WO1995018379A1

WO1995018379A1 - Methode d'analyse d'un complexe forme entre la secretine et un ligand de celle-ci et utilisation dudit complexe

Info

Publication number: WO1995018379A1
Application number: PCT/JP1994/002203
Authority: WO
Inventors: Reiji Kannagi; Naofumi Takahashi; Miki Kitade; Naoko Hashimoto; Hitomi Mimuro
Original assignee: The Nisshin Oil Mills, Ltd.
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1995-07-06
Also published as: AU1280695A

Description

明細書セレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法及びその用途技術分野

この発明は、セレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法及び癌転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断用キットに関する。より詳細には、この発明は、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とを用いる免疫学的反応によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の定性的及びノ又は定量的測定法、及びセレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とのセットからなる癌転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断用キットに関する。背景技術

セレクチンとは、細胞間接着分子フアミリーの 1 つであり、現在 Lーセレクチン、 P —セレクチン及び E —セレクチンの 3 つの分子が発見されている。これらの分子はいずれも、 N末端を細胞外に、 C末端を細胞内にもつ I型細胞膜糖夕ンパク質で、その N末端から細胞膜に向かって、レクチンドメイン、 E G F ドメイン、及び補体結合夕ンパク質にみられる配列を繰り返しもつ補体結合ドメインと呼ばれる 3つのドメインをもつことが遺伝子クローニングの結果明らかになつている。

各セレクチンの機能としては、次のようなことが明らかになっている。 Lーセレクチンは、白血球に発現され、リンパ球が特定の場所に移動する現象、特に血管系から末梢リンパ節へ移行する現象（リンパ球ホーミング）をつかさどる分子であり、より広く白血球が血管内皮細胞と接着を行うとき、特に白血球ローリングと呼ばれる特殊な相互作用を行う。 E —セレクチンは、活性化血管内皮細胞に発現され、好中球、単球、メモリー T細胞、好酸球及び好塩基球の血管内皮細胞への結合に関与する。 P—セレクチンは、活性化血小板及び活性化血管内皮細胞に発現され、血小板と好中球あるいは単球との結合及び好中球の活性化血管内皮細胞への結合に関与する。

セレクチンの発現に関しては、 Lーセレクチンは、ほとんど全ての白血球に刺激なしに発現され、 E—セレクチン及び P— セレクチンは、 I L一 1 ゃ T N F αのような炎症性サイト力インによってその発現が誘導されることが明らかになつている。また、 Ρ—セレクチンはヒスタミンやトロンビンによっても発現される。

炎症の発症メカニズムの 1つとして、白血球が血管内皮細胞と接着して組織内へ浸潤することによって、炎症がおこると考えられている。そこで、血清中の可溶性セレクチン（血管内皮細胞、血小板又は白血球から遊離したセレクチンのことを意味する）は、炎症の程度を診断するのに用いられている。特に限定されるものではないが、 E—セレクチンは血管内皮細胞に特異性が高いため、血管関連疾患の診断にも用いられている。 —方、 2— 3 シァリル L e ^x 及び 2— 3 シァリル L e * は、糖鎖構造を有する分子で古くから腫瘍マーカーとして利用されており、血清中の 2— 3 シァリル L e ^x や 2— 3 シァリル L e 4 のような癌細胞が発現する抗原は、癌の診断に用いられている。

炎症及び血管関連疾患の診断に用いられているヒト血清中の可溶性 E—セレクチンを測定する方法は、例えばニューマンら〔ニューマン，ダブリュ. （Newman, W.) ら， J. Immunol., 15 0 ： 644-654 (1993)〕及びカーソンら〔カーソン，シー. （Car son, C.W. ) ら， J. Rheumatol. , 20: 809-814 (1993) 〕によつて報告されており、ヒト血清中の可溶性 Lーセレクチンを測定する方法は、例えばシュライフェンバラムら〔シュライフェンバラム，ビー. （Schleifienbarum, Β. )ら， J. Cell Biol. , 11 9: 229-238 (1992) 〕によって報告されており、ヒト血清中の可溶性 Ρ—セレクチンを測定する方法は、例えば片山ら〔片山 ( atayama, M. ) J, Immunol. Methods, 153： 41-48 (1992 ) 〕によって報告されている。その詳細な方法は、それぞれの可溶性セレクチン抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を固相化したビーズ又は 96穴プレートのゥ Xルにそれぞれの可溶性セレクチン抗原を含む血清あるいは標準物質を添加して反応させた後洗浄し、次いでべルォキシダーゼゃアルカリフォスファターゼ等の酵素あるいは 1²⁵ I等の放射性同位元素でラベル化した可溶性セレクチン抗原を特異的に認識する標識モノクローナル抗体（固相化された抗体とは別の抗原部位を認識する抗体）を添加して反応させた後洗浄し、その後、酵素に特異的な基質を加えて発色させて吸光度を測定するか、又は直接放射能のレベルを測定することによって、それぞれのセレクチン抗原量として表す方法である。また、癌の診断に用いられている 2— 3シァリル L e ^x を測定する方法は、例えばチアら〔チア，ディー. （Chia.D.) ら， Cancer Res., 45: 435-437 (1985) 〕及び神奈木ら〔神奈木 ( annagi, R. ) ら. Cancer Res. , 46： 2619-2626 (1986) 〕によつて報告されており、 2→ 3 シァリル L e * を測定する方法は、例えばコプロウスキーら〔コプロウスキー，ェイチ. （Kop rowski.H.)ら， Science (Wash. DC), 212: 53-55 (1981)〕及びチアら〔Chia,D.， et al.. Cancer Res.. 45： 435-437 (1985 ) 〕によって報告されている。即ち、チアら及び神奈木らによって報告された 2— 3シァリル L e ^x を測定する方法は、 2 → 3シァリル L e ^x 抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を固相化したビーズ又は 96穴ブレートのゥエルに 2→ 3 シァリル L e ^x 抗原を含む血清あるいは標準物質を添加して反応させた後洗浄し、次いでペルォキシダーゼ又はアル力リフォスファターゼ等の酵素あるいは^{1 2 5} I等の放射性同位元素でラベル化した 2■* 3 シァリル L e ^x 抗原を特異的に認識する標識モノクローナル抗体を添加して反応させた後洗浄し、その後、酵素に特異的な基質を加えて発色させて吸光度を測定するか、又は直接放射能のレベルを測定することによって、 2→ 3 シァリル L e ^x 抗原量として表す方法である。コプロウスキーら及びチアらによって報告された 2→ 3 シァリル L e ^a を測定する方法は、 2→ 3 シァリル L e ^x 抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体及び標識モノクローナル抗体の代わりに 2— 3 シァリル L e ⁴ 抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体及び標識モノクローナル抗体を用いることを除いて、チアら及び神奈木らによって報告された 2→ 3 シァリル L e ^x を測定する方法と同様である。

従来から、血管内皮細胞の発現する細胞接着分子の多くは、炎症及び免疫との関連で研究されており、近年 E —セレクチンに対応する白血球側のリガンドが 2→ 3 シァリル L e ^x であることが同定されている。

また近年、古くから腫瘍マーカーとして利用されている 2→ 3 シァリル L e ^x 及び 2— 3 シァリル L e * 力く、セレクチンファミリーのリガンドであることが報告されている〔Biochem. Biophys. Comm. 184： 1048-1055 (1992); J. Cell Biol. 11 7： 895-902 (1992)； Cell. 63： 475-484 (1990); Science. 25 0: 1130-1132 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88： 103 75-10376 (1991); Science. 250: 1132-1135 (1990) ) 。

セレクチンフアミリーの各分子は、 2— 3 シァリル L e ^x 及び 2→ 3 シァリル L e ^β の糖鎖を特異的に認識することによりこれらと結合し、各セレクチンを発現する血管内皮細胞、血小板及び白血球と、 2— 3 シァリル L e ^x 又は 2→ 3 シァリル L e ⁴ を発現する白血球細胞や癌細胞との接着に関与することが明らかになってきた。

癌転移は、 ①原発巣で増殖した癌細胞の雜脱と血管内への遊離、 ②癌細胞の血管内での移動、 ③癌細胞の末梢血管内皮への接着、 ④癌細胞の基底膜及び結合組織内への浸潤による転移巣の成立、という 4つの段階を経て成立すると考えられている。このように、癌細胞の血管内皮細胞への接着は、癌の血行性転移の 1つのステップであると考えられており、最近、セレクチンファミリ一の細胞接着分子と癌細胞が発現する 2→ 3 シァリル L e ^x 及び 2— 3 シァリル L e ' のような糖鎖を介した接着、このステップで重要な役割を果たすことが明らかになってきた。そこで、癌転移におけるセレクチンの密接な関与が指摘されている。癌は、細胞の一部が異常増殖を始める疾患で、周りの正常組織を浸潤して増殖を続け、正常な機能を破壊する。更に、癌钿胞は、転移する能力を有しており、癌が悪性腫瘍ともいわれる理由の 1つとなっている。癌細胞の転移する能力は、生じた癌によって様々であり、転移能力の強い癌細胞もあれば、あまり転移する能力を有さない癌細胞もある。従って、血清中の各腫瘍マーカーを測定するだけでは、癌の進行状態を知ることはできても、癌の転移の可能性を予測することは困難である。そこで、癌転移の可能性を予測することができる診断方法が望まれている。

また、炎症性疾患や血管関連疾患についても、より正確に診断することができる診断方法が望まれている。特に、従来から血管内皮の状態を診断する方法は乏しく、血管内皮の変化，障害の正確な診断方法が望まれている。発明の開示

本発明者らは、より正確な癌転移の診断方法及び炎症性疾患や血管関連疾患の診断方法について鋭意研究を重ねた結果、血管内皮細胞、血小板及び白血球が強く活性化されると、血管内皮細胞、血小板及び白血球に発現されたセレクチンが遊離し、癌細胞及び白血球からも、癌細胞及び白血球に発現された 2→ 3 シァリル L e ^x 又は 2→ 3 シァリル L e * のようなセレクチンのリガンドが遊雜して、遊離したセレクチンとそのリガンドは血中で複合体を形成し、この形成された複合体を測定することによって、セレクチンや 2→ 3 シァリル L e ^x 又は 2— 3 シァリル L e * のようなセレクチンのリガンド単独を測定するよりも正確に癌転移、炎症性疾患又は血管閟連疾患を診断することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

この発明によれば、生体試料に、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とを接触させ、その生成物から、前記複合体と、該複合体のセレクチン部分を認識する抗体及びリガンド部分を認識する抗体との結合を測定することからなるセレクチンとそのリガンドとの複合体の定性的及び Z又は定量的測定法が提供される。

また、この発明によれば、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とのセットからなる瘙転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断用キットが提供される。

この発明において用いられる生体試料としては、生体内から得られる全体液成分を適用することができ、例えば血清、血漿、リンパ液、尿、滑液、鼻汁、髄液等が挙げられる。この発明においては、生体試料として、血清及び血漿を用いるのが好ましい。この発明におけるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法は、血管内皮細胞、血小板及び白血球等が発現する全セレクチン分子種と、癌細胞及び白血球等が発現する全セレクチンのリガンド分子種とから形成される全種類の複合体の測定に適用することができる。複合体を形成するセレクチン分子種としては、例えば E—セレクチン、 P—セレクチン、 Lーセレクチン等が挙げられ、セレクチンのリガンド分子種としては、例えば 2— 3 シァリル L e ^x 、 2— 3 シァリル L e ' 等が挙げられこの発明の方法で測定されるセレクチンとそのリガンドとの複合体の例としては、例えば E—セレクチンと 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体、 E—セレクチンと 2→ 3 シァリル L e ' との複合体、 P—セレクチンと 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体、 P -セレクチンと 2→ 3 シァリル L e * との複合体、 Lーセレクチンと 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体、 Lーセレクチンと 2→ 3 シァリル L e ^a との複合体等が挙げられる。それらのなかで、この発明における測定法は、特に E—セレクチンと 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体及び E—セレクチンと 2→ 3 シァリル L e * との複合体の測定に適用されるのが好ましい。

この明細書の以下の説明において、単に「セレクチン」と述ベるが、「セレクチン」とは、 E—セレクチン、 P—セレクチン及び Lーセレクチン等の血管内皮細胞、血小板及び白血球等によって発現される全てのセレクチン分子種を包含するものと理解されるべきであり、同様に単に「セレクチンのリガンド J と述べるが、「セレクチンのリガンド」とは、 2— 3 シァリル L e ^χ 及び 2→ 3 シァリル L e ' 等の癌細胞及び白血球等によって発現されるセレクチンに対する全リガンド分子種を包含するものと理解されるべきである。また、単に Γセレクチンとそのリガンドとの複合体 J と述べるが、 rセレクチンとそのリガンドとの複合体」とは、血管内皮細胞、血小板及び白血球等が発現する全セレクチン分子種と、癌細胞及び白血球等が発現する全セレクチンのリガンド分子種とから形成される全種類の複合体を包含するものと理解されるべきである。上記白血球には、例えば好中球、好酸球、好塩基球、単球及びリンパ球等があり、明細書の以下の説明において、単に「白血球」と述べる力それには好中球、好酸球、好塩基球、単球及びリンパ球等が包含されるものと理解されるべきである。

この発明において用いられるセレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体は、リガンドと接着した状態のセレクチンと反応する抗体であれば、どの領域を認識する抗体でも適用することができ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。また、これらの抗体は完全な分子以外に、 F ( a b ' ) ² や F a b等のフラグメントであってもよい。それらの抗体は、例えば可溶性 E—セレクチン、 P—セレクチン又は Lーセレクチンを抗原として用いて、その分子種に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、作製された抗体からリガンドと接着した状態のセレクチンを認識する抗体を分離することによって作製することができる。さらに、例えば I L一 1 /Sのようなセレクチンの発現を誘導するサイトカインによって活性化された血管内皮細胞（セレクチンを発現している）等の細胞を抗原として用いてボリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、作製された抗体から所望のセレクチン分子種に対する抗体を分離し、さらに分離された抗体から、リガンドと接着した状態のセレクチン部分を認識する抗体を分離することによって作製することができる。

この発明において用いられるセレクチンに対するポリクローナル抗体の作製方法としては、当該分野で一般的に用いられている方法を適用することができ、例えばニューマンら〔ニューマン，ダブリュ . （Newman, W. ) ら， J. I mmuno l . , 150 ： 644-65 4 ( 1993)〕に記載の方法によって作製することができる。その具体的な方法は以下のようである。

ァミノ末端 1 一 420 番目までの E L A M— 1 ( E—セレクチンと同義）フラグメントを遺伝子操作により作製する。このフラグメントはレクチンドメイン、 E G F ドメイン及び補体結合ドメインの一部を含有している。このフラグメントをグルタールアルデヒド法により、免疫アジュバント剤である KLH (ke yhole limpet hemocyanin)と結合させて兎に多回免疫する。免疫後の兎から抗血清を得、次いでその抗血清を、硫酸アンモニゥム法及び DEAE陰イオンカラムクロマトグラフィーによつて精製することにより、ボリクローナル抗体を得ることができる o

この発明において用いられるセレクチンに対するモノクローナル抗体の作製方法としては、例えばべヴイラクァら〔ベヴィラクァ（Bevillacqua)ら， Pro Natl. Acad. Sci. 84： 9238- 9242 (1987) 〕及びボーターら〔ポーター（Porter) ら， J. I mmunol. 136： 1680 (1986)〕によって報告された方法や、 W0/9 005539号及び W0/9005786号等に記載のマウスハイブリドーマ法を適用することができる。その具体的な方法を以下に述べる。抗原として I L一 1 のようなセレクチンの発現を誘導するサィトカインによって活性化された血管内皮細胞を用いる場合を例にとって説明する。

I L一 1 ^によって活性化された血管内皮細胞（セレクチンを発現している）をマウスに腹腔内投与することによってマウスを免疫した後、そのマウスから脾細胞を得る。免疫された脾細胞を、例えばケーラー及びミルスタインの方法〔ケーラー (Kohler) , ミルスタイン（Milstein) , Nature. 256： 495-4 97 (1975) 〕に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させる。融合後、 I L一 1 活性化血管内皮細胞には反応するが、正常な休止血管内皮細胞とは反応しないモノク口ーナル抗体産生融合細胞（以下、融合細胞をハイプリドーマと称す）を限界希釈法によってクローン化する。このようにして単離されたモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを大量培養してプリスタン（ハイプリドーマを腹腔内で増殖させる促進剤）投与したマウスに投与し、数日後マウスの腹水を採取する _c セレクチンに対するモノクローナル抗体は、採取した腹水から、 I g Gタイプの抗体は、例えばプロテイン Aカラムに付すことにより、また I g Mタイプの抗体は、例えばセファロース 4 B ゲル濾過カラムに付すことにより、精製抗体として得ることができる。

抗原としてセレクチンの発現を誘導するサイトカインによつて活性化された血管内皮細胞等の細胞を用いて作製されたポリクローナル抗体又はモノクロ一ナル抗体から所望のセレクチン分子種に対する抗体を分離する方法としては、例えば以下のような方法を適用することができる。所望のセレクチン分子種が E—セレクチン（又は E L A M— 1、以下 E L A M— 1 と称す）である場合を例にとって説明する。

E L A M— 1抗体（例えば、プリティッシュバイオテクノロジ一社製の E L A M - 1 抗体 BBA-2等を適用することができる）を 96穴プレートのゥヱルに固相化し、例えば E L A M— 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質を添加して反応させて未反応成分を洗浄除去した後、作製したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を例えば酵素で標識して添加し、同様に反応させて未反応成分を洗浄除去する。その後、酵素に特異的な基質を加えて発色させて吸光度を測定する。得られた吸光度に基づいて、 E L A M— 1 に対する抗体を分離することができる。

セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体（即ち、リガンドと接着した状態のセレクチン部分を認識する抗体）を得るためには、例えば高田らによって報告された方法〔咼田ら， B i ochem. B i ophy s . Re s . Comraun. , 179： 713-71 6 ( 1991 ) 〕に準じた方法を適用することができる。その具体的な方法を以下に述べる。

24穴プレート内で全く密な状態になるまで培養した正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞を、例えば I L一 1 のようなサイトカインによつて刺激して上清を除去する。 I L一 1 /5処理群に、作製したポリクロ一ナル抗体又はモノクローナル抗体を添加して反応させる（ I L一 1 処理 +抗体処理群）。対照として、 I L - 1 ;5未処理群（ I L一 1 未処理群）及び作製した抗体を添加しない I L一 1 y5処理群（ I L一 1 ^処理群）を作製する。その後、各処理群に例えば蛍光色素を封入したセレクチンのリガンドを発現する癌細胞株〔例えば、ヒト大腸癌細胞株 CO L020 大日本製薬社由来）を適用することができる〕を加えて遠心分離する。各ゥエルを洗浄し、 0.5%トリトン X-100を添加して撹拌後、それを 96穴ブレートに分注して蛍光強度を測定する。 I L一 1 ^8未処理群、 I L一 1 処理群及び I L一 1 ^ 処理 +抗体処理群において測定した蛍光強度の結果から、下記式

接着阻害率（％) = 1 0 0— 〔（ I L一 1 ^処理 +抗体処理群の蛍光強度）一（ 1 L一 1 /S未処理群の蛍光強度） Z ( I L 一 1 yS処理群の蛍光強度）一（ 1 L一 1 未処理群の蛍光強度）〕 X 1 0 0

を用いて接着阻害率（）を求める。得られた接着阻害率（ %) に基づいて、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体を分離することができる。このようにして得られる抗体は、リガンドと接着した状態でのセレクチン部分を認識する。

この発明においては、上記のようにして作製されたセレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体を用いることができるが、公知のセレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体を用いることもできる。そのような公知の抗体としては、例えば、ザジャーナルォブィムノロジ一に記載の E L AM- 1に対するモノクローナル抗体 BBIG-E5(The Journal of Immunology ： Vol. 147, 130- 135. No. 1， Ju l y 1 1991 ) や、ニューマンらによって報告された E L A M— 1 に対するボリクローナル抗体 E L A M— 1 - 420 〔ニューマン，ダブリュ. ら， J. Immuno l . . 150 : 64 4-654 (1993)〕等が挙げられる。

この発明において用いられる前記複合体のリガンド部分を認識する抗体としては、セレクチンのリガンド分子種に対する抗体であれば、ボリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。

セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法は、抗原としてセレクチンの代わりにセレクチンのリガンドを使用することを除いて、複合体のセレクチン部分を認識するボリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法と同様である。また、セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、抗原としてセレクチンのリガンドを発現している癌細胞又は白血球細胞等の細胞を用いることによつても作製することができる。その場合には、作製された抗体から所望の前記複合体のリガンド部分を認識する抗体を分離することが必要であり、その方法としては、血管内皮細胞等の細胞を抗原として用いて作製された抗体から所望の複合体のセレクチン部分を認識する抗体を分離する方法に準じた方法を適用することができる。前記複合体のリガンド部分を認識する抗体は、生体中においてセレクチンのリガンドの多くが多価の状態（コアタンパク質に抗原ェピトーブを有する多数の糖鎖が結合している状態）で存在しているために、セレクチンとの接着に関与する領域を認識する抗体であってもよく、セレクチンとの接着に関与しない領域を認識する抗体であってもよい。

また、前記複合体のリガンド部分を認識する抗体としては、セレクチンのリガンド又はセレクチンのリガンドを発現している癌細胞あるいは白血球細胞等の細胞を抗原として用いることによって作製されたリガンド部分を認識する抗体以外に、セレクチンのリガンドと反応する抗体を適用することもでき、そのような抗体の例としては、例えば公知のセレクチンのリガンドに対する抗体〔例えば C S L E X 1 (チア，ディー. （Ch i a， D. ) ら、 Cancer Res. 45 : 435-437(1985) 3 が挙げられる。これらは、複合体のセレクチン部分を認識する抗体と同様、完全な分子抗体以外に F C a b ' ) ² や F a b等のフラグメントでのつしちょレヽ

この発明のセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法は、一般的には、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体又はリガンド部分を認識する抗体のどちらか一方を第 1抗体として支持体に固定（又は固相化）した後、セレクチンとそのリガンドとの複合体を含むサンプル（生体試料）と接触させて抗原抗体反応（第 1反応）をおこさせ、未反応のサンプル成分を洗浄除去した後、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体又はリガンド部分を認識する抗体のうち第 1抗体として用いた抗体ではない他方を第 2抗体として反応（第 2反応）させ、第 2抗体を標識化合物で標識させておくことによって、形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合（セレクチンとそのリガンドとの複合体と、その複合体のセレクチン部分を認識する抗体及びリガンド部分を認識する抗体との結合）を測定することからなるサンドイッチ法である。

図 1 に、支持体に固定した第 1抗体が、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体である場合を例にとって、サンドイッチ法に基づくこの発明による測定法の原理を示す。

以下、サンドイッチ法を例にとって本発明の測定法を詳細に、説明する。

支持体に固定する第 1抗体としては、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体又はリガンド部分を認識する抗体のどちらでもよいが、セレクチン部分を認識する抗体が好ましい。

支持体としては、当該分野で一般的に用いられる支持体を適用することができる。例えば、ポリスチレンビーズ、チューブ、マイクロ夕イタプレート、ストリツプ等を挙げることができ、なかでも、マイクロ夕イタプレートが好ましい。

第 2抗体としては、前記複合体のセレクチン部分を認識する抗体又はリガンド部分を認識する抗体のうち、第 1抗体として用いた抗体ではない他方が用いられる。第 2抗体としては、リガンド部分を認識する抗体が好ましい。第 2抗体は、標識化合物で標識されているのが好ましく、第 2抗体を標識する標識化合物としては、当該分野で一般的に用いられている標識化合物を適用することができ、例えば酵素、補酵素、蛍光色素又は放射性同位元素等が挙げられ、酵素が好ましい。また、第 2抗体に無標識のものを用いる場合には、適切な試薬（例えば、第 2 抗体がマウス I g M単クローン抗体である場合には、抗マウス I g IV [抗体）を用いて検出することができる。

第 2抗体を標識する標識化合物として酵素、蛍光色素又は放射性同位元素を用いる場合には、第 2抗体を直接それらで標識することができ、反応した第 2抗体におけるそれらの酵素活性、蛍光強度又は放射活性を測定することによって、形成した第 1 抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することができる。

第 2抗体を標識する標識化合物として補酵素を用いる場合には、第 2抗体を補酵素で標識し、その補酵素と結合する結合物質を酵素、蛍光色素又は放射性同位元素で標識して補酵素と反応（結合）させ、補酵素と結合した結合物質における標識化合物の酵素活性、蛍光強度又は放射活性を測定することによって. 形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することができる。

標識化合物として用いられる酵素の好ましい例としては、例えばペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 β - Ό一ガラクトシダーゼ、ガラクトース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースォキシダーゼ等が挙げられ、これらのなかで、ペルォキシダーゼが特に好ましい。

これらの酵素の酵素活性を測定する方法としては、当該分野で一般的に用いられている方法を適用することができ、例えば比色法、蛍光法、生物発光法及び化学発光法等が挙げられる。具体的には、例えば酵素としてペルォキシダーゼ（以下、 Ρ〇 Dと略す）を用いた場合には、オルトフエ二レンジァミン（以下、 O P Dと略す）又は 3, 3'， 5, 5' -テトラメチルベンジン等を酵素に特異的な基質（以下基質と略す）として用いる比色法、 4 ーヒドロキシフヱニル酢酸又は 3 — （ 4 ーヒドロキシフエ二ル）プロピオン酸等を基質として用いる蛍光法、又はルミノールー Η ₂ 0 ₂を基質として用いる化学発光法等によって酵素活性を測定することできる。酵素としてアルカリフォスファタ一ゼを用いた場合には、 4 一二トロフエニルフォスファターゼ又は NAD P等を基質として用いる比色法、又は 4 ーメチルゥンベリフェリルフォスフヱート等を基質として用いる蛍光法等によって酵素活性を測定することができる。酵素として yS— D— ガラクトシダーゼを用いた場合には、 2—二トロフヱニル β 一 D—ガラクトシド等を基質として用いる比色法、 4一メチルゥンベリフヱリル ^一 D—ガラクトシド等を基質として用いる蛍光法、又は 2—二トロフヱニル — D—ガラクトシド等を基質として用いる化学発光法等によって酵素活性を測定することができる。酵素としてガラクトース脱水素酵素を用いた場合には、グルコース一 6— リン酸等を基質として用いる生物発光法等によって酵素活性を測定することができ、酵素としてグルコースォキシダーゼを用いた場合には、ペルォキシォキザレート等を基質として用いる化学発光法等によって酵素活性を測定することができる。

標識化合物として用いられる蛍光色素の好ましい例としては、例えばフルォレセインイソチオシァネート（F I TC) 、テトラメチルローダミンイッチオシァネート（R I T C： ) 、フィコエリトリン（P E) 、テキサスレツド（TE) 、ァロフィコシァニン（AP C) 等が挙げられる。これらの蛍光色素を用いた場合には、直接その蛍光強度を測定することができる。

標識化合物として用いられる放射性同位元素の好ましい例としては、例えば、 ¹²⁵1、 ^{131 3}H、 ¹⁹C等が挙げられる。これらの放射性同位元素を用いた場合には、直接その放射活性を測定することができる。

標識化合物として用いられる捕酵素の好ましい例としては、例えばピオチンが挙げられ、ピオチンと結合する結合物質の例としては、例えばストレブトアビジンやアビジンが挙げられる c 結合物質を標識する酵素、蛍光色素又は放射性同位元素の好ましい例は、上記と同様である。

第 2抗体を酵素、蛍光色素又は放射性同位元素で直接標識する方法としては、当該分野で一般的に用いられている方法を適用することができ、例えばグルタールアルデヒド法、過ョーソ酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等が挙げられる。第 2抗体を補酵素で標識する方法としては、例えば「免疫実験操作法、日本免疫学会編集、 3830頁」に記載のピオチンで標識する方法等に準じた方法を適用することができる。その具体的な方法は次のようである。抗体を 1 mgZinlの濃度になるように 0.1 M N a HC 0₃ に溶解させ、 NHS— ピオチン 1 mgを 1 mlの DMS 0に溶解させる。上記抗体溶液 1 mlに対し、 DM S Oに溶解させた NHS—ピオチンを 60 1加えて室温で 4時間反応させ、次いでリン酸塩緩衝化生理食塩液（以下、 P B S と略す）で十分透析することによってピオチン化抗体を得ることができる。

補酵素と結合する結合物質を標識する方法としては、当該分野で一般的に用いられている方法を適用することができる。また、標識化合物で標識された結合物質（以下、標識結合物質と称す）として市販品を用いることもできる。例えば、 P O Dによって標識されたアビジン（以下、アビジン化 P O Dと称す）としてはベクター社製のものを用いることができる。

また、第 2抗体として完全な分子以外に F ( a b ' ) ² や F a b等のフラグメントを用いる場合にも上記のような方法によってフラグメントを標識することができる。

この発明の測定法においては、第 2抗体としてピオチン化抗体を用い、ピオチンと結合する物質として P 0 Dで標識されたアビジンを用いて、ピオチンと結合したァビジンにおける P〇 Dの酵素活性を測定することにより、形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定するのが最も好ましい。

第 1抗体を支持体に固定する場合には、支持体に添加する第 1抗体の濃度は 50 g/mlが好ましく、第 1 抗体を希釈する溶媒としては、当該分野で一般的に用いられている溶媒を適用することができ、例えば P B S、炭酸塩緩衝液、トリスー塩酸緩衝液等が挙げられ、 P B Sが好ましい。また、支持体に添加する第 1抗体の添加量は 25 / 1 〜250 1 が適切であり、 50〃 1 〜 100〃 1 が好ましい。第 1 体を支持体に添加した後、 4〜37°C、好ましくは 4 °Cで、 10〜72時間、好ましくは 12〜24時間放置することによって第 1抗体を支持体に固定することができる。また、第 1抗体を上述のように直接支持体に固定する以外に、ァミノ基もしくはカルボキシル基修飾支持体に固定することもでさる。

第 1抗体を支持体に固定した後、抗体溶液を回収し、サンブル又は第 2抗体の非特異的な吸着を抑えるために、支持体上の第 1抗体が固定していない部分をブロックするのが好ましい。そのようなブロッキングに使用するブロック剤としては、当該分野で一般的に用いられているプロック剤を適用することができ、例えば 1 % B S A溶液、正常ゥサギ血清等が挙げられる。市販品としては、大日本製薬社製のブロックエース等が挙げられる。また、ブロック剤は、保存剤としてアジ化ナトリウムを 0. 05 %濃度となるように添加して用いるのが好ましい。ブロック剤の添加量は 25 1 〜250〃 1 が適切であり、 200〃 1 が好ましい。ブロック剤を添加した後、 4〜37て、好ましくは 4 °C で、 1 0時間〜 30日間、好ましくは 12〜48時間放置することによって、支持体上の第 1抗体が固定していない部分をブロックすることができる。

ブロッキング後、支持体を洗浄することが必要である。洗浄に使用する洗浄剤としては、当該分野で一般的に用いられている洗浄剤を適用することができ、例えば 0 . 1 % B S A— P B S、 0 . 1 %正常ゥサギ血清一 P B S、 10 %ブロックエース一 P B S 等が挙げられ、 1 0 %ブロックエース一 P B Sを用いるのが好ましい。洗浄回数としては 1 〜 5回が適切であり、 2〜 3回が好ましい。

洗浄後、セレクチンとそのリガンドとの複合体を含むサンブル（生体試料）を添加するが、その添加量は 25〃 1〜250 ζ 1 が適切であり、 50 1 〜1 00 1 が好ましい。サンプルを添加することによって、第 1抗体と、セレクチンとそのリガンドとの複合体の間の抗原抗体反応（第 1反応）がおこる。第 1反応の反応温度としては 4〜37°Cが適切であり、 20〜25てが好ましい。また、反応時間としては 30分〜 24時間が適切であり、 1 〜 2時間が好ましい。

第 1反応終了後、未反応のサンブル.成分を洗浄除去することが必要である。使用する洗浄剤の例は上記と同様である。洗浄回数としては、 1 〜 5回が適切であり、 3回が好ましい。

未反応のサンプル成分を洗浄除去した後、第 2抗体（標識抗体）を添加するが、添加する第 2抗体の濃度としては 2 ^ g/m l が好ましく、第 2抗体を希釈する溶媒の例は、第 1抗体を希釈する溶媒の例と同様である。また、第 2抗体の添加量は、 25 1 〜250 ; 1 が適切であり、 50 1 〜100 χ 1 が好ましい。第 2抗体を添加することよって、第 2抗体と、セレクチンとそのリガンドとの複合体の間の抗原抗体反応（第 2反応）がおこる。第 2反応における適切な反応温度及び反応時間は、第 1反応と同様である。すなわち、反応温度としては 4〜37°Cが適切であり、 20〜25でが好ましく、反応時間としては 30分〜 24時間が適切であり、 1 〜 2時間が好ましい。

第 2反応終了後、未反応の第 2抗体を洗浄除去することが必要である。使用する洗浄剤の例は上記と同様である。洗浄回数としては、 1 〜 5回が適切であり、 3回が好ましい。未反応の第 2抗体を洗净除去した後、反応した第 2抗体における標識化合物の酵素活性、蛍光強度又は放射活性を測定することによつて、形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することができる。

第 2抗体として補酵素で標識した抗体を用いる場合には、未反応の第 2抗体を洗浄除去した後、補酵素と結合する結合物質 (標識化合物で標識されている）を添加して第 2抗体における補酵素と反応（結合）させることが必要である。添加する結合物質の濃度としては、 0 . 5〜12 g/m lが適切であり、 2〜 6 〃 g/mlが好ましく、その添加量は 25 1 〜250 1 が適切であり、 50 / 1 〜 100〃 1 が好ましい。また、反応温度は 4て〜 37°Cが適切であり、 20'C〜25'Cが好ましく、反応時間は 1 0〜120分間が適切であり、 20〜60分間が好ましい。

補酵素と標識結合物質の間の反応終了後、未反応の標識結合物質を洗浄除去することが必要である。使用する洗浄剤の例は上記と同様である。洗浄回数としては 1 〜 5回が適切であり、 4回が好ましい。未反応の標識結合物質を洗浄除去した後、反応した標識結合物質における標識化合物の酵素活性、蛍光強度又は放射活性を測定することによって、形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することができる。

標識化合物の蛍光強度又は放射活性を測定する場合には、未反応の第 2抗体又は標識結合物質を洗浄除去した後、当該分野で一般的な方法によって直接蛍光強度又は放射活性を測定することができる。

標識化合物の酵素活性を測定する場合には、未反応の第 2抗体又は標識結合物質を洗浄除去した後、当該分野で一般的な方法によって酵素に特異的な基質と反応させることにより、その酵素活性を測定することができる。基質の添加量としては、 50 〜 1 00 1 が好ましい。反応温度は 4〜37^eCが適切であり、 15 〜25°Cが好ましく、反応時間は 5〜60分間が適切であり、 1 0〜 20分間が好ましい。反応停止剤としては、当該分野で一般的に用いられている反応停止剤を適用することができ、例えば 2 硫酸溶液等が挙げられる。反応停止剤の添加量としては、 50〜 1 00 1 が好ましい。反応停止後、所望の吸光度を測定することによって酵素活性を測定することができる。

上記のような方法により形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することによつて、セレクチンとそのリガンドとの複合体を定性的及び z又は定量的に測定することができる。即ち、測定した酵素活性、蛍光強度又は放射活性に基づいて、第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合の形成を確認することにより、セレクチンとそのリガンドとの複合体の存在の有無を確認（定性的測定）することができ、生体試料の代わりに標準物質（セレクチンとそのリガンドとの複合体の標準物質）の希釈系列を用いて同様に反応させて形成した第 1抗体ーセレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定して検量線を作製することにより、セレクチンとそのリガンドとの複合体の量（定量的測定）を測定することができる。

また、上記のような方法とは別に、より簡略化した以下のような方法によってもセレクチンとそのリガンドとの複合体を測定することができる。

即ち、上述のように第 1 抗体を支持体に固定後、ブロッキングして洗浄したものを第 1抗体固相化プレートとする。一方で、セレクチンとそのリガンドとの複合体を含むサンブル（生体試料）（添加量は上述の通り）及び第 2抗体（濃度、添加量は上述の通り）を試験管に加え、 4〜37°C、好ましくは 20〜25°Cで、 30分〜 24時間、好ましくは 1 〜 2時間放置する。次いで例えば第 2抗体として補酵素で標識した抗体を用いた場合には、そこへさらに補酵素と結合する結合物質（標識化合物で標識されている）（濃度、添加量は上述の通り）を添加し、 4〜37て、好ましくは 20〜25でで、 30分〜 24時間、好ましくは 1 〜 2時間放置し、反応させる。その後、第 1抗体固相化ブレートに試験管内混合物を適量加え、 4〜37て、好ましくは 20〜25でで、 30分〜24時間、好ましくは 1 〜 2時間放置する。これを上述同様の方法により洗浄した後、標識化合物の酵素活性、蛍光強度又は放射活性を測定することによって、形成した第 1抗体一セレクチンとそのリガンドとの複合体一第 2抗体の結合を測定することができる。

この発明の測定法は、日差変動、日内変動、同時再現性ともに良好であり、再現性よくセレクチンとそのリガンドとの複合体の量を測定することができる。

この発明によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法は、癌転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断に有用である。

この発明の瘙転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断は、生体試料中におけるセレクチンとそのリガンドとの複合体の存在の有無を確認することに基づくものであり、セレクチンとそのリガンドとの複合体の存在が確認されれば、炎症性疾患あるいは糖尿病をはじめとする血管関連疾患がおこつている可能性があることが示され、癌患者においては、癌転移がおこっている可能性があることが示される。また、生体試料中におけるセレクチンとそのリガンドとの複合体を定量的に測定し、高値が得られれば、癌転移、あるいは炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患がおこつている可能性が高いことが示される。

従って、この発明の第 2の観点によれば、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とのセットからなる癌転移、炎症性疾患又は糖尿病を始めとする血管関連疾患の診断用キットが提供される。

この発明の診断用キットにおけるセレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体は、標識化合物で標識されているのが好ましく、その標識化合物の例は上記の説明と同様である。

この発明の診断用キットは、この発明によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法を実施するための診断用キットであり、その測定方法については、上述が参照される。

この発明における診断用キットには、上記測定方法を実施するために必要な試薬類、支持体及び標準物質等が含まれており、これらの試薬類や標準物質等は、密閉容器中で保存されているのが好ましい。

この発明の診断用キットは、冷所で保存されるべきである。この発明の診断用キットを 1 0て以下で保存すると長期間安定であり、 30。C以上で保存すると抗体の活性が低下するために好ましくない。従って、この発明の診断用キットの保存温度としては、 4〜25°Cが適切であり、 4〜10。Cが好ましい。また、この発明の診断用キットを 13力月以上保存すると抗体の活性が低下するために好ましくない。従って、この発明の診断用キットの保存期間としては、約 1年が適当である。

診断に使用する生体試料は、 0て以下で保存すると抗原が安定となり、 1 て以上で保存すると抗原が不安定となるために好ましくない。従って、生体試料の保存温度としては、一 80〜 0 ^eCが適切であり、 —80〜一 20°Cが好ましい。また、生体試料を 1 3力月以上保存すると抗原が不安定となるために、生体試料の保存期間としては、約 1年が適当である。しかしながら、診断が行われるまで生体試料を長期間保存しておくことが必要になった場合には、 - 80て又はそれ以下の温度で保存すれば、診断結果の信頼性を著しく弱めることはないであろう。

この発明には、この発明の構成及び範囲からはずれることなしに、当業者がなしうる種々の変形も包含される。

この発明によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法は、癌転移、炎症性疾患又は糖尿病を始めとする血管関連疾患の診断に有用である。 ' 肝癌、腎癌、肺癌及び乳癌等の腺癌細胞には 2→ 3 シァリル L e ^x が優勢に発現され、脖癌、胆道系の癌及び大腸癌等の腺癌細胞には 2→ 3 シァリル L e * が優勢に発現されていることが明らかになつており、扁平上皮癌細胞においても 2→ 3 シァリル L e ^x 又は 2— 3 シァリル L e · が発現されていることが明らかになつている。 2— 3 シァリル L e ^x 及び 2→ 3 シァリル L e * は、癌細胞とセレクチンを発現する血管内皮細胞との接着に関与すると考えられている。従って、これらを強く発現する癌細胞は血行移行性をおこしゃすく、癌細胞において、 2 — 3 シァリル L e ' 又は 2→ 3 シァリル L e ¹¹ がより強く発現されると、これらは癌細胞から体液（特に血中、以下血中を例にとつて説明する）へ遊離すると考えられる。

—方、 E—セレクチン及び P —セレクチンは血管内皮細胞に発現され、血管内皮細胞が強く活性化されるとそれらの発現量も増大し、 E —セレクチン及び P—セレクチンがより強く発現されると、それらのセレクチンも血管内皮細胞から血中へ遊離すると考えられる。このようにして遊離したリガンドと E—セレクチン又は P—セレクチンは血中で複合体を形成し、この複合体を測定すれば、癌細胞と血管内皮細胞両方の活性化がおこっていることがわかり、活性化された癌細胞が活性化された血管内皮細胞へ接着（転移）する可能性を診断することができる。即ち、血中における E—セレクチン又は P—セレクチンとそのリガンドとの複合体の量が多ければ、それだけ癌転移の可能性が高いと考えられる。また、 P—セレクチンは、血管内皮細胞以外に血小板においても発現され、血小板において発現された P—セレクチンも、血小板の活性化にともなってその発現量が増大し、より強く発現されると血小板から血中へ遊離すると考えられる。血小板と瘙転移の関係としては、血中に遊離した癌細胞に活性化血小板が接着すると、血小板は元来接着性が高いために血管内皮細胞に着床して転移が成立しやすくなると考えられる。従って、血中における P—セレクチンとそのリガンドとの複合体を測定することにより、癌転移の可能性を診断することができる。

Lーセレクチンは白血球において発現され、同様に白血球の活性化によって血中に遊雜すると考えられる。白血球と癌転移の関係としては、血中に遊雜した癌細胞に白血球が接着すると、白血球の接着能で血管内皮細胞に着床して転移を促進すると考えられる。また、白血病および悪性リンパ腫細胞には Lーセレクチンを発現するものもあり、この場合には、血管内皮細胞に発現されたリガンド糖鎖と接着して、これらの悪性細胞の臓器浸潤のパターンに影響を与えると考えられる。従って、血中における Lーセレクチンとそのリガンドとの複合体を測定することにより、癌転移の可能性を診断することができる。

また、炎症性疾患や糖尿病を始めとする血管関連疾患は、 2 → 3 シァリル L e ^x を表面抗原として有する好中球、単球及びメモリー型 T細胞亜群〔神奈木ら、病態生理 7 : 888-900 ( 198 8) ; Medi ca l Immuno l . , Knnnag i . 25 : 89-95 ( 1993) 参照〕が炎症部位に集まり、組織内へ浸潤することによって進行すると考えられる。炎症部位においては、炎症性サイトカインの刺激によってセレクチンの発現増加が認められ、セレクチンがより強く発現されると、同様にそれは血中に遊離すると考えられる < 好中球、単球及びメモリー型 T細胞亜群においても、それらがより強く活性化されることによって 2→ 3 シァリル L e ^x は血中に遊離すると考えられる。従って、血中におけるセレクチンとそのリガンドとの複合体を測定することによって、炎症性疾患や糖尿病を始めとする血管関連疾患をより正確に診断することができると考えられる。図面の簡単な説明

図 1 は、この発明による測定法の原理を示した図である。

図 2は、この発明による測定法の具体例を示した図である。図中の符号は以下のことを示している。

1 支持体

2 セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体

3 セレクチン

4 セレクチンのリガンドのコアタンノ、'ク質

5 セレクチンのリガンドの糖鎖 6 セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体

7 標識化合物

8 9 6穴プレ一ト

9 E L AM- 1抗体

1 0 E L AM - 1

1 1 2→ 3 シァリル L e ^x 又は 2— 3 シァリル L e * が結合しているコアタンク質

1 2 2— 3 シァリル L e ^x 又は 2→ 3 シァリル L e '

1 3 ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 又はピオチン化 2→ 3 シァリノレ L e

1 4 アビジン化 P 0 D

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

1 . E L AM- 1 モノクローナル抗体の作製

E L AM— 1 モノクローナル抗体を作製する方法は、べヴィラクァら CBevi llacqua et al. , Pro Nat 1. Acad. Sci. 84: 8238-8242 (1987) 〕及びポーターら CPorter et al. , J. Im munol. 136： 1680 (1986) 〕によって報告された方法や WO 900 5539及び W0 9005786に記載の方法に従った。

クラボウ社から購入した正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞を添付の E GM— UVメディウ厶で培養し、これにリコンビナント I L - 1 ^ (ゼンザィム社製）を 200 UZnil添加して 4時間活性化させた。 BALB/Cマウスにこの I L一 1活性化血管内皮細胞 3 X 10⁶ 個を 10日ごとに 3回腹腔内投与し、最後の投与は細胞融合の 3日前に行った。免疫された脾細胞を、ケ一ラー及びミルスタイン〔Kohler, Milstein.. Nature. 256: 495-497 (197 5)〕の方法に従ってボリエチレングリコールを用いて P3U1骨髄腫細胞株と融合させた。融合した細胞から、約 14日後 I L一 1 活性化血管内皮細胞には反応するが、正常な休止内皮細胞とは反応しないモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを限界希釈法によりクローン化し、さらに約 14日後に同様の操作法にてサブクローン化した。

このようにして単離されたモノク口ーナル抗体産生ハイブリドーマを大量培養後、前日にプリスタン〔アルドリツチ社製 (Aldrich Chemical Co.) 〕投与した Balb/cマウスに 1匹あたり 1 X 10⁷細胞数投与した。約 1週間後に腹水を採取し、 I g Gタイプの抗体はプロテイン Aカラム（フアルマシア社製）により、また I gMタイプの抗体はセファロール 4 Bゲル濾過力ラム（フアルマシア社製）により処理して精製抗体を得た。得られた抗体は、 I g G夕イブの抗体を No.93、 I gMタイプの抗体を No.230 と称した。

2. セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体の分離

① E L AM— 1 に対するモノクローナル抗体の単雜

プリティッシュバイオテクノロジー社製 E L AM— 1抗体 BBA-2(25^g/ml) 50〃 1 を 96穴ブレートのゥヱルに室温で 1 時間反応させて吸引した後、ブロックエース（大日本製薬社製） -0.05%N a N 3溶液を 200 1 ずつ加え、 4でで一晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 1 回洗浄した後、以下のようにして調製した E L AM— 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質を各ゥエルに 50 1 加え、室温で 1 時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、あらかじめ以下のようにしてピオチン化した上記 1 で得られた抗体を各ゥヱルに 50 1加え、室温で 1 時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄し、ァビジン化ペルォキシダーゼ（ベクター社； 2 g/ml) を各ゥヱルに 50 z l加え、室温で 30分間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 4回洗浄した。以下のようにして調製したォルトフヱ二レンジアミン（以下 O P Dと略す）溶液を各 50〃 1 加え、室温で 10分間放置した後、 2 M H₂S 0₄ 溶液を各ゥエルに 50 1 加え、 492nm波長で吸光度を測定した。上記 1 で得られた抗体を P B S と反応させた時の吸光度を対照（ブランク）とした。結果を表 1 に示す。

E L AM - 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質は、次のようにして調製した。 150cm²シャ一レ内で培養した正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞（クラボウ社由来） 3 X 10⁶ 個を、リコンビナント I L一 1 (ゼンザィ厶社製） 200 U/mlで 37。C にて 4時間刺激した。上清を吸引して P B Sで 2回洗浄後、 1 % トリトン X-100— P B S溶液を 10ml加えてピベッティングをした。浮遊した細胞溶解質を回収後、 lOOOOOgで 2時間遠心してその上清を 1 mlまで濃縮し、そのサンブルを 20000 UZmlとして使用した。

ピオチン化抗体は、「免疫実験操作法、日本免疫学会編集、 3830頁）に記載の方法に従って作製した。まず、抗体を l mgZ mlの濃度になるように 0.1 M N a H C 03 に溶解させ、 NH S—ピオチン（ベクター社製） 1 mgを 1 mlの DMS〇に溶解させた。次に、抗体溶液 l mlに対し、 DMS Oに溶解した NH S 一ピオチンを 60〃 1 加え、室温で 4時間反応させて P B Sで充分透析し、ピオチン化抗体とした。

〇 P D溶液は、 O P D锭（13mg/l錠、製造元：和光純薬） 1 錠に 0.1 M N a P 04 を 20ral加えて溶解後、 30%H₂O ₂を 5 1 添加して撹拌することによって調製した。

(以下余白、次頁へつづく）表 1

表 1 より、 No.93及び No.230 ともに E L A M— 1 に対する抗体であることがわかる。

② 2— 3シァリル L e ^x 及び 2— 3シァリル L e ^e を細胞表面に含有するヒト大腸癌細胞株 C0L0201 (大日本製薬社由来）と I L - 1活性化正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞の接着を阻害する及び阻害しない抗体の評価

ヒト大腸癌細胞株 COL0201と I L一 1活性化正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞との接着実験は、高田ら〔Takada,A.,et al. , Biochem. Biop ys. Res. Commun. , 179： 713-716 (1991) 〕の操作法に従って行った。 24穴プレート内で全く密な状態になるまで培養した正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞を、リコンビナント I L一 l 5 (以下 r h I L— 1 /Sと略す）（ゼンザィ厶社製） 200UZmlで 37'Cにて 4時間刺激した。上清を吸引して除いた後、 r h I L— 1 /5処理群に、それぞれ 20 g/mlの上記精製抗体を加え、室温にて 30分間反応させた（ r h I L一 1 5処理 +抗体処理群）。その後、蛍光色素 2' , 7'—ビス一（カルボキシェチル）一 5, 6-カルボキシフルォレセインァセトキシメチルエステル（以下、 B C E C F— AMと略す）を封入したヒト大腸癌細胞株 C0L0201 を 1 ゥュルあたり 1 X 10⁶ 細胞数加え、 lOOrpmで 20分間遠心した。各ゥヱルを 3回洗浄し、 .0.5 % トリトン X-100 を.25ml 加えて撹拌後、 96穴ブレートに 100 fi 1 ずつ分注し、ベクター社製の蛍光強度測定装置を用いて 485nm Z 535nm で蛍光強度を測定した。対照として、 r h I L— 1 /5未処理群と抗体を加えない r h I L一 1 処理群をおき、同様に蛍光強度を測定した。 '

B C E C F一 AMを封入したヒト大腸癌細胞株 C0L0201 は、 B C E C F一 AMを細胞と反応させることによって作製したもので、 B C E C F— AMが膜を通過して細胞内に入り、細胞内エステラーゼにより分解されて膜不透過性の B C E C F となつてヒト大腸癌細胞株中に存在しているものである。

得られた蛍光強度の結果から、下記式によって接着阻害率 (%) を求め、得られた蛍光強度と接着阻害率の結果を表 2に示す

接着阻害率（） = 1 0 0 — 〔（ r h I L - l g処理 +抗体処理群の蛍光強度）一（ r h I L - 1 ^未処理群の蛍光強度） / ( r h I L - 1 ;5処理群の蛍光強度）一（ r h 1 L— 1 ；5未処理群の蛍光強度）〕 X 1 0 0 表 2

表 2より、 No.93 は、 E L AM— 1 とそのリガンドとの複合体の E L AM— 1部分を認識する抗体であると考えられる。実施例 2

1 . 2— 3 シァリル L e ^x 及び 2→_3 シァリル L e ' に対するモノクローナル抗体の作製

抗原としてヒト大腸癌細胞株より抽出した天然糖脂質のモソシァロ画分を用いること、アジュバント剤としてサルモネラを用いること、及び BALB/cマウスへ静脈投与により 4回免疫することを除いて、 E L AM— 1 に対するモノクローナル抗体の作製法（実施例 1 ) に準じた方法により、 2→ 3 シァリル L e ^x に対するモノクローナル抗体（以下、 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体と称す）及び 2— 3 シァリル L e ^e に対するモノクローナル抗体（以下、 2→ 3 シァリル L e ^β 抗体と称す）を作製した。

2. ピオチン化 2— 3 シァリル L e ^x 抗体及びピオチン化 2 → 3 シァリル L e · 抗体の作製

実施例 1 におけるピオチン化した E L A M— 1 に対するモノクローナル抗体の作製方法に準じた方法によって、各々の抗体をピオチン化した。ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体を 5A 12、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ' 抗体を No. 1 1と称した。実施例 3

セレクチンとそのリガンドとの複合体の測定

図 2に示されるような原理を有する測定系を確立するために、以下のような操作を行った。

1 . 固相化 E L A M — 1 に結合する 2→ 3 シァリル L e ^x の測定（より純粋なリガンドを用いた系）

①使用した材料は以下のようにして調製された。

* E L A M - 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質の調製

実施例 1 と同様である。

* 2→ 3 シァリル L e ^x リボソーム溶液の調製

ホスファチジルコリン（100 u g ) 、コレステロール（50 g ) 、ジセチルフォスフェート（3. 75 g ) 及び 2→ 3 シァリル L e ^x ( 25 / g ) を加えたクロ口ホルム /メタノール = 2 Z 1 溶液（500〃 1 ) を減圧乾固させた後、 0. 25mlの P B Sを加え、超音波処理（出力 90ヮット）を 5分間、撹拌処理（ボルテックスミキサー）を 5分間行い、リボソーム分散液とした。さらに、平均孔径 0.2 〃mのポリカーボネート膜フィルター（ヌクレポァ一社製）にリボソーム分散液を通過させて平均粒径が 0.2 mになるように調製し、このリボソーム溶液を 100 〃g/mlとし

* 0 P D溶液の調製

実施例 1 と同様である。

②固相化 E L AM— 1 に結合する 2→ 3 シァリル L e ^x を、以下の方法で測定した。

P B Sで希釈した E L AM— 1 抗体 No.93 ( 50 g/ml) を 96 穴プレートの各ゥヱルに 50^ 1 ずつ加え、 4 °Cで一晚放置した抗体溶液を回収した後、ブロックエース（大日本製薬社製）一 0.05%N a N₃ 溶液を各ゥエルに 200 μ. 1 ずつ加え、 4てで 1 晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 1 回洗浄した後、 E L AM— 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質（δΟΟθυΖπιΙ) を各ゥルに 50/ 1 ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10%プロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、 2→ 3 シァリル L e ^x リボソーム溶液（lOO g/m 1 ) を各ゥエルに 50 1 ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10 %ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体 5A12 ( 2 g/ral) を各ゥエルに 50〃 1ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10%ブロックエースー P B Sで各ゥヱルを 3回洗浄した後、アビジン化 P O D ( ベクター社； II g/ml) を各ゥヱルに 50 1 ずつ加え、室温で 30分間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 4 回洗浄した。 O P D溶液を各ゥエルに 50 / 1 ずつ加え、室温で 10分間放置した後、 2 M H₂S 0₄ 溶液を各ゥヱルに 50〃 1 ずつ加え、これを 492nm波長で吸光度を測した。

E L AM- 1抗体が、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体 5A12及び 2→ 3 シァリル L e ^χ リボソーム溶液と反応しないことを示すために、下記 1処理群及び 2処理群についても同様に吸光度を測定した。結果を表 3に示す。

表 3

〈各処理群の操作手順〉

1 ； E L A Μ - 1抗体（No.93) 一ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体（5A12) —アビジン化 P 0 D—発色

2 ； E L AM- 1抗体（No.93) — 2→ 3 シァリル L e ^x リポソ一厶溶液-ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体（5A12) 一アビジン化 P 0 D—発色

3 ； E L AM - 1抗体（No.93) - E L AM- 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質— 2→ 3 シァリル L e ^x リポソーム溶液一ピオチン化 2— 3 シァリル L e ^x 抗体（5A12) — アビジン化 P O D—発色

表 3より、 E L AM— 1抗体は、ピオチン化 2— 3 シァリル L e ^x 抗体及び 2→ 3 シァリル L e ^x とは反応せず、 E L AM 一 1 と 2→ 3 シァリル L e ^x とが結合することによって形成された複合体とのみ反応することが明らかである。

従って、 E L AM— 1 とそのリガンドとの複合体の E L AM 一 1部分を認識する E L AM— 1抗体及び 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体を用いることによって、 E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体のみが測定されることが明らかである。

2. 固相化 E L AM— 1 に結合する 2— 3 シァリル L e ' の測定（より生体中に近いリガンドを用いた系）

①使用した材料は以下のようにして調製された。

* 2→ 3 シァリル L e 糖夕ンパク溶液の調製

150cm²シャ一レ内で培養したヒト脖癌細胞株 SW1116 (大日本製薬社由来）（ 7 X 10⁷個）の上清を回収後、 lOOOrpmで 5分間遠心分離した上清を 10000 UZmlとした。

②固相化 E L AM— 1 に結合する 2— 3 シァリル L e ' を、以下の方法で測定した。

P B Sで希釈した E L AM— 1抗体 No.93 (50 g/ml) を 96 穴プレートの各ゥエルに 50 1 ずつ加え、 4てで 1 晚放置した。抗体溶液を回収した後、ブロックエース一 0.05%N a N₃ 溶液を各ゥエルに 200 〃 1 ずつ加え、 4てで 1 晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 1 回洗净した後、 E L AM - 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質（5000UZm 1 ) を各ゥェルに 50〃 1 ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10 %ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 3回洗浄した後、 2 → 3 シァリル L e * 糖タンパク溶液（5000UZnil) を各ゥヱルに 50 1 ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ' 抗体 No.11 ( 2 μ. g/ml) を各ゥヱルに 50〃 1 ずつ加え、室温で 1 時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、アビジン化 P O D (ベクタ一社； 2 g/ml) を各ゥヱルに 50〃 1 ずつ加え、室温で 30分間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 4回洗浄した。〇 P D溶液を各ゥエルに 50 1 ずつ加え、室温で 10分間放置した後、 2 H₂S 0₄ 溶液を各ゥエルに 50〃 1 ずつ加え、これを 49 2nm 波長で吸光度を測定した。

E L AM— 1抗体が、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ' 抗体 No.11及び 2→ 3 シァリル L e · 糖タンパク溶液と反応しないことを示すために、下記 1処理群及び 2処理群についても同様に吸光度を測定した。結果を表 4に示す。

(以下余白、次頁へつづく）表 4

〈各処理群の操作手順〉

1 ； E L AM- 1抗体（No.93) —ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ' 抗体（No.11) —アビジン化 P O D—発色

2 ； E L AM— 1抗体（No.93) - 2→ 3 シァリル L e 。糖夕ンパク溶液一ビォチン化 2— 3 シァリル L e ' 抗体（No.11) 一アビジン化 P 0 D—発色

3 ； E L AM - 1抗体（No.93) - E L AM- 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質一 2→ 3 シァリル L e 。糖夕ンパク溶液- ピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^β 抗体（No.11) 一アビジン化 P OD—発色

表 4 より、 E LMA— 1抗体は、ピオチン化 2→ 3 シァリル L e * 抗体及び 2→ 3 シァリル L e ' とは反応せず、 E L AM 一 1 と 2→ 3 シァリル L e ' とが結合することによって形成された複合体とのみ反応することが明らかである。

従って、 E L AM— 1 とそのリガンドとの複合体の E L AM 一 1部分を認識する E L AM— 1抗体及び 2→ 3 シァリル L e ' 抗体を用いることによって、 E L AM— 1 と 2— 3 シァリル L e ' との複合体のみが測定されることが明らかである。

3. E L AM- 1 と 2→ 3 シァリル L e ' との複合体（E L AM - 1 Z2→ 3 シァリル L e ' 複合体）の測定

①使用した材料は以下のようにして調製された。

* E L AM— 1 Z 2— 3 シァリル L e * 複合体溶液の調製 E L AM- 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質 ( 10000 U/ral) 及び 2— 3 シァリル L e · 糖タンパク溶液 ( 10000 U/ml) を等量混合して室温で 1 時間放置したサンプルを複合体溶液とし、その濃度を 10000 U/mlとした。

② E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e * との複合体を、以下の方法で測定した。

P B Sで希釈した E L AM— 1抗体 No.93 (50 ^ g/ml) を 96 穴プレートの各ゥエルに 50 1 ずつ加え、 4 °Cで 1 晚放置した。抗体溶液を回収した後、ブロックエース一 0.05%N a N₃ 溶液を各ゥヱルに 200 〃 1 ずつ加え、 4 °Cで 1 晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 1 回洗浄した後、上記 E L AM— 1 Z2— 3 シァリル L e ' 複合体溶液を各ゥエルに

1 ずつ加え、室温で 2時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥェルを 3回洗浄した後、ピオチン化 2— 3 シァリル L e ⁴ 抗体 No.11 ( 2 g/ml) を各ゥヱルに 50 1 ずつ加え、室温で 2時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥェルを 3回洗浄した後、アビジン化 P O D (ベクター社； 2 / g/ ml) を各ゥヱルに 50 z 1 ずつ加え、室温で 30分間放置した。 10 %ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 4回洗浄した。 O P D 溶液を各ゥルに 50 1 ずつ加え、室温で 10分間放置した後、 2 H₂S 04 溶液を各ゥエルに 50 ί 1 ずつ加え、これを 49 2nm波長で吸光度を測定した。

その結果、 10000 U/mlの E L AM— 1 2— 3 シァリル L e ' 複合体溶液の吸光度は、 1.608 であり、この方法によって E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e * との複合体を充分測定することができた。

従って、この発明の測定法によれば、セレクチンとそのリガンドとの複合体を充分測定することができると考えられる。実施例 4

固相化 2→ 3 シ了リル L e * に結合する E L AM— 1 の測定

①使用した材料は、すべて、実施例 1、 2、 3で調整した通りである。

②固相化 E L AM— 1 に結合する 2→ 3 シァリル L e ^e 糖夕ンパクの測定

P B Sで希釈した抗 2→ 3 シァリル L e ' 抗体 No.11 (50 g/ ml) を 96穴プレートの各ゥヱルに 50 1 ずつ加え、 4 °Cで 1晚放置した。抗体溶液を回収した後、ブロックエース（大日本製薬社製） -0.05%N a N₃ 溶液を各ゥエルに 200 1 ずつ加え、 4 °Cで 1 晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥェルを 1回洗净した後、 2— 3 シァリル L e ' 糖タンパク溶液（50 00U/ml) を各ゥルに 50 1 ずつ加え、室温で 2時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 3回洗浄した後、 E L AM- 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質（50 00U/ml) を各ゥエルに 50 1 ずつ加え、室温で 2時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥェルを 3回洗浄した後、ビチオン化した E L AM— 1抗体 No.93 ( 2 fi g/ml) を各ゥェルに 50 1 ずつ加え、室温で 2時間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 3回洗浄した後、アビジン化ペルォキシダ一ゼ（ベクター社； 2 〃 g /ml) を各ゥエルに 50 1 ずつ加え、室温で 30分間放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥエルを 4回洗浄した。〇 P D溶液を各ゥエルに 50 1 ずつ加え、室温で 40分間放置した後、 2 M H₂S〇 ₄溶液を各ゥエルに 50/ 1 ずつ加え、これを 492nm波長で吸光度を測定した。

2→ 3 シァリル L e ' 抗体とビチオン化 E L AM— 1 抗体 (No.93) は、 2— 3 シァリル L e ^β 糖タンパクのみとは反応しないことを示すために、下記処理群 1 についても同様に吸光度を測定した。結果を表 5に示す。

(以下余白、次頁へつづく）表 5

<各処理群の操作手順 >

1 . 2— 3 シァリル L e * 抗体（No.11)— 2→ 3 シァリル L e ' 糖タンパク溶液一ピオチン化 E L AM— 1抗体（No.93)— アビジン化ペルォキシダーゼ一発色

2. 2→ 3 シァリル L e * 抗体（No.11)— 2→ 3 シァリル L e ' 糖タンパク溶液一 E L AM— 1 を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質一ピオチン化 E L AM— 1抗体（No.93)—ァビジン化ペルォキシダーゼ一発色

表 5 より、 2→ 3 シァリル L e ^β 抗体とピオチン化 E L AM 一 1抗体は、 2— 3 シァリル L e · 糖タンパクのみとは反応せず、 2→ 3 シァリル L e ' 糖タンパクと E L AM— 1 とが結合することによって形成された複合体とのみ反応することが明ら力、である。

従って、 E L AM— 1 のリガンドと E L AM— 1 との複合体のリガンド部分を認識する 2→ 3 シァリル L e ' 抗体と E L A M- 1部分を認識する E L AM— 1抗体とを用いることによつて、 E L AM— 1 のリガンドと E L Αίν [— 1 との複合体のみが測定されることが明らかである。

実施例 5

癌患者の手術前後における血清中 E L AM— 1 と 2→ 3シァリル L e ^x からなる複合体（ E L AM— 1 2→ 3シァリル L e ^¾ ) 濃度又は E LAM— 1 と 2→ 3シァリル L e * からなる複合体（E LAM - 1 2→ 3シァリル L e * ) 濃度の推移 ①使用した材料は以下のようにして調整された。

* ピオチン化 2→ 3シァリル L e ^x 抗体及びピオチン化 2→ 3シァリル L e ' 抗体の作製

実施例 1におけるピオチン化した E L AM— 1 に対するモノクローナル抗体の作製法に準じた方法によって、 2 ~ 3シァリル L e ^x 抗体〔C S L E X— 1〕及び 2→ 3シァリル 6 ⁴ 抗体〔 2 D 3〕をそれぞれピオチン化した。

*標準溶液の調製

i ) E LAM— 1 Z2— 3シァリル L e ^x 複合体溶液の調製 E L A M - 1を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質 ( 10000 U/ml) 及び 2→ 3シァリル L e ^x リボソーム（100 H g/ml) を等量混合して室温で 1時間放置したサンプルを、 E LAM— 1 Z2→ 3シァリル L e ^x 複合体溶液とし、その濃度を 10000 U/mlとした。

u) E LAM— 1 Z2— 3シァリル L e ' 複合体溶液の調製 E L AM - 1を含む正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞溶解質 ( 10000 UZml) 及び 2— 3 シァリル L e * 糖タンパク溶液 ( 10000 UZml) を等量混合して室温で 1 時間放置したサンプルを、 E L AM— 1ノ 2→ 3 シァリル L e · 複合体溶液とし、その濃度を 10000 U/mlとした。

*患者血清

肝癌、胃癌患者の手術前後の血清

肝癌患者においては、手術 30日前及び 9 日前の血清と手術後 13日目及び 42日目の血清を用いた。胃癌患者においては、手術 25日前及び 4 日前の血清と手術後 6 日目及び 22日目の血清を用いた。

②血清中の E L AM— 1 と 2— 3 シァリル L e ^x からなる複合体（E L AM— 1 2— 3 シァリル L e ^x ) 又は E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e * からなる複合体（E L AM— 1ノ 2→ 3 シァリル L e * ) の測定

P B Sで希釈した E L AM- 1抗体 No.93 ( 50 ^ g/ml) を 96 穴プレートの各ゥヱルに 50 1ずつ加え、 4 °Cで 1 晚放置した。抗体溶液を回収した後、ブロックエース（大日本製薬社製）一 0.05^N a Ν₃ 溶液を各ゥエルに 200 1 ずつ加え、 4 °Cで 1 晚放置した。 10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 1 回洗浄し、 E L AM— 1抗体固相化プレートとした。一方、各試験管にそれぞれの血清 50〃 1 とピオチン化 2→ 3 シァリル L e ^x 抗体 CC S L E X— 1 〕又はピオチン化 2— 3 シァリル L e ' 抗体〔 2 D 3〕（ 2 ^ g/ml) 50/z 1 を加え、室温で 2時間放置した後、アビジン化ペルォキシダーゼ（ 6 μ. g / l) 50 1 をその上に添加し、室温で 1 時間放置した。これを E L AM— 1 抗体固相化ブレートに 100 1加え、室温で 2時間放置した。

10%ブロックエース一 P B Sで各ゥヱルを 3回洗浄した後、〇 P D溶液を各ゥエルに 100 1 ずつ加え、室温で 10分間放置した。その後 2 M H₂S 04 溶液を各ゥヱルに 100 μ. 1ずつ加え、これを 492nm波長で吸光度を測定した。

予め標準溶液を用いて作成した検量線から、各々の複合体濃度を算出し、その結果を表 6 に示す。

表 6中、 I は、 E L AM— 1 と 2— 3 シァリル L e ^x との複合体濃度の測定結果を、 Iは、 E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e ^Λ との複合体濃度の測定結果を示している。

(以下余白、次頁へつづく）

表 6

肝瘙患者 A

I E LAM— 1 と 2— 3シァリル L e ^x との複合体〔E LA

M 1 /2— 3シァリル L e ^x 〕濃度（U/ml)

I E LAM— 1 と 2→ 3シァリル L e * との複合体〔E LA M 1 / 2→ 3 シァリル L e * 〕濃度（ UZml) 一般に、癌患者の手術後は癌転移の可能性が高くなることが知られている。従って、本実施例の結果より、本発明による E L AM- 1 とそのリガンドとの複合体の測定法は、手術後の癌転移の危険度をモニタリングできる有効な診断法である可能性が高いことがわかる。特に、肝癌においては、 E L AM— 1 と 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体及び E L A M— 1 と 2→ 3 シァリル L e ' との複合体のいずれからもモニタリングできる可能性があり、胃癌においては、 E L A M— 1 と 2→ 3 シァリル L e ^x との複合体の測定により、モニタリングができると考えられる。また、このように癌転移の可能性が高くなれば複合体濃度が高値になることから、通常時（例えば手術前）の癌患者においても高値であればあるほど転移の可能性が高いと診断することができる。

この発明によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法は、癌転移、炎症性疾患又は糖尿病をはじめとする血管関連疾患の診断に有用である。特に、 2→ 3 シァリル L e ^x を発現する腎癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、降癌、肝癌、子宮癌、乳癌、白血病及び 2→ 3 シァリル L e * を発現する脖癌、胆癌、肝癌、大腸癌をはじめとする消化器系の癌における転移の可能性の診断に有用である。また、炎症に関わる疾患、例えばリウマチ、 S L Eをはじめとする自己免疫疾患や移植時に起こる炎症、ァレルギ一、気管支炎や喘息、敗血症、皮唐炎、ウィルス疾患等の診断に有用であり、さらには、血液関連疾患、例えば糖尿病、心筋虚血再灌流障害、粥状動脈硬化等の診断にも有用である。従って、この発明によるセレクチンとそのリガンドとの複合体の測定法によれば、炎症性疾患及び血管関連疾患をより正確に診断することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 生体試料に、セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とを接触させ、その生成物から、前記複合体と、該複合体のセレクチン部分を認識する抗体及びリガンド部分を認識する抗体との結合を測定することを特徵とするセレクチンとそのリガンドとの複合体の定性的及び/又は定量的測定法。

2 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体が、支持体に固定されている請求項 1 記載の測定法 6

3 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、支持体に固定されている請求項 1 記載の測定法。

4 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体が、無標識であるか、又は酵素、補酵素、蛍光色素もしくは放射性同位元素で標識されている請求項 1 又は 3に記載の測定法。

5 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、無標識であるか、又は酵素、補酵素、蛍光色素もしくは放射性同位元素で標識されている請求項 1 又は 2に記載の測定法。

6 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体が、ビォチンで標識されている請求項 4記載の測定法。

7 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、ピオチンで標識されている請求項 5記載の測定法 0

8 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体がモノクローナル抗体であり、かつ前記複合体のリガンド部分を認識する抗体がモノクローナル抗体である請求項 1 〜 7のいずれか 1 つに記載の測定法。

0 9 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体と、リガンド部分を認識する抗体とのセットからなる癌転移、炎症性疾患又は血管関連疾患の診断用キット。

10. セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体が、支持体に固定されている請求項 9記載の診断5 用キット。

1 1 . セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、支持体に固定されている請求項 9記載の診断用キッ卜 C

12. セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を0 認識する抗体が、無標識であるか、又は酵素、補酵素、蛍光色素もしくは放射性同位元素で標識されている請求項 9又は 1 1に記載の診断用キット。

1 3. セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、無標識であるか、又は酵素、補酵素、蛍光色素もしくは放射性同位元素で標識されている請求項 9又は 10に記載の診断用キット。

14. セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体が、ピオチンで標識されている請求項 12記載の診断用キット。

1 5. セレクチンとそのリガンドとの複合体のリガンド部分を認識する抗体が、ピオチンで標識されている請求項 1 3記載の診断用キット。

1 6. - セレクチンとそのリガンドとの複合体のセレクチン部分を認識する抗体がモノクローナル抗体であり、かつ前記複合体のリガンド部分を認識する抗体がモノクローナル抗体である請求項 9〜15のいずれか 1つに記載の診断用キット。

17. 血管関連疾患が、糖尿病である請求項 9〜1 6のいずれか 1 つに記載の診断用キット。