WO1995004539A1

WO1995004539A1 - Adjuvant d'immunite et procede permettant de renforcer l'immunite d'un animal avec cet adjuvant

Info

Publication number: WO1995004539A1
Application number: PCT/JP1994/001301
Authority: WO
Inventors: Atsune Takahashi; Teruo Okubo; Kazuhiro Kubo
Original assignee: Ahc Inc.
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 1995-02-16
Also published as: AU7276194A

Description

明細書免疫賦活剤及びこれを用いる動物の免疫陚活方法技術分野

本発明は、免疫賦活剤に関し、更に詳細には、特定のバチルス属微生物を利用する、ヒトをはじめとする哺乳動物や鳥類、魚類等の動物の免疫陚活剤および免疫賦活方法に関する。背景技術

動物の病原細菌等による感染症としては、哺乳動物や鳥類の大腸菌症、乳房炎、サルモネラ菌感染症や、魚類のカラムナリス病（columnari s di sease) 、類結節症（bacterial pseudotubercul osis ) 、連鎖球菌症などが知られているが、その予防 · 治療には抗生物質が中心的に用いられており、各種の抗生物質の利用により病原細菌等による重篤な感染症は減少している。

しかし、一方では、抗生物質の安易な使用が、例えば畜水産物中の抗生物質の残留、耐性菌の増加、菌交代症などを引き起し、社会問題となっている。

すなわち、抗生物質を乱用された患者や家畜、家禽、養殖魚等は、それ自身が有する感染防御能が著しく低下し、感染症に対する修復機能も障害されているため、感染症は治癒しにくく、再感染し易い状態になっている。

さらに日和見感染症が多発したり、畜水産業界におけるの生産性の低下による多大な損失などが報告されている。

例えば、乳牛の乳房炎は、細菌の感染によって発症する乳腺あるいは乳腺間質結合組織の炎症であり、その原因菌の種類は多いが、ブドウ球菌（Staphyl ococcus ) 、レンサ球菌 ( Streptococcus ) 、緑菌 ( Pseudomonas aeruginosa ) 、コリネバクテリゥム（Corynebac ter i um ) 、大腸菌（Escheri chia co l i ) 、真菌などの常在菌が主体であるとされている。

乳房炎の発病誘因として搾乳不全、ミルカ一の不適合などの窖理失宜をはじめ、飼育環境、ホルモン状態、免疫不全等広範囲に及ぶ。

乳房炎の症状、経過は、原因菌の種類、牛の年齢、泌乳期、季節などによりまちまちであるが、乳量の低下、乳汁中の体細胞数の増加等による乳質の低下が起こり、また投薬治療に伴う出荷停止、供用年数の短縮などの問題が生じるため、酪農家にとって大きな問題になっている。

この乳房炎には、臨床型乳房炎と不顕性乳房炎の 2つのタイプがあり、このうち、臨床型乳房炎は前記したように乳腺等に炎症が認められるもの、不顕性乳房炎は乳牛の全身、乳房あるいは乳汁に外親上の異状は認められないが、乳汁中の体細胞数が多く（ 5 0万個 Z m 1以上が乳房炎に罹病していると考えられており、 3 0万個 1以上の牛乳は出荷停止処分にする動き有り）、 p H、電気伝導度、細菌数あるいは N —ァセチルー /?ーグルコサミダーゼ等の特異的な酵素の上昇が認められるものをいう。

現在、乳房炎の大部分は不顕性乳房炎であり、酪農の経済性に絡み問題となつている。

乳房炎の予防 · 治療方法としては、他の感染症の予防 · 治療方法とほぼ同じく抗生物質、例えば、レパミゾ一ル（特公昭 5 9— 1 1 5 6 5号）、緑膿菌菌体蛋白（特開昭 5 1 _ 1 0 6 7 1 4号）等の投与が中心であって、乳房炎の予防に畜舎、搾乳機のあるいは乳房消毒などの環境衛生管理のほか、抵抗力増強のための栄養管理がなされているにすぎない。

上記したように、動物の感染症の予防 · 治療は、主に抗生物質の使用により行われているが、投与された抗生物質は畜水産製品中に残留して出荷が制限されるという問題があり、また、前記したような耐性菌の出現、あるいは、過剰投与による免疫機能の低下など多くの問題があり、感染症を抗生物質の投与によらず予防 · 治療する方法の開発が望まれていた。

また、これまでにも微生物の菌体、または細胞壁構成成分を家畜に与え、感染症を予防 · 治療する方法は既に知られているが、下痢の防止などの胃腸病に対するものが大部分である。

例えば、生きた菌を直接投与することにより、微生物を腸内に定着させ、病原性大腸菌等と拮抗し、これらを排除することによって腸内微生物叢を改善し、家畜等の白痢、下痢を予防 · 治療する方法が知られている。この方法には、乳酸菌なども使用されるが、製品の安定性のため、バチルス ' セレウス（特開平 2— 1 3 8 9 4 2号、特開平 4一 2 9 3 4 5 8号、特公平 5 3— 6 2 1 1号）、バチルス ' スブチリス（特開平 1 — 1 2 1 2 1 9号；抗クロストリジゥム生菌剤）、納豆菌（バチルス ' ナット）（特公昭 4 5— 1 1 1 0 8号）等のような有胞子細菌も用いられる。また、試験管内での抗菌活性について検討し、これから特定のバチルス · スプチリスや、バチルス ' リケニホルミスが白血球の食細胞活性を刺激するとの報告（特表平 1一 5 0 2 34 0号）もある。

—方、ペプチドグリカン等の細菌細胞壁成分は免疫陚活剤（アジュバンド）として古くから知られており、家畜等の白痢、下痢の予防 · 治療効果および、ある種の感染症に対する効果が報告されている。

例えば、ビフィドバクテリゥム ' サ一モフイリゥム（Bifidobacteruum Ther- mophilum) の細胞壁成分（特開昭 5 6— 1 08 7 1 7号）、ビフイドバクテリウム ' サーモフイリゥムのペプチドグリカン（特開昭 6 2— 2 6 5 2 3 1号）およびバチルス属他の殺菌処理菌体あるいは細胞壁成分（特開平 3— 1 7 3 8 2 6号）が知られている。

また、コクシジゥム症の予防 ' 治療のために、バチルス属他の殺菌処理菌体ぁるいは細胞壁成分を利用すること（特開平 4一 1 8 2 4 3 3号）およびォーエスキー病を予防 . 治療するためにペプチドグリカン含有菌体末を利用すること（特開平 4一 2 8 7 6 4 7号）も知られている。更に、ビフイドパクテリゥム属の細胞壁成分であるペプチドグルカンが、小腸粘膜固有層中の I g A保有細胞数を増加させることが報告されている（特開平？一 1 1 5 1 9号）。発明の開示

本発明者は、動物の感染症の予防 · 治療方法について鋭意研究を重ねた結果、特定のバチルス属微生物を用いることにより、有効に動物の免疫能を向上せしめることができ、乳房炎等の感染症を予防、治療しうることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明の第一の目的は、アフラトキシン分解能を有するバチルス

(Bacillus) 属の微生物の菌体またはその細胞壁構成物を有効成分とする免疫賦活剤を提供することである。

また、本発明の他の目的は、動物に、上記微生物の菌体またはその細胞壁構成物を摂取させることを特徴とする動物の免疫賦活方法を提供することである。なお、上述のように従来より微生物やその細胞膜成分は種々の目的に利用されているが、バチルス属微生物の菌体自身あるいはその細胞壁成分をマク口ファージの貪食活性上昇による免疫賦活のために利用する技術は知られておらず、本発明者らが初めて明らかにした作用である。発明を実施するための最良の形態

本発明において使用されるアフラトキシン分解能を有するバチルス（Bacillus) 属の微生物の一例としては、本発明者らが先に見出した、バチルススブチリス D B— 9 0 1 1株 [平成 3年 5月 2 1 日付で工業技術院微生物工業技術研究所にブタぺスト条約に基づく国際寄託済（F E RM B P— 3 4 1 8) ；最初は種名をバチルスリケニホルミスとして寄託したが、後にバチルススブチリスに変更した。 1 およびバチルスプミルス（ " プルミルス" ともいう） D B— 9 0 08 株 [平成 3年 5月 2 1 日付で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済（F E R M P— 1 2 2 6 6 ) ；その後 1 9 9 4年 7月 2 9 日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託に移管した（ F E R M B P— 4 7 6 2 ) 。 ] が挙げられる。このうち、バチルス ' スプチリス D B— 9 0 1 1株は、生菌剤として投与することにより乳量の増加が報告されている（特顧平 4 _ 1 8 43 4号）。

これら微生物の菌学的性状を示せば次の通りである。

表 1

項目 B .スブチリス B .プミルス

DB- 9011株 DB- 9008株菌体の膨脹

7 % N a C 1 + +

N 0₃→N 0 + +

V P反応 + +

E g · y o r k

インドール

6 0。C

グラム + +

芽胞の位置中央中央

光沢なしなし

コロニー表面しわしわ

形態：

バチルス · スブチリス D B— 9 0 1 1株は、菌体幅 0.7 ~ 0.8 ^ mの捍菌である。楕円形の芽胞がやや中央に存在し、菌体を膨脹しない。運動性はあり、 R型コロニーを形成する。嫌気性条件下において生育しない。

バチルス ' プミルス D B— 9 0 0 8株は、菌体幅 0 . 6 ~ 0 . 7 mの桿菌である。芽胞を形成し（楕円形、中央部に存在）、菌体の膨脹を認めない。：型コロニーを形成し、嫌気性条件下において生育しない。各培地における生育状態：

( バチルス - スブチリス D B— 9 0 1 1株）

( 1 ) D H L寒天培地

生育せず。

( 2 ) マッコンキ一寒天培地

発育せず。

( 3 ) マンニット食塩培地

良好な発育。光沢あり。コロニーの表面にしわはなく、コロニーの色は黄色である。

( 4 ) 普通寒天培地

良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。

( 5 ) ハートインフージョン寒天培地

( 6 ) 血液寒天培地（ 1 0 %緬羊血液加）

( 7 ) P D A培地

良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。 ( バチルス ' プミルス D B— 9 0 0 8株）

( 1 ) D H L寒天培地

生育せず。

( 2 ) マッコンキー寒天培地

発育せず。

( 3 ) マンニット食塩培地

発育せず。

(4 ) 普通寒天培地

発育せず。

( 5 ) ハートインフージョン寒天培地

良好な発育を示す。コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め、 R型である。また、コロニーは灰白を呈する。

( 6 ) 血液寒天培地（ 1 0 %緬羊血液加）

良好な発育を示す。コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め, R型である。また、コロニーは灰白色を呈する。溶血性は +である。 ( 7 ) P D A培地

良好な発育を示す。コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め、 R型である。また、コロニーは灰白色を呈する。生理学的性質：

( バチルス ' スブチリス D B— 9 0 1 株）

グラム反応： +

ゼラチン試験：

生育状態；全面液化

ゼラチン液化； +

リトマスミルク：反応；酸

状態；凝固

硝酸塩還元： +

脱窒反応：一

M Rテスト：一

インドールの生成：一

硫化水素の生成：一

クェン酸の利用（クリステゼン）

+

ゥレアーゼ：一

ォキシダーゼ： +

カタラーゼ： +

生育の範囲：

P H ； 4 ~ 9

温度； 2 5〜 5 0 °C

0 Fテスト：発酵およびガス発生（ブドウ糖分解によるもの）糖類の利用性

ガス発生酸生成

L—ァラビノース + .

D —キシロース +

D —グルコース + +

D—マンノース +

D —フラクト一ス +

D—ガラクト一ス + 麦芽糖（マルトース） + ショ糖 '（シュ一クロース） + 乳糖（ラクト一ス） + トレノヽロース +

D—ソルビヅト + D —マンニット + イノシット + グリセリン + デンプン + エスクリンの分解： +■

マロン酸の利用：

アルギニンの分解：

リジンの脱炭酸反応： +

尿素分解：

プロピオン酸分解性：

スターチ分解性： +

カゼィン分解性 +

アフラトキシン分解： +

オル二チンの脱炭酸反応：

コアグラ一ゼ：

溶血性： +

塩化ナトリゥムの耐性： 1 0 %以下

シアン化カリゥムの耐性：発育可能

レシチナーゼ： ( バチルス · ブミルス D B - 9 0 0 8株）

グラム反応： 4- 力タラ一ゼ： +

嫌気性発育：

7 % N a C 1培地発育： +

リジン脱水素反応： +

アルギニン脱水素反応： +

尿素分解：

卵黄反応：

硝酸塩還元： +

V P反応： +

炭水化物分解：

ぶどう糖 +

ァラビノース +

キシロース +

マンニヅト +

ガラクトース +

ラムノース +

グリセ口一ル +

エスクリン +

デンプン分解

インドール

ォキシダ一ゼ + ゼラチン液化： + (全面液化）塩化ナトリゥムの耐性： 1 0 %以下硫化水素産生：

クェン酸の利用：

アミラーゼ：

溶血性： +

生育の範囲：

P H ； 4 ~ 9

温度； 2 5〜 5 0 °C バチルス属微生物としては、上記菌株以外であっても、それらと菌学的に同一性を有するものであればいずれも利用することができる。

また、これら微生物としては、その生菌、死菌、細胞壁組成物のいずれをも利用することができる。なお、生菌は、栄養細胞と耐熱芽胞（バチルス属微生物が形成する耐熱性の胞子）を称し、通常の培養による場合は、培養物中にこれらが混在し、高温処理以外の手段により分離することは困難である。

本発明で用いるバチルス属微生物を得るには、通常の培養方法に準じてバチルス属微生物の培養を行なえば良い。培養で得られた微生物は、そのまま遠心分離法等により集菌し、栄養細胞と耐熱芽胞を生菌として用いても良いが、この生菌を 7 0 ~ 8 0 °C程度の温度で 1 0 ~ 3 0分間程度熱処理し、栄養細胞を死滅させ、耐熱芽胞のみで用いることも出来る。また、細胞を機械的あるいは酵素的に破碎し細胞壁構成画分を分画して用いることも出来る。

バチルス属微生物の細胞壁構成画分を得るには、例えば、フレンチプレス、超音波破砕機等を用いる機械的な方法で菌体を破碎し、遠心分離で細胞壁含有成分を回収すればよい。

かくして得られた生菌、死菌、細胞壁組成物は、適当な濃度になるよう水または緩衝液に懸濁し、必要によりこれを乾燥させることにより、本発明の免疫賦活剤を得ることができる。本発明免疫賦活剤のとりうる剤型には特に制限はなく、錠剤、粉剤、粒剤、力プセル、ペースト、液剤等の任意の剤型とすることができる。これらの剤には、例えば乳糖、グルコース、ソルビトール等の賦形剤や甘味料、色素、香料等の任意成分を加えることも可能である。

本発明の免疫賦活剤は、抗生物質の連続投与等により免疫力が低下した動物や、感染症に感染しあるいは感染が予想される動物に使用される。さらに本発明の免疫賦活剤は医薬品としてだけでなく、機能性を有する健康食品/保健用食品として利用することもできる。すなわち、本発明免疫賦活剤を含有する食品を日常的に摂取することによって免疫力の向上を促し積極的な健康保持を図ることが期待できる。

本発明免疫賦活剤の投与対象となる動物としては、例えばヒト、家畜等の哺乳動物、家禽等の鳥類、養殖魚等の魚類などを挙げることができる。これらの中でも本発明の有効利用が特に期待できる動物は、牛、豚等の家畜および鶏等の家禽である。

本発明の免疫賦活剤の投与方法としては、非経口投与、例えば注射剤による投与も可能であるが、経口投与方法が好ましい。

この免疫賦活剤の投与量は特に制約されるものではないが、動物種にかかわらず 1 日当り 1 0 ^fi ~ 1 0 ⁹個/ K g (体重）程度が好ましい。

また、家畜や家禽、養殖魚に対して本発明の免疫陚活剤を投与する場合は、そのまま経口投与するよりも、飼料、餌等に混ぜて投与することがより好ましい。この場合、一般には、飼料、餌中に 1 0 ³ ~ 1 0 ^{1 (1}個 Z g、好ましくは 1 0 ⁵ ~ 1

0 ⁸個程度の菌体を含有せしめることが好ましい。実施例

次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。参考例 1

バチルス ' スブチリス D B— 9 0 1 1の培養：

下記の培地 1 8 リヅトルを 3 0 リヅトルの培養槽にいれ、 1 2 1 °Cで 1 5分間殺菌した。予め、 5 0 Omlの三角フラスコ 2本（液量 1 00 m 1 ；培地組成は下記に同じ）で 1 2時間前培養した菌を植菌し、 2 4〜 4 8時間通気培養を行なつた。この培養は、通気量 1 8リットルノ分、回転数 4 0 0 r p m、内圧 0.2 k g /c m²- G、温度 3 7 °Cで行なった。

培養終了後、菌体を遠心分離機で回収し、この回収菌体に同容量の 1 0 %スキムミルク溶液を加え均一に混合した。更に凍結乾燥を行い、 l g当たり 1 X 1 0 '°個のバチルス · スブチリス D B— 9 0 1 1菌を含有する乾燥物 6 k gを得た。

( 培地組成）

グルコース 2 0 g/1

ポリペプトン 1 0 g/ 1

ミート - ェクストラクト 3 g/1

イースト · ェクストラクト 2 g/1

N a C 1 5 g/1

K H ₂P 0₄ 1 g/1

M g S 0 · 7 H ₂0 0.5 g/1

F e C 1₃ · 4 H ₂0 7 m g/ 1

参考例 2

バチルス · プミルス ϋ Β— 9 0 0 8·の培養：

参考例 1 と同様にして、 1 g当たり 1 0¹⁰個のバチルス ' プミルス D B— 9 00 8菌を含有する乾燥物 4 k gを得た。実施例 1

マウスマクロファージ貪食能の増強作用（ 1 ) ：

参考例 1のバチルス · スプチリス D B— 9 0 1 1 を用い、表 2の試料を調製した。この各試料を 1群 5匹の D D Y系マウス（ $、 8週令）に胃内投与し、投与 4 8時間後に脾臓を取り出してルミノール依存性化学発光法によりマクロファージ貪食能を評価した。対照区としては、試料を全く投与しない群を用いた。この結果、 D B— 90 1 1株にマクロファージの貧食能を増強する作用があることが判明した（表 3 ) 。

表 2

心分離により回収し、滅菌水で 3回洗浄後、滅菌水に想濁した。 5 X 1 0 '°個 Zm 1の芽胞想濁液とした。 3

* 各区共 5匹の平均、非投与区を 1 0 0 %とした。実施例 2

バチルス · スブチリス D B— 9 0 1 1菌による乳房炎感染防御：参考例 1で得た原末を乳糖で 1 0倍に希釈し、 1 0 ⁹個 , gの生菌を含有する飼料添加物（製剤 A ) を調製した。

ホルスタイン種の搾乳中の乳牛のうち、乳汁中への体細胞の流出が多い牛にこの製剤 Aを 1 日、 1頭当たり 1 0 gを 1 5 日間毎日投与し、体細胞流出の減少からバチルス · スブチリス D B — 9 0 1 1菌による L房炎感染防御作用を調べた。体細胞数の計測はブリード法（ B r e e d法）により行った。

投与は製剤 Aを少量の餌と混ぜ与え、食べ終わりを確認することで行った。対照区としては、乳汁中への体細胞の流出が多い牛（製剤 Bほか薬剤を投与しないもの）を用いた。この結果を表 4に示す。 ( 結果）

乳汁中の体細胞数（個/ m 1 )

I 牛番号投与前投与後試験区 80 0 0 X 1 0 < 1 0

7 8 34 X 1 0 5 X 1 0 対照区 6 5 24 X 1 0 1 5 X 1 0

6 6 34 1 0 3 6 X 1 0

67 2 6 X 1 0 8 X 1 0

実施例 3

バチルス · プミルス D B— 9 0 0 8菌による乳房炎感染防御：参考例 2で得た原末を、乳糖で 1 0倍に希釈し、 1 0⁹個の生菌を含有する飼料添加物（製剤 B ) を調製した。

以下、ホルスタイン種の乳牛を用い、実施例 2と同様にしてバチルス ' プミルス D B— 9 0 0 8菌による乳房炎感染防御作用を調べた。この結果を表 5に示す。

( 結果）乳汁中の体細胞数（個 Zm 1 )

牛番号投刖投与後試験区 5 0 2 3 X 1 0 < 1 0

1 5 1 5 8 1 0 4 X 1 0⁴

対照区 1 6 5 2 4 X 1 0⁴ 1 5 x 1 0

1 6 6 3 4 X 1 0⁴ 3 6 X 1 0

1 6 7 2 6 X 1 0⁴ 8 X 1 0

実施例 4

大腸菌症治療効果：

参考例 1で得た乾燥物を米糠で希釈し、 1 0⁸個のバチルス · スブチリス

D B - 9 0 1 1株の生菌を含有する飼料添加物（製剤 D ) を調製した。

予め大腸菌に感染させた鶏に、この飼料添加物を含有した飼料を一定期間与えた後、屠殺し、大腸菌の感染の有無を確認した。

大腸菌の感染は、 1 4日令のブロイラー（） 4 0羽に 1羽当たり 1 .9 X 1 0⁸個の大腸菌を胸筋内に接種することにより行った。

また治療試験は、大腸菌に感染した鶏を 2群に分け、それぞれ試験区一 1、試験区一 2 とした。試験区一 1には表 6に示す飼料一 Aを、試験区一 2には表 6 に示す飼料一 Bをそれぞれ 7 日間給与した。その後、各試験区の被験ブロイラーについて、元気消失、沈うつ、食欲不振、呼吸器症状、糞便性状の異常、跛行などの臨床症状を親察した後屠殺 · 解剖し、心嚢炎、肝包膜炎、気嚢の混濁腫脹、脾臓の充血および腫脹、関節嚢内の膿様物の貯留などの肉眼的病理所見を親察した。また心嚢拭い液を採取し D H L寒天培地を用いて大腸菌の検出試験を行った, なお、対照区としては、大腸菌の非感染のブロイラー（） 2 0羽に飼料一 B を同様に給与した 1群を用いた。この結果を表 7 に示す。

表 6

飼料組成

7 死亡率 I 臨床症状陽性率 * ί 大腸菌症陽性率'

(%) (%) ： (%) 試験区一 1 0 0 0 試験区一 2 6 0 0 0 1 0 0 対照区 0 0 0

* 臨床症状陽性：

元気消失、沈うつ、食欲不振、呼吸器症状、糞便性状の異常、跛行などの臨床症状を呈した個体を陽性とした。

** 大腸菌症陽性：

心嚢炎、肝包膜炎が認められ、かつ心臓から大腸菌が検出されたもの。表 7の結果から明らかなように、 7日間の飼養期間において、大腸菌感染鶏を通常の飼料（飼料一 Β ) で飼育した試験区一 2.においては、大腸菌症陽性率が 1 00 %であり、死亡率も 6 0 %と高率であった。一方、大腸菌感染鶏を D B— 9 0 1 1株を含む飼料（飼料— Α) で飼育した試験区一 1においては、対照区と同様、死亡例、臨床症状陽性例および大腸菌症陽性例は認められなかった。また、試験区一 1における体重の増加は対照区と有意差がなかった。実施例 5

バチルス · スプチリス D Β— 9 0 Γ 1菌によるサルモネラ菌感染防御：参考例 1で得た原末を貝化石 2 0 %、脱脂米糠 8 0 %を混合してなる希釈剤で希釈し 1 0⁶個/ gの生菌を含有する飼料添加物を調製した（製剤 C) 予め 1羽あたり、 1 0 ^s個 Z m lのサルモネラ菌（サルモネラ · エスピー · セルタイプ . ニューポート）懸濁液 1 m 1 を、 8 0日齢のデルカブ種鶏（ 1群 1 0 羽）にカテーテルで胃内強制投与し、サルモネラ菌に感染させた。

次いで、 1 . 5 %の製剤 Cを配合した大雛用飼料を 8 1 日令〜 8 8 日令の 8 日間、不断給餌で与えた後、屠殺し、肺臓、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、腸管を主体に剖検した。剖検後、小腸内容物を採取し 1 0 %緬羊血液加ブレインハートインフュージョン寒天培地を用いて 3 7 °Cで 1 8 ~ 4 8時間培養し小腸内のサルモネラ菌および大腸菌の検出並びに菌数の測定を行った。

対照としては、上記のようにしてサルモネラ菌に感染させたが、製剤 Cを含有しない大雛用飼料を与えた鶏（ 1群 1 0羽）を用いた。

( 結果）

1 . 剖検結果：

腸管、各臓器の異常は試験区、対照区とも無かった。

2 . 微生物の検出試験結果：

小腸中から、サルモネラ菌および/または大腸菌が検出された鶏の数（ 0羽中）は、表 8の通りである。表 8

サルモネラ菌大腸菌験区 0 3

対区 4 8

I 実施例 6

マウスマクロファージ貪食能の増強作用（ 2 ) ：

参考例 1のバチルス ' スプチリス D B— 9 0 1 1および参考例 2のバチルス · プミルス D B— 9 00 8菌を用い、表 9の試料を調製した。以下、 DD Y系マウス（$、 6週令）を用いる以外は実施例 1 と同様にしてルミノール依存性化学発光法によりマクロファ一ジ貪食能を評価した。その結果を表 1 0に示す。

表 9

試料番号 act ^1 " 名調製法

試料 4 対数増殖期の菌体を遠心分離により集め、これを滅菌水で 3回洗浄後、滅菌水に想濁した。

4 X 1 0⁹個ノ m 1濃度の菌体懸濁液とした。

\ 試料 5 ！！死菌試料 4を滅菌器にて 1 2 1 °C、 1 5分処理し、

1 生きた菌は存在しないことを確認し用いた。

試料 6 胞子芽胞形成期（培養後期）の菌体を 7 0°C、 3 0 分加熱処理し、栄養細胞を殺し、芽胞'のみを遠

！

心分離により回収し、滅菌水で 3回洗浄後、滅

！

水に懸濁した。 5 X 1 0^{1 β}個ノ m 1の芽胞懸濁液とした。 1 0

* 各区共 5匹の平均、非投与区を 1 00 %とした。実施例 7

ナチュラルキラ一（NK) 細胞活性の測定：

参考例 1のバチルス · スブチリス D B— 9 0 1 1を用い、表 1 1の試料を調製した。この試料を 1群 5匹の D D Y系マウス（ $、 6 0日令）に胃内投与し、投与 2 4時間後に脾臓を取り出し、 ⁵¹ C r標識 K 5 6 2細胞（Human myloid cell line) を用いてクロム放出法（Cr release法）により N K細胞活性を評価した。対照区としては、試料を全く投与しない群を用いた。この結果、 D B— 9 0 1 1株に NK細胞活性を増強する作用があることが判明した（表 1 2 ) 。試料番号試料名調製法試料 7 生菌；対数増殖期の菌体を遠心分離により集め、

：これを滅菌水で 3回洗浄後、滅菌水に想濁 : した。 4 X 1 0 ³個/ m 1濃度の菌体想濁；液とした。

表 1 2

* 各区共 5匹の平均。産業上の利用可能性

本発明の免疫賦活剤は、動物が本来有している免疫作用を活性化させ、各種病原細菌等による感染症、例えば、乳房炎や、サルモネラ、大腸菌に起因する感染症を予防 · 治療するものである。特に、乳牛に投与すれば、乳房炎の治療、予防に有効であり、また、鶏に投与すれば、心嚢炎、肝包膜炎等の大腸菌症の予防、治療に有効なものである。このように、本発明の免疫賦活剤は、抗生物質と異なる作用によって、感染症を予防、治療しょうとするものであるから、連用した場合でも問題となることはないという利点を有するものである。

したがって、抗生物質等の薬剤を使用することなく乳房炎等の感染症を予防 - 治療でき、畜水産業における環境管理作業の低減、および畜水産製品の品質低下を防止でき、更には日和見感染症による生産性低下をも防止できるので、特に畜水産業の分野において有利に利用することのできるものである。

Claims

請求の範囲

1 アフラトキシン分解能を有するバチルス（Baci l lus) 属の微生物の菌体またはその細胞壁構成物を有効成分とする免疫賦活剤。

2 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · スブチリスである請求項第 1項記載の免疫賦活剤。

3 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス ' スブチリス D B— 9 0 1 1株である請求項第 1項または第 2項記載の免疫賦活剤。

4 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルスである請求項第 1項記載の免疫賦活剤。

5 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルス D B— 9 0 0 8株である請求項第 1項または第 4項記載の免疫賦活剤。

6 動物に、アフラトキシン分解能を有するバチルス（Bac i l l us) 属の微生物の菌体またはその細胞壁構成物を投与することを特徴とする動物の免疫賦活方法。

7 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · スブチリスである請求項第 6項記載の動物の免疫賦活方法。

8 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス ' スブチリス D B— 9 0 1 1株である請求項第 6項記載の動物の免疫賦活方法。

9 動物が、家畜、家禽または養殖魚である請求の範囲第 6項記載の免疫賦活方法。

0 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · スブチリスである請求項第 9項記載の家畜、家禽または養殖魚の免疫賦活方法。

1 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · スブチリス D B— 9 0 1 1株である請求項第 9項記載の家畜、家禽または養殖魚の免疫賦活方法。

2 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルスである請求項第 6項記載の動物の免疫陚活方法。

3 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルス D B— 9 0 0 8株である請求項第 6項記載の動物の免疫陚活方法。アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルスである請求項第 9項記載の家畜、家禽または養殖魚の免疫賦活方法。5 アフラトキシン分解能を有するバチルス属の微生物が、バチルス · プミルス D B— 9 0 0 8株である請求項第 9項記載の家畜、家禽または養殖魚の免疫賦活方法。