WO1993020217A1 - Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product - Google Patents

Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product Download PDF

Info

Publication number
WO1993020217A1
WO1993020217A1 PCT/JP1993/000408 JP9300408W WO9320217A1 WO 1993020217 A1 WO1993020217 A1 WO 1993020217A1 JP 9300408 W JP9300408 W JP 9300408W WO 9320217 A1 WO9320217 A1 WO 9320217A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant
virus
plant virus
foreign gene
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000408
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Hamamoto
Yoshinori Sugiyama
Noriaki Nakagawa
Eiji Hashida
Suguru Tsuchimoto
Noriyuki Nakanishi
Yuji Matsunaga
Yoshimi Okada
Original Assignee
Kanebo Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27311278&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO1993020217(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from JP4188744A external-priority patent/JP2880024B2/ja
Priority claimed from JP4351970A external-priority patent/JPH06169789A/ja
Application filed by Kanebo Limited filed Critical Kanebo Limited
Priority to US08/313,127 priority Critical patent/US5618699A/en
Priority to DE69333529T priority patent/DE69333529T2/de
Priority to EP93906862A priority patent/EP0672754B1/en
Publication of WO1993020217A1 publication Critical patent/WO1993020217A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8103—Exopeptidase (E.C. 3.4.11-19) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a foreign gene into a plant by using a plant virus, improving the properties of the plant, expressing the foreign gene in the whole plant, and a method for easily and efficiently obtaining the foreign gene product.
  • an object of the present invention is to provide a plant virus vector having infectivity to the whole plant (whole infectivity), a plasmid providing the plant virus vector as a transcript, and the plant virus vector It is an object of the present invention to provide a method for expressing a foreign gene in a whole plant by inoculating the plant with-
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above-mentioned object, and as a result, a base sequence that induces read-through downstream of a coat protein gene of a plant virus C JM Skuzesk et al., J. Mol. Biol. 218, 365-373 (1991)), the use of a plant virus vector to which a foreign gene is connected, the use of a plasmid containing the plant virus vector as a transcript, and the use of a plant virus vector in a plant.
  • By inoculating the body and expressing the foreign gene in the plant it is possible to infect the whole plant (systemic infectivity), to introduce useful properties to the whole plant, or to use it in the whole plant. They have found that protein can be produced, and have completed the present invention.
  • Plant virus vector A replicable recombinant obtained by introducing a foreign gene into the DNA or RNA sequence of a plant virus.
  • Read-through A phenomenon in which translation does not stop at the stop codon during translation from RNA to protein, and is sometimes translated to the next stop codon. It is caused by the base sequence near the stop codon to be read through.
  • Plant plant individual (plant consisting of leaves, stems and roots), plant cells, It includes callus, protoplasts, adventitious buds, adventitious roots, adventitious embryos and the like derived from callus, and is a host for plant viruses in the present invention.
  • Wild-type coat protein means a protein essential for plant virus particle formation. Usually, it is simply called a coat protein, but in the present invention, it is intentionally described as a wild-type coat protein to distinguish it from the coat protein in the fusion protein described below.
  • Fusion protein A protein in which a foreign gene product is bound downstream of the coat protein, or a part of the coat protein is replaced by the foreign gene product.
  • Virus particle The virus genome is covered with a coat protein.
  • Examples of the plant virus used in the present invention include a group belonging to a DNA virus such as a calimovirus and a diemini virus, and a group belonging to an RNA virus such as a tobamovirus, a bromovirus, and a cucumovirus.
  • a DNA virus such as a calimovirus and a diemini virus
  • an RNA virus such as a tobamovirus, a bromovirus, and a cucumovirus.
  • As specific virus species there are rifa-mozavirus virus belonging to Karimovirus, tomato golden mosaic virus belonging to geminivirus, tobacco mosaic virus belonging to tobamovirus, bromomozaik virus belonging to bromovirus and cue belonging to cucumovirus. Rikbar mosaic virus and the like.
  • exogenous gene used in the present invention examples include a peptide gene having pharmacological and physiological activities, a protein gene that imparts stress tolerance and disease and pest activity to plants, and a protein gene that changes plant morphology and flower color.
  • Specific examples include enkephalin, calcitonin, corticotropin, human epidermal growth factor (EGF), and angiotensin converting enzyme inhibitor, which has a blood pressure lowering effect as shown in Table 1.
  • AC EI Examples include students who code peptides and the like.
  • genes can be obtained from the genomic DNA or cDNA of an organism, or from the plasmid DNA, etc., but can also be synthesized using a DNA synthesizer or the like.
  • the nucleotide sequence that induces lead-through used in the present invention is not particularly limited as long as it is a nucleotide sequence that causes a lead-through phenomenon.
  • a protein called 130/180 K of tobacco mosaic virus is used.
  • the nucleotide sequence may be obtained by partially substituting those nucleotide sequences.
  • TAGC AATTA corresponding to U AG CA AUU A present in the 180 K protein gene, or its DNA type (underlined part is a stop codon), or a stop codon is replaced with another stop UAACAAUU A (TAAC AATTA), UG AC AAUU A (TG AC AAT TA), or U AG CA RYYA (TAG C AR YYA) (R is A Or G and Y represent C or U or T.)
  • UAGC AAUUA (TAGCAATTA) is preferred because of its good read-through efficiency.
  • the coat protein gene of the plant virus used in the present invention may be a naturally occurring gene, a gene in which a part of the base sequence has been deleted, or a gene in which a part of the base sequence has been substituted.
  • a coat protein gene in which the base immediately before the base sequence that induces through is A is preferable from the viewpoint of read-through efficiency.
  • substitution of U (T) at the 3 'end of the coat protein gene with A or UCU (TCT) at the 3' end is preferred, and these substitutions are preferable because the read-through efficiency is significantly improved.
  • RNA virus for example, the PM promoter CAhlquist. P. and Janda M., Mol. Cell. Biol., 4, 2876 as a promoter for in vitro transcription. -2882 (1984)], p LFW3 CMeshi T. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5043 (1986)], T7 Promo-Yuichi CRosa, .D., Cell, 16, 815-825 (1979)) with pTLW3 CMeshi T., Watanabe Y. and Okada Y., in: Genetic Engineering with Plant Viruses., Wilson, T..A. And Davis, JW (Eds)., CRC, Florida, USA., Pl54 (1992)]. If the plant virus is a DNA virus, a plasmid that does not have a promoter for in vitro transcription may be used.
  • the plant virus vector of the present invention can be prepared, for example, as follows.
  • the cDNA of the plant RNA virus is incorporated downstream of the promoter of a plasmid containing an in vitro transcription promoter.
  • a foreign gene of interest is incorporated downstream of the plant virus-derived coat protein gene via a base sequence that induces read-through, according to a technique commonly used in genetic engineering.
  • the base sequence that induces read-through and the foreign gene are combined.
  • Amino acids recognized by proteolytic enzymes include, for example, arginine and lysine (cleaved by trypsin), fenylalanine and tyrosine (cleaved by chymotribsine), and methionine (chemically degraded by bromocyan).
  • RNA is prepared from the constructed plasmid by a transcription reaction in a test tube and used as a plant virus vector.
  • the plant virus vector of the present invention may be one in which particles are formed with the envelope protein of wild-type virus in a test tube (plant virus vector particles).
  • virus vectors can be created by methods such as cutting out the DNA virus portion from the genetically engineered plasmid.
  • the plant virus vector obtained as described above may be in the form of RNA or DNA, or, in the case of RNA, preferably in the form of particles, for example, rubbed into leaves with force volundum, carborane dams, etc. At the same time, the plant can be easily infected by spraying the plant.
  • the plant in this case is not particularly limited as long as it can infect the plant virus of the present invention.
  • the virus used as a vector is a tobacco mosaic virus, tobacco, tomato , And soybean plants such as capsicum, bromine mosaic virus, grasses such as wheat and oats, and curry flower mosaic viruses such as cruciferous plants and turnips.
  • Cells can be used. Infected plants produce wild-type coat protein and fusion protein simultaneously throughout the body. That is, a foreign gene product is produced in the form of a fusion protein.
  • virus particles were collected from infected plants, and the resulting plant virus particles were separated, purified, and analyzed, it was found that both wild-type envelope proteins and fusion proteins were used for particle formation. .
  • the fusion protein is also used for particle formation. Therefore, by collecting plant virus particles from a plant, a foreign gene product can be obtained as a fusion protein. By cutting the obtained fusion protein using an appropriate means, a target foreign gene product can be obtained.
  • the plant virus vector of the present invention has a nucleotide sequence that induces read-through, a fusion protein with a wild-type coat protein (useful protein derived from a foreign gene or a fusion protein with a peptide and a coat protein) Are produced simultaneously. As a result, virus particles can be formed normally, and systemic infectivity can be exhibited, and foreign genes can be expressed in the whole plant.
  • a foreign gene product can be easily separated and purified with high purity, good reproducibility, low cost, and low cost.
  • FIG. 1 represents the plasmid pTLW3.
  • Fig. 2 shows a plant virus vector created in Examples and Comparative Examples.
  • a and A 'are Comparative Example 1, B and B' are Example 1
  • C and C 'are Example 2 are Example 3).
  • FIG. 3 shows the positional relationship in the plasmid PTLW3 of the DNA fragments used in the plasmid construction in Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 4 shows (a) the plasmid prepared in Comparative Example 1 and (b) the plasmid prepared in Example 1.
  • FIG. 5 shows the presence / absence of Dielsberg in the infected leaves and the uninfected leaves in the experiment on the infection of the plant individuals performed in Comparative Example 1 and Examples 1-3.
  • FIG. 6 shows the presence or absence of ACEI in infected leaves and uninfected leaves in the experiment on infection of plant individuals performed in Comparative Example 1 and Examples 1 to 3.
  • FIG. 7 shows the fusion protein productivity of the read-through type vector of the present invention (Examples 1 to 3).
  • FIG. 8 shows the presence or absence of ACEI in the tomato in the experiment on infection of the minitomato performed in Example 4.
  • FIG. 9 shows the purity of the virus particles collected in the virus particle collection experiment performed in Example 5.
  • FIG. 10 shows the presence or absence of the fusion protein and the ACE I peptide in the collected virus particles in the virus particle collection experiment performed in Example 5.
  • A shows the result of antibody staining with anti-TMV ⁇ egret serum
  • (b) shows the result of antibody staining with anti-ACE ⁇ rabbit serum.
  • FIG. 1 shows the plasmid pTLW3 used in the examples.
  • B and B' are read-through vectors (Example 1)
  • the c- synthesized DNA which has an arginine-encoding sequence on the 5 'side of the ACEI sequence, can be used to isolate the ACE I peptide from the expressed fusion protein by trypsin digestion.
  • the DNA synthesized in the above (1) was adjusted to a concentration of 0.1 gZ / z1, phosphorylated with 0.2 mM ATP, and purified by phenol treatment and ether washing.
  • the purified DNA was prepared at 0.02 ⁇ gZ / i1, mixed with A and A ', B and B', C and C ', D and D', and treated with 65 for 5 minutes. . After the treatment, it was annealed by slowly cooling to room temperature.
  • FIG. 1 A publicly known document represented in FIG. 1 CMeshi T. et al., In: Genetic Engineering with plant Viruses., Wilson, TMA and Davis, JW (Eds)., CRC, Florida, USA., Pl54 (1992)]
  • the plasmid pTLW3 constructed on the basis of the above was digested with a combination of restriction enzymes shown in Table 2 to prepare fragments of each size.
  • Each fragment in pTLW3 Figure 3 shows the positional relationship.
  • NsiI / M1uI fragment 0.2 kbp Each fragment was prepared by agarose gel electrophoresis and then using a GENECLEAN kit (BIO101) according to the attached instructions. "L line one.
  • the 7.lkbp fragment of Kpnl and Mull was treated with alkaline phosphatase and used for the following reaction except for the terminal phosphoric acid.
  • Each of the four annealed synthetic DNA solutions prepared in (2) above was combined with the four DNA fragment solutions derived from pTLW3 prepared in (3) above at 15 ° C. with the following composition. By reacting for 15 hours, each was bound to form four kinds of plasmids. Two of the obtained plasmids are shown in Fig. 4 (a; Comparative Example 1, ⁇ ; Example),
  • the four plasmids (one having a conventional vector sequence and one having the vector sequence of the present invention) prepared in the above 1) were digested with restriction enzymes, purified by phenol treatment and ethanol precipitation. ⁇ type DNA. Using this type I DNA, in vitro transcription reaction was performed at 37 ° C for 2 hours in the reaction system shown in Table 5 to prepare four kinds of plant virus vectors (RNA). The prepared plant virus vector (RNA) was purified by phenol treatment and ethanol precipitation.
  • the leaves of Samsung tobacco (Nicotiana tabacum cv. Sarasun), 6 weeks old after sowing, were inoculated by inoculation of 1001 each.
  • the presence or absence of the plant virus vector was determined based on the presence or absence of the wild-type envelope protein and the fusion protein.
  • the SDS-modified protein sample 11 prepared in the above (1) was subjected to SDS-PAGE (12.5% polyacrylamide) to classify the protein.
  • the separated protein was transferred from the gel to a PVDF membrane by electroplating.
  • anti-tobacco mosaic virus ⁇ heron serum was added to TBS buffer
  • the plant virus vector (Examples 1 to 3) of the present invention in which a read-through sequence was introduced so as to simultaneously produce the wild-type coat protein and the fusion protein, was used for the production of infected leaves and uninfected leaves. Detected in both- Transfer from leaf to leaf (systemic infectivity) was confirmed (3 to 8 in Fig. 5).
  • the conventional plant virus vector produced ACEI only in infected leaves
  • the plant virus vector of the present invention produced ACEI in the form of fusion protein in both infected and uninfected leaves.
  • Example 4 Comparing the band density in Fig. 7 and calculating the amount of fusion protein produced for each vector, the vector in Example 1 was 0.025 mg / g of tobacco leaf, and And the vector of Example 3 produced 0.25 mg of the fusion protein. Thus, by replacing the base sequence at the 3 'end of the coat protein gene from U to A or from UCU to CAA, the read-through efficiency was improved, and the fusion protein production ability was increased 10-fold. I understood that. Example 4.
  • Example 1 Infection of the plant diarrhea vector particle solution of the present invention having the ACEI sequence prepared in Example 1 into the leaves of a minitomato [sugar lamp species, purchased from Sakata Seed Co., Ltd.] about 6 months after seeding I let it. Infection was performed as in Example 1. After 14 days, tomato fruits were harvested, and ACEI in a protein sample extracted from the tomato fruits was detected using an anti-ACEI antibody in the same manner as in Example 1. Fig. 8 shows the results.
  • the produced tomato fruit is expected to contain a large amount of ACEI which has a blood pressure lowering effect by oral ingestion.
  • Example 2 The solution of the plant virus vector particles of the present invention having the ACE I sequence prepared in Example 2 was used to infect the leaves of tobacco of Samson species 6 weeks old after seeding. Infection was performed as in Example 1 or 2.
  • virus particles were purified from 10 g of leaves of the infected plant individual. Specifically, it is as follows.
  • the concentration of the virus particles was calculated as 1 Orag / ml from the absorbance at a wavelength of 280 nm.
  • the number of days required for the above separation and purification was about 1 day.
  • the calculated ratio of the amount of the fusion protein incorporated into the virus particles to the amount of the wild-type coat protein was approximately 1:20. From the purified and purified protein. This indicates that the fusion protein was efficiently incorporated into the virus particles.
  • virus particles of the uninfected leaves had the fusion protein, it was found that the virus particles containing the fusion protein could be collected from the whole plant using the read-through vector.
  • the plant virus vector of the present invention since the plant virus vector of the present invention has a great advantage of systemic infectivity, it introduces useful properties into plant individuals and produces foreign gene products in whole plants. Becomes possible.
  • a foreign gene product can be easily separated and purified with high purity, good reproducibility, low cost, and low cost.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明 細 書 植物ウィルスベクタ一、 プラスミ ド、 外来遺伝子発現方法及び外来 遺伝子産物の取得方法 技術分野
本発明は、 植物ゥィルスべクタ一による外来遺伝子の植物体への 導入と、 植物の性質の改良及び植物体全体における外来遺伝子の発 現と、 その外来遺伝子産物を簡便に効率良く取得する方法に関する c 背景技術
トバモウィルス等に代表されるある種の植物ウィルスは、 植物体 に感染すると、 その植物体内で増殖し、 外被タンパク質と呼ばれる 夕ンパク質を大量に作りながら、 植物体内で急速に拡がって行く こ とが知られている。
すでに、 これらの植物ゥィルスを用いた遺伝子操作系が幾つか構 築されており、 この系を用いて外来遺伝子を植物体内へ導入する試 みがなされている。 例えば外被夕ンパク質遺伝子と外来遺伝子を置 換する方法 CTakamatsu N. , Ishikawa . , Meshi Τ. and Okada Y. , ΕΝΒΟ J. , 6， 307-311 (1987)〕 ， 或いは外被タンパク質遺伝子と外 来遺伝子を直結して融合タンパク質を作らせる方法 〔Takamatsu N. , atanabe Y. , Yanagi Η.， Meshi T. et al.， FEBS Lett. , 269， 73- 76 (1990) 〕 等である。
しかし、 これら公知の方法で用いられている植物ウィルスベクタ 一はいずれも、 植物個体全体に拡がる能力 （全身感染性） を持たな いという、 大きな欠点を有しており、 植物個体全体に有用な性質を 導入したり、 植物個体全体で有用タンパク質を生産することは、 不 可能であった。
植物ウイルスが全身感染性を示す為には、 野生型外被タンパク質 による粒子形成が必要である 〔T. Sai to et al. , Virol ogy, 176, 329 (1990)〕 。 既存の植物ウィルスベクターは、 外被タンパク質が産生 されなかったり （置換型ベクター） 、 外被タンパク質が融合タンパ ク質となっており、 その性質が大きく変化してしまったり （直結型 ベクター） する為、 粒子形成をすることができず、 全身感染性を示 さなかつたものと考えられる。
またさらに、 既存の植物ウィルスベクターを用いて外来遣伝子を 発現させた場合、 外来遺伝子を導入した植物体から外来遺伝子産物 のみを簡便に効率よく分離， 精製することは非常に困難である。 なぜならば、 分離， 精製の目標である （ 1 ) 簡単な装置と経済性， ( 2 ) 高い回収率， （ 3 ) 高い純度， （ 4 ) 良好な再現性， を達成 するためには、 分別沈澱， 脱塩， 濃縮， 各種クロマトグラフィーを 行うなど数種類の操作の組み合わせが必要不可欠であるが、 これら —連の操作は、 通常半月から一力月にも及ぶ多大な時間と労力を必 要とすることが多いからである。 仮に簡便， 迅速であったとしても 植物体中には外来遺伝子産物と分子量， 等電点， 溶媒に対する親和 性などの諸性質が類似するタンパク質が共存するため、 これらと外 来遺伝子産物とを分離するには各種の分離， 精製工程における外来 遺伝子産物の損失を回避すること しい。 それ故、 外来遺伝子産 物の高い回収率は望めない。 発明の開示
従って本発明の目的とするところは、 植物体全体への感染性 （全 身感染性） を有する植物ウィルスベクタ一， 転写物として該植物ゥ ィルスベクターを提供するプラスミ ド、 及び該植物ウィルスベクタ —を植物体に接種することによって外来遺伝子を植物体全体に発現 させる方法を提供することにある。
またさらに、 植物体中に産生した外来遺伝子産物を簡便に効率良 く取得する方法を提供することにある。
本発明者等は上述の目的を達成するために鋭意研究した結果、 植 物ウィ ルスの外被タンパク質遺伝子の下流に、 リー ドスルーを誘起 する塩基配列 C J. M. Skuzeskら、 J. Mol. Bi o l . 218， 365-373 ( 1991 ) ) を介して外来遺伝子が接続されている植物ゥィルスべクタ一の利用， 該植物ウィ ルスベクターを転写産物とするプラスミ ドの利用， 及び 該植物ウイ ルスベクターを植物体に接種し、 外来遺伝子を植物体中 で発現させる方法により植物体全体の感染 （全身感染性） が可能と なり、 植物個体全体に有用な性質を導入したり、 植物個体全体で有 用夕ンパク質を生産することができることを見出し、 本発明を完成 するに至った。
またさらに、 植物体から外来遺伝子産物を取得するに際し、 ウイ ルス粒子として植物体より採取することにより外来遺伝子産物を簡 便に効率良く取得できることを見出し、 本発明を完成するに至った。 以下、 本発明の構成について詳説するが、 それに先立ち本明細書 中で用いた用語について説明する。
植物ゥィルスべクタ一 ； 植物ゥィルスの持つ D N A或いは R N A 配列に、 外来遺伝子を導入すること - よつて得られる複製可能な組 換え体。
リー ドスルー ； R N Aから夕ンパク質への翻訳において、 終止コ ドンで翻訳がス ト ップせず、 時として次の終止コ ドンまで翻訳され てしまう現象。 リー ドスルーされる終止コ ドンの近傍の塩基配列に よつて起きる。
植物体 ； 植物個体 （葉、 茎、 根からなる植物。 ） の他、 植物細胞， カルス， プロ トプラスト， カルスより誘導した不定芽， 不定根， 不 定胚等を含むものであって、 本発明において植物ウィルスの宿主と なるものである。
野生型外被タンパク質 ；植物ウィルスの粒子形成に必須なタンパ ク質を意味する。 通常単に外被タンパク質と呼ばれているが、 本発 明においては下記の融合夕ンパク質中の外被タンパク質と区別する ため、 あえて野生型外被タンパク質と記載する。
融合タンパク質 ； 外被夕ンパク質の下流に外来遺伝子産物が結合 したもの或いは外被タンパク質の一部を外来遺伝子産物で置換した ものである。
ウィルス粒子 ； ウィルスゲノムが外被タンパク質により覆われた ものである。
本発明に用いられる植物ウィルスとしては、 カリモウィルス， ジ エ ミ二ウィルス等の D N Aウィルスに属するグループ， トバモ イ ルス， ブロモウィルス及びククモウィルス等の R N Aウィルスに属 するグループが挙げられる。 具体的なウィルス種としてほ、 カ リモ ゥィルスに属する力リフラヮーモザィクウイルス， ジェ ミニウィル スに属する トマトゴールデンモザイクウィルス， トバモウィルスに 属するタバコモザイクウィルス， ブロモウィルスに属するブロムモ ザイクウィルス， ククモウィルスに属するキュー力ンバーモザイク ウィルス等が挙げられる。
本発明に用いられる外来遺伝子としては、 薬理， 生理活性を有す るペプチド遺伝子や、 植物にストレス耐性， 病害虫酎性を与える夕 ンパク質遺伝子， 植物の形態や花色を変化させる夕ンパク質遺伝子 等があり、 具体的には、 エンケフア リ ン， カルシトニン， コルチコ トロピン， ヒ ト上皮細胞成長因子 （E G F ) や、 第 1表に示したよ うな、 血圧低下作用を持つ、 アンジォテンシン転換酵素阻害 (AC E I ) ペプチ ド等をコー ドする遣 子等が挙げられる。
第 1表
C E I 1 2 Phe - Phe - Vaト Ala - Pro - Phe - Pro - Glu - Vaト Phe - Gly -し ys
C E マ Ala- Val-Pro- Tyr-Pro Gln-Arg
C E I 6 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp
C E I 5 Phe-Phe-Val-Ala-Pro
これらの遺伝子は、 生物のゲノム DN Aや c DN A， 或いはブラ スミ ド DN A等から得ることができるが、 DNA合成機等を用いて 合成することもできる。
本発明に用いられる リー ドスルーを誘起する塩基配列とは、 リー ドスル一現象を引き起こす塩基配列ならばその種類は問わないが、 例えばタバコモザイクウィ ルスの 1 3 0 / 1 8 0 Kと呼ばれるタン パク質遺伝子中に存在する塩基配列等のような天然に存在する塩基 配列の他、 それらの塩基配列の一部を置換したものであっても良い < 具体的には、 タバコモザイクウィルスの 1 3 0 / 1 8 0 Kタンパ ク質遺伝子中に存在する U AG C A AUU A, 又はその DNA型に 相当する TAGC AATTA (下線部は終止コ ドンである。 ） ， あ るいは終止コ ドンを他の終止コ ドンに置き換えた UAACAAUU A (TAAC AATTA) ， UG AC AAUU A (TG AC AAT TA) ， もしく は終止コ ドン以外の塩基配列を置換した U AG C A RYYA (TAG C AR YYA) (Rは A又は G、 Yは C又は Uあ るいは Tを表す。 ） 等が挙げられるが、 中でも UAGC AAUUA (TAGCAATTA) が、 リ一ドスルー効率が良いという点で好 ましい。
本発明に用いられる植物ウイルスの外被タンパク質遺伝子として は、 天然に存在する遺伝子の他、 その一部の塩基配列を欠失させた もの， 又は一部の塩基配列を置換した遺伝子でも良いが、 特にリー ドスルーを誘起する塩基配列の直前の塩基が Aである外被夕ンパク 質遺伝子が、 リードスルー効率の点で好ましい。
塩基配列の置換を具体的に示すと、 タバコモザィクウイルスの場 合、 外被タンパク質遺伝子の 3 ' 末端の U (T) の Aへの置換ある いは 3' 末端の UCU (TCT) の CAAへの置換等が挙げられ、 これらの置換はリー ドスルー効率が著しく向上するという点で好ま しい。
本発明において用いられるプラスミ ドとしては、 植物ウィルスが RNAウイルスの場合は、 例えば試験管内転写用のプロモーターと して PMプロモーター CAhlquist. P. and Janda M.， Mol. Cell. Biol., 4, 2876-2882(1984) 〕 を持つ p LFW3 CMeshi T. et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5043 (1986) 〕 ， T 7プロモ一 夕一 CRosa, . D.， Cell, 16, 815-825(1979)〕 を持つ p TLW3 CMeshi T. , Watanabe Y. and Okada Y.， in:Genetic Engineering with Plant Viruses. , Wilson, T. . A. and Davis, J. W. (Eds). , CRC, Florida, USA., pl54 (1992) 〕 等が挙げられるが、 植物ウイ ルスが DN Aウイルスの場合は、 試験管内転写用のプロモータ一を 持たないプラスミ ドでよい。
本発明の植物ゥィルスべクタ一は、 ウイルスが RN Aの場合は例 えば次のようにして作成することができる。
まず、 植物 RNAウィルスの c DNAを、 試験管内転写用プロモ —夕一を有するプラスミ ドのプロモーター下流に組み込む。 次に、 遺伝子操作において通常用いられる手法に従い、 植物ウイルス由来 の外被タンパク質遺伝子の下流に、 リ一ドスルーを誘起する塩基配 列を介して目的とする外来遺伝子を組み込む。
この時、 外来遺伝子に起因するタンパク質 （又はペプチド） を単 離し易いように、 リー ドスルーを誘起する塩基配列と外来遺伝子と の間に、 夕ンパク質分解酵素等が認識するァミ ノ酸をコー ドする塩 基配列を挿入しておくのが好ましい。 タンパク質分解酵素が認識す るアミ ノ酸としては、 例えばアルギニンおよびリ ジン （ ト リプシン により開裂） 、 フエ二ルァラニンおよびチロシン （キモ ト リブシン により開裂） 、 並びにメチォニン （ブロムシアンにより化学的に分 解） が挙げられる。
次に、 構築した上記のプラスミ ドから、 試験管内転写反応によつ て、 R N Aを作成し、 植物ウィルスベクタ一とする。 又、 本発明の 植物ウィルスベクターは、 更に試験管内で野生型ゥィルスの外被夕 ンパク質と粒子形成させたもの （植物ウィルスベクター粒子） であ つてもよい。
ウィルスが D N Aの場合は、 D N Aウィルスを直接プラスミ ドに 組み込み、 遺伝子操作を行う。 遺伝子操作を行ったプラスミ ドから D N Aウィルス部分を切り出す方法等によって、 植物ウィルスべク 夕一を作成することができる。
上述のようにして得られた植物ゥィルスべクタ一は、 R N A又は D N Aの形で， 或いは R N Aの場合は好ま しく は粒子形成させた形 で、 例えば力一ボランダムとともに葉に摺り込んだり、 カーボラン ダムとともに植物体に噴霧する方法等で、 簡単に植物体に感染させ ることができる。
この場合の植物体としては、 本発明の植物ゥィルスべクターが感 染するものであれば、 その種類を問わないが、 例えばベクターとし て用いるウィルスがタバコモザイクウィルスの場合は、 タバコ、 ト マ ト、 トウガラシ等のナス科植物、 ブロムモザイクウィルスの場合 は、 コムギ、 ォォムギ等のイネ科植物、 カ リ フラワーモザイクウイ ルスの場合は、 カ リ フラワー、 カブ等のアブラナ科植物のそれぞれ 植物個体や培養細胞を用いることができる。 感染した植物体は、 全身において野生型外被タンパク質と融合夕 ンパク質を同時に産生している。 すなわち、 融合タンパク質の形で 外来遺伝子産物が産生されている。
また、 感染した植物体からウィルス粒子を回収し、 得られた植物 ウィルス粒子を分離， 精製し分析すると、 粒子形成に野生型外被夕 ンパク質と融合タンパク質の両方が使われていることが分かる。
このことは、 野生型外被タンパク質との共存下においては、 融合 夕ンパク質も粒子形成に用いられることを意味している。 従って、 植物体から植物ウィルス粒子を回収することによって、 外来遺伝子 産物を融合夕ンパク質として取得することができる。 得られた融合 夕ンパク質を適当な手段を用いて切断することによって、 目的とす る外来遣伝子産物を取得することができる。
ウィルス粒子の回収は、 高価な試薬を必要とせず、 又多くの時間 を必要とせず操作は遠心分離のみでほぼ 1 日で完了する。 しかも遠 心分離操作の再現性は高く、 得られるウィルス粒子の純度は高い。 本発明の植物ウイルスベクターは、 リー ドスルーを誘起する塩基 配列を有している為、 野生型外被タンパク質と融合タンパク質 （外 来遺伝子由来の有用タンパク質又はべプチドと外被タンパク質との 融合タンパク質） を、 同時に産生する。 その為、 ウィルス粒子形成 が正常に行われ、 全身感染性を示すと供に、 植物体全体において外 来遺伝子を発現できる。
また、 本発明の方法により、 外来遺伝子産物を高純度で、 再現性 良く、 安価で、 簡便に分離、 精製することができる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 プラスミ ド p T L W 3を表す。
図 2は、 実施例及び比較例において、 植物ウィ ルスベクタ一を作 成する際に使用した合成 DN Aの、 塩基配列を表す （A及び A' は 比較例 1 , B及び B' は実施例 1， C及び C' は実施例 2， D及び D' は実施例 3 ) 。
図 3は、 実施例及び比較例においてブラスミ ド構築に用いた DN A断片の、 プラスミ ド PTLW3中における位置関係を示す。
図 4は、 （ a ) は比較例 1 , (b ) は実施例 1において作成した プラスミ ドを表す。
図 5は、 比較例 1及び実施例 1〜3で行った植物個体への感染実 験において、 感染葉及び非感染葉中のゥィルスべク夕一 0有無を表 す。
図 6は、 比較例 1及び実施例 1〜 3で行った植物個体への感染実 験において、 感染葉及び非感染葉中の A C E Iの有無を表す。
図 7は、 本発明のリー ドスルー型べクタ一 （実施例 1〜3 ) の、 融合夕ンパク質生産能を表す。
図 8は、 実施例 4で行ったミニトマ トへの感染実験において、 ト マ ト実中の AC E Iの有無を表す。
図 9は、 実施例 5で行ったウィルス粒子の採取実験において、 採 取したウイルス粒子の純度を表す。
図 1 0は、 実施例 5で行ったウィルス粒子の採取実験において、 採取したウィルス粒子中の融合夕ンパク質， 及び A C E Iペプチ ド の有無を表わす。 （a) は抗 TMVゥサギ血清による抗体染色、 ( b ) は、 抗 AC E Iゥサギ血清による抗体染色の結果を表す。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例によって本発明を更に詳細に説明する。 尚、 実施例で 用いたプラスミ ド p T L W 3を図 1に示す。 実施例 1〜3および比較例 1.
1 ) AC E I配列を組み込んだ転写用プラスミ ドの作成
( 1 ) A C E I配列を有する合成 DN Aの作成
A B I社 （Applied Biosystems, Inc. ) 3 8 O A型合成 DNA機 を用いて、 0. 2 πι 0 Iスケールで、 図 2に示す 8本の合成 D N Αを作成した。 A及び A' は従来の直結型ベクター （比較例 1 ) , B及び B' はリ一 ドスルー型べクター （実施例 1 ) , C及び C' は 外被夕ンパク質遺伝子の 3 ' 末端の 1塩基を置換したリ一ドスルー 型ベクター （実施例 2) , D及び D' は外被タンパク質遺伝子の 3 ' 末端の 3塩基を置換したリードスルー型ベクター （実施例 3) に用 いるものである。 いずれのベクターも、 発現した融合タンパク質か ら、 トリプシン消化によって ACE Iぺプチドが単離できるように, A C E I配列の 5 ' 側にアルギニンをコー ドする配列を付してある c 合成した DNAは、 AB I社 OP Cカートリ ツジによって精製した c
( 2 ) 合成 DNAのリ ン酸化とァニール
前記 （ 1 ) で合成した DN Aを 0. 1 gZ/z 1の濃度に調製し， 0. 2mMの ATPによってリ ン酸化し、 フエノール処理とエーテ ル洗浄によって精製した。 精製した DNAを 0. 0 2〃 gZ/i 1に 調製し、 Aと A' ， Bと B' , Cと C' , Dと D' を各々混合して, 6 5でで 5分間処理した。 処理後、 室温となるまでゆつ く り 冷却 することによってァニールした。
(3) プラスミ ド構築の為の断片調製
図 1で表される公知の文献 CMeshi T. et al.， in ： Genetic Engineering with plant Viruses. , Wilson, T. M. A. and Davis, J. W. (Eds)., CRC, Florida, USA., pl54(1992)〕 に基づいて構築 したプラスミ ド p TLW3を、 第 2表に示す制限酵素の組合せにて 消化し、 各大きさの断片を調製した。 尚、 p TLW3中での各断片 の位置関係を、 図 3に示す。
第 2表
K p n I /U 1 u I断片 7. 1 k b p
K p n I ZS t u I断片 1. 2 k b p
S t υ I /A V a II断片 0. 5 6 k b p
N s i I /M 1 u I断片 0. 2 k b p 各断片の調製は、 ァガロース電気泳動による分離の後、 G ENE C L EANキッ ト （B I O 1 0 1社製） を用い、 添付説明書に 従つ" L行つ 。
上記断片のうち、 K p n l と M l u lの 7. l k b p断片につい ては、 アルカ リ ホスファターゼ処理を行い、 末端のリ—ン酸を除いて、 以下の反応に用いた。
( 4 ) プラスミ ドの構築と調製
前記 （ 2 ) で作成した、 ァニールした 4種の合成 DNA溶液各々 を、 前記 （ 3 ) で作成した p TLW3に由籴する 4つの DNA断片 溶液とともに、 以下の組成にて、 1 5 °Cで 1 5時間反応させるこ と によって各々結合させ、 4種のプラスミ ドを作成した。 得られたプ ラスミ ドのうち、 2種を図 4に示す （ a ； 比較例 1 , ゎ ； 実施例 ）,
第 3表 ァニールした合成 DN A溶液（0.02〃g/ 1) 1.0 ^ 1 K p n I /U 1 u I断片 （0.001 g/ 1) 9.0 1 K p n I /S t Ή I断片 （0.01 g/ zl) 1.5 ^ 1 S t u I /A v a II断片 （0.015 g/ l) 0.5 ^ 1 N s i I ZM 1 u I断片 （0.005/ig/ 1) 0.5
x 1 0結合反応用バッファー 1.5 1 T 4 リガ一ゼ 〔宝酒造 （株） 350Units / 1 〕 1.0 1 計 15.0 1 尚、 X 1 0結合反応用バッファーの組成を、 第 4表に示す,
第 4表
X 1 0結合反応用バッファ一組成
T r i s— HC 1 (p H = 6 ) 6 6 0 m
Figure imgf000014_0001
DTT 1 0 0 mM
ATP 1 mM 反応液をそのまま用いて E. C o l HB 1 0 1コンビテン ト セル 〔宝酒造 （株） 製〕 を形質転換し、 カルべニシリ ン耐性のコロ 二一を選抜した。 選抜したコロニーの大腸菌から、 目的とするブラ スミ ドを抽出 · 精製した。 2 ) 試験管内転写反応による植物ウィ ルスベクターの作成
前記 1 ) で作成した 4種のプラスミ ド （従来型ベクターの配列を 持つものと、 本発明のベクタ一配列を持つもの） を、 制限酵素で消 化した後、 フヱノール処理とエタノール沈澱で精製し、 鐯型 DNA とした。 この铸型 DNAを用い、 第 5表に示す反応系で、 3 7 °C, 2時間、 試験管内転写反応を行い、 4種の植物ウィ ルスベクター (RNA) を作成した。 作成した植物ウィ ルスベクター （RNA) は、 フヱノール処理とエタノール沈澱により精製した。
第 5表
1 M T r i s — H C 1 C D_t H = 8 n 1上
1V1 2 1 X
1 M iV上 Π 1*/ T丄 T丄 1 1
丄 β 上
1丄 U n m ill s ρ- / /丄τη 1丄 R lJ
Figure imgf000016_0001
1 1丄
Figure imgf000016_0002
1 0 0 mM U T P 1 / 1 X
1 0 0 mM C T P 1 1丄
1 0 m M G T P 1丄
1 n τ 1η1 C A P o η υ 1丄
m D N A. ( 0 5 m o- /m 1 1上 η υ // 1丄
T 7ポリ メラーゼ 1 11 1
〔宝酒造 （株） 50Units / l ) 1 11 1
RNa s eイ ンヒビター
〔宝酒造 （株） 50Units / n\ 5 5 H 1
H2 0 計 100 1 作成した植物ウィ ルスベクター （RNA) と、 公知の方法
CFrankel-Conrat.H., Virology, 4, 1 〜4 (1957)〕 により精製し たタバコモザイクウイルスの野生型外被タンパク質とを、 第 6表に 示すの組成にて、 2 0°Cで 1 5時間反応させることによって、 試験 管内で人為的に粒子形成を行った。 反応溶液は、 そのまま植物ウイ ルスベクター粒子溶液として使用した。 第 6表 植物ウィルスベクタ一 （RNA)(0. Z g / μ. 1 ) 8 a 1 野生型外被タンパク質 （ 1 0 z gZ/z l ) 1 0 // 1 0. 2 Mリ ン酸バッファー （ D H = 7. 0 ) 1 8 ^ 1
3 ) 植物ゥィルスべクター粒子の接種による植物個体内への外来遺 伝子の導入
前記 2 ) で作成した植物ウィルスベクター粒子溶液を 1 O mMリ ン酸バッファ一 （ p H= 7. 0 ) によって 1 0 0倍に希釈し、 カー ボランダム （ナカライテスク社製、 Carborundum, 600mesh) を用い て、 播種後 6週令のサムソン種タバコ （Nicotiana tabacum cv. Sarasun) の葉に、 1 0 0 1ずつ塗擦接種した。
4 ) 植物個体内における植物ウィルスべクターの複製と上葉へ ©移 行の確認
( 1 ) サンプルの調製
植物ウィ ルスベクタ一粒子を感染させてから 1 5 日後に、 同一個 体内の感染葉及び非感染葉各々から 1 0 m gの切片を切り取った。 第 7表に示す組成の S D Sサンプリ ングバッファー 5 0 fi 1 を加え ホモジナイズした後、 1 0 0てで 3分間処理した。 冷却した後、 1 2 , 0 0 0 r p mで 5分間、 遠心分離を行い、 上清を S D S化夕 ンパク質サンプルとした。
第 7表
Figure imgf000018_0001
(2) 各サンプル中の植物ウィルスベクタ一の検出
植物ゥィルスベクターの存否は、 野生型外被夕ンパク質及び融合 タンパク質の有無によって判断した。 前記 （ 1 ) で調製した SD S 化夕ンパク質サンプル 1 1を、 SD S— PAGE ( 1 2. 5 %ポ リアク リルァミ ド） にかけ、 夕ンパク質を分雜した。 分離したタン パク質をゲルから電気式プロッティ ングにより P VD F膜へと転写 した。 次に、 抗タバコモザイクウィルスゥサギ血清を TB S緩衝液
CTr i s— HC 1 (p H= 7. 6) 2 0 mM及び N a C 1 , 1 3 7 mM) で 6 4， 0 0 0倍希釈したものを一次抗体染色液とし、 ゥ サギ抗体用プロッティ ング検出キッ ト （アマシャム社製） を甩いて， 添付説明書に従い、 抗体染色を行った。 結果を図 5に示す。
融合夕ンパク質のみを産生する従来型植物ウイルスベクター
(比較例 1 ) は、 感染葉中では検出されたが、 非感染葉への移行は 認められなかった （図 5の 1 , 2) 。
一方、 野生型外被タンパク質と融合夕ンパク質とを同時に産生す るようにリー ドスルー配列を導入した本発明の植物ゥィルスべクタ 一 （実施例 1〜3) は、 感染葉と非感染葉の両方において検出され- 葉から葉へと移行している （全身感染性を持つ） ことが確認された (図 5の 3〜 8 ) 。
5 ) 植物個体内における A C E Iの産生の確認
前記 4 ) と同じサンプルを用いて、 同様に電気泳動， 膜への転写 を行い、 抗 A C E I ゥサギ血清を T B S緩衝液で 1 2 8， 0 0 0倍 希釈したものを一次抗体染色液とし、 前記 4 ) と同様に抗体染色を 行った。 結果を図 6に示す。
従来型植物ウイルスベクターは感染葉のみに、 本発明の植物ウイ ルスべクターは感染葉及び非感染葉の両方において、 融合夕ンパク 質の形で AC E Iを産生していることが確認された。
6 ) 植物ウィルスベクターの融合タンパク質生産能の比較
前記 （ 2) と同様に行い、 実施例 1〜 3の植物ウィルスベクター の融合タンパク質生産能を比較した。
その際、 SD S— PAG Eにかけるサンプルは、 感染葉から抽出 し、 生葉 0. 2 m g相当量として揃えた。 また、 同時にタバコモザ イクウイルス野生型外被夕ンパク質スタンダー ド 1 0 0， 7 5 , 5 0 , 2 5, 1 0， 5 n gも S D S— P A G Eにかけた。 検出は 4 ) の （ 2 ) と同様、 抗タバコモザイクウィルスゥサギ血清による抗体 染色によって行った。 その結果を図 7に示す。
図 7におけるバン ドの濃さを比較し、 それぞれのベクタ一の融合 タンパク質生産量を算出したところ、 タバコの葉 1 gあたり実施例 1のべクタ一は 0. 0 2 5 m g， 実施例 2のベクター及び実施例 3 のベクターは 0. 2 5 m gの融合タンパク質を生産していた。 この ことから、 外被タンパク質遺伝子の 3 ' 末端の塩基配列を Uから A あるいは U CUから CAAに置換することによって、 リー ドスルー 効率が向上し、 融合タンパク質生産能が 1 0倍に増大していること が判った。 実施例 4 .
実施例 1で作成した A C E I配列を持つ本発明の植物ゥィルスべ クタ一粒子溶液を、 播種後約 6 力月のミニトマ トの 〔シュガーラン プ種， サカタのタネ （株） から購入〕 葉に感染させた。 感染は、 実 施例 1 と同様に行った。 1 4 日後にトマ トの実を収穫し、 トマ トの 実から抽出したタンパク質サンプル中の A C E Iを、 実施例 1 と同 様にして、 抗 A C E I抗体を用いて検出した。 結果を図 8に示す。
図 8から明らかなように、 トマ ト実中で A C E Iが産生されてい ることが確認された。 一
作成されたトマトの実は、 経口摂取による血圧低下作用を有する A C E Iを多量に含有しているものと期待される。
実施例 5 .
1 ) 植物ウイルスベクターの接種による植物個体への外来遺伝子導 入
実施例 2で作成した A C E I配列を持つ本発明の植物ウイルスべ クター粒子溶液を、 播種後 6週令のサムソン種のタバコの葉に感染 させた。 感染は、 実施例 1 または 2 と同様に行った。
2 ) 外来遣伝子導入植物個体からの植物ウィルス粒子の採取
感染させてから 1〜 2か月後に、 感染植物個体の葉 1 0 gからゥ ィルス粒子を精製した。 具体的には、 以下の通りである。
感染タバコの非感染葉を凍結後ミキサ一で粉砕する。 ついでチォ グリ コール酸を 0 . 1 %含む 0 . 1 Mリ ン酸バッファー （ p H = 7 . 0 ) を粉砕した非感染葉に等重量加え、 ホモジナイズした後低温で 低速遠心 （ 8 0 0 0 X g , 1 0分） する。 沈澱を捨て、 上清の液量 に対して 0 . 0 6倍量の 2 M塩化ナト リゥム溶液と 0 . 2倍量の 2 0 %ポリエチレングリ コール溶液を加え、 1時間氷上に放置する。 ついで低速遠心を行い沈澱を回収する。 沈澱を蒸留水に良く分散 後低速遠心と高速遠心 （ l O O O O O x g, 5 0分） の交互による 分画遠心を 2回繰り返す。 最後の高速遠心の沈澱を蒸留水に懸濁さ せることによって、 ウィルス粒子を得た。
ゥィルス粒子の濃度は、 波長 2 8 0 nmに対する吸光度の値から 1 Orag/mlと算出された。 また、 上記の分離、 精製に要した日数は 約 1 日であった。
3 ) ウィルス粒子の純度評価
ウィルス粒子 5 n 1 に第 7表に示した組成の S D Sサンプリ ング ノくッファーを 5 〃 1加え、 1 0 0 °C、 5分処理したものを S D S化 タンパク質サンプルとした。 S D S化夕ンパク質サンプル 2 1 を S D S - PAG E ( 1 2. 5 %ポリアク リルアミ ドゲル） にかけ、 ゲルをクーマシーブリ リアン トブルー染色し、 7. 5 %酢酸— 5 % メタノ ールで脱色後乾燥した。 結果を図 9に示す。
図 9から明らかなように、 野生型外被夕ンパク質と融合タンパク 質に対応するバン ドのみが検出されており、 植物体由来の他のタン パク質をほぼ完全に除去できた。
4 ) ウィルス粒子中の融合タンパク質の検出
前記 3 ) と同様に S D S化タンパク質サンプルを調製し、 その 1 0倍希釈したもの 2〃 ^を503—？八〇 £ ( 1 2. 5 %ポリアク リルアミ ドゲル） にかけタンパク質を分離した。 分離したタンパク 質をゲルから電気式プロッティ ングにより P V D F膜に転写した。
つぎに、 抗 TMVゥサギ血清又は抗 A C E I ゥサギ血清を一次抗 体染色液とし、 ゥサギ抗体用プロッティ ング検出キッ ト （プロメガ 社製） を用いて添付説明書に従い抗体染色を行った。 結果を図 1 0 ( a) ， (b) に示す。
ウィルス粒子に取り込まれている融合タンパク質と野生型外被タ ンパク質の量比を算出したところ、 およそ 1 ： 2 0であり、 植物体 から分離， 精製したタンパク質中の量比とほぼ一致した。 このこと は、 融合タンパク質が効率よくウィルス粒子に取り込まれているこ とを示している。
また、 非感染葉のウィルス粒子が融合タンパク質を有しているこ とから、 リードスルー型ベクターを用いれば、 融合タンパク質を含 むウィルス粒子が植物個体全体から採取できることが分かった。 産業上の利用可能性
以上の様に、 本発明の植物ウィルスベクターは、 全身感染性とい う大きな利点を有しているため、 植物個体への有用な性質の導入及 び植物体全体での外来遣伝子産物の生産が可能となる。
また、 本発明の方法により、 外来遺伝子産物を高純度で、 再現性 良く、 安価で、 簡便に分離、 精製することができる。
配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 6 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GACCTCTGCA CCTGCATCTA GATTCTTCGT TGCTCCTTTT CCTGAAGTAT 50 TCGGTAAGTA AATGCA 66 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 5 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTTACTTACC GAATACTTCA GGAAAAGGAG CAACGAAGAA TCTAGATGCA 50 GGTGCAGAG- 59 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 7 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GACCTCTGCA CCTGCATCTT AGCAATTAAG ATTCTTCGTT GCTCCTTTTC 50 CTGAAGTATT CGGTAAGTAA ATGCA 75 配列番号 ί 4
配列の長さ ： 6 8 配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類：合成 D N A
配列
TTTACTTACC GAATACTTCA GGAAAAGGAG CAACGAAGAA TCTTAATTGC 50 TAAGATGCAG GTGCAGAG 68 配列番号： 5
配列の長さ ： 7 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：一本鎖
配列の種類： 合成 D N A
配列
GACCTCTGCA CCTGCATCAT AGCAATTAAG ATTCTTCGTT GCTCCTTTTC 50 CTGAAGTATT CGGTAAGTAA ATGCA 75 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 6 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類： 合成 D N A
配列
TTTACTTACC GAATACTTCA GGAAAAGGAG CAACGAAGAA TCTTAATTGC 50 TATGATGCAG GTGCAGAG 68 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 7 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ：一本鎖
配列の種類： 合成 D N A 配列
GACCTCTGCA CCTGCACAAT AGCAATTAAG ATTCTTCGTT GCTCCTTTTC 50 CTGAAGTATT CGGTAAGTAA ATGCA 75 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 6 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTTACTTACC GAATACTTCA GGAAAAGGAG CAACGAAGAA TCTTAATTGC 50 TATTGTGCAG GTGCAGAG 68

Claims

請 求 の 範 囲
1. 植物ウィ ルスの外被タンパク質遺伝子の下流に、 リー ドスル
—を誘起する塩基配列を介して外来遺伝子が接続されている植物ゥ ィルスベクター。
2. 外被タンパク質遺伝子が、 一部の塩基配列を欠損又は置換し た外被タンパク質遣伝子である請求項 1に記載の植物ゥィルスべク ター。
3. 前記植物ウィルスが、 DNAウィルスである請求項 1又は 2 に記載の植物ゥィルスべクタ一。
4. 前記植物ウィルスが、 RNAウィルスである請求項 1又は 2 に記載の植物ウイルスベクター。
5. 前記 D N Aウィルスがカリモウィルス又はジェ ミニウィルス である請求項 3に記載の植物ゥィルスべクタ一。
6. 前記 RN Aウィルスがトバモウィ ルス、 ブロモウィ ルス、 ク クモウィルスなどである請求項 4に記載の植物ゥィルスベクター。
7. 前記 RNAゥィルスがトバモウィルスである請求項 4に記載 の植物ゥィルスベクター。
8. 前記リードスルーを誘起する塩基配列が、 UAGC AAUU Aもしく はその DNA型である TAGCAATTA, U_A A C A A UU Aもしく はその DN A型である T AA C AATT A， U G A C AAUUAもしく はその DNA型である TGA C AATT A、 又は UAGCARYYAもしく はその D N A型である T A G C A R Y Y A (配列中、 下線は終止コ ドンを示し、 Rは A又は Gであり、 Yは. Cまたは ϋあるいは Tである） である、 請求項 1又は 2に記載の植 物ウィルスベクタ一。
9. 請求項 1〜3, 5, 8のいずれか 1項に記載の植物ウィ ルス ベクタ一の D N A配列を含んで成るプラスミ ド。
10. 請求項 1， 2 , 4 , 6〜 8のいずれか 1項に記載の植物ウイ ルスべクターの相補 D N A及び該 D N Aを転写するためのプロモー ターを含んで成るプラスミ ド。
11. 前記プラスミ ドで転写するためのプロモーターが P Mプロモ 一夕一又は T 7プロモーターである、 請求項 1 0に記載のプラスミ ド、。
12. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の植物ゥィルスべクター を植物体に接種し、 該植物ウイルスベクター中の外来遺伝子を発現 させることを特徴とする、 外来遺伝子を植物体中で発現せしめる方
13. 前記植物体が、 カ リモウィ ルスの場合は、 カブやカ リ フラヮ 一 一などである請求項 1 2に記載の方法。
14. 前記植物体が、 ジヱ ミニウィルスの場合は、 トマ ト、 キ'ャ ッ サバ、 トウモロコシなどである請求項 1 2に記載の方法。
15. 前記植物体が、 トバモウィ ルスの場合は、 タバコ、 トマ トな どである請求項 1 2に記載の方法。
16. 前記植物体が、 ブロモウィ ルスの場合は、 コムギ、 ォォムギ などである請求項 1 2に記載の方法。
17. 前記植物体が、 ククモウィ ルスの場合は、 キユウ リ、 トマ ト などである請求項 1 2に記載の方法。
18. 植物体を用いて外来性遺伝子産物を製造する方法であって、
( 1 ) 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の植物ゥィルスべクタ 一を植物体に接種し、 該植物ゥィルスベクター中の外来遺伝子を発 現させ、
( 2 ) 前記植物体からウィ ルス粒子を回収し、 そして
( 3 ) 前記回収されたウイルス粒子から外来性遺伝子産物を単離 する、 ことを含んで成る方法。
PCT/JP1993/000408 1992-03-31 1993-03-31 Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product WO1993020217A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/313,127 US5618699A (en) 1992-03-31 1993-03-31 Plant virus vector, plasmid, process for expression of foreign gene and process for obtaining foreign gene product
DE69333529T DE69333529T2 (de) 1992-03-31 1993-03-31 Pflanzenvirus-vektor, plasmid, methode der expression fremder gene und methode zur gewinnung obiger genprodukte
EP93906862A EP0672754B1 (en) 1992-03-31 1993-03-31 Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10862892 1992-03-31
JP4/108628 1992-03-31
JP4188744A JP2880024B2 (ja) 1992-03-31 1992-06-22 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法
JP4/188744 1992-06-22
JP4/351970 1992-12-08
JP4351970A JPH06169789A (ja) 1992-12-08 1992-12-08 外来遺伝子産物の取得方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993020217A1 true WO1993020217A1 (en) 1993-10-14

Family

ID=27311278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1993/000408 WO1993020217A1 (en) 1992-03-31 1993-03-31 Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5618699A (ja)
EP (1) EP0672754B1 (ja)
DE (1) DE69333529T2 (ja)
WO (1) WO1993020217A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996012028A1 (en) * 1994-10-14 1996-04-25 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US7033835B1 (en) 1988-02-26 2006-04-25 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660500B2 (en) * 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
AU1838495A (en) * 1994-02-03 1995-08-21 Scripps Research Institute, The Method for using tobacco mosaic virus to overproduce peptides and proteins
CA2202761A1 (en) 1994-10-18 1996-04-25 Sean Nicholas Chapman Method of producing a chimeric protein
US5824870A (en) * 1995-11-06 1998-10-20 Baszczynski; Chris Commercial production of aprotinin in plants
US5939262A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US5677124A (en) * 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
FI972293A (fi) 1997-05-30 1998-12-01 Joseph Atabekov Useamman kuin yhden geenin yhteisekspressiomenetelmät
US6933378B2 (en) 1997-05-30 2005-08-23 Joseph Atabekov Methods for coexpression of more than one gene in eukaryotic cells
FI110323B (fi) * 1997-06-02 2002-12-31 Timo Korpela Rekombinanttikonstrukti geenin ilmentämisen lisäämiseksi kasveissa
US20030027173A1 (en) * 1998-01-16 2003-02-06 Della-Cioppa Guy Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
US6303848B1 (en) 1998-01-16 2001-10-16 Large Scale Biology Corporation Method for conferring herbicide, pest, or disease resistance in plant hosts
US6426185B1 (en) 1998-01-16 2002-07-30 Large Scale Biology Corporation Method of compiling a functional gene profile in a plant by transfecting a nucleic acid sequence of a donor plant into a different host plant in an anti-sense orientation
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
CN1321064A (zh) * 1998-09-14 2001-11-07 衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司 病毒蛋白介导的植物对虫害的抗性
JP2002532098A (ja) 1998-12-11 2002-10-02 インスティテュート・オブ・モレキュラー・アグロバイオロジー ユビキチンまたはキュウリ・モザイク・ウイルス被覆タンパク質ペプチドによる高等植物におけるタンパク質産生の増加
IL147343A0 (en) * 1999-07-21 2002-08-14 Large Scale Biology Corp Method for enhancing ran or protein production using non-native 5' untranslated sequences in recombinant viral nucleic acids
US20020061309A1 (en) * 2000-03-08 2002-05-23 Garger Stephen J. Production of peptides in plants as N-terminal viral coat protein fusions
TWI268138B (en) * 2000-05-11 2006-12-11 Kanebo Seiyaku Ltd Composition containing peptide and electrolyte excretion enhancing substance, and food containing the same
IL158004A0 (en) * 2001-03-22 2004-03-28 Scentgene Pollination Ltd Method of enhancing entomophilous
WO2003000855A2 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Uab Research Foundation Chimeric capsid proteins and uses thereof
US20040002058A1 (en) * 2001-06-21 2004-01-01 Uab Research Foundation Chimeric capsid proteins and uses thereof
WO2003017023A2 (en) * 2001-08-14 2003-02-27 Quigo Technologies, Inc. System and method for extracting content for submission to a search engine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0999281A1 (en) * 1988-02-26 2000-05-10 Biosource Technologies, Inc. Non-nuclear chromosomal transformation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Molecular Biology, Vol. 218, No. 2, 1991, SKUZESKI J.M. et al.; "The Signal for a Leaky UAG Stop Codon in Several Plant Viruses Includes the Two Downstream Codons", see p. 365-374. *
MESHI T. et al., "Genetic Engineering with Plant Viruses", 1992, WILSON, T.M.A. et al. (Eds), (Florida, USA), p. 154. *
See also references of EP0672754A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977438A (en) * 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US7033835B1 (en) 1988-02-26 2006-04-25 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
WO1996012028A1 (en) * 1994-10-14 1996-04-25 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
AU711549B2 (en) * 1994-10-14 1999-10-14 Kentucky Bioprocessing, Llc Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
EP1304382A3 (en) * 1994-10-14 2004-01-07 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions

Also Published As

Publication number Publication date
EP0672754B1 (en) 2004-05-19
EP0672754A1 (en) 1995-09-20
DE69333529T2 (de) 2004-10-14
EP0672754A4 (en) 1996-03-27
DE69333529D1 (de) 2004-06-24
US5618699A (en) 1997-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1993020217A1 (en) Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product
US5424412A (en) Enhanced expression in plants
EP1561758B1 (en) Method for isolating and purifying viruses from plant sources
EP1268826B1 (en) Cestrum yellow leaf curling virus promoters
JP2021531727A (ja) アフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター及びその使用
CN115894646A (zh) OsJDG1基因及其在调控水稻粒型和千粒重中的应用
KR20020013508A (ko) 외래 서열을 발현시키기위한 다성분 ｒｎａ 벡터 시스템
CA1341019C (en) Plant elongation factor promoters, coding sequences and uses
CN111321155B (zh) 在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法
EA002180B1 (ru) Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащая такие молекулы днк
CN110257406B (zh) 密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因及其应用
KR101724370B1 (ko) Trsv 재조합 벡터 및 이의 용도
US6664384B1 (en) Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof
EP1162267A2 (en) Plant virus vector, plasmid, process for expression of foreign gene and process for obtaining foreign gene product
AU733982B2 (en) Bacterial resistance in grapevine
EP3850087A1 (en) Rice plant material resistant against biotic stress
JP2880024B2 (ja) 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法
JP4228072B2 (ja) アビジンをコードする人工合成遺伝子
KR102714089B1 (ko) 이종 바이러스의 RNA 침묵억제 단백질을 포함하는 Potato virus X 기반 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도
US5428144A (en) Maize dwarf mosaic virus cDNA
KR20230032679A (ko) 이종 바이러스의 RNA 침묵억제 단백질을 포함하는 Potato virus X 기반 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도
KR20230168524A (ko) 신규한 대두 제미니바이러스 b의 감염성 클론 및 이의 용도
CN118272422A (zh) 一种碱基编辑系统及其在提高碱基c到碱基g编辑效率和纯度中的应用
JP2003334087A (ja) 植物ウイルス由来プロモーター
CN117965616A (zh) 与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbMYC2及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993906862

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08313127

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993906862

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1993906862

Country of ref document: EP