmation des méthodes classiques de dépistage de ces infections,
- ou encore dans le cadre de la vaccination destnée à prévenir de telles infections.
Toutefois, les méthodes existant actuellement pour l'isolement des protéines à partir de cellules ou microorganismes, en vue notamment de leur obtention, détruisent ces structures oligomériques pour donner naissance à des formes monomériques dont l'utilisation ne permet pas toujours de conclure de façon certaine à une infection, ni d'obtenir une vaccination efficace contre ces infections.
Or la présente invention a précisément pour but de fournir un procédé d'isolement de protéines à partir de cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, qui présente l'avantage de permettre le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines existant sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes.
L'invention a également pour but de mettre à la disposition du public des méthodes de diagnostic in vitra, notamment chez l'Homme, d'infections causées par ces micro-organismes, et plus particulièrement des tests de diagnostic et de confirmation, notamment dans le cadre de l'infection par HIV, qui soient plus performants et plus fiables que les méthodes de diagnostic ou tests de confirmation actuels.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions vaccinantes à base de protéines oligomériques, notamment dans le cadre de la vaccination contre les infections par HIV.
L'invention a également pour but de fournir des compositions pour la mise en oeuvre d'un tel procédé d'isolement de protéines sous forme oligomérique.
L'invention a pour objet un procédé de lyse de cellules ou de micro-organismes, notamment de virus, ou d'hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, aux génomes modifiés ou non, ce procédé permettant de maintenir sous forme oligomérique celles des protéines susceptibles d'être présentes sous une telle forme dans les cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires susmentionnés, tout en détruisant l'activité biologique des protéines (présentes dans le milieu soumis à ce procédé de lyse), lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de traitement de ces cellules, microorganismes ou hôtes cellulaires à l'aide d'une composition contenant une association d'au moins deux molécules différentes au caractère amphipathique, chacune de ces molécules comprenant une partie hydrophobe et une partie hydrophile.
L'invention vise plus particulièrement l'application d'un tel procédé de lyse aux fins de séparation des protéines oligomériques à localisation membranaire dans les cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires susmentionnés, aux fins d'obtention et, le cas échéant de purification de ces protéines.
Par séparation des protéines membranaires ci-dessus, il faut entendre la possibilité de séparer l'ensemble des différentes protéines oligomériques présentes dans le milieu sur lequel est appliqué le procédé de lyse susmentionné, des autres constituants, protéiques ou non, de ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires, et, le cas échéant, la possibilité de séparer ces différentes protéines oligomériques entre elles.
Une des caractéristiques particulièrement avantageuses du procédé de l'invention est que l'activité biologique de l'ensemble des protéines présentes dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires, est détruite, tout en permettant le maintien des structures oligomériques des protéines qui sont sous une telle forme.
Une autre caractéristique particulièrement avantageuse de l'invention est que le procédé de lyse sus-mentionné est réalisable à température ambiante.
L'association des deux molécules amphipathiques utilisées dans le procédé de l'invention permet à la fois la solubilisation des protéines susceptibles d'être présentes sous forme oligomérique dans les cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, et la reconstitution d'un environnement analogue à celui trouvé dans la membrane de ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires, cet environnement étant nécessaire au maintien de ces structures oligomériques. Un des mécanismes possibles à l'origine de la reconstitution d'un tel environnement serait que l'une de ces deux molécules soit un composé (ci-après désigné par premier composé) se substituant aux phospholipides et glycolipides membranaires, tandis que l'autre soit un composé (ci-après désigné par second composé) se substituant au cholestérol membranaire.
Le procédé de lyse de l'invention est davantage caractérisé en ce que l'une au moins des deux molécules de la composition utilisée pour le traitement des cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires, à savoir le premier composé sus-mentionné, posséde la propriété, lorsqu'il est utilisé en dehors de l'association définie ci-dessus avec le second composé, de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires et de dissocier les protéines qui sont sous forme oligomérique (ce qui conduit aux stuctures monomériques de ces protéines), ce composé étant utilisé dans l'association définie cidessus avec le second composé dans des proportions telles qu'il conserve la propriété de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires tout en autorisant le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines susceptibles d'être sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires.
Avantageusement, le premier composé défini ci-dessus est constitué d'une ou plusieurs chaînes hydrocarbonées -(CH2)n-, avec n > 4, hydrophobes saturées ou insaturées, ramifiées ou non, et d'une tête polaire reliant entre elles ou non ces chaînes hydrophobes. De préférence le premier composé est choisi parmi les sels de dodécyl sulfate, notamment le dodécyl sulfate de sodium (SDS) ou de lithium. A titre illustratif, le premier composé peut également être choisi parmi les sels de dioctyl sulfosuccinate (de sodium par exemple), les sels de cétyltriméthylammonium (de brome par exemple), les sels de cétylpyridinium (de chlore par exemple), les Ndodécyl- ou N-tétradécyl-sulfobétaïne, l'octylglucoside, le lauryl maltoside, l'oxyde de lauryldiméthylamine, le décanoyl-N-méthylglucamide, et les polyéthylène glycol (n) lauryl éther.
Avantageusement le second composé utilisé dans l'association définie ci-dessus avec le premier composé, possède la propriété de solubiliser les protéines oligomériques membranaires en les maintenant sous forme oligomérique, sans détruire nécessairement leur activité biologique.
Un second composé particulièrement avantageux a pour structure de base hydrophobe le noyau gonane, constitué de 4 noyaux cycliques A, B, C et D, à 17 atomes de carbone, constituant la structure de base du cholestérol, portant ou non des groupements hydrocarbonés branchés en 10 ou en 13, ainsi que des groupements hydrophiles sur certains des 17 atomes de carbone, en alpha ou béta, principalement en 3, 7, 12, estérifiés ou non, cette structure de base étant associée ou non à une autre tête polaire branchée sur le noyau cyclique D en 15, 16 ou 17, directement ou non par l'intermédiaire d'une chaîne hydrocarbonée.
Un second composé préféré est représenté par le 3 [(3-cholamidopropyl) -diméthylamino-1-propane sulfonate] (ou CHAPS). A titre illustratif le second composé peut également être choisi parmi les sels des acides biliaires, cholique et désoxycholique, chénodésoxycholique ou lithocholique (de sodium par exemple), les sels des acides biliaires conjugués taurocholique ou glycocholique (de sodium par exemple), et la digitonine.
Les différentes cellules sur lesquelles le procédé de l'invention peut être appliqué, sont représentées par toute cellule du corps humain ou animal ou encore les cellules végétales, aux génomes modifiés ou non, notamment par mise en oeuvre de manipulations génétiques ou par mutation. Ces cellules peuvent également être infectées par des micro-organismes tels que décrits cidessous.
Les micro-organismes sur lesquels le procédé de lyse de l'invention est susceptible d'être appliqué sont représentés notamment par les bactéries ou les virus humains ou animaux (ou encore de végétaux) présentant des glycoprotéines d'enveloppe susceptibles d'être sous forme oligomérique. Dans le cas ou ces micro-organismes sont des virus, ces derniers peuvent être responsables de la fusion des membranes virus-hôte lors de l'infection, et sont plus particulièrement représentés par les rétrovirus humains du type HIV-1, HIV-2 et HTLV-I, HTLV-II, les myxovirus, notamment les virus de l'influenza, les paramyxovirus, notamment le virus des oreillons et le virus de la rougeole.
Le procédé de lyse selon l'invention est avantageusement appliqué aux différents types de virus responsables du SIDA, HIV 1 ou HIV-2 ou un mélange de ces derniers, en vue de la séparation, pour ce qui concerne
HIV-1, d'une part de la protéine d'enveloppe transmembranaire de HIV-1, de 4lkDa décrite ci-dessus et connue sous le nom de gp41 (responsable de la fusion des membranes avec les cellules cibles lors de l'infection), sous forme oligomérique, c'est à dire trimérique de 120kDa et plus particulièrement tétramérique de 160 kDa, et d'autre part des autres protéines entrant dans la composition du virion, notamment les produits des gènes viraux "gag", "pol" et "env", y compris la gpl20 (autre produit de clivage décrit ci-dessus du précurseur de la protéine d'enveloppe gp160 et qui est responsable de la reconnaissance de la cellule cible CD4 positive) sous forme monomérique.
HIV-1, d'une part de la protéine d'enveloppe transmembranaire de HIV-1, de 4lkDa décrite ci-dessus et connue sous le nom de gp41 (responsable de la fusion des membranes avec les cellules cibles lors de l'infection), sous forme oligomérique, c'est à dire trimérique de 120kDa et plus particulièrement tétramérique de 160 kDa, et d'autre part des autres protéines entrant dans la composition du virion, notamment les produits des gènes viraux "gag", "pol" et "env", y compris la gpl20 (autre produit de clivage décrit ci-dessus du précurseur de la protéine d'enveloppe gp160 et qui est responsable de la reconnaissance de la cellule cible CD4 positive) sous forme monomérique.
Pour ce qui concerne HIV-2, l'application du procédé de l'invention permet la séparation d'une part des formes oligomériques de la protéine d'enveloppe de 36kDa connue sous le nom de gp36 et, d'autre part des autres protéines constitutives du virion de façon analogue à celles d'HIV-l.
Le procédé de lyse selon l'invention peut également être appliqué aux différents types de myxovirus responsables de la grippe ou influenza, avec possibilité de séparer, d'une part la protéine d'enveloppe HA aux propriétés hémaglutinantes sous forme oligomérique et plus particulièrement trimérique et, d'autre part, les autres protéines entrant dans la composition du virion.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de protéines sous leur forme oligomérique telle qu'existante dans la membrane de cellules ou dans la membrane de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de lyse des cellules, des microorganismes, notamment de virus, ou des hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, suivant le procédé de l'invention décrit ci-dessus, le cas échéant suivie d'une étape de séparation proprement dite des protéines obtenues lors de l'étape précédente, notamment par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium par exemple, permettant la séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire, les protéines sous forme oligomérique restant associées sous une telle forme.
Avantageusement le procédé sus-mentionné peut être utilisé dans le but d'obtenir lesdites protéines oligomériques sous forme purifiée, notammment en faisant suivre l'étape de lyse ou celle de séparation précédemment décrites, par une étape de purification, notamment par immuno-affinité ou par séparation moléculaire et recueil de la (ou des) fraction(s) contenant la (ou les) protéine(s) oligomérique(s) recherchée(s) purifiée ( s).
Il va de soi que la réalisation, après l'étape de lyse sus-mentionnée, de la purification des protéines permet d'obtenir un composition comprenant différentes protéines oligomériques en association, tandis que la réalisation de cette étape de purification après celle de séparation permet d'obtenir des protéines oligomériques isolées et purifiées.
L'invention a également pour objet les protéines oligomériques telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé sus-mentionné de l'invention.
L'invention vise plus spécifiquement le trimère de 120ka et le tétramère de 160kDa sus-mentionnés sous forme purifiée, ou encore les formes oligomériques de la gp36 sus-mentionnées, tels qu'obtenus par mise en oeuvre du procédé de lyse de l'invention suivi d'une étape de purification, de la manière décrite ci-dessus, de ces protéines oligomériques ainsi obtenues, lesdites protéines présentant la caractéristique d'être stables à température ambiante en présence de quantités de SDS supérieures ou égales à environ 0,5%, notamment d'environ 1%, et de quantités de CHAPS qui soient au moins du même ordre que celles de SDS.
L'invention vise plus particulièrement des compositions de protéines sous forme oligomérique obtenues par mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus de lyse de virus du type HIV, ou d'hôtes cellulaires susceptibles de contenir de tels virus, et le cas échéant purifiées, ces compositions comprenant soit des protéines oligomériques différentes entre elles en association, soit des protéines oligomériques identiques isolées.
L'invention vise notamment des compositions comprenant le trimère de la protéine d'enveloppe transmembranaire de HIV-1 de 41kDa (ou gp41), à savoir le trimère de 120kDa décrit ci-dessus, et/ou le tétramère de cette gp41, à savoir le tétramère de 160kDa décrit cidessus, et/ou une ou plusieurs formes oligomériques de la gp36 d'HIV-2 sus-mentionnées.
L'invention vise également des compositions comprenant les formes oligomériques de la protéine d'enveloppe de 36kDa sus-mentionnée.
L'invention vise encore des compositions comprenant les protéines oligomériques, et plus particulièrement trimérique, de la protéine HA des myxovirus tels que ceux responsables de la grippe ou infuenza.
L'invention vise également l'application de compositions comprenant une ou plusieurs protéines oligomériques, et obtenues selon le procédé décrit cidessus pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic ou de tests de confirmation in vitro de pathologies causées par l'infection d'individus (homme ou animal) par des micro-organismes susceptibles d'être porteurs de telles protéines oligomériques.
A ce titre, l'invention a pour objet toute méthode de diagnostic ou tout test de confirmation sus-mentionnés, et réalisés par détection des anticorps reconnus spécifiquement par ces protéines oligomériques et susceptibles d'être présents dans des échantillons biologiques, notamment dans du sérum, provenant d'individus eux-mêmes susceptibles d'être infectés par les micro-organismes en question (notamment ceux décrits ci-dessus).
L'invention concerne plus particulièrement toute méthode de diagnostic in vitro des infections causées par les différents virus du type HIV, et qui sont à l'origine du SIDA, chez l'Homme ou chez l'animal, ou tout test de confirmation de ces infections, comprenant le cas échéant une étape d'application du procédé de lyse de l'invention sur les virus du SIDA ou sur les cellules infectées par ces derniers susceptibles d'être contenus dans un échantillon biologique, notamment dans le sérum, prélevé chez un individu, et une étape de détection des anticorps sus-mentionnés à l'aide d'une ou plusieurs protéines sous forme oligomérique telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé de lyse sus-mentionne.
L'invention a également pour objet toute composition comprenant:
- au moins un premier composé, choisi parmi ceux décrits ci-dessus, susceptible de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans des cellules, micro-organismes, notamment des virus, ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, et de dissocier (lorsqu'il est utilisé seul ou en très large excès par rapport au second composé) les protéines qui sont sous forme oligomérique, en association avec
- au moins un second composé, choisi parmi ceux décrits ci-dessus, possédant la propriété de solubiliser les protéines oligomériques membranaires en les maintenant sous forme oligomérique, sans détruire nécessairement leur activité biologique, le premier composé étant utilisé dans l'association définie ci-dessus dans des proportions telles qu'il conserve la propriété de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, microorganismes (notamment de celles des protéines responsables de la réplication du génome de ces microorganismes) ou hôtes cellulaires, tout en autorisant le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines susceptibles d'être sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires.
- au moins un premier composé, choisi parmi ceux décrits ci-dessus, susceptible de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans des cellules, micro-organismes, notamment des virus, ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, et de dissocier (lorsqu'il est utilisé seul ou en très large excès par rapport au second composé) les protéines qui sont sous forme oligomérique, en association avec
- au moins un second composé, choisi parmi ceux décrits ci-dessus, possédant la propriété de solubiliser les protéines oligomériques membranaires en les maintenant sous forme oligomérique, sans détruire nécessairement leur activité biologique, le premier composé étant utilisé dans l'association définie ci-dessus dans des proportions telles qu'il conserve la propriété de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, microorganismes (notamment de celles des protéines responsables de la réplication du génome de ces microorganismes) ou hôtes cellulaires, tout en autorisant le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines susceptibles d'être sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires.
Une composition particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention est telle que:
- le premier composé est constitué d'un sel de lithium ou de sodium de dodécyl sulfate,
- le second composé est le 3-[(3-cholamidopropyl) diméthylamino-l-propane sulfonate] (ou CHAPS).
- le premier composé est constitué d'un sel de lithium ou de sodium de dodécyl sulfate,
- le second composé est le 3-[(3-cholamidopropyl) diméthylamino-l-propane sulfonate] (ou CHAPS).
A titre illustratif, la quantité du premier compose, et plus particulièrement celle du SDS, représente de préférence environ 1,5 fois la quantité (en g/l) de protéines totales présentes dans l'échantillon biologique à traiter selon le procédé de lyse de l'invention.
Dans l'hypothèse où l'on se trouve en présence d'échantillon biologique où la concentration en protéines totales n'excéde pas environ 3mg/ml, la concentration de
SDS est avantageusement de l'ordre d'environ Smg/ml.
SDS est avantageusement de l'ordre d'environ Smg/ml.
De préférence, la quantité du second composé, et plus particulièrement du CHAPS, est au moins équivalente à celle du premier. Avantageusement, le second composé est utilisé dans un rapport équipondéral avec le premier composé.
Des compositions particulièrement préférées contiennent environ 1% de SDS et environ 1% de CHAPS.
L'invention a également pour objet tout procédé d'obtention des compositions décrites ci-dessus de l'invention, et comprenant à titre d'exemple le mélange du premier et du second composé tels que décrits cidessus, le cas échéant en solution aqueuse tamponnée.
L'invention vise également des trousses de réactifs (ou kits) pour la mise en oeuvre d'un procédé de lyse selon l'invention et comprenant une composition contenant en association un premier composé et un second compose tels que décrits ci-dessus.
L'invention concerne également des trousses de réactifs pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic ou tests de confirmation tels que décrits ci-dessus, et comprenant une composition contenant une ou plusieurs protéines oligomériques telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé de lyse de l'invention, et, le cas échéant une composition contenant en association un premier composé et un second composé tels que décrits cidessus.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une ou plusieurs protéines oligomériques telles qu'obtenues par le procédé de lyse de l'invention, pour l'obtention de médicaments et compositions vaccinantes destinés respectivement au traitement et à la prévention de pathologies causées par les infections par les microorganismes porteurs de ces protéines oligomériques.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet des vaccins contre les différents virus du type
HIV, et comprenant une ou plusieurs protéines telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé de lyse de l'invention sur des virus du type HIV (notamment HIV-1 et
HIV-2) ou sur des cellules infectées par ces virus.
HIV, et comprenant une ou plusieurs protéines telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé de lyse de l'invention sur des virus du type HIV (notamment HIV-1 et
HIV-2) ou sur des cellules infectées par ces virus.
L'invention vise plus particulièrement des compositions vaccinantes comprenant le trimère de 120kDa et/ou le tétramère de 160ka, et/ou les formes oligomériques de la protéine d'enveloppe de 36kDa susmentionnés, tels qu'obtenus par mise en oeuvre du procédé de lyse de l'invention sur des virus du type HIV-1 et/ou
HIV-2, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
HIV-2, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
L'invention vise également des compositions vaccinantes contre les différents virus responsables de la grippe ou influenza, comprenant une composition contenant les protéines oligomériques, et plus particulièrement trimérique, de la protéine HA, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de réalisation du procédé de lyse de l'invention pour l'obtention des protéines oligomériques de 120kDa et de 160kDa d'HIV-1 décrites cidessus.
I MATERIEL ET METHODES
1-LIGNEES CELLULAIRES ET VIRUS
1-1 CEM
Lignée lymphoblastique isolée à partir de sang périphérique d'une malade atteinte de leucémie lymphoblastique aiguë (T4+). Ces cellules proviennent de "l'American Tissue Culture Collection" (ATCC CC L 119) et portent la référence CCRS - CEM.
1-LIGNEES CELLULAIRES ET VIRUS
1-1 CEM
Lignée lymphoblastique isolée à partir de sang périphérique d'une malade atteinte de leucémie lymphoblastique aiguë (T4+). Ces cellules proviennent de "l'American Tissue Culture Collection" (ATCC CC L 119) et portent la référence CCRS - CEM.
1-2 CEM HIV
Il s'agit de cellules CEM chroniquement infectées par l'isolat LAV BRU pour les CEM HIV-1 et par l'isolat
ROD pour les CEM HIV-2.
Il s'agit de cellules CEM chroniquement infectées par l'isolat LAV BRU pour les CEM HIV-1 et par l'isolat
ROD pour les CEM HIV-2.
1-3 PRODUCTION DE PARTICULES VIRALES
Les lignées productrices sont cultivées à une densité de 1 à 2.106 cellules/ml. Le milieu, contenant les particules virales produites, est renouvelé deux fois par jour et conservé à 40C pendant au maximum 3 jours avant la purification.
Les lignées productrices sont cultivées à une densité de 1 à 2.106 cellules/ml. Le milieu, contenant les particules virales produites, est renouvelé deux fois par jour et conservé à 40C pendant au maximum 3 jours avant la purification.
1-4 PURIFICATION DES PARTICULES VIRALES
Les surnageants sont traités de la façon suivante:
- une première centrifugation permet d'éliminer les débris cellulaires pendant 30 min à 3 000 g,
- le surnageant est prélevé, les particules virales en suspension sont sédimentées par centrifugation pendant 1,5 h à 100 000 g,
- les particules virales sont remises en suspension dans du TNE (Tris-HCl 0,02 M à pH7,5, NaCl 0,1 M, EDTA 0,001 M) et purifiées par centrifugation isopycnique en gradient discontinu de saccharose de 20 à 59% pendant 16 h à 280 000 g.
Les surnageants sont traités de la façon suivante:
- une première centrifugation permet d'éliminer les débris cellulaires pendant 30 min à 3 000 g,
- le surnageant est prélevé, les particules virales en suspension sont sédimentées par centrifugation pendant 1,5 h à 100 000 g,
- les particules virales sont remises en suspension dans du TNE (Tris-HCl 0,02 M à pH7,5, NaCl 0,1 M, EDTA 0,001 M) et purifiées par centrifugation isopycnique en gradient discontinu de saccharose de 20 à 59% pendant 16 h à 280 000 g.
Le gradient est préparé à partir de cinq solutions de saccharose à 20, 30, 38,5, 47 et 59% (poids/volume).
Il s'agit d'une centrifugation à l'équilibre dans un gradient de densité discontinue. Les particules vont donc traverser les couches successives du gradient jusqu'à ce qu'elles rencontrent un milieu de densité identique à leur propre densité (d= 1,13).
Les particules virales sont recueillies au sommet de la fraction de saccharose à 38%. La fraction contenant les particules virales est diluée par deux volumes de TNE et centrifugée pour concentrer les virions pendant 3 h à 150 000g. Le culot, constitué de particules virales, est alors repris avec du TNE.
2-SEPARATION DES PROTEINES PAR ELECTROPHORESE EN
GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE SDS
2-1 SOLUBILISATION DES PROTEINES VIRALES DANS LES
CONDITIONS OPTIMISEES
Les protéines sont solubilisées dans le tampon d'échantillon suivant:
Tris-HCl pH 6,8 0,0625M
DTE (dithioérythritol) 0,100M
SDS 1%
CHAPS 1%
Glycérol 10%
2-2 CONDITIONS D'ELECTROPHORESE
Les gels de polyacrylamide sont coulés à température constante de 200C.La séparation des protéines est effectuée en gel de polyacrylamide de 1 mm d'épaisseur composé successivement:
- d'un gel de résolution fait de:
Acrylamide 12,5 %
MBA (Méthylène Bisacrylamide) 0,4 %
Tris-HCl pH 8,8 0,375 M
- et d'un gel de concentration fait de:
Acrylamide 4 %
MBA 0,11 %
Tris-HCl pH 6,8 0,125 M
Tampons d'électrophorèse:
supérieur Tris base 0,025M
Glycine 0,192M
SDS 0,1%
inférieur Tris base 0,025M
Glycine 0,192M
Paramètres électriques:
500 volts (V)
0,5 ampères (A)
6 watts/plaque (W)
600 volts.heure (V/h)
Avec ces paramètres la migration s'effectue à puissance constante et prend fin lorsque les 600 volts heures sont atteints. La migration est effectuée à température contrôlée, constante à 200C.
GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE SDS
2-1 SOLUBILISATION DES PROTEINES VIRALES DANS LES
CONDITIONS OPTIMISEES
Les protéines sont solubilisées dans le tampon d'échantillon suivant:
Tris-HCl pH 6,8 0,0625M
DTE (dithioérythritol) 0,100M
SDS 1%
CHAPS 1%
Glycérol 10%
2-2 CONDITIONS D'ELECTROPHORESE
Les gels de polyacrylamide sont coulés à température constante de 200C.La séparation des protéines est effectuée en gel de polyacrylamide de 1 mm d'épaisseur composé successivement:
- d'un gel de résolution fait de:
Acrylamide 12,5 %
MBA (Méthylène Bisacrylamide) 0,4 %
Tris-HCl pH 8,8 0,375 M
- et d'un gel de concentration fait de:
Acrylamide 4 %
MBA 0,11 %
Tris-HCl pH 6,8 0,125 M
Tampons d'électrophorèse:
supérieur Tris base 0,025M
Glycine 0,192M
SDS 0,1%
inférieur Tris base 0,025M
Glycine 0,192M
Paramètres électriques:
500 volts (V)
0,5 ampères (A)
6 watts/plaque (W)
600 volts.heure (V/h)
Avec ces paramètres la migration s'effectue à puissance constante et prend fin lorsque les 600 volts heures sont atteints. La migration est effectuée à température contrôlée, constante à 200C.
3-ELECTROTRANSFERT SUR NITROCELLULOSE
Les protéines séparées par électrophorèse sont ensuite électrotransférées sur une feuille de nitrocellulose ou tout autre support équivalent.
Les protéines séparées par électrophorèse sont ensuite électrotransférées sur une feuille de nitrocellulose ou tout autre support équivalent.
4-REVELATION DES PROTEINES TRANSFEREES
En fin de transfert la nitrocellulose est colorée avec une solution:
rouge Ponceau à 0,025 %
acide trichloroacétique 3,5 %
Cette étape fixe les protéines sur la nitrocellulose mais permet aussi de colorer les protéines transférées et donc de vérifier la qualité du transfert. Cette coloration est labile à pH neutre.
En fin de transfert la nitrocellulose est colorée avec une solution:
rouge Ponceau à 0,025 %
acide trichloroacétique 3,5 %
Cette étape fixe les protéines sur la nitrocellulose mais permet aussi de colorer les protéines transférées et donc de vérifier la qualité du transfert. Cette coloration est labile à pH neutre.
5-IMMUNODETECTION
Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante et sous agitation constante. Le rouge Ponceau est totalement éliminé par rinçage avec du PBS.
Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante et sous agitation constante. Le rouge Ponceau est totalement éliminé par rinçage avec du PBS.
- La nitrocellulose est saturée 30 min dans une solution de lait écrémé à 1% dans du PBS.
- Fixation du premier anticorps contenu dans du sérum dilué au 1/100ème dans la solution de saturation, pendant 1 heure.
- La solution contenant le premier anticorps est éliminée et la nitrocellulose est rincée 3 fois 10 min avec une solution de Tween 20 à 0,1% dans du PBS.
- le second anticorps est dilué au 1/1000ème dans du
PBS/Tween 20 et incubé pendant 1 heure.
PBS/Tween 20 et incubé pendant 1 heure.
- La nitrocellulose est alors lavée 3 fois 10 min dans du PBS/Tween puis rincée rapidement dans du PBS.
- La révélation est effectuée dans une solution de
NBT/BCIP ("nitro blue tetrazolium/5 bromo-4 chloro-3 indolyl phosphate"), la réaction est arrêtée dans de l'eau distillée.
NBT/BCIP ("nitro blue tetrazolium/5 bromo-4 chloro-3 indolyl phosphate"), la réaction est arrêtée dans de l'eau distillée.
II-RESULTATS ET DISCUSSION
Dans les conditions utilisant le procédé de l'invention de solubilisation des protéines virales, trois bandes correspondant aux produits - de gène "env peuvent être mises en évidence à 160, 120 et 41 kDa, laissant supposer, en première approche, qu ' il s'agit respectivement:
- du précurseur, gp160;
- de la glycoprotéine externe gp120, permettant la reconnaissance du CD4;
- de la glycoprotéine transmembranaire gp41, permettant la fusion des membranes.
Dans les conditions utilisant le procédé de l'invention de solubilisation des protéines virales, trois bandes correspondant aux produits - de gène "env peuvent être mises en évidence à 160, 120 et 41 kDa, laissant supposer, en première approche, qu ' il s'agit respectivement:
- du précurseur, gp160;
- de la glycoprotéine externe gp120, permettant la reconnaissance du CD4;
- de la glycoprotéine transmembranaire gp41, permettant la fusion des membranes.
Dans ces conditions, toutefois, la gp41 apparaît toujours de faible intensité, alors que dans les conditions de solubilisation des protéines virales classiquement utilisées, la gp41 apparaît avec une plus grande intensité avec, en contre partie, une absence de gp160 et gp120.
Cependant les résultats obtenus avec des anticorps monoclonaux montrent que: - la bande située à 120 kDa contient une protéine qui possède un étitope de la gp41, puisqu'un anticorps monoclonal anti-gp41 reconnaît à la fois les produits de 160 kDa et de 120 kDa, - le même produit de 120 kDa est reconnu très faiblement par un anticorps monoclonal anti-gpl20 qui lui-même ne reconnaît pas le produit qui devrait être son précurseur, la gp160.
Si on ne peut pas écarter l'hypothèse que l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal anti-gpl20 ne soit pas accessible sur le précurseur gp160 non clivé, la présence d'un épitope de gp41 sur la gp120 ne peut, en revanche, pas être expliquée puisque ces deux protéines sont codées par des régions différentes du génome viral et qu'elles ne possèdent ni homologie de séquence ni réactivité immunologique croisée.
Par conséquent, tous les épitopes reconnus par ces anticorps monoclonaux anti-gp41 sont présents sur les produits de 120 à 160 kDa et les épitopes de la gpl20 ne sont jamais détectés sur le produit de 160 kDa. Ceci suggère que les deux bandes mises en évidence en "western blot" à 120 et 160 kDa correspondent à des formes oligomériques de la gp41.
Cependant, les anticorps monoclonaux anti gp120 reconnaissent également un produit de 120 kDa. Il faut donc supposer que la bande mise en évidence par immunodétection avec un sérum positif, correspond à la détection de deux produits du gène "env", à savoir une forme multimérique de la gp41 associée à la glycoprotéine externe gp120. Ceci est compatible avec les résultats obtenus en "western blot" puisque, l'immunodétection effectuée avec les anticorps monoclonaux anti gp120 donne dans la région de 120 kDa une bande d'environ 1 mm, alors que sur la même membrane, un sérum positif donne dans cette région un signal beaucoup plus large de 3 à 4 mm environ. De plus, cette bande reconnue par l'anticorps anti gp 120 est non seulement plus fine mais également légèrement plus haute que la bande reconnue par l'anticorps monoclonal anti-gp41.
Ainsi le produit de 160 kDa mis en évidence sur les "western blots" préparés à partir de lysats de virus correspond-il à un tétramère de gp41 et la bande de 120 kDa correspond-elle à la fois à la gp120 et à un trimère de la gp41.
Le précurseur codé par le gène env (la gp160) ne serait pas présent dans la particule virale sous sa forme non clivée. Ce point est en caccord avec les résultats de
Pinter et col. (1989) qui, grâce à un anticorps monoclonal anti-gp120, mettent en évidence la présence de gpl60 et de gp120 dans un lysat de cellules infectées, alors que le même anticorps ne reconnaît que la gp120 dans les particules virales.
Pinter et col. (1989) qui, grâce à un anticorps monoclonal anti-gp120, mettent en évidence la présence de gpl60 et de gp120 dans un lysat de cellules infectées, alors que le même anticorps ne reconnaît que la gp120 dans les particules virales.
L'addition de CHAPS ou 3-[(3-cholamidoproyl)diméthylamino-l-propane sulfonate] au tampon de dissociation des particules virales apparaît directement responsable du maintien des structures oligomériques des glycoprotéines de l'enveloppe virale. Le CHAPS est un détergent "zwitterionique" dont la structure est proche de celle du cholestérol et qui possède des propriétés proches de celles d'autres détergents ioniques, comme les cholates et deoxycholates. Le CHAPS permet une bonne solubilisation des protéines membranaires et empêche la formation d'aggrégats protéiques. Il a permis d'isoler des récepteurs membranaires sans en altérer les propriétés (affinités, spécificités), alors que ces récepteurs perdent leur propriété lorsqu'ils sont extraits avec d'autres détergents [Simonds et col., 1980;
Sladeczek et col., 1984; Brose et col., 1992].
Sladeczek et col., 1984; Brose et col., 1992].
Dans le cas de HIV, l'effet stabilisateur du CHAPS sur la structure quaternaire du tétramère dépend de la concentration en CHAPS au moment de la dissociation des particules virales. Si le CHAPS est ajouté à des particules virales déjà dissociées par action du SDS, il ne permet pas la réassociation des monomères. Pour HIV, l'interaction gp41/CHAPS semble stabiliser la conformation oligomérique de la gp41, ce qui lui permet d'être parfaitement reconnue par les anticorps. Sans
CHAPS et à 1% de SDS, les formes oligomériques sont progressivement dissociées, la dissociation étant accélérée par le traitement à 95"C. De plus, il a été montré que la concentration maximum de SDS tolérée par le tétramère de gp41 est de l'ordre de 0,1 à 0,15 %. Au-delà le tétramère est dissocié.Il semble cependant que les tétramères puissent résister à des concentrations plus élevées en SDS mais pendant un laps de temps très court (environ 5 min) [Pinter et col., 1989]. Ces résultats renforcent les observations effectuées au laboratoire avec la mise en évidence de la perte de réactivité antigénique au niveau des formes oligomériques de la gp41 par traitement de échantillons à 950C en présence de 1% de SDS.
CHAPS et à 1% de SDS, les formes oligomériques sont progressivement dissociées, la dissociation étant accélérée par le traitement à 95"C. De plus, il a été montré que la concentration maximum de SDS tolérée par le tétramère de gp41 est de l'ordre de 0,1 à 0,15 %. Au-delà le tétramère est dissocié.Il semble cependant que les tétramères puissent résister à des concentrations plus élevées en SDS mais pendant un laps de temps très court (environ 5 min) [Pinter et col., 1989]. Ces résultats renforcent les observations effectuées au laboratoire avec la mise en évidence de la perte de réactivité antigénique au niveau des formes oligomériques de la gp41 par traitement de échantillons à 950C en présence de 1% de SDS.
On peut donc supposer que lors du traitement de la particule virale par le tampon de solubilisation contenant à la fois du CHAPS et du SDS: - le CHAPS prend la place du cholestérol membranaire avec une affinité pour les aminoacides hydrophobes impliqués dans l'interaction avec le cholestérol plus importante que celle, moins spécifique, du SDS pour ces mêmes aminoacides hydrophobes transmembranaires, - tandis que le SDS prend la place des phospholipides et glycolipides membranaires, - l'association SDS-CHAPS tendant à reconstituer l'environnement nécessaire au maintien des structures oligomériques des glycoprotéines transmembranaires.
Cependant, un excès de SDS ou le chauffage prolongé au moment de la solubilisation déplacent l'interaction en faveur du SDS qui prend alors, de façon irréversible, la place du CHAPS.
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Genetic Medicine, Vol.2, Friedman, T. ed., PP 189-219.
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Claims (24)
1. Procédé de lyse de cellules ou de microorganismes, tels que les virus, ou d'hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, aux génomes modifiés ou non, notamment aux fins d'obtention et, le cas échéant de purification des protéines à localisation membranaire chez ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires, ce procédé permettant de maintenir sous forme oligomérique celles des protéines susceptibles d'être présentes sous une telle forme dans les cellules, microorganismes ou hôtes cellulaires sus-mentionnés, tout en détruisant l'activité biologique des protéines, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de traitement de ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires à l'aide d'une composition contenant une association d'au moins deux molécules différentes (désignées respectivement par premier et second composés) au caractère amphipathique, chacune comprenant une partie hydrophobe et une partie hydrophile.
2. Procédé de lyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'une au moins des deux molécules, à savoir le premier composé, possède la propriété, lorsqu'il est utilisé en dehors de l'association avec le second composé, de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires et de dissocier les protéines qui sont sous forme oligomérique, ce composé étant utilisé dans l'association définie dans la revendication 1 avec le second composé dans des proportions telles qu'il conserve la propriété de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, microorganismes ou hôtes cellulaires tout en autorisant le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines susceptibles d'être sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires.
3. Procédé de lyse selon la revendication 2, caractérise en ce que le premier composé, est constitué d'une ou plusieurs chaînes hydrocarbonées -(CH2)n-, avec n > 4, hydrophobes saturées ou insaturées, ramifiées ou non, et d'une tête polaire reliant entre elles ou non ces chaînes hydrophobes.
4. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le second composé utilisé dans l'association définie dans la revendication 1, possède la propriété de solubiliser les protéines oligomériques membranaires en les maintenant sous forme oligomérique, sans détruire nécessairement leur activité biologique.
5. Procédé de lyse selon la revendication 4, caractérisé en ce que le second composé a pour structure de base hydrophobe le noyau gonane, constitué de 4 noyaux cycliques A, B, C et D, à 17 atomes de carbone, constituant la structure de base du cholestérol, portant ou non des groupements hydrocarbonés branchés en 10 ou en 13, ainsi que des groupements hydrophiles sur certains des 17 atomes de carbone, en alpha ou béta, principalement en 3, 7, 12, estérifiés ou non, cette structure de base étant associée ou non à une autre tête polaire branchée sur le noyau cyclique D en 15, 16 ou 17, directement ou non par l'intermédiaire d'une chaîne hydrocarbonée.
6. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le premier composé est le sodium dodécyl sulfate (ou SDS) et ie second composé est le 3 [(3-cholamidopropyl)-diméthylamino-1-propane sulfonate] (ou CHAPS).
7. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est appliqué sur des cellules humaines, animales ou végétales, ou sur des micro-organismes ou des hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, notamment par des virus humains, animaux ou végétaux, présentant des protéines, notamment des glycoprotéines d'enveloppe, susceptibles d'être sous forme oligomérique et, le cas échéant, responsables de la fusion des membranes virus-hôte lors de l'infection.
8. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est appliqué sur des rétrovirus humains du type HIV-1, HIV-2 et HTLV-I, HTLV II, les myxovirus, notamment les virus de l'influenza, les paramyxovirus, notamment le virus des oreillons et le virus de la rougeole.
9. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué aux différents types de virus responsables du SIDA, HIV-1 ou HIV-2 ou un mélange de ces derniers, en vue de la séparation, pour ce qui concerne HIV-1, d'une part la protéine d'enveloppe transmembranaire de HIV-1, de 4lkDa connue sous le nom de
GP41 (responsable de la fusion des membranes avec les cellules cibles lors de l'infection), sous forme oligomérique, c'est à dire trimérique de 120kDa et plus particulièrement tétramérique de 160 kDa, et d'autre part les autres protéines entrant dans la composition du virion, notamment les produits des gènes viraux "gag", "pol" et "env", y compris la gp120 (autre produit de clivage du précurseur de la protéine d'enveloppe gpl60 et qui est responsable de la reconnaissance de la cellule cible CD4 positive) sous forme monomérique, et, pour ce qui concerne HIV-2, d'une part les formes oligomériques de la protéine d'enveloppe de 36kDa connues sous le nom de gp36 et, d'autre part les autres protéines constitutives du virion de façon analogue à celles d'HIV-1.
10. Procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué aux différents types de myxovirus responsables de la grippe ou influenza, avec possibilité de séparer, d'une part la protéine d'enveloppe HA aux propriétés hémaglutinantes sous forme oligomérique et plus particulièrement trimérique et, d'autre part, les autres protéines entrant dans la composition du virion.
11. Procédé d'obtention de protéines sous leur forme oligomérique telle qu'existante dans la membrane cellulaire ou dans la membrane des micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de lyse des cellules, des micro-organismes, notamment de virus, ou des hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, suivant le procédé selon l'une des revendications 1 à 10, le cas échéant suivie d'une étape de séparation proprement dite des protéines obtenues lors de l'étape précédente, notamment par electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium par exemple, permettant la séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire, les protéines sous forme oligomérique restant associées sous une telle forme, cette dernière etape ou l'étape de lyse précédente étant elles-mêmes le cas échéant suivie d'une étape de purification de la protéine ou des protéines ainsi obtenues.
12. Protéines oligomériques telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 11.
13. composition de protéines oligomériques telles selon la revendication 12, comprenant le trimère de la protéine d'enveloppe transmembranaire de HIV-1 de 4lkDa (ou gp41), à savoir le trimère de 120kDa décrit cidessus, et/ou le tétramère de cette gp41, à savoir le tétramère de 160ka, et/ou une ou plusieurs formes oligomériques de la gp36 d'HIV-2.
14. Composition de protéines oligomériques selon la revendication 12, comprenant la protéine d'enveloppe HA aux propriétés hémaglutinantes sous forme oligomérique et plus particulièrement trimérique, des myxovirus responsables de la grippe ou influenza.
15. Méthode de diagnostic de pathologies causées par l'infection d'individus (homme ou animal) par des microorganismes, notamment par les virus du type HIV, cette méthode comprenant une étape de détection des anticorps reconnus spécifiquement par les protéines oligomériques telles qu'obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12, notamment par les protéines selon la revendication 13, ces anticorps étant susceptibles d'être présents dans des échantillons biologiques, notamment dans du sérum, provenant d'individus eux-mêmes susceptibles d'être infectés par les micro-organismes en question.
16. Composition vaccinante contre les différents virus du type HIV, comprenant une composition selon la revendication 13, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
17. Composition vaccinante contre les différents virus responsables de la grippe ou influenza, comprenant une composition selon la revendication 14, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
18. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend:
- au moins un premier composé susceptible de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans des cellules, micro-organismes, notamment des virus, ou hôtes cellulaires infectés par ces micro-organismes, et de dissocier (lorsqu'il est utilisé seul ou en très large excès par rapport au second composé) les protéines qui sont sous forme oligomérique, en association avec
- au moins un second composé possédant la propriété de solubiliser les protéines oligomériques membranaires en les maintenant sous forme oligomérique, sans détruire nécessairement leur activité biologique,
le premier composé étant utilisé dans l'association définie ci-dessus avec dans des proportions telles qu'il conserve la propriété de détruire l'activité biologique des protéines présentes dans ces cellules, microorganismes ou hôtes cellulaires tout en autorisant le maintien sous forme oligomérique de celles des protéines susceptibles d'être sous une telle forme dans ces cellules, micro-organismes ou hôtes cellulaires.
19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que le premier composé est le sodium dodécyl sulfate (ou SDS) et le second composé est le 3 [(3-cholamidopropyl)-diméthylamino-1-propane sulfonate] (ou CHAPS).
20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que la quantité du premier composé, et plus particulièrement celle du SDS, représente de préférence environ 1,5 fois la quantité (en g/l) de protéines totales présentes dans l'échantillon biologique à traiter selon le procédé de lyse défini dans l'une des revendications 1 à 12.
21. Composition selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que la quantité du second composé, et plus particulièrement du CHAPS, est au moins équivalente à celle du premier.
22. Composition selon l'une des revendications 18 à 21, caractérisée en ce que le SDS et le CHAPS sont utilisés dans un rapport équipondéral, et contient de préférence environ 1% de chacun de ces deux composés.
23. Trousses de réactifs (ou kits) pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 12 et comprenant une composition selon l'une des revendications 18 à 22.
24. Trousses de réactifs pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic selon la revendication 15, comprenant une composition contenant une ou plusieurs protéines oligomériques telles qu'obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12, notamment une composition selon la revendication 13, et le cas échéant une composition selon l'une des revendications 18 à 22.
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