WO1995031568A2 - Procede d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'adn a l'aide d'amorces en escalier - Google Patents

Procede d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'adn a l'aide d'amorces en escalier Download PDF

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WO1995031568A2
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Ronald Colimon
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Universite De Rennes I
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Definitions

  • the present invention relates to a method of enzymatic amplification of a DNA fragment in vitro.
  • the present invention also relates to diagnostic methods based on the detection of DNA and in which methods of DNA amplification are used, in particular the detection of sequences of viruses such as the human immunodeficiency virus HIV.
  • the present invention also relates to DNA amplification kits or diagnostic kits for implementing the methods according to the invention. More particularly, the present invention relates to methods of enzymatic amplification in vitro of single-strand or double-stranded DNA nucleic acid sequences involving the use of primers, in particular the so-called "PC / T" method.
  • Enzymatic DNA amplification techniques are well known to those skilled in the art.
  • In vitro amplification techniques, in particular by PCR, have been described in the literature and their implementation and improvements have been the subject of patent applications. Mention may in particular be made of the European publications EP 201 184 and
  • EP 200 362 on the basic technique for the PCR method.
  • In vitro gene amplification techniques in particular the so-called "PCR” (Polymerase Chain Reaction) method (21), are experiencing rapid development in microbiology.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • virology their great sensitivity makes them a tool of choice for diagnosis and epidemiological studies alongside isolation and serology techniques.
  • the present invention relates to an improvement of these amplification methods, to improve priming and making it possible to amplify a genomic sequence comprising mutations in the region of the primers.
  • a cycle comprises several stages: a first stage of thermal denaturation of the DNA which separates, if necessary, the double-stranded DNA into two mono-strands, a second stage of hybridization of the primers on the sequences of the single-strands which are complementary to them, and a third step of elongation from the 3 ′ ends of the primers using poly DNA merase.
  • Use is made of specific oligonucleotide primers which will hybridize on sequences which are complementary thereto framing at its 5'P ends the DNA fragment to be amplified.
  • the 3 'OH ends of these primers constitute the starting point of an elongation carried out, in the 5'-> 3 'direction, by DNA replication enzymes called "DNA polymerases".
  • the reaction medium therefore contains the DNA to be amplified, the primers, the DNA polymerase, as well as other elements such as a buffer, salts, tri-phosphate deoxynucleotides.
  • Each strand of the fragment then serves as a matrix for the enzyme which synthesizes the complementary strands; the multiplication factor is then two.
  • the primer oligonucleotides are again returned to hybridize with the DNA strands from the first " amplification cycle, each strand serving as a template for DNA polymerase.
  • the amplification factor will then be four - and so on - with theoretical doubling of copies of the DNA fragment in each cycle.
  • thermostable polymerase Taq polymerase
  • the operating conditions of the different stages are essentially distinguished by the temperature at which they take place, the denaturation conditions generally correspond to an increase in the temperature of the reaction medium above 90 ° C., the hybridization generally takes place between 50 and 70 ° C and the elongation by DNA polymerase can be carried out at relatively high temperatures, of the order of 70 ° C if using a DNA polymerase stable to heat.
  • the products from the first cycle, as from each of the successive cycles are not denatured. It is an isothermal method.
  • the primers are always chosen, preferably, in the most conserved genomic regions (18).
  • RNA viruses human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis C virus, picornavirus, etc.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • hepatitis C virus hepatitis C virus
  • picornavirus picornavirus
  • the aim of the present invention is to provide a method for the in vitro enzymatic amplification of DNA comprising a simpler and above all more reliable priming method making it possible, during a single amplification reaction, to amplify a region given genomics, whether or not the primed region has nucleotide variations.
  • Another object of the present invention is that the amplification method nevertheless resulting in the synthesis of a single band detected in the form of a single signal at electrophoresis and in southern blot requiring the use of a single hybridization probe.
  • the present invention consists in using so-called "stair-primers".
  • the conventional primer is replaced by a mixture ("set") of oligonucleotides of variable length, the 5 'end being fixed, " so that the length of the amplified fragment is constant, and the end 3 'of these oligonucleotides shifting with respect to each other, for example base by base, as illustrated in Figure 1.
  • deletion or insertion may be provided by oligonucleotides whose 3' end is located upstream and / or downstream of this mutation.
  • the sequences of the oligonucleotides of the mixture derive from the same sequence and not from a mixture of different sequences. It is also necessary that the different molecules of the mixture are in equimolar quantities. It is necessary to avoid that a molecular species of the mixture, incapable of initiating the amplification, but more abundant, does not block the amplification by competition.
  • the present invention therefore more specifically relates to a method of enzymatic amplification in vitro of a DNA fragment in which two primers respectively upstream and downstream are used, at least one of which is a so-called "staircase" primer which consists of a mixture of oligonucleotides, the oligonucleotides constituting the mixture being in equimolar quantities, of different sizes, of sequences complementary to the same region upstream or downstream of said fragment to be amplified and each oligonucleotide having, from its 5 ′ end, in the 5'—> 3 'direction, the same sequence as the smaller oligonucleotides in the mixture.
  • a so-called "staircase” primer which consists of a mixture of oligonucleotides, the oligonucleotides constituting the mixture being in equimolar quantities, of different sizes, of sequences complementary to the same region upstream or downstream of said fragment to be amplified and each oligonucleotide
  • two upstream and downstream primers are used, each consisting of a mixture of oligonucleotides, the oligonucleotides constituting each upstream or downstream mixture being in equimolar quantities, of different sizes, of sequences complementary to the same region respectively upstream. or downstream of the said fragment to be amplified and each oligonucleotide having, from its 5 'end, in the 5'-> 3 ⁇ direction, the same sequence as the smaller oligonucleotides of the same mixture.
  • the oligonucleotides of each mixture therefore all have the same 5 'end and are distinguished only at the 3' end.
  • the term "primer” is understood to mean a determined quantity of oligonucleotide. This is why we speak of a staircase primer, constituted by a mixture of oligonucleotides ", and not by a” mixture of primers ". This terminology reflects the fact that the overall quantity of the different oligonucleotides included in each mixture is the same as the quantity of oligonucleotides constituting a conventional unimolecular primer used in known conventional in vitro DNA amplification methods.
  • the rest of the selection of the sequences and the size of the oligonucleotides are governed by the same criteria as for the conventional uni-molecular primers, that is to say criteria of complementarity and specificity with respect to the target sequence to be amplified.
  • the number of oligonucleotides in each mixture that is to say pictorially, the number of "stair steps", is not limiting. The greater this number, the greater the reliability of the process.
  • a mixture of five to fifteen oligonucleotides is suitable, in particular, when the " target region of the primer can undergo mutations and / or deletions or insertions of sequences on one to five nucleotides and the difference in size between each oligonucleotides and the next largest and smallest is one or two nucleotide (s).
  • an extended mutation of the genome to be amplified simultaneously concerning several nucleotides 3 ′ of the molecules making up the mixture is statistically very unlikely.
  • the mutations never relate to more than three consecutive bases.
  • the mutations no longer play a role in the efficiency of the amplification.
  • the difference in size between each oligonucleotide and that immediately larger or smaller, that is to say pictorially the "width of the steps" is not necessarily 1 nucleotide as we have seen and can be from 1 to 4 nucleotides, preferably 1 to 3.
  • the width of the steps may make it possible, in certain cases, to decrease the number of oligonucleotides, that is to say the number of steps, and thereby increase the reliability of the system without resort to an excessive number of oligonucleotides, in particular in cases where it is known that the variable region extends over a fairly large domain, or when the variability is due to point but frequent mutations.
  • the "width of the steps" is not necessarily identical between the different oligonucleotides of the same staircase primer, that is to say of the same mixture.
  • the number of steps that is to say the number of oligonucleotides
  • the number of steps is not necessarily identical in the upstream primer mixture and the downstream primer mixture. If it is considered that the downstream or upstream region of the target is more conserved, it is possible to envisage a reduced number of oligonucleotide steps in the downstream or upstream primer respectively, provided that the overall molar quantity of oligonucleotides remains identical in each mixture.
  • the symmetry of the two mixtures is not compulsory with regard to the size of the different nucleotides and the width of the steps.
  • upstream and downstream primers which are symmetrical in terms of number of oligonucleotides and of size difference between them. , i.e. width of steps. Therefore, in one embodiment of the present invention, the number and sizes of the respective oligonucleotides in the upstream and downstream primers are the same.
  • the upstream and downstream primers comprise oligonucleotides of identical sizes two by two. More preferably still, in a staircase primer according to the invention or in each primer, the size differences between each oligonucleotide, the oligonucleotide immediately larger or immediately smaller, are identical
  • the main advantage of the method according to the invention is to reduce the risk of amplification and false negative detection, and even to eliminate it completely, if one addresses a region of the genome which does not undergo modifications important deletion or insertion type greater than five nucleotides in the region of the primers, in particular, in the most frequent case, where the region of the primers contains only point mutations.
  • the staircase primers indeed consist of oligonucleotides complementary to the best preserved regions of the genomes constituting the fragment, preferably with regions which only undergo point mutations.
  • the staircase primers according to the invention make it possible in all cases to regularize the yield of the primers, which is very important when implementing a quantitative amplification method.
  • Another advantage of the method according to the invention is to reinforce the specificity of the primers.
  • the quantity of each oligonucleotide relative to the quantity of unimolecular primers in conventional methods is divided by the number of oligonucleotides in the mixture, the non-specific hybridization decreases correspondingly.
  • the mixtures of oligonucleotides according to the invention are necessarily led to have primers comprising oligonucleotides of larger size. This last characteristic also reinforces the specificity.
  • the staircase primers according to the invention therefore constitute an additional means of avoiding non-specific primers.
  • the size of the oligonucleotides in a staircase primer according to the invention is from 15 to 40 nucleotides, in particular from 20 to 30.
  • the method according to the invention is applicable in any method involving the use of DNA amplification primers, in particular diagnostic methods involving the in vitro detection of a DNA fragment in which an in vitro enzymatic amplification process of the said DNA fragment according to the invention is used.
  • the method according to the invention can in particular be adapted to genetic diagnosis.
  • the possibility of sequencing numerous strains makes it possible to choose the conserved regions and thus minimizes the drawbacks due to genomic variations. This possibility is more limited for a human genome and the method according to the invention using staircase primers makes it possible to greatly improve the reliability of the diagnosis by amplification of DNA in the field of human genetics.
  • the method according to the invention can make it possible, from a known gene in a given species, to search for the same gene in a neighboring species.
  • the number of oligonucleotides can be increased and the homology with the primers of the sequences sought can be lower.
  • the staircase primers according to the invention are in particular applicable for detecting more stable regions of HIV than those exemplified below and they are also applied for the diagnosis of hepatitis C, for the development of generic primers for certain enteroviruses and for the diagnosis of herpes viruses.
  • the method according to the present invention by its simplicity, provides services by improving the reliability of the diagnosis by DNA amplification, in particular of the PCR type, in particular for HIV.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for the implementation of a diagnostic method according to the invention, characterized in that it comprises primers for enzymatic amplifications in vitro of a DNA fragment to be detected, the said primers consisting of staircase primers as defined above for the implementation of an amplification method according to the invention.
  • Figure 1 shows the principle of "staircase primers".
  • A Example of “staircase primers”. The conventional primer is replaced by a mixture of 11 oligonucleotides of 20 to 30 bases (A to K), having an identical 5 ′ end and a 3 ′ end moving base by base.
  • B DNA priming by the staircase primers in the event of a point mutation of the sequence to be amplified: the black square represents the mutated nucleotide present in the target sequence of the primer.
  • the oligonucleotide D unable to pair at 3 ', is supplemented by the oligonucleotides whose 3' end is located upstream or downstream of the mutated nucleotide (primers A, B, C, E ..).
  • Figure 2 shows the position of the HIV genome region amplified by HIVSET, and primer sequences.
  • A Situation of the amplified region of gp 120.
  • the symbol (Q) represents the position of the primers flanking the V3 sequences.
  • B Sequences of the oligonucleotides composing HIVSET1 and HIVSET2.
  • Figure 3 shows the results of the mutated primers.
  • A Sequence of primers used.
  • DNA fragment size marker (Boehringer DNA molecular-weight marker VI - Cat. No. 1062590). Amplification after 25 cycles (10 ⁇ of deposit) of the DNA extracted from 8E5 cells containing 1 copy of the HIV genome per cell, using the different primers.
  • the primer 1-F is the wild primer.
  • Figure 4 shows examples of amplifications of HIV strains by HIVSET, polV2, and SK38-39.
  • Amplifications with A) HIVSET, B) polV2, C) SK38-39 respectively (a: gel, b: hybridization with the respective probes labeled with digUTP).
  • Figure 5 shows results of alignment by the Blastn program.
  • the 32 sequences represent all of the mutations observed among
  • the method according to the invention was applied to the detection of HIV, the genomic variability of which has been widely studied (Revues 15, 23). Each isolate can be considered as a population of very close unique genomes (quasi-species) (19). Primers according to the invention (“stair-primers”) were voluntarily selected from the most variable HIV genomic sequences, those coding for the glycoprotein gp 120, in the regions surrounding the V3 loop. They were tested on strains isolated from seropositive patients as well as on lymphocytes of patients, and compared the results with those obtained with conventional primers selected in the most stable regions of the genome (pol and gag genes).
  • the amplification related to a fragment of 437 bp (nucleotides 6925 to 7361 of the strain HXB2, Embl Accession n ° K03455), in the region coding for the glycoprotein gp 120. This fragment is centered by the sequences of the V3 loop.
  • the amplified DNA is that of the gp 160 of the HIV Bru strain (recombinant virus WTG 1139). Only the upstream primer is mutated, the downstream primer is unchanged. The amplification steps are those described below.
  • oligonucleotides composing the staircase primers The conventional primer is replaced by a mixture of oligonucleotides of variable length, the 5 ′ end being fixed (length of the amplified fragment constant), the 3 ′ end shifting base by base (figure 1). For each primer, a mixture of 11 oligonucleotides of 20 to 30 bases, 1-A to 1-K for the primer upstream HIVSET1, and 2-A to 2-K for the primer downstream HrVSET2 was produced. ).
  • each primer or mixture is used at the molarity of 1 ⁇ M, each oligonucleotide involved for 1/11 in the final molarity (mixture in equal quantity of a suspension 1 ⁇ M of each of the 11 oligonucleotides).
  • the primers polV2 flanking a region of 261 bp in the pol gene were selected by the PCrare software (Eurogentec Brussels) (10).
  • the primers SK38-39 flanking a region of 1 15 bp in the gag gene have been described by C.Y. Ou et al (20) (Table 1). These primers are used in current practice.
  • the Blastn (1) program (Server Blast@crihan.fr) sought the homology between the HIVSET oligonucleotides and the HIV sequences referenced to date in the Embl bank (latest version).
  • Isolated strains of patients come from the co-culture of lymphocytes from 72 patients, with an HIV positive serology, seen at the CHR in Rennes.
  • the viral culture is carried out from the lymphocyte fraction of whole blood, separated in a Ficoll gradient.
  • the lymphocytes are taken up in RPMI medium supplemented with fetal bovine serum and interleukin-2, and cultured in the presence of lymphocytes from seronegative subjects (2 ⁇ 10 6 cells / ml) stimulated with phytohemagglutinin (7).
  • the cell suspension is collected and stored at -80 ° in the form of 1 ml aliquots containing approximately 3 ⁇ 10 6 cells.
  • the HIV genome was searched directly (before coculture) in the DNA of the lymphocytes of 29 of these patients.
  • the negative controls are HIV-negative blood donor lymphocytes.
  • Proviral reference DNA The DNA of the BRU strain was used as a reference target. This DNA comes from 3 sources: a) 8E5 cells (1 copy of integrated provirus per cell) (8). These cells are maintained in RPMI medium supplemented with fetal bovine serum, b) gp 160 DNA originating from the culture supernatant on BH 21 cells of the recombinant Vaccine virus WTG 1 139 (Laboratoire Trans consequent SA ⁇ France-France-), c) Plasmid pBTl (strain BRU) provided free of charge by Pr. Montagnier (Institut Pasteur Paris).
  • Extraction of the proviral DNA from the lymphocytes It is carried out on 50 ⁇ l of the cell suspension, or approximately 150,000 cells.
  • the deproteinization is carried out in a volume of 500 ⁇ l in lysis buffer (Tris 0.1M - EDTA 0.01M - SDS 0.5%) containing 200 ⁇ g / ml of proteinase (BOEHRINGER) (1 hour at 37 °).
  • Two phenol-chloroform extractions are followed by precipitation in absolute alcohol in the presence of Na acetate (0.3 M final).
  • the nucleic acids are taken up in 70 ⁇ l of sterile water and stored at -80 °.
  • PCR Region V3 (HIVSET): The reaction is carried out in a volume of 50 ⁇ l. The sample to be amplified (the equivalent of 40,000 cells in 15 ⁇ l) is covered with 100 ⁇ l of paraffin oil, then heated at 95 ° for 3 minutes.
  • the temperature is maintained on a plateau at 70 ° during the distribution of the different reagents: 3.75 ⁇ l of each 10 ⁇ M set, 5 ⁇ l of Taq 10X buffer (Tris Hcl 0.6 M, pH 8.4, S0 4 " (NH4) 2 0, 17 M, B 2 mercaptoethanol 0.1 M, BSA 1.7 mg / ml MgCl 2 1.5 mM), 5 .mu.l of mixture of the 4 nucleotides dTTP / dATP / dCTP / dGTP 1 mM solution (Pharmacia) and 2 units of Taq polymerase (Perkin Helmer) 35 amplification cycles are carried out: 93 ° C, 30 seconds; 52 ° C, 1 minute 20: 72 ° C, 1 minute 20 (25 cycles for primers pol region (polV2) - The reaction is carried out in a volume of 25 ⁇ l.
  • Taq 10X buffer Tris Hcl 0.6 M, pH 8.4, S0 4 "
  • the equivalent of 40,000 cells is added with 2.5 ⁇ l of each primer at 10 ⁇ M, 2.5 ⁇ of Taq 10 X buffer. (KCL 50 mM, MgC12 1.5 mM, Tris 10 mM pH 8.4, gelatin 1 mg / ml), 2.5 ⁇ l of the nucleotides at 2 mM, 1 IU of Taq polymerase. After denaturation at 92 ° C for 10 minutes , 35 amplification cycles are carried out: 93 ° C, 15 seconds: 55 ° C, 1 minute 15 seconds: 72 ° C, 1 minu te 15 seconds.
  • Region gag S 38-39 - The reaction is carried out with the SK38-39 primers under the same conditions of volume and concentration of the different reagents. After denaturation at 92 ° C for 10 minutes, 35 amplification cycles are carried out as follows: 93 ° C for 45 seconds, 55 ° C for 45 seconds, 70 ° C for 40 seconds.
  • Hybridization probes are obtained by PCR, from internal primers ( Figure 2C, Table 1), and incorporation of UTPs labeled with digoxigenin (Boehringer) (9).
  • the DNA materiel comes from the culture supernatant on BHK 21 cells of the recombinant virus WTG 1139, for the fragment amplified by HIVSET, and from pBTl for the fragments amplified by polV2 and by SK38-39.
  • Membrane hybridization The membranes are hybridized for 16 hours with the specific probes in 10 ml of hybridization buffer (SSC 5X, 0.5% blocking reagent, 0.1% sodium sarcosinate, 0.02% SDS) at 60 °. for HIVSET and polV2 (50 ° C for SK38-39), and 20 ng of probe denatured by boiling for 10 minutes are added. After hybridization, the filters are washed twice 5 minutes in SSC 2X-SDS 0.1%, then twice 15 minutes in SSC 0.1X -SDS 0.1% at 55 ° C for HP / SET and polV2 ( 37 ° C for SK38-39).
  • SSC 5X 0.5% blocking reagent
  • 0.1% sodium sarcosinate 0.02% SDS
  • the coloring of the membranes and the development are carried out as indicated by the manufacturer (Boehringer, ref 1093657).
  • the preparation of aliquoted reagents, the extraction of DNA from the samples, the PCR reaction itself, the analysis of the amplification products are carried out in 4 different premises, geographically distant with their own equipment.
  • the reference primer gives a signal equal to 4.
  • the results of the amplification are only affected when the mutation involves one of the last two nucleotides of the primer sequence at its 3 ′ end (FIG. 3). Thus, if the cytosine 3 ′ of the primer 1-F is replaced by a guanine or an adenine, the signal is equal to 1 or zero (substitution of a pyrimidine base by a purine base).
  • the signal is equal to 2 (substitution of a pyrimidine base with a pyrimidine base).
  • the signal is zero.
  • it is replaced by a guanine it is equal to 2
  • it is replaced by a cytosine it is equal to 3.
  • Any basic substitution concerning a nucleotide located upstream of the penultimate position leads to obtain a signal equal to 3 or 4.
  • Comparison of HIVSET and conventional primers in gp 120 The amplification of 17 strains of HIV by the “staircase primers” according to the present invention was compared with electrophoresis and in Southern blot.
  • a strain gives, with HIVSET, a very weak band for hybridization and of size greater than 437 bp.
  • a total of 72 strains 71 were amplified by S and polV2 and 72/72 by HIVSET.
  • the staircase primers used above have made it possible to constantly prime regions of HIV with up to 17% of point sequence divergences.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN dans lequel on utilise deux amorces respectivement amont et aval dont au moins une est une amorce dite 'en escalier' qui consiste en un mélange d'oligonucléotides, les oligonucléotides constituant le mélange étant en quantités équimolaires, de tailles différentes, de séquences complémentaires à la même région en amont ou en aval dudit fragment à amplifier et chaque oligonucléotide ayant, à partir de son extrémité 5', dans le sens 5'→3', la même séquence que les oligonucléotides plus petits du mélange. La présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic et un kit de diagnostic, notamment de maladies virales.

Description

Procédé d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN à i'aide d'amorces en escalier.
La présente invention concerne un procédé d'amplification enzymatique d'un fragment d'ADN in vitro.
La présente invention concerne également des procédés de diagnostic basés sur la détection d'ADN et dans lesquels on utilise des méthodes d'amplification d'ADN, en particulier la détection des séquences de virus tels que le virus de l'immunodéficience humaine VIH.
La présente invention concerne également des kits d'amplification d'ADN ou kits de diagnostic pour la mise en oeuvre des procédés selon l'invention. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte aux méthodes d'amplification enzymatique in vitro de séquences d'acide nucléique ADN monobrin ou double brin impliquant l'utilisation d'amorces, notamment la méthode dite "PC/T.
Les techniques d'amplification enzymatique d'ADN sont bien connues de l'homme de l'art. Les techniques d'amplification in vitro, notamment par PCR, ont été décrites dans la littérature et leur mise en oeuvre et perfectionnements ont fait l'objet de demandes de brevet. On peut citer en particulier les publications européennes EP 201 184 et
EP 200 362 sur la technique de base pour la méthode PCR. Les techniques d'amplification génique in vitro, notamment la méthode dite "PCR" (Polymerase Chain Reaction) (21 ), connaissent un développement rapide en microbiologie. En virologie, leur grande sensibilité en fait un outil de choix pour le diagnostic et les études épidémiologiques à côté des techniques d'isolement et de sérologie. Plus particulièrement, la présente invention concerne un perfectionnement de ces méthodes d'amplification, pour améliorer l'amorçage et permettant d'amplifier une séquence génomique comportant des mutations dans la région des amorces.
Dans ces méthodes d'amplification enzymatique d'ADN, l'amplification de la séquence s'effectue par cycles successifs. Un cycle comporte plusieurs étapes : une première étape de dénaturation thermique de l'ADN qui sépare, le cas échéant, l'ADN double brin en deux mono¬ brins, une seconde étape d'hybridation des amorces sur les séquences des mono-brins qui leur sont complémentaires, et une troisième étape d'élongation à partir des extrémités 3' des amorces à l'aide d'un ADN poly- mérase. On utilise des amorces oligonucléotidiques spécifiques qui vont s'hybrider sur des séquences qui leur sont complémentaires encadrant à ses extrémités 5'P le fragment d'ADN à amplifier. Les extrémités 3 'OH de ces amorces constituent le point de démarrage d'une élongation effectuée, dans le sens 5' — > 3', par les enzymes de réplication de l'ADN appelées "ADN polymérases" .
Pour une amplification, le milieu réactionnel contient donc l'ADN à amplifier, les amorces, l'ADN polymérase, ainsi que d'autres éléments tels qu'un tampon, des sels, des désoxynucléotides tri-phosphates. Chaque brin du fragment sert alors de matrice à l'enzyme qui synthétise les brins complémentaires ; le facteur de multiplication est alors de deux. Les oligonucleotides "amorces" (primer) sont à nouveau remis à hybrider avec les brins d'ADN provenant du premier "cycle d'amplification, chaque brin servant de matrice à l'ADN polymérase. Le facteur d'amplification sera alors de quatre - et ainsi de suite - avec doublement théorique des copies du fragment d'ADN à chaque cycle.
Dans certaines techniques d'amplification enzymatique d'ADN telles que la technique PCR, les produits issus de ce premier cycle, puis de chacun des cycles successifs, sont dénaturés par la chaleur. L'emploi d'une polymérase thermostable, la Taq polymérase, a permis de développer des cycleurs automatiques (hybridation/polymérisation enzymatique/ dénaturation thermique), rendant plus aisé l'emploi routinier de la méthode. Les conditions opératoires des différentes étapes se distinguent en effet essentiellement par la température à laquelle elles ont lieu, les conditions de dénaturation correspondent généralement à une élévation de la température du milieu réactionnel au-dessus de 90°C, l'hybridation a lieu généralement entre 50 et 70°C et l'élonga tion par l'ADN polymérase peut s'effectuer à des températures relativement élevées, de l'ordre de 70°C si l'on utilise une ADN polymérase stable à la chaleur. En revanche, dans d'autres techniques d'amplification enzymatique d'ADN, les produits issus du premier cycle, comme de chacun des cycles successifs, ne sont pas dénaturés. Il s'agit de méthode isotherme. Dans les méthodes amplification enzymatique d'ADN in vitro, les amorces sont toujours choisies, de préférence, dans les régions génomiques les plus conservées ( 18).
De nombreux problèmes doivent être résolus pour faire d'une méthode d'amplification enzymatique d'ADN in vitro, notamment de la PCR, un outil fiable de diagnostic, compte tenu de problèmes de contamination, reproductibilité et quantification ( 3, 6, 11, 16). Le risque d'une amplification et d'une détection faussement négative pour cause de mutation est également un inconvénient majeur de ces méthodes. Ce risque est plus important pour les virus à ARN que pour les virus à ADN.
En effet, les variations génomiques fréquentes, notamment chez les virus à ARN [virus de l'immunodéficience humaine (VIH), virus de l'hépatite C, picornavirus, etc.] peuvent entraîner l'absence d'amplification et entravent la mise au point de diagnostics fiables par ces méthodes (4). A cause de mutations dans le fragment d'ADN à amplifier, correspondant à la région complémentaire de l'extrémité 3' d'une amorce, le rendement de la méthode d'amplification par PCR peut se trouver altéré.
Plusieurs solutions ont été préconisées dans l'état de la technique pour résoudre ce problème. Selon une première approche, on a proposé d'utiliser plusieurs couples d'amorces, encadrant des régions différentes du génome, testés en parallèle sur le même échantillon. Ceci impose la multiplication des réactions d'amplification et la multiplication des sondes d'hybridation, ou encore la mise en oeuvre de PCR secondaires visant à améliorer l'amplification d'échantillons contenant une faible quantité d'ADN (nested-PCR). Il a été aussi proposé d'associer différents couples d'amorces, mais au sein de la même réaction ("multiplex") ( 5, 24). La sensibilité, dans ce dernier cas, peut encore être diminuée par compétition entre les diverses amplifications dans le même tube. Une autre approche a consisté à étudier des modifications de l'extrémité 3' de l'amorce. Certains auteurs préconisent en effet d'insérer une double désoxythymidine en 3', car quels que soient les nucléotides de la cible, ce type de non- appariement portant sur les deux bases de la terminaison 3', assure un bon rendement d'amorçage. Les amorces substituées avec une 3' inosine (amorces dégénérées) ont été également préconisées ( 16, 17). Le but de la présente invention est de fournir un procédé d'amplification enzymatique in vitro d'ADN comportant une méthode d'amorçage plus simple et surtout plus fiable permettant, au cours d'une seule réaction d'amplification, d'amplifier une région génomique donnée, que la région amorcée comporte ou non des variations nucléotidiques. Un autre but de la présente invention est que le procédé d'amplification aboutissant néanmoins à la synthèse d'une seule bande détectée sous la forme d'un signal unique à l'électrophorèse et en southern-blot nécessitant l'utilisation d'une seule sonde d'hybridation. La présente invention consiste à utiliser des amorces dites " en escalier" ("stair-primers"). Selon la présente invention, l'amorce classique est remplacée par un mélange ("set") d'oligonucléotides de longueur variable, l'extrémité 5' étant fixe, "de sorte que la longueur du fragment amplifiée est constante, et l'extrémité 3' de ces oligonucleotides se décalant l'une par rapport à l'autre, par exemple base par base, comme illustré à la Figure 1. S'il existe une mutation ponctuelle, voire une délétion ou une insertion, l'amorçage, impossible avec l'oligonucléotide dont l'extrémité 3' correspond à la mutation, délétion ou insertion, pourra être assuré par des oligonucleotides dont l'extrémité 3' se situe en amont et/ou en aval de cette mutation.
Il convient de relever que le problème d'amorçage ne se présente qu'au premier cycle de l'amplification, puisque la mutation est "corrigée" par la séquence de l'amorce. Dès le second cycle, pratiquement toutes les espèces moléculaires du mélange peuvent initier l'amplification. L'empilement des séquences des oligonucleotides constituant chacun des deux mélanges prenant l'allure de marches d'escalier a inspiré le nom de "amorces en escalier" ("stair-pήmers").
Selon l'invention, il est nécessaire, pour la meilleure efficacité des "amorces en escalier", notamment pour une bonne compatibilité des amorces au cycle suivant, que les séquences des oligonucleotides du mélange dérivent d'une même séquence et non pas d'un mélange de séquences différentes. Il est aussi nécessaire que les différentes molécules du mélange soient en quantité équimolaires. Il faut éviter qu'une espèce moléculaire du mélange, incapable d'amorcer l'amplification, mais plus abondante, ne bloque l'amplification par compétition. La présente invention a donc plus précisément pour objet un procédé d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN dans lequel on utilise deux amorces respectivement amont et aval dont au moins une est une amorce dite " en escalier" qui consiste en un mélange d'oligonucléotides, les oligonucleotides constituant le mélange étant en quantités équimolaires, de tailles différentes, de séquences complémentaires à la même région en amont ou en aval du dit fragment à amplifier et chaque oligonucleotide ayant, à partir de son extrémité 5', dans le sens 5'— >3', la même séquence que les oligonucleotides plus petits du mélange.
De préférence, on utilise deux amorces en escalier respectivement amont et aval qui consistent chacune en un mélange d'oligonucléotides, les oligonucleotides constituant chaque mélange amont ou aval étant en quantités équimolaires, de tailles différentes, de séquences complémentaires à la même région respectivement en amont ou en aval du dit fragment à amplifier et chaque oligonucleotide ayant, à partir de son extrémité 5', dans le sens 5'— >3 \ la même séquence que les oligonucleotides plus petits du même mélange.
Conformément à cette définition, les oligonucleotides de chaque mélange ont donc tous la même extrémité 5' et ne se distinguent qu'à l'extrémité 3'.
Il convient de remarquer que dans la présente description, on entend par "amorce" une quantité déterminée en oligonucleotide. C'est pourquoi on parle d'amorce en escalier, constituée par un mélange d'oligonucléotides", et non d'un "mélange d'amorces". Cette terminologie reflète le fait que la quantité globale des différents oligonucleotides compris dans chaque mélange est la même que la quantité d'oligonucléotides constituant une amorce classique unimoléculaire utilisée dans les méthodes d'amplification classique d'ADN in vitro connues. Pour le reste, le choix des séquences et la taille des oligonucleotides sont régies par les mêmes critères que pour les amorces uni-moléculaires classiques, c'est-à-dire des critères de complémentarité et de spécificité vis-à-vis de la séquence cible à amplifier. Selon l'invention, dans son principe, le nombre d'oligonucléotides dans chaque mélange, c'est-à-dire de façon imagée, le nombre de "marches d'escalier", n'est pas limitatif. Plus ce nombre est grand, plus la fiabilité du procédé sera grande. Si l'on considère qu'au-delà de deux bases à partir de l'extrémité 3', les mutations n'interviennent pas, ou de manière non significative, c'est- à-dire n'affectent pas l'efficacité d'amorçage et qu'en outre les mutations ne portent jamais sur plus de deux bases consécutives, cinq oligonucleotides pourront suffire dans chaque mélange-amorce. Si l'on augmente ces nombres de bases à trois, sept oligonucleotides pourront alors suffire.
En pratique, un mélange de cinq à quinze oligonucleotides convient, en particulier, lorsque la région "cible de l'amorce peut subir des mutations et/ou des délétions ou insertions de séquences sur un à cinq nucléotides et que la différence de taille entre chaque oligonucleotides et celui immédiatement plus grand et plus petit est de un ou deux nucléotide(s).
En pratique, une mutation étendue du génome à amplifier concernant simultanément plusieurs nucléotides en 3 ' des molécules composant le mélange est statistiquement très improbable. En particulier, on considère en pratique que les mutations ne portent jamais sur plus de trois bases consécutives. En outre, on considère qu'au-delà de trois bases de l'extrémité 3', les mutations n'interviennent plus dans le rendement de l'amplification. Dans un mode de réalisation de l'invention, la différence de taille entre chaque oligonucleotide et celui immédiatement plus grand ou plus petit, c'est-à-dire de façon imagée la "largeur des marches" n'est pas nécessairement de 1 nucléotide comme on l'a vu et peut être de 1 à 4 nucléotides, de préférence 1 à 3. En effet, il peut être avantageux, dans certains cas, d'avoir des marches de plusieurs nucléotides, par exemple de deux à quatre. L'augmentation de la largeur des marches peut permettre, dans certains cas, de diminuer le nombre d'oligonucléotides, c'est-à-dire le nombre de marches, et augmenter ce faisant la fiabilité du système sans avoir recours à un nombre excessif d'oligonucléotides, en particulier dans les cas où l'on sait que la région variable s'étend sur un assez large domaine, ou lorsque la variabilité est due à des mutations ponctuelles mais fréquentes. De même, la "largeur des marches" n'est pas nécessairement identique entre les différents oligonucleotides d'une même amorce escalier, c'est-à-dire d'un même mélange.
Lorsqu'on utilise deux amorces en escalier, le nombre de marches, c'est-à-dire le nombre d'oligonucléotides, n'est pas nécessairement identique dans le mélange d'amorce amont et le mélange d'amorce aval. Si l'on estime que la région aval ou amont de la cible est plus conservé, il est possible d'envisager un nombre réduit de marches d'oligonucléotides dans l'amorce aval ou amont respectivement, à condition que la quantité molaire globale d'oligonucléo-tides reste identique dans chaque mélange.
De même, la symétrie des deux mélanges n'est pas obligatoire en ce qui concerne la taille des différents nucléotides et la largeur des marches.
Toutefois, pour des raisons d'homogénéité quant à la stabilité et à la spécificité de l'hybridation, il peut être préférable d'utiliser des amorces amont et aval qui soient symétriques en termes de nombre d'oligonucléotides et de différence de taille entre eux, c'est-à-dire de largeur de marches. Donc, dans un mode de réalisation de la présente invention, le nombre et les tailles des oligonucleotides respectifs dans les amorces amont et aval sont identiques. Dans ce mode de réalisation particulier, les amorces amont et aval comportent des oligonucleotides de tailles identiques deux à deux. De préférence encore, dans une amorce en escalier selon l'invention ou dans chaque amorce, les différences de tailles entre chaque oligonucleotide, l'oligonucléotide immédiatement plus grand ou immédiatement plus petit, sont identiques
L'avantage principal du procédé selon l'invention est de réduire le risque d'amplification et de détection faussement négative, et même de l'éliminer complètement, si l'on s'adresse à une région du génome qui ne subit pas de modifications importantes du type délétion ou insertion supérieure à cinq nucléotides dans la région des amorces, en particulier, dans le cas le plus fréquent, où la région des amorces ne comporte que des mutations ponctuelles. De préférence, selon l'invention, les amorces en escalier sont en effet constituées d'oligonucléotides complémentaires aux régions les mieux conservées des génomes constituant le fragment, de préférence avec des régions qui ne subissent que des mutations ponctuelles. En outre les amorces en escalier selon l'invention permettent dans tous les cas de régulariser le rendement des amorces, ce qui est très important lorsqu'on met en oeuvre une méthode d'amplification quantitative.
Un autre avantage de la méthode selon l'invention est de renforcer la spécificité des amorces. En effet, dans la mesure où la quantité de chaque oligonucleotide par rapport à la quantité d'amorces unimoléculaires dans les méthodes classiques, est divisée par le nombre d'oligonucléotides dans le mélange, l'hybridation non spécifique diminue d'autant. Par ailleurs, les mélanges d'oligonucléotides selon l'invention sont amenés nécessairement à avoir des amorces comportant des oligonucleotides de taille plus grande. Cette dernière caractéristique renforce également la spécificité. Les amorces escalier selon l'invention constituent donc un moyen supplémentaire d'éviter les amorçages non spécifiques. Le fait que chaque espèce moléculaire représente seulement le énième (dans le cas où le mélange comporte n nucléotides) de la molarité nécessaire pour amplifier efficacement explique vraisemblablement le fait qu'on ne voit pas apparaître de bandes non spécifique due à la multiplicité des terminaisons 3' comme on pouvait le craindre. De préférence, la taille des oligonucleotides dans une amorce en escalier selon l'invention, est comprise de 15 à 40 nucléotides, en particulier de 20 à 30.
Comme on l'a vu, le procédé selon l'invention est applicable dans tout procédé impliquant l'utilisation des amorces d'amplification d'ADN, notamment les procédés de diagnostic impliquant la détection in vitro d'un fragment d'ADN dans lequel on utilise un procédé d'amplification enzymatique in vitro du dit fragment d'ADN selon l'invention.
Le procédé selon l'invention peut en particulier être adapté au diagnostic génétique. Pour les agents pathogènes, la possibilité de séquencer de nombreuses souches permet de choisir les régions conservées et minimise ainsi les inconvénients dûs aux variations génomiques. Cette possibilité est plus restreinte pour un génome humain et le procédé selon l'invention à l'aide d'amorces en escalier permet d'améliorer grandement la fiabilité du diagnostic par amplification d'ADN dans le domaine de la génétique humaine.
Le procédé selon l'invention peut permettre, à partir d'un gène connu dans une espèce déterminée de rechercher le même gène dans une espèce voisine. Le nombre d'oligonucléotides peut être augmenté et l'homologie avec les amorces des séquences recherchées peut être ainsi plus basse.
Les amorces en escalier selon l'invention sont en particulier applicables pour détecter des régions plus stables du VIH que celles exemplifiées ci-après et elles sont également appliquées pour le diagnostic de l'hépatite C, pour la mise au point d'amorces génériques pour certains entérovirus et pour le diagnostic des virus de l'herpès.
Le procédé selon la présente invention, de par sa simplicité, rend des services en améliorant la fiabilité du diagnostic par amplification d'ADN, notamment du type PCR, en particulier pour le VIH.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière d'un mode détaillé de réalisation qui va suivre et des figures 1 à 5. La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte des amorces d'amplifications enzymatiques in vitro d'un fragment d'ADN à détecter, les dites amorces consistant en des amorces en escalier telles que définies ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'invention.
La Figure 1 représente le principe des "amorces en escalier". A : Exemple d'" amorces en escalier". L'amorce classique est remplacée par un mélange de 11 oligonucleotides de 20 à 30 bases (A à K), possédant une extrémité 5' identique et une extrémité 3' se déplaçant base par base. B : Amorçage de l'ADN par les amorces en escalier en cas de mutation ponctuelle de la séquence à amplifier : le carré noir figure le nucléotide muté présent dans la séquence cible de l'amorce. L'oligonucléotide D, incapable de s'apparier en 3', est suppléé par les oligonucleotides dont l'extrémité 3' se situe en amont ou en aval du nucléotide muté (amorces A, B, C, E..). La Figure 2 représente la position de la région du génome du VIH amplifiée par HIVSET, et séquences des amorces.
A : Situation de la région amplifiée de la gp 120. Le symbole (Q) représente la position des amorces encadrant les séquences V3. B : Séquences des oligonucleotides composant HIVSET1 et HIVSET2.
C : Amorces internes pour la sonde. Ces amorces aboutissent à la synthèse d'une sonde de 368 pb. En 5', un site de restriction Hind III a été rajouté pour permettre le clonage du fragment.
La Figure 3 représente les résultats des amorces mutées. A : Séquence des amorces utilisées.
B : Gel d'électrophorèse après amplification par des amorces mutées.
Marqueur de taille des fragments d'ADN (Boehringer DNA molecular- weight marker VI - Cat. N° 1062590). Amplification après 25 cycles (10μ de dépôt) de l'ADN extrait des cellules 8E5 contenant 1 copie de génome de VIH par cellule, par les différentes amorces. L'amorce 1-F est l'amorce sauvage. Les amorces Mutl-a/b/c à Mut5-a/b/c sont les amorces mutées de la position 1 à la position 5 à partir de leur extrémité 3' (a, b, c = substitution par les 3 autres nucléotides).
C : Hybridation avec la sonde marquée à la digUTP. La Figure 4 représente des exemples d'amplifications des souches de VIH par HIVSET, polV2, et SK38-39.
Amplifications avec A) HIVSET, B) polV2, C) SK38-39 respectivement (a: gel, b: hybridation avec les sondes respectives marquées à la digUTP).
En 1 Marqueur de taille des fragments d'ADN, de 2 à 8 Amplifications de 7 souches de patients avec une sérologie positive pour le VIH. La souche en
2 est celle qui n'est pas amplifiée par polV2.
La Figure 5 représente des résultats de l'alignement par le programme Blastn.
A : Référence des séquences dans la banque Embl. B : Représentation schématique des homologies de bases entre l'amorce 1-
A et la région génomique homologue.
Les 32 séquences représentent l'ensemble des mutations observées parmi
210 séquences. Les mutations sont symbolisées par l'absence du trait vertical correspondant à la position de la base mutée. Quel que soit le génome, plus de la moitié des espèces moléculaires du mélange sont théoriquement capables d'amorcer l'amplification au premier cycle.
C : Séquence génomique homologue de l'amorce 1-A. 11
On a appliqué le procédé selon l'invention à la détection du VIH, dont la variabilité génomique a été largement étudiée (Revues 15, 23). Chaque isolât peut être considéré comme une population de génomes uniques très proches (quasi-espèces) ( 19). Des amorces selon l'invention, ("stair-primers") ont été volontairement sélectionnées dans les séquences génomiques du VIH les plus variables, celles codant pour la glycoprotéine gp 120, dans les régions encadrant la boucle V3. On les a testées sur des souches isolées de patients séropositifs ainsi que sur des lymphocytes de malades, et comparé les résultats à ceux obtenus avec des amorces classiques sélectionnées dans les régions les plus stables du génome (gènes pol et gag).
1) Matériel et méthodes :
L'amplification a porté sur un fragment de 437 pb (nucléotides 6925 à 7361 de la souche HXB2, Embl Accession n° K03455), dans la région codant pour la glycoprotéine gp 120. Ce fragment est centré par les séquences de la boucle V3.
1.1 ) Amorces "mutées" : on a d'abord étudié l'influence, sur le rendement de l'amplification, de mutations génomiques de l'extrémité 3' des amorces choisies, dans les conditions de la réaction. Les amplifications, du même ADN proviral du VIH, ont été faites avec des amorces dérivées de l'amorce 1-F (Figure 2), comportant des mutations ponctuelles des cinq nucléotides de l'extrémité 3*. Une série de 16 amorces de 25 nucléotides a été synthétisée (Laboratoire de Biochimie de la Faculté de Médecine de Rennes- Pr. Legall). Chacun des 5 nucléotides à muter a été remplacé par les 3 autres nucléotides (Voir Résultats, Figure 3).
L'ADN amplifié est celui de la gp 160 de la souche de VIH Bru (virus recombinant WTG 1139). Seule l'amorce d'amont est mutée, l'amorce d'aval est inchangée. Les étapes de l'amplification sont celles décrites plus bas.
1.2) Choix des oligonucleotides composant les amorces en escalier: L'amorce classique est remplacée par un mélange d'oligonucléotides de longueur variable, l'extrémité 5' étant fixe (longueur du fragment amplifié constante), l'extrémité 3' se décalant base par base (figure 1). On a réalisé pour chaque amorce un mélange de 11 oligonucleotides de 20 à 30 bases, 1-A à 1-K pour l'amorce en amont HIVSETl, et 2-A à 2-K pour l'amorce en aval HrVSET2 (Figure 2). Chaque amorce ou mélange est utilisé à la molarité de 1 μM, chaque oligonucleotide intervenant pour 1/11 dans la molarité finale (mélange en quantité égale d'une suspension 1 μM de chacune des 11 oligonucleotides). 1.3) Amorces classiques :
Les amorces polV2 encadrant une région de 261 pb dans le gène pol ont été sélectionnées par le logiciel PCrare (Eurogentec Bruxelles) ( 10). Les amorces SK38-39 encadrant une région de 1 15 pb dans le gène gag ont été décrites par C.Y. Ou et coll (20) (Tableau 1). Ces amorces sont utilisées en pratique courante.
Les séquences SK38-39, S 40-41 et de p~blV2 A à D sont décrites dans Genbank n° KO2007; les positions sur le génome sont décrites dans le Tableau 1.
AMORCES DANS POL
AMORCES EXTERNES polV2-A 5' CACCTTTGCCTAGTGTTACG 3' (5569 à 5588) polV2-B 5' CGCCTATTCTGCTATGTCGA 3' (5829 à 5810)
Fragment de 261 pb
AMORCES INTERNES polV2-C 5' TTCAATGGAACAGGA 3' polv2-D 5' TTGTATTGTTGTTGG.3'
Fragment de 221 pb
AMORCES DANS GAG
AMORCES EXTERNES £
SK38 5'ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT 3' (1551 à 1578)
SK39 5TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC 3' (1665 à 1638)
Fragment de 1 15 pb
AMORCES INTERNES
SK40 5' TTATAAAAGATGGAT 3' '
SK41 5' TGGTAGGGCTATACA3'
Fragment de 59 pb
Séquences GenBank Accession number 02007
TABLEAU 1
1.4) Comparaison des séquences amorces HIVSET à celles d'une banque génomique :
Pour étudier la position des mutations rencontrées dans les régions des amorces HIVSET, on a recherché par le programme Blastn ( 1) (Serveur Blast@crihan.fr) l'homologie entre les oligonucleotides HIVSET et les séquences de VIH référencées à ce jour dans la banque Embl (dernière version).
1.5) Echantillons biologiques :
. Souches isolées de malades. Les souches proviennent de la co- culture de lymphocytes de 72 patients, avec une sérologie VIH positive, vus au CHR de Rennes. La culture virale est réalisée à partir de la fraction lymphocytaire du sang total, séparée en gradient de Ficoll. Les lymphocytes sont repris en milieu RPMI additionné de sérum foetal de bovidé et d'interleu kine-2, et cultivés en présence de lymphocytes de sujets séronégatifs (2X106 cellules/ml) stimulés à la phytohémagglutinine (7). Au bout de 21 jours, après détection de l'antigène p24 (Laboratoires Abbott), la suspension cellulaire est recueillie et stockée à -80° sous forme d'aliquots de 1 ml contenant environ 3X106 de cellules.
. Le génome du VIH a été recherché directement (avant coculture) dans l'ADN des lymphocytes de 29 de ces patients.
. Les témoins négatifs sont des lymphocytes de donneurs de sang séronégatifs pour le VIH.
. ADN proviral de référence. L'ADN de la souche BRU a été utilisé comme cible de référence. Cet ADN provient de 3 sources : a) Cellules 8E5 ( 1 copie de provirus intégré par cellules) (8). Ces cellules sont entretenues en milieu RPMI additionné de sérum foetal de bovidé, b) ADN de la gp 160 provenant du surnageant de culture sur cellules BH 21 du virus recombinant de la Vaccine WTG 1 139 (Laboratoire Transgène S.A.¬ Strasbourg-France-), c) Plasmide pBTl (souche BRU) fourni gracieusement par le Pr. Montagnier (Institut Pasteur Paris).
1.6) Extraction de l'ADN proviral des lymphocytes : Elle est réalisée sur 50 μl de la suspension cellulaire, soit environ 150 000 cellules. La déprotéinisation est faite sous un volume de 500 μl en tampon de lyse (Tris 0.1M - EDTA 0.01M - SDS 0,5 %) contenant 200 μg/ml de protéinase (BOEHRINGER)( l heure à 37°). Deux extractions par le phénol-chloroforme sont suivies d'une précipitation en alcool absolu en présence d'acétate de Na (0,3 M final). Les acides nucléiques sont repris dans 70 μl d'eau stérile et stockés à -80°. Les extractions sont faites par groupe de 18 ( 17 cocultures de lymphocytes - souches - ou culots de lymphocytes de patients séropositifs, et 1 culot de lymphocytes de donneur de sang séronégatif). 1.7) PCR : Région V3 (HIVSET) : La réaction est faite sous volume de 50 μl. L'échantillon à amplifier (l'équivalent de 40 000 cellules dans 15 μl) est recouvert de 100 μl d'huile de paraffine, puis chauffé à 95° pendant 3 minutes. La température est maintenue en plateau à 70° pendant la distribution des différents réactifs : 3,75 μl de chaque set 10 μM, 5 μl de tampon Taq 10X (Tris Hcl0,6 M, pH 8,4, S04 "(NH4)2 0, 17 M, B2 mercapto- éthanol 0,1 M, BSA 1,7 mg/ml, MgCl2 1,5 mM), 5 μl de mélange des 4 nucléotides dTTP/dATP/dCTP/dGTP en solution 1 mM (Pharmacia) et 2 unités de Taq polymérase (Perkin Helmer). On réalise 35 cycles d'amplification : 93°C, 30 secondes ; 52°C, 1 minute 20 : 72°C, 1 minute 20 (25 cycles pour les amorces mutées). . Région pol (polV2) - La réaction est faite sous volume de 25 μl. L'équivalent de 40 000 cellules est additionné de 2,5 μl de chaque amorce à 10 μM, 2,5 μ de tampon Taq 10 X (KCL 50 mM, MgC12 1,5 mM, Tris 10 mM pH 8,4, gélatine 1 mg/ml), 2,5 μl des nucléotides à 2mM, 1 UI de Taq polymérase. Après dénaturation à 92°C pendant 10 minutes, on réalise 35 cycles d'amplification : 93°C, 15 secondes : 55°C, 1 minute 15 secondes : 72°C, 1 minute 15 secondes.
. Région gag S 38-39 - La réaction est faite avec les primers SK38-39 dans les mêmes conditions de volume et de concentration des différents réactifs. Après dénaturation à 92°C pendant 10 minutes, on réalise 35 cycles d'amplification comme suit : 93°C pendant 45 secondes, 55°C pendant 45 secondes, 70°C pendant 40 secondes.
- Analyse des produits d'amplification :
. Gel : L'analyse est faite par électrophorèse de 10 μl des produits amplifiés, et, pour les amorces mutées : produits amplifiés et dilutions de 10'1 à ÎO4. On utilise un gel d'agarose à 2 % contenant 0,5 μg/ml de bromure d'éthidium, en tampon Tris - Acétate (Tris 0.04M - EDTA 0,001 M - pH 7,7 ajusté par l'acide acétique glacial). Après dénaturation du gel (NaOH 0,5 M - NaCI 1,5M) neutralisation (Tris 0.5M - NaCI 0.5M), l'ADN amplifié est transféré sous vide sur filtre de nylon (Hybond0). La membrane est lavée dans du SSC 2X puis séchée à l'air et fixée 40 secondes par exposition aux UV. . Sondes d'hvbridation : Les sondes d'hybridation sont obtenues par PCR, à partir des amorces internes (Figure 2C, Tableau 1), et incorporation d'UTPs marqués à la digoxigénine (Boehringer)(9). L'ADN matritiel provient du surnageant de culture sur cellules BHK 21 du virus recombinant WTG 1139, pour le fragment amplifié par HIVSET, et de pBTl pour les fragments amplifiés par polV2 et par SK38-39.
. Hybridation des membranes : Les membranes sont hybridées 16 heures avec les sondes spécifiques dans 10 ml de tampon d'hybridation (SSC 5X, réactif bloquant 0,5 %, sarcosinate de sodium 0,1 %, SDS 0,02 %) à 60° pour HIVSET et polV2 (50°C pour SK38-39), et 20 ng de sonde dénaturée par ébullition pendant 10 minutes sont ajoutés. Après hybridation, les filtres sont lavés 2 fois 5 minutes dans du SSC 2X-SDS 0,1 %, puis deux fois 15 minutes dans du SSC 0,1X -SDS 0,1 % à 55°C pour HP/SET et polV2 (37°C pour SK38-39). La coloration des membranes et la révélation sont réalisées comme indiqué par le fabriquant (Boehringer, réf 1093657). Pour éviter toute contamination, la préparation des réactifs aliquotés, l'extraction de l'ADN des échantillons, la réaction de PCR à proprement parler, l'analyse des produits d'amplification, sont réalisées dans 4 locaux différents, géographiquement distants possédant leur propre matériel.
2) Résultats
2.1) Amplification par les amorces mutées : L'intensité du signal obtenu au Southern-blot est graduée de 0 à 5 ( 0 = absence de bande, 5 ≈ bande à la dilution 10-4 du produit d'amplification). L'amorce de référence donne un signal égal à 4. Les résultats de l'amplification ne sont affectés que lorsque la mutation intéresse l'un des deux derniers nucléotides de la séquence de l'amorce à son extrémité 3'(figure 3). Ainsi, si la cytosine en 3' de l'amorce 1-F est remplacée par une guanine ou une adénine, le signal est égal à 1 ou nul (substitution d'une base pyrimidique par une base purique). Si elle est remplacée par une thymidine, le signal est égal à 2 (substitution d'une base pyrimidique par une base pyrimidique). Lorsque la thymidine de l'avant dernière position de la séquence est remplacée par une adénine, le signal est nul. Lorsqu'elle est remplacée par une guanine, il est égal à 2, lorsqu'elle est remplacée par une cytosine, il est égal à 3. Toute substitution de base concernant un nucléotide situé en amont de l'avant dernière position conduit à obtenir un signal égal à 3 ou 4. 2.2) Comparaison HIVSET et amorces classiques dans la gp 120 : On a comparé à l'électrophorèse et en Southern Blot, l'amplification de 17 souches de VIH par les "amorces en escalier" selon la présente invention à celles réalisées avec des couples simples d'amorces, constitués des amorces standards (uni-moléculaires) de 25 nucléotides ( 1-F et 2-F), et de 20 nucléotides ( 1K et 2K)(figure 2). Les résultats sont rapportés sur le tableau 2 : 17 souches/ 17 sont amplifiées par HIVSET contre 15/17 par les amorces de 25 nucléotides et 12/17 par celles de 20 nucléotides. Le génome du VIH a été recherché dans lymphocytes de 10 de ces 17 patients. Il est retrouvé 10 fois / 10 par HP SET contre 9 fois / 10 et 4 fois / 10 par les amorces de 25 et 20 nucléotides respectivement. 2.3 ) Comparaison de HIVSET aux amorces des régions conservées polV2 et SK38-3 : Sur ces 17 souches, les résultats sont de 17 amplifications / 17 pour polV2, et de 16 / 17 pour SK38-39. Le génome du VIH a été mis en évidence 10 fois dans les lymphocytes de 10 de ces malades par SK38-39 et par polV2 (Tableau 2 ci-après). 55 autres souches virales provenant de 55 malades différents (Figure 4) ont été amplifiées par les amorces HIVSET et par les amorces polV2 et SK38-39 : 55 souches / 55 ont été amplifiées par HIVSET et SK38-39, et 54 : 55 par polV2. Il faut noter qu'une souche donne avec HIVSET une bande très faible à l'hybridation et de taille supérieure à 437 pb. On a pu amplifier les séquences du VIH, par les 3 systèmes, à partir des lymphocytes de 12 malades / 12 étudiés dans ce groupe. Au total sur 72 souches 71 ont été amplifiées par S et polV2 et 72 / 72 par HIVSET.
Tous les discordants ont été vérifiés 2 fois (Réextraction de l'ADN). Les témoins négatifs des diverses séries d'extraction et d'amplification sont toujours restés négatifs. Titre : Amplification par HIVSET et par les amorces classiques.
AMPLIFICAT ON
S0UCHES{ après coculture) LYMPHOCYTES
AMORCES 1 F-2F 1 K-2K HIVSET polV2 S 3Θ-3Θ 1 F-2F 1 K-2K HIVSET polV2 SK38-39
M1 (KER) 0(a) + + + + + 0 + + +
M2 (ABH) + + + + + + + + + +
M3 (MOU) + + + + + + + + + +
M4 (JOU) + O + + + + O + + +
M5 (SAL) + + + + + + + + + +
M6 (KLE) + + + + + + O + + +
M7 (FOU) 0 (b) O + + + O 0 + + +
M8 (CHO) + + + + 4- + + + + +
M9 (MIN) + O + + + + O + + +
M10(PAR) + O + + + + O + + +
Ml 1 (TER) + + + + +
M12(BEL) + + + + +
M13(DUO) + + + + O
M14{BRI) O O + + + 1
M1 5(REM) + + + + +
M1 6(RIC) + + + + +
M1 7(LOU) + + + + +
(a) : Positivité après hybridation
(b) : Négativité après hybridation
TABLEAU 2
2.4) Comparaison des séquences amorces HIVSET à celles de la banque génomique : 210 séquences de VIH référencées dans la banque Embl ont été comparées aux séquences des amorces par le programme Blastn. On constate qu'il existe de 83 à 100 % d'homologie entre régions correspondantes. La projection de l'amorce 1-A sur la région génomique homologue a permis de retenir 33 variants différents représentant l'ensemble des mutations rencontrées dans cette portion de génome. L'analyse graphique (figure 5) de la position de ces mutations fait ressortir que les variations ne portent jamais sur plus de 3 bases consécutives, les mutations les plus fréquentes sont ponctuelles. Une séquence de 30 bases ne contient jamais plus de 3 mutations. Etant donné qu'une mutation portant sur une base n'affecte le rendement de l'amplification que si elle se situe à moins de 3 bases de l'extrémité 3* de l'amorce, on peut conclure que, quel que soit le génome viral, plus de la moitié des espèces moléculaires du mélange seront capables d'amorcer l'amplification.
La même analyse réalisée pour l'amorce 2-A aboutit aux mêmes constatations (83 à 100 % d'homologie, résultats non montrés).
Les amorces en escalier utilisées ci-dessus ont permis d'amorcer de façon constante des régions du VIH comportant jusqu'à 17 % de divergences ponctuelles de séquences.
Dans des conditions d'amorçage peu stringentes, la comparaison des "amorces escalier" à des amorces uni-moléculaires de la même région ( 1 K, 2 ), (résultats non montrés) a permis de constater la quasi-absence d'amorçage non spécifique avec les "amorces en escalier". La crainte était de voir apparaître de nombreuses bandes non spécifiques dues à la multiplicité des terminaisons 3'. Chaque espèce moléculaire représente seulement le l lème de la molarité nécessaire pour amplifier efficacement, ce fait explique vraisemblablement ce constat. Les amorces en escalier peuvent donc être utilisées comme moyen supplémentaire pour éviter les amorçages non spécifiques. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN dans lequel on utilise deux amorces respectivement amont et aval dont au moins une est une amorce dite " en escalier" qui consiste en un mélange d'oligonucléotides, les oligonucleotides constituant le mélange étant en quantités équimolaires, de tailles différentes, de séquences complémentaires à la même région en amont ou en aval du dit fragment à amplifier et chaque oligonucleotide ayant, à partir de son extrémité 5', dans le sens 5'— >3\ la même séquence que les oligonucleotides plus petits du mélange.
2. Procédé d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN selon la revendication 1, dans lequel on utilise deux amorces en escalier respectivement amont et aval, qui consistent chacune en un mélange d'oligonucléotides, les oligonucleotides constituant chaque mélange amont ou aval étant en quantités équimolaires, de tailles différentes, de séquences complémentaires à la même région respectivement en amont ou en aval du dit fragment à amplifier et chaque oligonucleotide ayant, à partir de son extrémité 5', dans le sens 5'— >3', la même séquence que les oligonucleotides plus petits du même mélange.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que une amorce en escalier comporte de 5 à 20 oligonucleotides.
4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que la différence de taille entre chaque oligonucleotide et celui immédiatement plus petit ou plus grand d'une même amorce est de 1 à 4 nucléotides.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise deux amorces en escalier respectivement amont et aval, dans lesquelles le nombre et les tailles des oligonucleotides respectifs des amorces amont et aval sont identiques.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, dans l'amorce en escalier, les différences de tailles entre chaque oligonucleotide et l'oligonucléotide immédiatement plus grand ou plus petit sont identiques.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la taille des oligonucleotides dans une amorce en escalier est de 15 à 40, de préférence 20 à 30 nucléotides.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la ou les amorce(s) est(sont) constituée(s) d'oligonucléotides complémentaires aux régions les mieux conservées de génomes constituant le fragment à amplifier, de préférence des régions qui ne subissent que des mutations ponctuelles.
9. Procédé de diagnostic impliquant la détection in vitro d'un fragment d'ADN dans lequel on utilise un procédé d'amplification enzymatique in vitro du dit fragment d'ADN à détecter selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Procédé de diagnostic de maladies virales impliquant la détection d'un virus tel que le virus de l'hépatite C, le virus du SIDA, les virus d'herpès, les virus entériques selon la revendication 9.
11. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comporte des amorces d'amplification enzymatique in vitro d'un fragment d'ADN à détecter consistant en des amorces en escalier telles que définies pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'une des revendications 1 à 8.
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