WO1993013133A1 - HUMAN TYPE ANTIBODY REACTIVE WITH GPIIb/IIIa - Google Patents

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WO1993013133A1
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Man Sung Co
J. Yun Tso
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to recombinant DNA technology
  • null antibody technology and more particularly, for example, the production of non-immunogenic (in human) immunoglobulins specific for the GPII b / ⁇ a antigen and their For in vitro and in vivo use.
  • Cardiovascular disease is a leading cause of death and illness in developed countries.
  • Atherosclerosis or arterial stenosis and sclerosis are major causes of cardiovascular disease.
  • Arterial thrombosis the formation of a clot or thrombus, usually occurs in arteries affected by atherosclerosis, especially when the plaque formed on the vessel wall is ruptured. Thrombus formation in coronary arteries can cause acute myocardial infarction (heart attack) if blood flow is sustained or unstable angina if blood flow is transient.
  • Arterial thrombus can cause a stroke or transient ischemic stroke
  • Arterial thrombus is formed by aggregation of platelets together with protein fibrin.
  • Glycoprotein GP lib / IIIa is present on the surface of platelets and plays an important role in platelet aggregation. Thus, it plays an important role in thrombus formation (see generally, Phillips et al., Blood 71 ⁇ 831 (1988), which is hereby incorporated by reference).
  • Ca 2+ ions are required to maintain the heterodimer structure of GP IIb / IIIa, a member of the adhesion molecule family of integers.
  • platelets When platelets are activated by physiological agonists such as thrombin, adenosine diphosphate (ADP) or epinephrine, they change the structure or environment of the GP IIb / IIIa molecules on the platelet surface, which results in Serum tan It can bind to protein fibrinogen. Fiprinogen forms aggregates by cross-linking platelets.
  • GP Ilb / IIIa is also a receptor for the adhesive proteins fibronectin, von Willebrand factor and vitronectin, so that platelets adhere to the subendothelial layer of damaged blood vessels and extend pseudopodia. May cause bleeding.
  • mosochronal antibodies have been developed that bind to GPIIb / IIIa and inhibit binding to fibrinogen. These antibodies include mouse monoclonal antibody 10 E5 CCoIler, etc., J. Clin. Invest. 72, 325 (1983), mouse monoclonal antibody AP-2 CPidard, etc., Biol. Chem. 258> 12582 (1983) and mouse monoclonal antibody. Null antibody 7E3 [Coller, J. Clin. Invest., 101 [1985]. These are incorporated herein by reference] and C4G1 described herein. By inhibiting fibrinogen binding, these antibodies block platelet aggregation in vitro in response to agonists such as ADP.
  • agonists such as ADP.
  • anti-GPIIb / IIIa antibodies can prevent blood formation by preventing further aggregation of platelets. Indeed, treatment with the 7E3 antibody has been found to contribute to coronary reopening in a model of canine coronary thrombosis, especially when administered in combination with the tissue plasminogen activator (CtPA). (Gold et al., Circulation 67
  • non-human monoclonal antibodies such as 7 ⁇ 3 or C4G1
  • mouse monoclonal antibodies have a short half-life in humans and tend to lack other important immunoglobulin functional properties when used in humans.
  • non-human monoclonal antibodies contain a significant range of amino acid sequences that are antigenic to humans when injected into human patients. Numerous studies have shown that after injection of a foreign antibody, the immune response elicited by the patient against the antibody is very strong, diminishing the therapeutic utility of the antibody after initial treatment. Furthermore, as more and more different mouse or other antigenic [to human] monoclonal antibodies are expected to be developed to treat different diseases, any different non-human Cross-reactivity after first or some treatment with antibodies Therefore, even unrelated therapies may render the subsequent treatment ineffective or even dangerous per se.
  • chimeric antibodies eg, mouse variable regions linked to human constant regions
  • the important antigenicity problem is Remaining.
  • using typical human monoclonal antibody production techniques to react with many antigens as well as the GP IIb / IIIa antigen to produce high affinity human immunoglobulins would be very difficult.
  • human immunoglobulin that inhibits platelet aggregation and can be used as a therapeutic agent for thrombosis.
  • recombinant DNA technology see, e.g., Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988) and U.S. Pat.No.
  • the present invention provides, for example, a novel composition useful for treating a human disease associated with arterial thrombosis, that is, a composition containing a humanized immunoglobulin that can specifically bind to a GPlib / IIIa antigen.
  • This immunoglobulin has two pairs of LZH chain complexes consisting of one or more mouse complementarity-determining regions (CDRs) with at least one chain operatively linked to a fragment of the human framework region. be able to.
  • CDRs mouse complementarity-determining regions
  • a mouse complementarity-determining region with or without additional native mouse amino acid residues may be introduced into the human framework region to provide G ⁇ IIb / IIla with an affinity greater than about ⁇ - 1. It is possible to produce a miniaturized immunoglobulin capable of binding to an antigen.
  • These humanized immunoglobulins can also inhibit the binding of GP Ilb / IIIa to a mouse monoclonal antibody that provides complementarity determining regions.
  • the immunoglobulins of the present invention include binding fragments and other derivatives. It can be readily produced by various recombinant DNA techniques by permanent expression in transfected fc cells, preferably immortalized eukaryotic cells, such as myeloma or hybridoma cells.
  • a polynucleotide comprising a first sequence encoding a framework region of a humanized immunoglobulin and a second set of sequences encoding a desired immunoglobulin-competent determining region may be synthesized or It can be produced by combining an appropriate cDNA and a genomic DNA fragment.
  • Humanized immunoglobulin can be used in substantially pure form alone or with therapeutic agents such as tissue plasminogen activator or aspirin that are active against blood. it can. All of these compounds are particularly useful for treating acute myocardial infarction, anxiety and angina pectoris, stroke and other platelet-mediated disorders. Humanized immunoglobulins or their complexes can be prepared in pharmaceutically acceptable dosage forms, which vary depending on the mode of administration.
  • Humanized immunoglobulin can also be used in conjunction with a marker to diagnose the presence and location of certain types of pain that express GPlib / IIIa on the thrombus or surface of human patients.
  • labels include radiopaque dyes, radioimaging agents, fluorescent molecules, spin-labeled molecules, enzymes, or other labels of particular diagnostic value in radiology or magnetic resonance imaging techniques. However, it is not limited to these.
  • FIG. 1 shows an anchored PCR cloning scheme for the heavy and light chain variable region cDNA.
  • RN A was prepared from about 10 7 Hype Li dormer cells using heat phenol extraction method. Briefly, cells were suspended in 1 ml of RNA extraction buffer (50 mM sodium phosphate, pH 5.2 / 1% SDS), agitated, and mixed with 0.5 ml of phenol ⁇ 655.2 at 65. For 15 minutes and then on ice for a further 15 minutes. The aqueous layer was collected and precipitated twice with ethanol.
  • RNA extraction buffer 50 mM sodium phosphate, pH 5.2 / 1% SDS
  • cDNA was synthesized from 10 ⁇ g of total RNA using reverse transcriptase (BRL, Bethesda, MD) and oligo dTi 2- : i 8 CPharmacia as bimer, Biscuit Tree, NY.
  • Poly (dG) tail uses terminal deoxynucleotidyl transferase (BBL) And linked to the 3 'end of cDNA (EY Loh et al., Science 243, 217 (1989)).
  • variable region gene (V) was prepared by using the primer (mc045 CTAATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCC) that forms a hybrid with the poly (dG) tail and AmpliTag CPerkin Elmer-Cetus) using the primer that forms a hybrid with the constant region gene (C).
  • the primer used was mc046 CTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGT GGGAAGATGGATACAGTTGGTGC).
  • the primer used was mc047 CTATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC (CAT) GATGGGG (GO TGT (TC) GTTTTGGC). Sequences in parentheses indicate bases corresponding to degeneracy.
  • the primers would have been able to hybridize to most of the gamma chains since the bases corresponding to the degeneracy were introduced.
  • the amplified fragment was then digested with EcoRI and Hindlll and cloned into a PUC18 vector for sequencing.
  • FIG. 2 shows the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the variable region of the light chain (FIG. 2A) and heavy chain (FIG. 2B) of antibody C4G1.
  • CDR sequences are underlined.
  • the mature L chain protein begins with 21 Asp amino acid and the mature H chain protein starts with 20 Gin amino acid, preceded by a respective signal sequence.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the plasmids pVgl-dhfr (FIG. 3A) and pVk (FIG. 3B).
  • the plasmid pVgl-dhfr has the following parts: about 4200 base pairs containing the amp and dhfr genes BamHI-EcoRI fragment: EcoRI and Xbal linkers at the 5 'and 3' ends, respectively Connected human cytomegalovirus (CMV) 630 base pair fragment containing IE1 gene promoter and enhancer (Boshart et al., Cell 1, 521 (1985), which is incorporated herein by reference. And a 2800 base pair Hindlll-PvuII fragment containing a 215 base pair leading intron and a human gamma 1 constant region with a poly (A) signal (Ellison et al., Nucleic Acids Res.
  • CMV cytomegalovirus
  • the plasmid pVk is a 1530 base pair EcoRI-Xbal fragment containing the human kappa constant region gene substituted for the gamma-11 gene and an approximately 335 base pair intron (Hieter et al.). Cell 22, 197 (1980), which is incorporated herein by reference] and constructed similarly using the gptII gene in which the dhfr gene was replaced. Fragments containing the region genes were created using Xbal and BamH The I site is fired at the 5 'and 3' ends, respectively.
  • brasmids were constructed from designated portions using methods well known in the art (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring, NY, Cold Spring, NY). Harbor Laboratory).
  • pVgl-dhfr replaces the Hind III-Bgl II fragment containing the hyg gene with a 660 base pair fragment containing the dhfr gene and up to the Bgl II site (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Figure 4 shows no antibody (), chimeric C4G1 antibody extended, humanized C4G1 antibody
  • Fig. 5 shows amino acids that do not contain the signal sequence of the variable region (Fig. 5A) and H chain (Fig. 5B) of the humanized C4G1 antibody (top row) and mouse C4G1 antibody (bottom row). Sequence is shown Three underlined CDRs in each chain Underlined residues replaced with mouse amino acids or consensus human amino acid in the humanized antibody are double underlined The amino acid sequences of the complete L chain (Fig. 5C) and H chain (Fig. 5D) of the humanized C4G1 antibody are shown.
  • FIG. 6 shows the oligonucleotides used for constructing the H chain Crh29-rh32) and L chain (rh33-rh36) of humanized C4G1.
  • the following oligonucleotide pairs are mixed, extended with iCIenow polymerase or AmpliTaq and ligated to pUC18 before designated enzymes: rh29 and rh30 are XbaI and Eco, rh31 and rh32 are XbaI and Eco. And EcoRI, rh33 and rh34 were cut with XbaI and HindIII, and rh35 and rh36 were cut with XbaI and HindIII.
  • the rh29-rh30 and rh31-rh32 fragments were then cut from pUC18 with XbaI and XhoI and ligated together into the XbaI site of pVgl-dhfr, and the rh33-rh34 and rh35-rh36 fragments.
  • the insert was cut with XbaI and HindIII and ligated together at the XbaI site of pVk.
  • Figures 7A and B show the plasmids pHFab.D ( Figure 7A) and pHF, used for the expression of the humanized Fab and F (ab ') 2 fragment heavy chains, respectively.
  • (ab ') 2.D shows a schematic diagram (Fig. 7B). This plasmid resembles the plasmid pVgl-dhfr ( Figure 3), except that pHFab.D contains Cnl of the human Crl gene and the first five amino acids of Hinjexon, followed by a stop codon.
  • element pHF (ab ') 2.D is C H 1, the first two amino acids of the hinge and C h 2, followed by stop codons and It has only a splice donation signal. The final exon is followed by a region other than the mouse r2a constant region gene that has the polyA signal.
  • Figure C and D seventh Fab Furagume down bets human-type C4G1 antibody (FIG. 7 C) and F (ab ') 2 - 1 called recombinant F (ab') 2 off Ragume The amino acid sequence of the H chain of each of the H chains (Fig. 7D) is shown.
  • FIG. 8 shows humanized and competitive binding of mouse C4G1 antibody and fragment to platelets.
  • About 3 X 10 7 platelets radioactive ® ⁇ containing labeled mouse C 4 G 1 of 4.5ng tracer antibody (3.5 / Ci / U g) and various non-labeled murine C4G1 antibody Wakashi Ku is Furagume down bets amount (Black) or with humanized C4G1 antibody or fragment (white).
  • A indicates the complete antibody
  • B indicates the Fab fragment
  • C indicates the mouse F (ab ') 2 and humanized F (ab') 2 -1 fragments.
  • FIG. A shows the platelet aggregation inhibitory effect of the mouse C4G1 antibody and FIG. B shows the platelet aggregation inhibitory effect of the human C4G1 antibody.
  • the Y axis shows the percentage of light transmission and the X axis shows the time (minutes).
  • the black curve at the top of each panel shows the increase in light transmission caused by platelet aggregation when no antibody was added, and the thinner curve at the bottom shows the platelet with antibody addition, as measured by the change in light transmission. Indicates that aggregation is strongly inhibited.
  • a humanized immunoglobulin that specifically reacts with a GP IIb / IIIa-related ebitove. These immune globulin is 0? 111) / / 111 & least with respect about IiGM- 1 preferably has a binding affinity of 10 E M 1 to IO M- 1 or greater strength, for example, platelet aggregation Can be blocked.
  • Humanized immunoglobulin has a human framework and one or more of immunoglobulins, typically derived from a mouse immunoglobulin that specifically reacts with the GPIIb ZIIIa antigen. It has the above complementarity determining region [CDR].
  • the one or more CDRs are from a C4G1 antibody.
  • the immunoglobulins of the present invention which can be mass-produced economically, find use, for example, in the treatment of platelet-mediated diseases in human patients by various techniques.
  • each tetramer is composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one “L” chain (about 25 kD) and one “HJ” chain (about 50-70 kD)
  • the amino-terminal portion of each chain has a variable region of about 100 to 110 or more amino acids that is primarily responsible for antigen recognition
  • the carboxy-terminal portion of each chain is a constant region that primarily performs effector functions.
  • Light chains are classified as either kappa [A or lambda [s].
  • Heavy chains are classified as gamma (7, mu [], alpha [ ⁇ ], delta ( ⁇ ), or epsilon [ ⁇ ], and specify the antibody's isotype as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, respectively.
  • the variable and constant regions are joined by a "JJ" region of about 12 or more amino acids, and the H chain also has a "DJ" region of about 10 or more amino acids.
  • variable region of each LZH chain pair forms the binding site of the antibody. All of these chains are basically identical in structure and have three hypervariable regions, also known as catchability determining regions or CDRs, and relatively conserved framework regions that bind CDRs.
  • C ⁇ Sequences of Proteins of Immunological Interest J, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services (1987); and Chothia and Lesk, J. Moi. Bioi., 196, 901-917 [1987], which are incorporated herein by reference).
  • the CDRs from the two strands of each pair are correctly positioned by the framework regions and can bind to specific epitopes.
  • immunoglobulin refers to a protein consisting of one or more polypeptides substantially encoded by an immunoglobulin gene. Recognized immunoglobulin genes include kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu constant region genes, as well as a myriad of immunoglobulin variable region genes. Immunoglobulins include, for example, Fv, Fab and F (ab ') 2 as well as bifunctional and hybrid antibodies (e.g., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). Various forms other than antibodies and single chains (e.g., Huston et al., Proc.
  • Chimeric antibodies are those that are constructed, typically by genetic engineering, from immunoglobulin gene fragments whose L and H chain genes of the antibody belong to different species.
  • a variable (V) fragment of a gene obtained from a mouse monoclonal antibody can be ligated to a human constant (C) fragment such as r1 and r3.
  • C constant
  • typical therapeutic chimeric antibodies are derived from mouse (or other mammalian species can also be used) V- or antigen-binding domains derived from antibodies and C- or effector-domains derived from human antibodies. It is a hybrid protein consisting of In.
  • a “human framework region” is a framework region that is substantially identical (about 85% or more identical) to a naturally occurring human antibody framework.
  • humanized immunoglobulin J comprises a human framework, at least one CDR derived from a non-human antibody, and any constant region present therein.
  • Immunoglobulin refers to an immunoglobulin that is substantially identical to the human immunoglobulin constant region, ie, at least about 85-90%, and preferably at least 95%. All parts of the protein are substantially identical to the corresponding parts of one or more of the native human immunoglobulin sequences, possibly except for the CDRs. Region / human constant region antibodies will not.
  • Humanized antibodies have at least three advantages over mice and, in some cases, chimeric antibodies when used to treat humans:
  • humanized antibodies can interact better with other parts of the human immune system (e.g., trap-dependent cytotoxicity [CDC] or Target cells are more effectively destroyed by antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)].
  • CDC trap-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the human immune system does not recognize the framework or C region of the humanized antibody as foreign, and consequently the antibody response to such injected antibodies is entirely foreign mouse antibodies or partially foreign antibodies. Less for chimeric antibodies.
  • the invention relates to H and Z or L chain CDRs obtained from immunoglobulins (e.g., monoclonal antibodies C4G1, 7E3, 10E5 or AP-2) that can bind to the desired epitope of the GP Hb / IIIa antigen.
  • immunoglobulins e.g., monoclonal antibodies C4G1, 7E3, 10E5 or AP-2
  • a recombinant polynucleotide encoding Polynucleotides encoding these regions typically bind to a polynucleotide encoding a human framework region.
  • the human framework is a non-human immunoglobulin framework from which CDRs are obtained or The amino acid sequence of the variable region is compared with the corresponding sequence in the human immunoglobulin sequence collection, and a sequence with high homology is selected.
  • Monoclonal antibodies (representative polynucleotides encoding polypeptide chains comprising the heavy and light chain CDRs of G1 are included in Figure 2. Codon degeneracy and minor amino acids These sequences can be easily replaced with other polynucleotide sequences, as detailed below.
  • the design of a humanized immunoglobulin is performed as follows. Can be.
  • amino acids corresponding to [a:] to (c) are converted from the framework amino acids from non-human immunoglobulins (donor immunoglobulins) from which CDRs are obtained. Substitutes the framework amino acid of human immunoglobulin (receptor immunoglobulin) using a protein.
  • amino acid is in the immediate vicinity of one of the CDRs.
  • [C] The amino acid is present in about 3 CDRs in a three-dimensional immunoglobulin model. (See Queen et al., Supra and Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 ⁇ 2869 (1991), both of which are incorporated herein by reference).
  • the polynucleotide typically further comprises an expression control polynucleotide sequence comprising a naturally associated region or a heterologous promoter region, operably linked to the sequence encoding the humanized immunoglobulin.
  • the expression control sequences are eukaryotic promoter systems in vectors capable of transforming eukaryotic host cells, although prokaryotic host control sequences can also be used.
  • the vector is introduced into a suitable host, the host is maintained under conditions suitable for high-level expression of the nucleotide sequences, and If desired, light chains, heavy chains, LZ heavy chain dimers or complete antibodies, binding fragments or other immunoglobulins can be collected and purified.
  • the nucleotide sequence of the present invention that can permanently express the desired humanized antibody is composed of various polynucleotides (genomic or cDNA, RNAs synthetic oligonucleotides, etc.) and components (eg, V, J, D and C regions) Although combining the appropriate genome and synthetic nucleotide sequence is currently the most common method of manufacture, cDNA sequences can also be used. No. 0239400 and L. Reichraanri et al., Nature 332 ⁇ 323-327 [1988], both of which are incorporated herein by reference).
  • the human constant region DNA sequence can be isolated from various human cells according to well-known methods, but is preferably from immortalized B cells (see Kabat, supra and WP87 / 02671).
  • the CDRs used in the production of the immunoglobulins of the present invention are also derived from monoclonal antibodies that can bind to GPlib / IIIa, and can be used to produce antibodies by well-known methods. ⁇ Manufactured in any convenient mammal species, including herons or other vertebrates.
  • Cells as a source of the above polynucleotides and host cells used for immunoglobulin expression and secretion can be obtained from a number of sources, such as the ATCC (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5th Edition [1985 ), Rockville, Maryland, USA, which is incorporated herein by reference).
  • ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5th Edition [1985 ), Rockville, Maryland, USA, which is incorporated herein by reference).
  • substantially homologous modified immunoglobulins can be readily designed and are well known to those skilled in the art. It can be produced using various recombinant DNA techniques. For example, in the framework regions, the primary structure of the native sequence can be altered by several amino acid substitutions, terminal and intermediate amino acid additions and deletions, and the like. In addition, a wide variety of human framework regions can be used alone or in combination as a basis for the humanized immunoglobulins of the present invention. In general, gene modification can be readily accomplished by a variety of well-known techniques, such as site-directed mutagenesis (Gillman and Sinitfu Gene, 81-97 (1979) and S.
  • polypeptide fragments can be produced that consist of only a portion of the primary antibody structure with one or more immunoglobulin activities (eg, complement fixation activity).
  • immunoglobulin activities eg, complement fixation activity
  • These polypeptide fragments can be obtained by proteolytic cleavage of whole antibodies by methods well known in the art, or by using site-directed mutagenesis. Add a stop codon at the desired position in -dhfr ( Figure 3), for example, after CH1 to produce Fab fragment or after hinge region to produce F (ab ') 2 fragment. It can be manufactured by inserting.
  • Single chain antibodies can be produced by linking VL and VH with a DNA linker (see Huston et al., Supra, and Bird et al., Supra). Also, like many genes, immunoglobulin-related genes each have one or more distinct functional regions with distinct biological activities, so these genes The gene can be fused to a functional region obtained from another gene to produce a fusion protein having new characteristics.
  • a polynucleotide is operably linked to an expression control sequence (ie, positioned to ensure that the expression control sequence is functional) and then expressed in a host.
  • expression control sequence ie, positioned to ensure that the expression control sequence is functional
  • expression vectors are typically replicable in the host organism either as episomes or integrated into the host chromosome DNA.
  • expression vectors include a selectable marker, such as tetracycline or neomycin, to allow detection of cells transformed with the desired DNA sequence (see, eg, US Pat. 704, 362, which is incorporated herein by reference).
  • E. coli is a particularly useful prokaryotic host for cloning the polynucleotides of the present invention.
  • Other microbial hosts suitable for use include bacilli, such as Bacillus subtilus, and other intestinal bacteria, such as Salmonel la, Serratia, and various Pseudomonas species. Is included.
  • prokaryotic hosts one can also produce expression vectors, which typically contain expression control sequences compatible with the host cell (eg, an origin of replication).
  • promoters obtained from, for example, the lactose promoter system, the tributophan (trp) promoter system, the beta-lactamase promoter system, or There are a number of different well-known promoters, such as one-part systems.
  • the promoter optionally has an operator sequence, and typically has liposome binding site sequences and the like, which regulate expression and initiate and complete transcription and translation.
  • yeast can also be used for expression.
  • Sacharomyces CSaccaromyces is a preferred host, having expression control sequences such as a promoter containing 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, and appropriate vectors having a desired replication origin, termination sequence, etc. ing.
  • mammalian-derived cultured cells can also be used to express and produce the polypeptides of the invention (Winnacker, Prom Genes to Clones, VCH Publishers ⁇ New York, NY [1987 ), which is hereby incorporated by reference).
  • Eukaryotic cells are developed in the art using a number of suitable host cell lines capable of secreting intact immunoglobulin. These include the CH0 cell line, various COS cell lines, HeLa cells, preferably myeloma cell lines, etc. or transformed B cells or hybridomas.
  • the expression vector for these cells is an expression control sequence, such as a replication origin, promoter, homogenizer (Queen et al., Immunol. Rev.
  • Preferred expression control sequences are promoters derived from immunoglobulin gene, SV40, adenovirus, papilla virus, cytomegalovirus and the like.
  • Vectors containing important polynucleotide sequences can be introduced into host cells by well known methods, which depend on the type of cellular host. Change. For example, calcium chloride transfection is commonly used for prokaryotic cells, while calcium phosphate treatment or electorporation can be used for other cellular hosts. Generally, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuak Cold Spring Harbor Press (1982), which is incorporated herein by reference. )
  • immunoglobulins can be purified according to standard techniques in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity column, column chromatography, gel electrophoresis, etc. , R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York [1982], which is incorporated herein by reference).
  • substantially pure immunoglobulin of at least about 90-95% purity is preferred, and 98-99% or higher purity is most preferred.
  • the polypeptide can be used therapeutically (including in vitro applications) or for the development and implementation of assays, fluorescent immunostaining, etc. it can. (See generally, Immunological Methods, Volumes I and II, eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, New York, NY (1979 and 1981)).
  • the immunoglobulins of the present invention can typically be used alone for the treatment of cardiovascular and other thromboembolic disorders.
  • typical disease states suitable for treatment include acute myocardial infarction, unstable angina, stroke, transient ischemic attacks, deep vein thrombosis, and pulmonary embolism (typically Hoffbrand & Pettit, see Essential Haematology, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1980)).
  • These immunoglobulins can also be used to prevent reocclusion after angioplasty and after vascular surgery, or after or during extracorporeal blood circulation, such as dialysis and cardiopulmonary extracorporeal circulation.
  • the immunoglobulins of the present invention could also be used to treat other platelet-related diseases. For example, treatment of nephritis, peripheral circulatory disorders, obstructive thromboangiitis, thrombosis after transplantation, chronic arterial occlusion, obstructive arteriosclerosis, coronary sclerosis, congestive heart failure and cerebral vasospasm. It can also be used to treat thrombotic thrombocytopenic purpura, an autoimmune disease involving HUS and platelets, suppress pain metastasis, and promote the differentiation or induction of megakaryocytes or megakaryoblasts.
  • nephritis peripheral circulatory disorders
  • obstructive thromboangiitis thrombosis after transplantation
  • chronic arterial occlusion obstructive arteriosclerosis
  • coronary sclerosis congestive heart failure
  • cerebral vasospasm congestive heart failure
  • cerebral vasospasm congestive heart failure
  • the humanized immunoglobulin of the present invention it is preferable to use CDR derived from immunoglobulin which inhibits platelet aggregation among antibodies binding to GPlib / IIIa.
  • Antibodies that react with vascular endothelium may cause damage to vascular endothelium, and it is known that 7E3 etc. react with vascular endothelium (ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 614, 204 (1991) ).
  • ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 614, 204 (1991) vascular endothelium
  • there is an epitobe on the platelets Use CDRs derived from immunoglobulin such as C4G1 that have no or little epitope on the vascular endothelium.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention such as the humanized immunoglobulin that binds to the antigenic determinant identified by the mouse antibody C4G1, is not expected to damage endothelial cells
  • AD ⁇ ADad'renalin-stimulated platelet aggregation shows reversible primary aggregation first seen after addition of these agonists, followed by irreversible dose-dependent secondary aggregation following release.
  • Can be Antibodies such as 7 ⁇ 3 are known to inhibit aggregation when platelets are previously treated with antibodies, but are known to inhibit aggregation when antibodies are added during platelet aggregation. There was nothing. However, it was confirmed that C4G1 not only inhibits primary aggregation, but also has the effect of inhibiting secondary aggregation when added after primary aggregation has been induced.
  • humanized immunoglobulins using CDRs derived from C4G1 or immunoglobulins having an action similar to that of C4G1 described above also suppress the initial processes of platelet activation and aggregation in the acute phase of hematopoietic disease. Can be expected.
  • humanized immunoglobulins of the present invention can also be used in combination with other antibodies, particularly humanized antibodies that react with various platelet antigens or blood clotting factors.
  • suitable antigens to which a mixture of humanized immunoglobulins can react include VLA-2, VLA-5, GPIb, GPIV, fombilbrand factor, thrombin and blood plasma thrombin receptor (Co Lier, New Eng. J. Med. 322. 33 (1990)).
  • immunoglobulins are also administered separately, used together with other therapeutic agents It can also be used as a composition.
  • these drugs include aspirin and heparin, but the use of a number of other drugs (eg, tPA) well known to those skilled in the art to treat cardiovascular disease. Can also.
  • the humanized immunoglobulin and the pharmaceutical composition of the immunoglobulin of the present invention are particularly useful for parenteral administration, ie, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • Parenteral administration usually consists of a solution of immunoglobulin or a mixture thereof dissolved in an administrable carrier, preferably an aqueous carrier.
  • aqueous carriers can be used, for example, water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine, 5% glucose, human albumin solution, and the like. These solutions are sterile and generally free of particulate matter.
  • These compositions can be sterilized by conventional, well-known sterilization techniques.
  • compositions may be formulated and administered as necessary to approximate physiological conditions such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, toxicity adjusting agents, etc., e.g. sodium acetate , Sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate, sodium citrate and the like.
  • concentration of immunoglobulin in these formulations can vary widely, from ⁇ , less than about 0.5% by weight, usually from at least about 1% by weight to as much as 15 or 20% by weight. And, depending on the particular mode of administration chosen, mainly based on volume, viscosity, etc.
  • a typical pharmaceutical composition for injection can be made up to contain 1 ml of sterile buffered water and 1 to 10 mg of immunoglobulin.
  • a typical composition for intravenous infusion could consist of 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of antibody.
  • the actual methods of preparing parenterally administrable compositions are known or will be apparent to those skilled in the art and include, for example, Remington's Pharmaceutical Science, 15th edition, Further details can be found in Mack Pub lishing Company> Easton, PA (1980), which is incorporated herein by reference.
  • the immunoglobulins of the present invention can be frozen or lyophilized for storage and reconstituted with a suitable solvent before use. This technique has been shown to be effective with conventional immunoglobulins, and lyophilization and regeneration techniques known in the art can be used. Lyophilization and regeneration to varying degrees (Eg, in normal immunoglobulins, IgM antibodies tend to lose more activity than IgG antibodies) and the amount used must be adjusted for capture Those skilled in the art will consider.
  • compositions containing the humanized immunoglobulins of the present application or mixtures thereof can be used for therapeutic or prophylactic treatment.
  • the composition may be sufficient to cure or at least partially arrest the disease and its complications in patients already suffering from arterial thrombosis or other platelet-mediated diseases. It is administered in an amount.
  • An amount adequate to accomplish this is defined as "therapeutically effective dose.” Effective amounts for this use will depend on the severity of the illness and the general state of the patient's own immune system, but will generally range from about 1 to about 200 mg of antibody per dose, with Generally, doses of 5 to 25 mg per patient are used. It should be noted that the substances of the present invention can generally be used in serious disease states, ie, life-threatening or potentially life-threatening situations.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention achieves a substantial amount of the above substance in view of minimizing in vitro substances and reducing the possibility of rejection of “foreign substances”.
  • Immunoglobulin can be administered and may be desirable by the treating physician.
  • Typical prophylactic uses include treatments to prevent acute occlusion in patients undergoing balloon angioplasty or to prevent subsequent attacks in patients who have had a single heart attack or stroke.
  • compositions can be carried out with dose values and patterns being selected by the treating physician.
  • the drug formulation will provide a quantity of the immunoglobulin (s) of the invention sufficient to effectively treat the patient. .
  • a composition comprising a humanized immunoglobulin of the invention can be used to diagnose the presence and location of blood in a human patient.
  • the antigenic determinant to which the mouse antibody C4G1 binds is present on platelets but is absent or low in vascular endothelial cells.
  • a humanized immunoglobulin of the invention such as a humanized immunoglobulin that binds to an antigenic determinant identified by the mouse antibody C4G1, contains a significant degree of vague activated platelets. It can be labeled and used to identify anatomical sites that have it, such as thrombus sites.
  • one or more labeling agents can be attached to the humanized immunoglobulin.
  • Representative labels include radiopaque dyes, radioimaging agents, fluorescent molecules, spin-labeled molecules, enzymes, or other labels of diagnostic value, especially in radiology or magnetic resonance imaging techniques. Including, but not limited to.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention can further find widespread utility in the oral cavity.
  • the immunoglobulin of the present invention can be used for detection of GPI Ib / IHa antigen, isolation of platelets, and the like.
  • the immunoglobulins of the invention can be used labeled or unlabeled.
  • Unlabeled immunoglobulin can be used in combination with another labeled antibody (secondary antibody) that reacts with the humanized antibody with an antibody specific for the human immunoglobulin constant region.
  • second antibody another labeled antibody
  • the immunoglobulins of the invention can be directly labeled.
  • a wide range of labels can be used, such as radionuclides, fluorophores, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), and the like. Numerous types of immortality are available and are well known to those skilled in the art.
  • the immunoglobulin compositions of the present invention can be provided alone or together with other antibodies specific for the desired cell type, usually in lyophilized form in a container.
  • the immunoglobulins of the present invention which can be conjugated or unconjugated to a label or toxin, can be used as a buffer, stabilizing agent, storage agent such as tris, phosphate, carbonate and the like. Agents, inactive proteins, such as serum albumin, etc. and a set of instructions for use can be included in the kit.
  • these materials are present in less than about 5%, based on the amount of active immunoglobulin, and usually again in a total amount of at least about 0.001% by weight based on immunoglobulin concentration.
  • Existing Often it is desirable to include a non-chemically active excipient or excipient to dilute the active ingredient, with the excipient being present in about 1 to 99% by weight of the total composition be able to.
  • Immunoglobulin If a secondary antibody capable of binding to the protein is used in the assay, it will usually be in a separate vial. Secondary antibodies are typically conjugated to a label and are formulated in a manner similar to the immunoglobulin formulations described above.
  • the heavy and light chain variable region gene cDNAs hybridize with the constant region and contain a Hindlll site and a 3 'primer and a dG tail, form a hybrid, and contain an EeoRI site.
  • Plasmid vectors were prepared to construct and express chimeric antibody genes.
  • Brasmid pVgl-dhfr [Fig. 3A] is a human cytomegalovirus IE1 promoter and Engensa-I. CM. Boshart et al., Cell 41, 521 (1985)), a human genome CA with a preceding intron. One fragment, as well as the dihydrofolate reductase Cdhfr) gene for selection (Simonsen et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495 [1984], which is incorporated herein by reference). Plasmid pVk (FIG.
  • 3B is similar to pVgl-dhfr, but contains the human genomic C fc fragment and the gpt gene.
  • Derivatives of C4G1H and light chain variable regions are derived from cDNA by PCR. Prepared. The 5 'primer hybridized with the V region starting at the ATG codon, sodated, and contained an Xbal site; the 3' primer hybridized with the last 15 nucleotides of the J region. Formed and contained a splice donor signal and an Xbal site (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10029 (1989), which is incorporated herein by reference). The modified V region was cloned into the Xbal site of each plasmid vector between the constant region CMV promoter and the partial intron.
  • H-chain and power chain plasmids were transfected into Sp2 / 0 mouse myeloma cells by electo-poration and selected for gpt expression. Clones secreting the greatest amount of complete antibody were detected by the EUSA method. The purified chimeric C4G1 antibody bound to HEL 92.1.7 cells expressing the GP IIb / IIIa antigen, as demonstrated by flow cytometry [FIG. 4]. Construction of a computer model for humanized antibodies
  • “rare” includes amino acids that occur in less than about 20% of the human sequence in the same subgroup as Eu light chains and heavy chains (as defined above, CKabat et al.). And “typical” is to be construed to include amino acids that occur in more than about 25%, but generally more than 50%, of the human sequence in the above subgroup. For positions in these categories, amino acids from mouse C4G1 antibody were used. In addition, the position is the fifth category,
  • a typical amino acid for the human antibody at that position can be used.
  • Table 1 shows the amino acids in each category. Some amino acids can be in more than one category.
  • the final sequences of the humanized C4G1 L chain and H chain variable regions are shown in FIGS. 5A and 5B in comparison with the mouse C4G1 sequence.
  • nucleotides and sequences encoding the protein sequences of the humanized H and L chains were selected. This included a typical immunoglobulin signal peptide and generally used codons found in mouse sequences. Some of the degenerate codons were changed to create restriction sites or to remove unwanted restriction sites. This nucleotide sequence also had the same splice donor signal used in the chimera gene and an Xbal site at each end. Each gene was constructed from four partially overlapping synthetic oligonucleotides. For each variable region gene, double overlapping oligonucleotides that alternated between strands were synthesized.
  • Oligonucleotides were synthesized on an Applied Biosystems 380B DNA synthesizer. ⁇ Each oligonucleotide is approximately 110-140 bases in length, with approximately 15 bases overlapping. Was.
  • Double-stranded DNA fragments were synthesized from each oligonucleotide pair with Kienow polymerase, digested with restriction enzymes, ligated into the PUC18 vector and sequenced. The two fragments, each with the correct half sequence, were then ligated in the correct orientation to the XbaI site of the pVgl-dhfr or pVk expression vector to produce the complete H and L chain genes.
  • the humanized C4G1 variable region gene is included in the XbaI fragment of pVgl-dhfr. Reactions were performed under conditions well known in the art (Maniats et al., Supra). The predicted amino acid sequences of the complete H and L chains of the humanized C4G1 antibody are shown in FIGS. 5C and 5D.
  • H and L chain plasmids were transfected into Sp2 / 0 mouse myeloma cells by electroporation, and cells were selected for gpt expression.
  • Clones were screened for human antibody production in culture supernatants by the EUSA method, and antibodies were purified from the clones with the highest production.
  • Antibodies were purified by passing the tissue culture supernatant through a force column of Staphylococcus protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). Bound antibody eluted at 0.2 M glycine-HC1, pH 3.0, and at 1 M tris, pH 8.0 Neutralized. The buffer was changed to PBS by passing through a PD10 column (Pharmacia). Manufacture of humanized Fab and F (ab ') 2 fragments
  • plasmid pHFab.D first five Amino acids C H 1 Ekuson Contact and Hinjekuson, followed by stop codon and splice donor signals only Yes And the plasmid pHF (ab ') 2.D is the first two amino acids of CH1, hinge and C (counting the codons cross-linking to slyce as part of the hinge), then fires and stops It has only codon and splice donation signals.
  • the final exon was followed by a 162 base pair Sai I—Bam HI fragment, which was obtained from the region immediately after the CH3 exon of the mouse 2a constant region gene and was polyadenylation.
  • Plasmid containing each heavy chain gene was transfected into Sp2 / 0 cells by electroporation together with a plasmid containing the humanized C4G1 light chain gene, and the cells were gpt Selected for expression.
  • Clones were screened human antibody fragment bets in culture ⁇ by ELISA, and human-type C4G1 antibody Fab or F (ab ') 2 - 1 fragment metropolitan purified from clone giving the maximum production amount did.
  • the culture supernatant was initially reduced to 0 £ £ in 20 l ⁇ of Tris buffer, ⁇ 8.6. After passing through a Sepharose column, the non-adsorbed fraction was further subjected to purification.
  • Humanized C4G1 antibodies and fragments can also be purified by other slightly or significantly different methods.
  • the cells were separated from the culture by centrifugation at 10,000 g for 10 minutes, the supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ filter, and then 30,000 for whole antibody and 10 000 for fragment It was concentrated approximately 20-fold using a molecular weight molecular weight cut-off (MW CO) membrane of 2,000.
  • MW CO molecular weight molecular weight cut-off
  • the concentrated culture supernatant is adjusted to pH 7.5 with 1 M Tris, centrifuged at 10,000 g for 10 minutes, and then 0.45 / m The solution was filtered.
  • the sample was then applied to a Protein A-Sepharose FF column (Pharmacia) using 0.15 M NaCK 0.05 M Tris, pH 7.5, 2 mM EDTA as equilibration and wash buffer.
  • Antibodies were eluted with 0.1 M acetic acid adjusted to pH 3.5 with Tris-HCl and the collected fractions adjusted to pH 7.5 with Tris.
  • the collection was then dialyzed against PBS using sterile dialysis tubing and filter sterilized using a 0.2 ⁇ m filter.
  • the concentrated culture supernatant was filtered through 20 mM Tris, pH 8.6, filtered at 10,000 g for 10 min. Centrifuged and filtered through a 0.45 // B1 filter. The sample was applied to a DEAE Sepharose (Pharmacia) column equilibrated with lOmM Tris, ⁇ 8.6, and the unadsorbed fraction was collected. The buffer of the DEAE pool was adjusted to 10 mM with MES and adjusted to pH 6.5 with HC1.
  • the sample was then applied to a CM Sepharose (Pharmacia) column equilibrated with 10 mM MES, pH 6.5 and eluted with an O-500 mM NaCl gradient. Fab fragment was included in the first peak.
  • the boule of this beak fraction was concentrated using a 10,000 MW C0 membrane and applied to a Sephacryl S-200 (Pharmacia) column equilibrated with PBS. Abli.
  • the beak fraction was collected and filter sterilized using a 0.2 / ⁇ filter.
  • Human-type C4G1 F (ab ') 2 - 1 Furagume down bets may be prepared and purified as follows.
  • the concentrated culture supernatant is filtered through 20 mM Tris, pH 8.6, centrifuged at 10,000 g for 10 minutes, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • the sample is applied to a DEAE Sepharose (Pharmacia) column equilibrated with 10 mM Tris, pH 8.6, and the unadsorbed fraction is collected.
  • the pool is concentrated approximately 10-fold using a 10,000 MWC0 membrane, adjusted to pH 5.0 with acetic acid, and the precipitate is removed by centrifugation.
  • the sample is then adjusted to pH 9.0 with Tris, lOmM reduced glutathione is added and incubated at 22 ° C for 30 minutes.
  • the sample is then 0.1M Tris, and dialyzed for 16 hours at 4 ° C against pH 9.0, as a result approximately 30% of ab ') 2 - 1 is formed.
  • the sample is then concentrated approximately 10-fold using a 10,000 MWC0 membrane and loaded onto a Cefacryl S-200 column. Collect the 90 kDa peak and filter sterilize using a 0.2 m filter.
  • Cell lines producing higher levels of humanized C4G1 antibodies and fragments can be obtained by incubating the producer cell lines in methotrexate at a high concentration, CSinonsen et al., Supra).
  • Fab and F (ab ') 2 fragments can be produced by enzymatic digestion of a fully human C4G1 antibody using methods well known in the art instead of the recombinant methods described above. (Antibodies. A Laboratory Manual, edited by Hallow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, which is hereby incorporated by reference).
  • human-type C4G1 F (ab ') 2 of Have another one form, namely F (ab') 2 - 2 as referred shape state was prepared by pepsin digestion as follows. Culture supernatant of human C4G1 IgG-producing cells was adjusted to pH 8.5 with 1 M Tris, and applied to a protein A affinity membrane devis (Nygene) equilibrated with 50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCK 2 mM EDTA. Applied. All antibodies were eluted with 0.1 M glycine-HCl pH 2.5, and the collected fractions were adjusted to pH 3.5 with 1 M Tris.
  • the IgG produced in this manner was digested with bebsin (Sigma) obtained from pig gastric mucosa. Pepsin was dissolved in 0.1 M glycine-HCl pH 3.5 and added to the IgG solution (enzyme: IgG ratio (w / w) 1: 100) The reaction mixture was inverted at 37 for 3 hours. Incubation and the reaction is 1M It was stopped by adding squirrel and adjusting to pH 8.0.
  • the properties of the humanized C4G1 antibody were examined in comparison with the mouse and chimeric antibodies.
  • the humanized antibody was bound to HEL 92.1.7 cells by fluorometric analysis in the same manner as the chimeric antibody (Fig. 4), indicating that the humanized antibody was GP 11b / II. It was shown to recognize the la antigen.
  • Human-type C4G1 antibody, Fab Furagume down bets and F (ab ') 2 - 1 affinity Furagume down bets was determined by competitive binding with murine C4G1 antibody and Furagume down bets.
  • Purified human platelets were used as a source of GP IIb / IIIa antigen. Platelets were purified from puffy coats obtained from normal human donors by centrifugation on Ficoll hypaque.
  • Competing humanized or mouse antibodies or fragments were added in varying amounts to 4.5 ng of radioiodinated tracer C4G1 antibody (3.5 ⁇ Ci / ⁇ g), and 3 ⁇ 10 7
  • the platelets were incubated with 0.2 ml of modified Tyrode's buffer for 1 hour at room temperature. Cells were washed with 2 ml of ice-cold buffer and centrifuged to pellet. The radioactivity was measured and the binding and free tracer antibodies were calculated (Figure 8). 0 The binding affinities of various antibodies and fragments were determined by Queen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA M, 10029 (1989). The results show that the humanized and mouse C4G1 antibody (Fig.
  • mice and humanization The G1 antibody and fragment were tested for their ability to block platelet aggregation. Each antibody or fragment was treated at a final concentration of 5 gZmi with fresh citrated blood at 200 X g for 10 min. Platelet-rich plasma [P RP], prepared with care, was added and incubated for 5 minutes with shaking at 37. ADP was added at a final concentration of 4.6% to initiate aggregation. (Sienco) Light transmission was monitored using a two-channel aggregometer, model DP-247F or HEMA-TRACER. Humanization and the ability of the mouse C4G1 antibody to inhibit aggregation ( Figure 9) or each.
  • the binding of the mouse and humanized C4G1 antibodies to human umbilical vein endothelial cells [HUVEC] was compared with that of GPIIIa-specific mouse monoclonal antibody B6A3 and examined.
  • the binding of the antibody to HEL 92.1.7 cells was also examined.
  • the antibody was radiolabeled as described above (C3.5uCi / Cig).
  • 500 ⁇ 1HUVEC or HEL 92.1.7 (2 XlOVml 2 XI OVmK 2 XIOVEO suspension was incubated with lOOfmol of each monoclonal antibody for 90 minutes at room temperature or 4 in a 1.5 ml eppendorf tube.
  • mouse and human-type C4G1 monoclonal antibody 2 Xl0 5 / inl, 2 Xl0 6 / inl cells
  • mouse ⁇ 6 ⁇ 3 showed specific binding to HEL 92.1.7 cells to the same extent as mouse ⁇ 6 ⁇ 3, whereas mouse ⁇ 6 ⁇ 3 specifically bound to HU VEC at 2 ⁇ 10 6 / ral, while mouse and humanized C4G1 Is any cell But HU It showed no specific binding to VEC.
  • the humanized immunoglobulins of the present invention provide a number of advantages over other GPIIb / IIIa-specific antibodies. Compared to the mouse monoclonal antibody, the humanized immunoglobulins of the invention contain substantially less heterologous amino acid sequences. The reduced likelihood of developing antigenicity after injection into human patients indicates a significant therapeutic improvement.

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Description

明 細 書
G P II b/III aと反応性のヒ ト型化抗体 技術分野
本発明は、 .新規な生物学的製剤を開発するために組換え DN A技術とモノ ク口
—ナル抗体技術を組み合わせるこ とに関するものであり、 更に詳細には、 例えば、 G P II b/ΠΙ a抗原に特異的な （ヒ トにおける） 非免疫原性の免疫グロプリ ンを 製造すること並びにそれらをイ ンビ トロおよびイ ンビボで使用するこ とに関する。
背景技術
心血管疾病は先進国における死亡および疾病の主要原因である。 ァテローム性 動脈硬化または動脈の狭窄および硬化は心血管疾病の主要原因である。 動脈血栓 症、 即ち凝血塊または血栓の形成は通常、 特に血管壁上に形成されたプラークに 開裂が生じたと きァテローム性動脈硬化の影響を受けた動脈で発生する。 冠状動 脈における血栓形成は、 血流遮断が持続する場合には急性心筋梗塞 （心臓発作〕 または血流遮断が一過性である場合には不安定狭心症を引き起こすこ とがある。 脳動脈の血栓は卒中または一過性の虚血性発作を引き起こすこ とがある。 動脈血 栓は血小板がタ ンパク質フィプリ ンと一緒に凝集して形成される。
糖タ ンパク質 GP lib /III aは血小板の表面に存在し、 そして血小板の凝集に 重要な役割を果たす。 従って、 血栓形成において重要な役割を果している （全般 的には、 Phillips等、 Blood 71^ 831 (1988) 参照、 これは本明細書に参考と して 組み入れる）。 G P II b /III aコンプレックスは、 1つまたはそれ以上のジスルフ ィ ド結合で結合した大きい （分子量 = 125 kDa) 鎖と小さい （分子量 =25 kDa) 鎖 からなる 1分子の G P II b (分子量 = 140 kDa) と、 1本鎖かちなる 1分子の G P Ilia (分子量 = 105 kDa) とから構成されている。 Ca2 +イオンは、 接着分子のィ ンテグリ ンファ ミ リ一の一員である GP II b/III aのへテロダイマー構造を維持 するために必要である。 血小板がトロンビン、 アデノ シンジホスフェート （AD P) またはェビネフリ ンのような生理的ァゴニス 卜で活性化されると き、 血小板 表面の GP II b/III a分子の構造または環境が変化するので、 血小板は血清タ ン パク質フイブリノ一ゲンと結合することができる。 フィプリノーゲンは血小板を 架橋することによって凝集塊を形成する。 GP Ilb/III aはまた接着性タンパク 質であるフイブロネクチン、 フォン ビルブラント因子およぴビ卜ロネクチンの受 容体であるため、 損傷を受けた血管の内皮下層に血小板が接着しそして偽足を伸 ばす原因となる。
GPIIb/IIIaと結合し、 フイブリノ一ゲンとの結合を阻害する多数のモソク ローナル抗体が開発されてきた。 これらの抗体にはマウスモノクローナル抗体 10 E5 CCoIler等、 J. Clin. Invest. 72, 325〔1983) 、 マウスモノ クローナル抗体 AP-2 CPidard等、 Biol. Chem. 258> 12582 (1983) およびマウスモノクロ一ナ ル抗体 7E3〔Coller、 J. Clin. Invest. 、 101 〔1985) 。 これらは本明細書に参 考として組み入れる〕 および本明細書に記載した C4G1が含まれる。 フイブリノ一 ゲン結合を阻害することによって、 これらの抗体は AD Pのようなァゴニス トに 応答してインビトロで血小板の凝集を阻止する。 それ故、 抗 GPIIb/IIIa抗体 は血小板の更なる凝集を防止することによつて血拴の形成を阻止することができ る。 実際に、 7E3抗体による治療は、 特に組織ブラスミノーゲンァクチべ一ター CtPA) と組み合わせて投与するとき、 ィヌの冠動脈血栓症のモデルにおいて冠 動脈の再開通に寄与することが見い出されている （Gold等、 Circulation 67
0 (譲） )ο
残念ながら、 7Ε3または C4G1のような非ヒ トモノクローナル抗体の使用はヒ トの 治療、 特に ¾下で説明するような繰り返して行われる治療法では明白な欠点を有 している。 例えば、 マウスモノクローナル抗体はヒ トでの半減期が短くそしてヒ トで使用するとき他の重要な免疫グロプリンの機能特性を欠く傾向がある。
恐らく更に重要なことには、 非ヒ トモノクロ一ナル抗体はヒト患者に注射する ときかなりの範囲でヒトに抗原性を示すアミノ酸配列を含んでいる。 多数の研究 によって、 外来抗体の注射後に抗体に対して患者が引き起こす免疫応答が非常に 強烈であり、 初期治療後の抗体の治療上の有用性を消失させることが示されてい る。 更に、 益々多数の種々のマウスまたは他の抗原性のある 〔ヒ トに対して〕 モ ノクローナル抗体が種々の疾病を治療するために開発されることが期待されるの で、 任意の異なる非ヒト抗体による最初のまたは幾つかの治療後に、 交差反応性 のため、 関係のない療法であってもその後の治療が無効またはそれ自体危険にな るこ とさえある。
いわゆる 「キメラ抗体」 の産生 （例えば、 ヒ ト定常領域に結合したマウスの可 変領域） が幾らか上記の外来抗体への反応を逃れる事が証明されているが、 重要 な抗原性の問題は残っている。 一般的に、 典型的なヒ トモノ クローナル抗体産生 技術を使用して、 多く の抗原と同様に G P II b /III a抗原と反応し、 高い親和性 をもつヒ ト免疫グロブリ ンを產生するこ とは非常に困難であろう。 血小板凝集を 阻害し、 血栓症の治療剤と して使用し得るヒ ト免疫グロプリ ンは知られていない。 同様に、 いわゆる 「ヒ ト型化した」 または 「改変した」 抗体を製造するために組 換え DNA技術 〔例えば、 Riechmann等、 Nature 332, 323 (1988) およびョ一口 ッパ公開特許第 0239400号参照、 これらは本明細書に参考と して組み入れる） を使 用すると、 一部予測できない結合親和性のため、 不確かな結果がもたらされる。 かく して、 ヒ トにおいて実質的に抗原性がな く、 治療的処方および他の使用に 適する方法で容易に且つ経済的に生産される GP lib /III a抗原に特異的なヒ ト 型化免疫グロプリ ンの改良が必要と されている。 本発明はこれらや他の必要性を 満たすものである。 発明の開示
本発明は、 例えば、 動脈血栓症に関連したヒ ト疾患の治療に有用な新規組成物、 即ち GP lib /III a抗原と特異的に結合し得る ヒ ト型化免疫グロプリ ン含有組成 物を提供する。 この免疫グロブリ ンは、 少なく とも 1つの鎖がヒ トフ レームヮー ク領域断片に機能的に結合した 1つまたはそれ以上のマウス相補性決定領域 （C D R) からなる 2対の LZH鎖コ ンプレックスを有するこ とができる。 例えば、 天然マウスアミ ノ酸残基を更に有するかまたは有していないマウス相補性決定領 域をヒ ト フレームワーク領域に導入して約 Ιί Μ-1より強い親和性で G Ρ II b/II la抗原と結合し得るヒ小型化免疫グロプリ ンを産生することができる。 これらの ヒ ト型化免疫グロプリ ンはまた、 相補性決定領域を与えるマウスモノ クローナル 抗体と GP Ilb/III aの結合を阻害することもできる。
本発明の免疫グロブリ ンは、 結合フラグメ ン トおよび他の誘導体を含めて、 ト ランスフヱク トし fc細胞、 好ましくは不死匕した真核細胞、 例えばミエローマま たはハイプリ ドーマ細胞での永銃的発現により種々の組換え DN A技術で容易に 産生させることができる。 ヒ ト型化免疫グロブリ ンのフレームワーク領域をコー ドする第 1の配列および所望の免疫グロプリン相捕性決定領域をコ一ドする第 2 の配列セッ トからなるポリヌクレオチドは合成的にかまたは適当な c DN Aとゲ ノム DN A断片を組み合わせることによって製造することができる。
ヒト型化免疫グロプリ ンは実質的に純粋な形態で単独で、 または血拴に対して 活性のある組織プラスミノーゲンァクチべ一ター若しくはアスピリ ンのような治 療剤と一緒に使用することができる。 これら化合物は全て、 急性心筋梗塞、 不安 定狭心症、 卒中および他の血小板介在疾患の治療に特に有用である。 ヒ 卜型化免 疫グロブリンまたはそれらのコンプレックスは製剤的に可能な剤形で製造するこ とができ、 この形態は投与様式に依拠して変化する。
ヒト型化免疫グロプリンはまたヒ ト患者の血栓あるいは表面に GP lib /III a を発現するある種の痛の存在および位置の診断に用いるために標識物質と—緒に 使用することもできる。 このような標識物質には放射線不透過性染料、 放射線造 影剤、 蛍光分子、 スピン標識分子、 酵素または、 特に放射線学または磁気共鳴ィ メージング技術において診断的価値のある他の標識物質が含まれるが、 これらに 限定されない。 図面の簡単な説明
第 1図は、 Hおよび L鎖可変領域 c DN Aのアンカード （anchored) P CRク ローニング図式を示す。 RN Aは熱フエノール抽出法を使用して約 107個のハイプ リ ドーマ細胞から作成した。 簡単に言えば、 細胞を lmlの RNA抽出緩衝液 （50 mMの酷酸ナト リ ウム、 pH 5.2/1% SDS) に懸濁して攪拌し、 0.5mlのフエノ ール ρΗ 5.2を用いて 65でで 15分間抽出し、 次いで氷上で更に 15分間抽出した。 水 層を回収しそしてエタノールで 2度沈殿させた。 c DNAは逆転写酵素 〔BRL、 メ リーランド州べセスダ） およびブラィマーとしてオリゴ dTi2-:i8 CPharmacia, 二 ユージャージ州ビスカツ トウヱイ） を使用して 10〃 gの総 RN Aから合成した。 ポリ (d G)テールは末端デォキシヌク レオチド トランスフェラーゼ （BBL) を使用 して c DN Aの 3 '末端に結合させた （E. Y. Loh等、 Science 243, 217 (1989) )。 可変領域遺伝子 （V) は、 ポリ （d G)テールとハイプリ ッ ド形成するプライマー mc045 CTAATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC) および定常領域遺伝子 （C) とハイブ リ ヅ ド形成するブラィマ一を用いて AmpliTag CPerkin Elmer-Cetus) を使用して 増幅させた。 L鎖では、 使用したプライマ一は mc046 CTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGT GGGAAGATGGATACAGTTGGTGC) であった。 H鎖では、 使用したプラ イマーは mc047 CTATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC (CAT) GATGGGG (GO TGT (TC) GTTTTGGC) であった。 括弧内の配列は縮重に対応する塩基を示す。 縮重に対応する塩基が導入されたの でプライマーは大部分のガンマ鎖とハイブリ ッ ド形成するこ とができたであろう。 次いで、 増幅したフラグメ ン トは EcoRIおよび Hindlllで消化し、 そして配列決定 のため PUC18べクター中にクローン化させた。
第 2図は、 抗体 C4G1の L鎖 （第 2図 A) と H鎖 （第 2図 B) の可変領域の c D N A配列および翻訳されたァミ ノ酸配列を示す。 C D R配列には下線が引いてあ る。 成熟 L鎖タ ンパク質はァミ ノ酸 21 Aspで始ま りそして成熟 H鎖タ ンパク質は ァミ ノ酸 20 Ginで始まっており、 それぞれのシグナル配列で先行されている。 第 3図は、 プラスミ ド pVgl-dhfr (第 3図 A) および pVk (第 3図 B) の概略図 を示す。 プラスミ ド pVgl-dhfrは次の部分を有している： ampおよび dhfr遣伝子を 含有する約 4200の塩基対 BamHI-EcoRIフラグメ ン ト ： EcoRIおよび Xbalリ ンカーが それぞれ 5 'および 3 '末端に接続したヒ トサイ トメガロウィルス （CMV) IE1遺 伝子プロモータ一およぴェンハンサーを含有する 630の塩基対フラグメ ン ト （Bos hart等、 Cell 1, 521 〔1985)、 これは本明細書に参考と して組み入れる）； 並び に 215塩基対の先行ィ ン トロンおよびポリ （A)シグナルを有するヒ トガンマー 1定 常領域を含有する 2800塩基対の Hindlll-PvuIIフラグメ ン ト （Ellison等、 Nuclei c Acids Res. 10, 4071 (1982)、 これは本明細書に参考と して組み入れる）。 ブラ スミ ド pVkは、 ガンマ一 1遗伝子を置換したヒ トカッパ定常領域遗伝子および約 3 35塩基対の先行ィン トロンを含有する 1530塩基対の EcoRI-Xbalフラグメ ン ト （Hi eter等、 Cell 22, 197 (1980)、 これは本明細書に参考と して組み入れる〕 並びに dhfr遺伝子を置換した gpt遗伝子を用いて同様にして構築した。 ヒ ト ガンマー 1お よび力ッパ定常領域遺伝子を含有するフラグメ ン トは創製された Xbalおよび BamH I部位がそれぞれ 5 'および 3 '末端に接銃されている。 これらブラスミ ドは当該技 術分野で周知の方法を使用して指定された部分から構築した （Maniatis等、 Mole cular Cloning: A Laboratory Manual、 第 2版、 ニューヨーク州コールドスプリ ングノ、ーパ一の Cold Harbor Laboratory参照）。 例えば、 pVgl-dhfrは、 hyg遣伝子 を含有する Hind III-Bgl IIフラグメ ン トを dhfr遺伝子を含有し、 Bgl II部位まで 含む 660塩基対のフラグメン トで置換し （Simonsen等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80、 2495〔1983) )、 そして免疫グロブリ ンブロモータ一およびェ ンノ、ンサ一 を含有する EcoRI-Xba I フラグメン トを CMVプロモーターおよびェンハンサー を含有するフラグメントで置換することによってプラスミ ド pVr 1から構築した (Queen等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029 〔1989) )。
第 4図は、 抗体無し （ ）、 キメラ C4G1抗体 （ ...） 、 ヒ ト型化 C4G1抗体
(——） で染色した HEL 92.1.7細胞のフローサイ トメ ト リー fluorocytometry) を示す。 細胞は FAC S緩衝液 CP B S + 2 % PC S +0.1% アジ化ナトリ ウ ム） 中約 5 Xl0sZnilで懸濁した。 100/z 1の細胞懸濁液をポリスチレン管に移し、 そして氷上で 80nsの精製抗体と共に 30分間ィンキュベートした。 細胞は FACS 緩衢液で洗狰し、 そして F I TC標識ャギ抗ヒ ト I g抗体と共に氷上で更に 30分 間インキュベートした。 細胞は再度洗浄し、 そして最後に PBS+ 1%パラホル ムアルデヒド中に再懸濁した。 細胞は PACSmate CBecton Dickinson) で分析 した。
第 5図は、 ヒト型化 C4G1抗体 〔上部列） およびマウス C4G1抗体 （下部列〕 の 鎖 （第 5図 A) および H鎖 （第 5図 B) 可変領域のシグナル配列を含まないアミ ノ酸配列を示す。 各鎖の 3つの CDRには下線が引いてある。 ヒ ト型化抗体中で マウスアミノ酸またはコンセンサスヒ トァミノ酸で置換されているフレームヮ一 クの残基には二重線が引いてある。 ヒ ト型化 C4G1抗体の完全な L鎖 （第 5図 C) および H鎖 〔第 5図 D) のアミノ酸配列を示す。
第 6図は、 ヒト型化 C4G1の H鎖 Crh29-rh32) および L鎖 （rh33— rh36) の構 築に使用したオリゴヌクレオチドを示す。 下記のオリゴヌクレオチド対を混合し、 iCIenowポリメラーゼまたは AmpliTaqで伸長させ、 そして pUC18に連結する前に指定 された酵素： rh29および rh30は Xba Iおよび Eco で、 rh31および rh32は Xba Iお よび Eco RIで、 rh33および rh34は Xba Iおよび Hind ΙΠで、 rh35および rh36は Xba Iおよび Hind IIIで切断した。 次いで、 rh29—rh30および rh31— rh32フラグメ ン ト は Xba Iおよび Xho Iを用いて pUC18から切断しそして pVgl— dhf rの Xba I部位に一 緖に連結し、 そして rh33— rh34および rh35— rh36フラグメ ン トは Xba Iおよび Hin d IIIで切断しそして pVkの Xba I部位に一緒に連結した。
第 7図 A及び Bは、 ヒ ト型化 Fabおよび F(ab')2フラグメ ン トの H鎖の発現にそ れぞれ使用されるプラス ミ ド pHFab.D (第 7図 A) および pHF(ab')2. D 〔第 7図 B) の概略図を示す。 このプラス ミ ドはプラスミ ド pVgl— dhfr (第 3図） に類似して いるが、 pHFab.Dはヒ ト C r l遺伝子の Cnlと ヒンジェクソ ンの最初の 5個のアミ ノ酸、 続いて停止コ ド、ンおよびスプライス供与シグナルしか有しておらず； そし て pHF(ab')2.Dは CH1、 ヒンジおよび C h2の最初の 2個のアミ ノ酸、 続いて停止コ ドンおよびスプラィス供与シグナルしか有していない。 最終ェクソンの後にはポ リ Aシグナルを有するマウス r2a定常領域遺伝子以外から得られる領域が続いて いる。 また、 第 7図 C及び Dは、 ヒ ト型化 C4G1抗体の Fabフラグメ ン ト （第 7図 C) および F(ab')2— 1と称される組換え F(ab')2フ ラグメ ン ト （第 7図 D) の H鎖のァ ミ ノ酸配列を夫々示す。
第 8図は、 ヒ ト型化およびマウス C4G1抗体おょぴフラグメ ン トの血小板への競 合的結合を示す。 約 3 X 107個の血小板は 4.5ngの放射性ョゥ素標識マウス C 4 G 1 ト レーサー抗体 （3.5/ Ci/ U g) および種々の量の非標識マウス C4G1抗体若し く はフラグメ ン ト （黒印） かまたはヒ ト型化 C 4 G 1抗体若し く はフラグメ ン ト (白印） と共にイ ンキュベー ト した。 図中 Aは、 完全抗体、 Bは、 Fabフラグメ ン ト、 Cは、 マウス F(ab')2およびヒ ト型化 F(ab')2-1フラグメ ン トを示す。
第 9図においては、 図 Aはマウス C4G1抗体によるおよび図 Bはヒ ト型化 C4G1抗 体による血小板凝集阻止効果を示す。 Y軸は光透過パーセン トを示し、 X軸は時 間 （分） を示す。 各パネルの上部の黒い曲線は抗体を添加しないと きに血小板凝 集で生じた光透過の上昇を示し、 下部のより薄い曲線は、 光透過の変化で測定さ れるとおり、 抗体の添加によって血小板凝集が強く阻止されることを示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明に従って、 GP II b /III a関連ェビトーブと特異的に反応するヒト型化 免疫グロプリンが提供される。 これらの免疫グロプリンは0?111)//111&に対し て少なく とも約 ΙίΓΜ-1 好ましくは 10EM 1乃至 IO M-1またはそれ以上の強さ の結合親和性を有し、 例えば血小板凝集を阻止できる。 ヒ ト型化免疫グロブリ ン はヒ トのフレームワークを有し、 そして免疫グロプリ ン、 典型的には、 GPIIb ZIII a抗原と特異的に反応するマウス免疫グロプリ ンから得られる 1つまたはそ れ¾上の相補性決定領域 〔C D R〕 を有する。 好ましい実施態様では、 1つまた はそれ以上の CD Rは C4G1抗体に由来する。 かく して、 経済的に大量生産し得る 本発明の免疫グロブリンは、 例えば、 種々の技術によるヒ ト患者の血小板介在疾 患の治療用途が見い出されている。
基本的な抗体構造単位は四量体からなっていることが知られている。 各四量体 は 2つの同一対のポリぺプチド鎖からなっており、 各対は 1つの 「L」 鎖 （約 25 kD) および 1つの 「HJ 鎖 〔約 50— 70kD) を有している。 各鎖のアミノ末端部分 には主として抗原認識を行う約 100から 110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域 がある。 各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能を果たす定常領 域である。
L鎖はカッパ 〔A かまたはラムダ 〔ス） かのいずれかに分類される。 H鎖は ガンマ （7 、 ミュー 〔 〕 、 アルファ 〔α) 、 デルタ （δ〕 またはイブシロン 〔ε〕 として分類され、 そして抗体のアイソタイプ （isotype) をそれぞれ IgG、 IgM、 IgA、 IgDおよび IgEとして明示する。 L鎖および H鎖内で、 可変および定常 領域は約 12またはそれ以上のアミノ酸の 「JJ 領域によって結合されており、 H 鎖はまた約 10またはそれ以上のアミノ酸の 「DJ 領域も有している 〔一般的には、 Fundamental Immunology^ W. Paul編、 7章、 131〜： L66頁、 ニューヨーク州の Bav en Press (1984)、 これは本明細書に参考として組み入れる）。
各 LZH鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成する。 これらの鎖は全て、 基 本的には同一の構造をもち相捕性決定領域または CD Rとも呼ばれる 3つの超可 変領域と、 CD Rを結合する相対的に保存-されたフレームワーク領域とからなる C Γ Sequences of Proteins of Immunological InterestJ、 E. Kabat等、 米国保 健福祉省 〔1987); および Chothiaおよび Lesk、 J. Moi. Bioi.、 196, 901〜917 〔1987)、 これらは本明細書に参考と して組み入れる）。 各対の 2つの鎖から得ら れる CD Rはフレームワーク領域によって正し く位置が決定され、 特定のェピ ト ープに結合するこ とができる。
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本明細書で使用すると き、 用語 「免疫グロブリ ン」 は、 免疫グロプリ ン遺伝子 によって実質的にコードされた 1つまたはそれ以上のポリペプチ ドからなるタ ン パク質を言う。 認識される免疫グロブリ ン遺伝子にはカッパ、 ラムダ、 アルフ ァ、 ガンマ、 デルタ、 ィプシロンおよびミ ュー定常領域遺伝子、 並びに無数の免疫グ ロブリ ン可変領域遣伝子がある。 免疫グロブリ ンは、 例えば、 Fv、 Fabおよび F(a b')2 並びに二機能性ノ、イブリ ッ ド抗体 〔例えば、 Lanzavecchia等、 Eur. J. Imm unol. 17, 105 (1987)) を含む抗体以外の種々の形態並びに 1本鎖 （例えば、 Hu ston等、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 5879〜5883 (1988) および Bird等, Science^ 242 423〜426 〔1988)、 これらは本明細書に参考と して組み入れる） で 存在することができる。 （一般的には、 Hood等、 Immunology、 ニューヨーク州べ ンジャ ミ ン、 第 2版 〔1984)、 Halow and し ane、 Antibodies. A Laboratory Manu ai、 Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 並びに Hunkapi 1 lerおよび Hood、 Na ture> 323 15〜16 (1986)、 これらは本明細書に参考と して組み入れる）。
キメ ラ抗体は、 抗体の Lおよび H鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロプリ ン 遗伝子断片から、 典型的には遺伝子工学によって構築されるものである。 例えば、 マウスモノ ク口一ナル抗体から得られる遺伝子の可変 （V) 断片は r 1および r 3 のようなヒ ト定常 （C) 断片と結合させるこ とができる。 それ故、 典型的な治療 用キメ ラ抗体は、 マウス （他の哺乳動物種を使用するこ と もできる） 抗体から得 られる Vまたは抗原結合ドメ イ ンおよびヒ ト抗体から得られる Cまたはエフェク タードメ イ ンからなるハイブリ ッ ドタンパク質である。
本明細書で使用すると き、 用語 「フ レームワーク領域」 は Kabat等、 前掲で定義 されているように、 1つの種の異なる免疫グロプリ ン中で相対的に保存されてい る （即ち、 CDR以外の） 免疫グロプリ ンしおよび H鎖可変領域の部分を言う。 本明細書で使用するとき、 「ヒ ト フレームワーク領域」 は自然産生のヒ ト抗体フ レームワーク と実質的に同一 （約 85%またはそれ以上同一） であるフ レームヮー ク領域である。 本明細書で使用するとき、 用語 「ヒ ト型化免疫グロブリ ン J はヒ ト フレームヮ —ク、 非ヒト抗体から得られる少なく とも 1つの CDRを含んでなり、 その際存 在する任意の定常領域ぼヒ ト免疫グロプリ ン定常領域と実質的に同一、 即ち、 少 なく とも約 85〜90%、 好ましくは少なく とも 95%が同一である免疫グロプリ ンを 言う。 それ故、 ヒ ト型化免疫グロブリ ンの部分は全て、 多分 CDRを除いて、 1 つまたはそれ以上の天然のヒ ト免疫グロプリ ン配列の対応する部分と実質的に同 —である。 例えば、 ヒト型化免疫グロプリンはキメラマウス可変領域/ヒ ト定常 領域抗体ば包含しないであろう。
ヒト型化抗体はヒ トの治療に使用するときマウス、 そして場合によってはキメ ラ抗体に比べて少なく とも下記の 3つの利点を有している ：
1) エフヱクタ一部分がヒ トであるので、 ヒ ト型化抗体はヒト免疫系の他の部 分とより良好に相互に作用することができる 〔例えば、 捕体依存性細胞傷 害 〔CDC〕 または抗体依存性細胞傷害 （ADCC) によって標的細胞を より効果的に破壊する〕 。
2) ヒト免疫系はヒト型化抗体のフレームワークまたは C領域を外来物として 認識せず、 そしてその結果このような注入抗体に対する抗体応答は全体と して外来のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するより少な い。
3) 注入されたマウス抗体はヒト血液循環での半減期が通常の抗体の半減期よ り短いと報告されている 〔D. Shaw等、 丄 Immunol. 1^、 4534〜4538 C19 87))。 注入されたヒト型化抗体は多分、 自然產生のヒ ト抗体と本質的に同 一の半滅期を有しており、 投与すべき投与量および回数をより少なくする ことができるであろう。
ある面では、 本発明は、 GP Hb/IIIa抗原の所望のェピトーブに結合し得る 免疫グロブ ン 〔例えば、 モノクローナル抗体 C4G1、 7E3、 10E5または AP— 2) か ら得られる Hおよび Zまたは L鎖 CDRをコードする組換えポリヌクレオチド、 に向けられている。 これらの領域をコードするポリヌクレオチドは典型的には、 逋当なヒトフレームワーク領域をコ一ドするポリヌクレオチドに結合する。 ヒト フレームワークは、 CDRを得る非ヒト免疫グロプリ ンのフレームワークまたは 可変領域のァミ ノ酸配列を、 ヒ ト免疫グロブリ ンのシークェンスコ レクショ ン中 の対応する配列と比較して、 相同性の高い配列を選び用いる。 モノ ク ローナル抗 体 ( G1の Hおよび L鎖 C D Rを含んでなるポリペプチ ド鎖をコー ドする代表的な ポリ ヌ ク レオチ ドは第 2図に含まれる。 コ ドン縮重および重要でないアミ ノ酸の 置換によって、 それらの配列を他のポリ ヌク レオチ ド配列で以下で詳記するよう に容易に置換するこ とができる。 ヒ ト型化免疫グロプリ ンの設計は、 以下のよう に行う こ とができる。
( 1〕 〔 a：) 〜 （ c〕 に該当するアミ ノ酸は、 C D Rを得る非ヒ ト免疫グロプリ ン （供与体免疫グロブリ ン） からのフ レームワークアミ ノ酸によ り、 フ レームヮ ークを用いるヒ ト免疫グロブリ ン （受容体免疫グロブリ ン） のフ レームワークァ ミ ノ酸を置換する。
( a ) 受容体免疫グロプリ ンのヒ ト フレームワーク領域中の該アミ ノ酸がヒ ト 免疫グロプリ ンのその位置に稀であり、 そして供与体免疫グロプリ ン中の対応す るアミ ノ酸がヒ ト免疫グロブリ ン中のその位置に典型的である ：
( b ) 該アミ ノ酸が C D Rの 1つのすぐ近く である ； または
〔 c ) 該アミ ノ酸が三次元免疫グロプリ ンモデルにおいて C D Rの約 3人以内 にある。 （Queen等、 前掲および Co等、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA 88 ^ 2869 ( 1991) 参照。 これらは共に本明細書に参考と して組み入れる） 。
( 2 ) 受容体免疫グロプリ ンのヒ ト フレームワーク領域中の該ァミ ノ酸及び給与 体免疫グロプリ ンの対応するァミ ノ酸がヒ ト免疫グロプリ ン中のその位置に稀で ある場合、 ヒ トフレームワークのその位置に典型的であるァミ ノ酸に置換する。 ヒ ト型化免疫グロブリ ンの製造の詳細な説明については、 Queen等、 前掲および C 0等前掲参照。
上記ポリヌ ク レオチ ドは典型的には、 ヒ ト型化免疫グロプリ ンをコードする配 列に操作的に連結された、 天然関連領域または異種プロモーター領域を含む発現 調節ポリ ヌ グレオチ ド配列を更に有している。 好まし く は、 発現調節配列は真核 宿主細胞を形質転換し得るベクター中の真核プロモーター系であるが、 原核宿主 の調節配列を使用するこ ともできる。 ベクターが適当な宿主に導入されるとすぐ、 宿主はヌク レオチ ド配列の高レベル発現に適する条件下で維持し、 そして所望の 場合続いて L鎖、 H鎖、 L ZH鎖二量体または完全抗体、 結合フラグメン トまた は他の免疫グロプリンを採集しそして精製することができる。
所望のヒト型化抗体を永続的に発現し得る本発明の塩基配列は種々のポリヌク レオチド （ゲノムまたは c D N A、 R N As 合成オリゴヌクレオチド等〕 および 成分 （例えば、 V、 J、 Dおよび C領域） から多種多様の技術によって形成させ ることができる。 適当なゲノムと合成ヌクレオチド配列を結合させることが現在 最も通常の製造方法であるが、 c D N A配列を使用することもできる 〔ョ一口ッ パ公開特許第 0239400号および L. Reichraanri等、 Nature 332^ 323〜327 〔1988) 参 照、 これらぼ共に本明細書に参考として組み入れる）。
ヒト定常領域 D N A配列は種々のヒ ト細胞から周知の方法に従って単離するこ とができるが、 不死化 B細胞からが好ましい （Kabat、 前掲および WP87/02671参照）。 本発明の免疫グロプリンの製造に使用する C D Rは同様に、 G P l i b /I I I aに結 合し得るモノク口一ナル抗体から誘導され、 そして周知の方法によって抗体を産 生し得るマウス、 ラッ ト、 ゥサギまたは他の脊椎動物を含めて任意の好都合な哺 乳類種中で製造される。 上記ポリヌクレオチド供給源としての細胞並びに免疫グ ロブリン発現および分泌に使用する宿主細胞は A T C Cのような多数の供給源か ら得ることができる （Cata logue of Cel l Lines and Hybridomas、 第 5版 〔1985)、 米国メリーランド州ロックビル、 これは本明細書に参考として組み入れる）。
本明細書に特に記載したヒト型化免疫グロブリ ンに加えて、 他の 「実質的に同 種の」 修飾免疫グロプリ ンを容易に設計することができ、 そして当該技術分野の 熟練者に周知の種々の組換え D N A技術を使用して製造することができる。 例え ば、 フレームワーク領域において、 幾つかのアミノ酸置換、 末端および中間部分 でのアミノ酸付加並びに欠失等によって天然配列の一次構造を変えることができ る。 更に、 多種多様のヒ トフレームワーク領域を単独でまたは組み合わせて本発 明のヒ ト型化免疫グロプリンのベースとして使用することができる。 一般的に、 遺伝子の修飾は特定部位の突然変異誘発のような種々の周知の技術で容易に達成 することができる （Gi l lmanおよび Sinitfu Gene 、 81〜97 〔1979) 並びに S. Bob erts等、 Nature 328, 731〜734 〔1987) 参照、 これらは共に本明細書に参考とし て祖み入れる）。 或いは、 1つまたはそれ以上の免疫グロブリ ン活性 （例えば、 補体結合活性） を有する主要な抗体構造の一部分だけからなるポリべプチ ドフラグメ ン トを製造 するこ とができる。 これらのポリべプチ ドフラグメ ン トは当該技術分野で周知の 方法による完全抗体のタ ンパク質分解酵素による切断によってか、 或いは特定部 位の突然変異誘発を使用してべクタ一 P Vkおよび p Vgl-dhfr (第 3図） の所望の 位置に、 例えば Fabフラグメ ン トを製造するために CH1の後にまたは F (ab ' ) 2フラグ メ ン トを製造するためにヒンジ領域の後に停止コ ドンを挿入するこ とによって製 造するこ とができる。 1本鎖抗体は VLと VHを D N Aリ ンカ一で結合させるこ とに よって製造するこ とができる （Huston等、 前掲、 および B i rd等、 前掲参照）。 また， 多数の遣伝子と同様に、 免疫グロブリ ン関連遺伝子は、 各々が 1つまたはそれ以 上の明確な生物学的活性を有する別々の機能性領域も有しているので、 これら遺 伝子は.他の遺伝子から得られる機能性領域に融合させて新しい特性を有する融合 タ ンパク質を製造するこ とができる。
上記したように、 ポリ ヌ ク レオチ ドは、 その配列を発現調節配列と操作的に結 合させた （即ち、 発現調節配列を確実に機能化させるよう に位置させた） 後宿主 内で発現させられる。 これらの発現ベクターは典型的には、 ェピソ一ム （epi som e) と してかまたは宿主染色体 D N Aに組み込まれて宿主生物内で複製可能である。 一般的に、 発現ベクターには所望の D N A配列で形質転換された細胞の検出が可 能になるよう に選択マーカー、 例えばテ トラサイ ク リ ンまたはネオマイ シンが含 まれる （例えば、 米国特許 4, 704, 362参照、 これは本明細書に参考と して組み入れ る）。
大腸菌 〔E. Co l i) は本発明のポリ ヌ ク レオチ ドをクローン化するのに特に有用 な原核生物宿主である。 使用に適する他の微生物宿主には桿菌、 例えば枯草菌 (Bac i l lus subti lus)、 および他の腸内細菌、 例えばサルモネラ (Sa lmonel la)、 セラチア （Serrat i a) および種々のシユードモナス ( Pseudomonas) 種が含まれる。 これらの原核生物宿主中で、 宿主細胞と適合できる発現調節配列を典型的に含有 する発現ベクターも製造することができる （例えば、 複製オリ ジン （or igin) )。 更に、 例えばラク ト一スプロモーター系、 ト リ ブ トフ ァ ン （trp) プロモーター系、 ベータラクタマーゼプロモーター系、 またはファージラムダから得られるプロモ 一ター系のような多数の多様な周知のプロモーターが存在する。 プロモーターは、 任意にオペレーター配列を有し、 典型的には発現を調節し、 そして転写および翻 訳を開始させそして完結させるリポソーム結合部位配列等を有している。
酵母のような他の微生物も発現用に使用することができる。 サッカロミセス CSaccaromyces) ぼ好ましい宿主であり、 3—ホスホグリセリ ン酸キナーゼまた は他の解糖酵素を含むプロモーターのような発現調節配列、 および所望の複製ォ リジン、 終結配列等を有する適当なべクターを有している。
微生物に加えて、 哺乳動物由来培養細胞も本発明のポリペプチドを発現させそ して製造するために使用することができる 〔W innacker、 Prom Genes to C lones、 VCH Publ ishers^ ニューヨーク州ニューヨーク 〔1987) 参照、 これは本明細書に 参考として組み入れる）。 真核細胞は、 完全免疫グロブリ ンを分泌し得る多数の適 当な宿主細胞株が当該技術分野で開発されている。 これらには CH0細胞株、 種々の COS細胞株、 HeLa細胞、 好ましくはミエローマ細胞株等または形質転換された B細 胞若しくはハイプリ ドーマが含まれる。 これら細胞の発現ベクターは発現調節配 列、 例えば複製オリ ジン、 プロモーター、 ェンノヽンサ一 （Queen等、 Immuno l . Re v. 89 49〜68 〔1986)、 これは本明細書に参考として組み入れる）、 並びに必要な プロセッシング伝達部位、 例えばリボソーム結合部位、 R N Αスブライス部位、 ポリアデニル化部位および転写タ一ミネーター配列を含むことができる。 好まし い発現調節配列ぼ免疫グロブリ ン遺伝子、 SV40、 アデノ ウイルス、 ゥシ乳頭腫ゥ ィルス、 サイ トメガロウィルス等から誘導されるプロモーターである。
重要なポリヌクレオチド配列 〔例えば、 Hおよび L鎖をコードする配列および 発現調節配列） を含有するベクターは周知の方法で宿主細胞中に導入することが でき、 該方法は細胞宿主のタイプに依存して変化する。 例えば、 塩化カルシウム トランスフヱクションは通常原核細胞に使用され、 一方リ ン酸カルシウム処理ま たはエレク ト口ポレーシヨ ン （electroporation) は他の細胞宿主用に使用するこ とができる。 般的には、 Maniatis等、 Molecular Cloning: A Laboratory Ma nuaK Cold Spring Harbor Press ( 1982)、 これは本明細書に参考として組み入れ る。 ）
発現された、 本発明の完全抗体、 それらの二量体、 個々の Lおよび H鎖または 他の免疫グロブリ ンは、 硫酸アンモニゥム沈降法、 ァフ ィ 二ティ カ ラム、 カ ラム クロマ トグラフィ ー、 ゲル電気泳動等を含む当該技術の標準的な方法に従って精 製することができる 〔一般的には、 R. Scopes, Protein Purif ication、 Springe r-Verlag, ニューヨーク 〔1982)、 これは本明細書に参考と して組み入れる）。 医 薬品と して使用するためには、 少なく と も約 90乃至 95%純度の実質的に純粋な免 疫グロプリ ンが好ま し く、 そして 98乃至 99%またはそれ以上の純度のものが最も 好ましい。 ひとたび部分的にまたは所望の純度にまで精製されると、 このポリべ プチ ドは治療的に （体外的適用を含む） またはアツセィ法、 蛍光免疫染色法等の 開発および実施に使用する こ とができる。 （一般的には、 Immunological Method s、 Iおよび II巻、 Lefkovitsおよび Pernis編、 Academic Press, ニューヨーク州 ニューヨーク （ 1979および 1981) 参照） 。
本発明の免疫グロプリ ンは典型的には、 心血管疾病及び他の血栓塞栓性疾患の 治療に単独での使用が可能である。 例えば、 治療に適する典型的な疾病状態には 急性心筋梗塞、 不安定狭心症、 卒中、 一過性虚血発作、 深部静脈血栓症および肺 塞拴症が含まれる （一般的には、 Hoffbrand & Pettit、 Essential Haematology、 Blackwell Scientific Publications, オッ クスフ ォー ド （1980) 参照）。 これら 免疫グロプリ ンはまた血管形成術後の再閉塞及び血管手術後、 透析や心肺体外循 環等の血液体外循環後または最中の閉塞を防ぐために使用するこ ともできる。
本発明の免疫グロプリ ンは、 他の血小板が関与する疾患の治療にも使用できる であろう。 例えば、 腎炎、 末梢循環障害、 閉塞性血栓血管炎、 移植後の血栓、 慢 性動脈閉塞症、 閉塞性動脈硬化症、 冠硬化症、 う つ血性心不全及び脳血管れん縮 等の治療である。 また、 血栓性血小板減少性紫斑病、 HUS及び血小板の関与す る自 Ξ免疫疾患の治療、 痛転移の抑制、 巨核球又は巨核芽球の分化又は誘導を促 す為にも用いるこ とができるかも しれない。
本発明のヒ ト型化免疫グロプリ ンは、 GP lib /III aに結合する抗体のうち血 小板凝集を阻害する免疫グロプリ ン由来の CD Rを用いるこ とが好ま しい。 また、 血管内皮と反応する抗体は、 血管内皮に障害を与える可能性があり、 7E3等は血管 内皮と反応するこ とが知られている （ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 61 4, 204 (1991) )。 従って、 さ らに好まし く は、 血小板上にはェピ トーブがあるが、 血管内皮上にはェピトープが存在しないか、 少ない C4G1等の免疫グロプリ ン由来 の C D Rを用いる。 マウス抗体 C4G1によって同定される抗原決定基に結合するヒ ト型化免疫グロプリ ンのような本発明のヒ ト型化免疫グロプリンは、 投与した場 合、 内皮細胞を損傷させないことが期待される。
A D Ρ Λ ア ド'レナリ ン剌激による血小板凝集では、 これらのァゴニス ト添加後 最初に見られる可逆的な一次凝集と、 次いで用量依存的に非可逆的で放出反応を 伴う二次凝集が見られる。 7Ε3等の抗体では、 血小板を予め抗体で処理しておいた 場合に凝集阻害をすることは知られているが、 血小板凝集の過程で抗体を加えた 場合に凝集阻害をすることが知られているものはなかった。 しかし、 C4G1は、 一 次凝集を阻害するのみならず、 一次凝集が惹起された後に添加した場合に、 二次 凝集を阻害する作用を持つことが確認された。 従って、 C4G1又は前述の C4G1と同 様の作用をもつ免疫グロブリン由来の C D Rを用いたヒ ト型化免疫グロブリンは、 血拴性疾患急性期に於ける血小板活性化及び凝集の初期過程をも抑制することが 期待できる。
血拴性疾患の治療に際し、 PTCA、 PTCR等によって血行再建がえられた後の急激 なトロンボキサン A2、 PAI-1等の血中レベルの上昇が知られている。 その原因とし て血小板の活性化及び種々のメディエーター CTGP- i3 1、 PDGF等） の放出が重要視 されている。 マウス C4G1は、 in vitroで A D P剌激による血小板凝集を抑制する とともに、 血小板放出反応も抑制した。 従って、 マウス C4G1等の血小板凝集と血 小扳放出反応を抑制する免疫グロプリン由来の C D Rを用いたヒ ト型化免疫グロ ブリンは、 人に投与した際に、 血小板凝集を抑制するのみでなく、 血小板放出反 応を抑制して PTCA、 PTCR等の血行再建療法後の副作用を抑制する可能性がある。 本発明の任意のヒト型化免疫グロブリンはまた他の抗体、 特に、 種々の血小板 抗原または血液凝固因子と反応するヒ ト型化抗体と組み合わせて使用することも できる。 例えば、 ヒ ト型化免疫グロブリ ンの混合物が反応し得る適当な抗原には VLA— 2、 VLA— 5、 GPIb、 GPIV、 フォ ン ビルブラント因子、 トロンビンおよび血小 扳トロンビンレセプターが含まれる （Co l ier、 New Eng. J. Med. 322. 33 ( 1990〕 参照） 。
これら免疫グロブリンはまた他の治療剤と一緖に使用される、 別々に投与され る組成物と して使用するこ ともできる。 典型的には、 これら薬剤にはアスピリ ン およびへパリ ンがあるが、 心血管疾病を治療するために当該技術分野の熟練者に 周知の多数の他の薬剤 （例えば、 tPA) を使用すること もできる。
本発明のヒ ト型化免疫グロプリ ンおよび該免疫グロプリ ンの製剤組成物は非経 口投与、 即ち皮下、 筋肉内または静脈内投与に特に有用である。 非経口投与は通 常、 投与可能な担体、 好ま し く は水性担体に溶解した免疫グロブリ ンまたはその 混合物の溶液からなる。 種々の水性担体、 例えば水、 緩衝水、 0. 4%の食塩水、 0. 3%のグリ シン、 5 %のグルコース、 ヒ ト アルブミ ン溶液等を使用する こ とができ る。 これらの溶液は無菌でありそして一般的に粒子物質を有していない。 これら の組成物は慣用で周知の滅菌技術によって滅菌するこ とができる。 これら組成物 は pH調整および緩衝化剤、 等張化剤、 毒性調整剤等のような生理学的条件に近づ けるのに必要な製剤的に投与されう る補助物、 例えば酢酸ナ ト リ ウム、 塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウム、 塩化カルシウム、 乳酸ナ ト リ ウム、 クェン酸ナ ト リ ウム 等を含有するこ とができる。 これら処方中の免疫グロブリ ンの濃度は広範に、 βΡ ち、 約 0. 5重量％未満、 通常は少な く と も約 1重量％から 15または 20重量％ほどの 多い量まで変化させるこ とができ、 そして選択される特別の投与様式に従って、 主と して容積、 粘度等に基づいて選択される。
かく して、 注射用の典型的な製剤組成物は l m lの滅菌緩衝水および l〜10mgの 免疫グロプリ ンを含むように構成するこ とができょう。 静脈内注入用の典型的な 組成物は 250m lの滅菌リ ンゲル溶液および 150mgの抗体を含むように構成するこ と ができょう。 非経口的に投与できる組成物の実際の製造方法は当該技術分野の熟 練者に既知であるかまたは明らかであり、 そして、 例えば、 Rem ington ' s Pharma ceutica l Sc i ence、 第 15版、 Mack Pub l i sh i ng Company > ペンシルベニア州ィース トン （1980) (これは本明細書に参考と して組み入れる） に更に詳細に記載され ている。
本発明の免疫グロプリ ンは貯蔵するため冷凍するかまたは凍結乾燥しそして使 用する前に適当な溶媒で再生させることができる。 この技術は慣用の免疫グロプ リ ンに関して有効であるこ とが示されており、 そして当該技術分野で既知の凍結 乾燥および再生技術を使用するこ とができる。 凍結乾燥および再生が種々の程度 の抗体活性損失をもたらすことがあり 〔例えば、 通常の免疫グロブリ ンでは、 Ig M抗体は IgG抗体より多くの活性が損なわれる傾向がある） そして使用量は調整し て捕正しなければならないと当該技術分野の熟練者は考えるであろう。
本願のヒト型化免疫グロプリンまたはその混合物を含有する組成物は治療的ま たは予防的処置に使用することができる。 治療的な適用では、 組成物は動脈血栓 症または他の血小板介在疾患に既に罹っている患者に、 疾病およびその合併症を 治癒するかまたば少なく とも部分的にそれらを抑止するのに十分な量で投与され る。 これを達成するために適当な量は 「治療的有効投与量」 と定義される。 この 用途に有効な量は疾病の重篤さおよび患者自身の免疫系の一般的な状態に依存す るが、 一般的には投与量当たり約 1から約 200mgまでの抗体の範囲であり、 より一 般的には患者当たり 5から 25mgまでの投与量が使用される。 本発明の物質は一般 的に重篤な疾病状態、 即ち生命を脅かすかまたは生命を脅かす可能性のある状況 下で使用することができることに留意すべきである。 このような場合には、 本発 明のヒト型化免疫グロプリ ンによって生体外物質の最少化および 「外来物質」 拒 絶の可能性の低下が達成されることからみて、 実質的に多量の上記免疫グロプリ ンを投与することが可能であり、 そして治療する医師によって望ましいと考えら れよう。 典型的な予防的使用には、 バルーン血管形成術を受けている患者の急性 閉塞を防ぐためや 1度心臓発作または卒中を起こした患者のその後の発作を防ぐ ための治療がある。
これら組成物の 1回または複数回投与は治療する医師によって選択される投与 値およびパターンで実施することができる。 いずれにしても、 本薬剤処方は患者 を有効に治療するのに十分な量の本発明の免疫グロブリン 〔単数または複数〕 を 提供する。 .
特別の実施態様では、 本発明のヒ ト型化免疫グロプリンからなる組成物はヒト 患者の血拴の存在および位置を診断するために使用することができる。 例として であって限定するためではないが、 マウス抗体 C4G1が結合する抗原決定基は血小 板上に存在するが血管内皮細胞には存在しないかまたは量が少ない。 かく して、 マウス抗体 C4G1によって同定される抗原決定基に結合するヒ ト型化免疫グロプリ ンのような本発明のヒト型化免疫グロプリンは、 有意な漠度の活性化血小板を含 有する解剖学的部位、 例えば血栓部位を同定するために標識しそして使用するこ とができる。 例と してであって限定するためではないが、 1つまたはそれ以上の 標識物質をヒ ト型化免疫グロプリ ンに結合させるこ とができる。 代表的な標識物 質には放射線不透過性染料、 放射線造影剤、 蛍光分子、 スピン標識分子、 酵素ま たは、 特に放射線学または磁気共鳴像形成技術で診断的価値のある他の標識物質 が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のヒ ト型化免疫グロプリ ンには更にィ ンビト 口での広範な有用性を見い 出すことができる。 例と して、 本発明の免疫グロプリ ンは G P I I b /I H a抗原の 検出、 血小板の単離等に使用するこ とができる。
診断の目的では、 本発明の免疫グロプリ ンは標識するかまたは標識しないで用 いるこ とができる。 標識しない免疫グロブリ ンは、 ヒ ト免疫グロブリ ン定常領域 に特異的な抗体でヒ ト型化抗体と反応する他の標識抗体 （二次抗体） と組み合わ せて使用するこ とができる。 或いは、 本発明の免疫グロブリ ンは直接標識するこ とができる。 放射性核種、 蛍光体、 酵素、 酵素基質、 酵素コ フアクター、 酵素ィ ンヒビター、 リガン ド （特にハプテン） 等のような広範囲の標識を使用するこ と ができる。 多数のタイブのィムノ アヅセィが利用可能でありそしてそれらは当該 技術分野の熟練者に周知である。
細胞活性に対する保護若し く はその検出または選択した抗原の存在の検出に対 象抗体を用いて使用するためにキッ ト と して供給するこ と もできる。 かく して、 本発明対象の免疫グロプリ ン組成物は単独かまたは所望の細胞タィプに特異的な 他の抗体と一緖にして、 通常容器中の凍結乾燥形態で提供するこ とができる。 標 識若し く は毒素と抱合するかまたは抱合しないこ とができる本発明の免疫グロブ リ ンは、 ト リ ス、 リ ン酸塩、 炭酸塩等のような緩衝液、 安定化剤、 保存剤、 不活 性タンパク質、 例えば血清アルブミ ン等および 1組の使用説明書と共にキッ トに 含めることができる。 一般的に、 これらの材料は活性免疫グロブリ ンの量に基づ いて約 5 %未満で存在し、 そして通常は再び免疫グロブリ ン濃度に基づいて少な ， く とも約 0. 001重量％の総量で存在している。 しばしば、 活性成分を希釈するため に化学作用を起こさない增量剤または賦形剤を含めるこ とが望ま し く 、 その際賦 形剤は総組成物の約 1から 99重量％までで存在するこ とができる。 免疫グロプリ ンと結合可能な二次抗体をアツセィに使用する場合、 これは通常別々のバイアル 中に存在する。 二次抗体は典型的には標識と抱合しており、 そして上記した免疫 グロプリン処方物と類似する方法で処方される。
^下の実施例は説明のために提供するものであって限定するものではない。 こ れら実施例は C4G1抗体に関連しているが、 G P 11 b /II I a抗体に対し高い結合親 和性を有するヒ ト型化抗体の製造はまた 10E5、 7E3、 AP— 2または G P IIb/ΙΠ a のェピトープに結合する他のモノク口一ナル抗体から得られる CD Ftの使用も意 図されていることが理解されよう。
実施例
H鎖および L鎖 c DNAのクロ一ユング
H鎖および L鎖の可変領域遣伝子の c DN Aは、 定常領域とハイブリツ ド形成 しそして Hindlll部位を含有する 3 'プライマ一および dGテールとノ、イブリ ヅ ド 形成しそして EeoRI部位を含有する 5 'ブライマ一を使用して、 アンカード P CR
CE. Y. Loh等、 Science 243、 217〔1989) ) を使用してクローン化した 〔第 1図 に示される図式）。 PCR増幅フラグメントは Ecol および Hindlllで消化し、 そ して塩基配列決定のために PUC18ベクター中にクローン化した。 C4G1では、 2つの ガンマ一 1特異性おょぴ 2つの力ッパ特異的クローンの配列決定をした。 2つの ガンマ一 1クローンおよび 2つのカツパクローンはそれぞれ配列が同一である。 c DN A可変領域配列および推定ァミノ酸配列は第 2図に示す。 キメラ抗体の構築および発現
プラスミ ドベクターはキメラ抗体遺伝子を構築および発現させるために調製し た。 ブラスミ ド pVgl— dhfr〔第 3図 A〕 はヒトサイ トメガロウィルス IE1プロモー ターおよびェ ンノヽンサ一 CM. Boshart等、 Cell 41、 521 (1985〕 ）、 先行イン トロ ン部を有するヒ トゲノム Cァ 1断片、 並びに選択用のジヒドロ葉酸レダクターゼ Cdhfr) 遺伝子 （Simonsen等、 Pro Natl. Acad. Sci. USA 80、 2495 〔1984)、 これは本明細書に参考として組み入れる） を含有している。 プラスミ ド pVk (第 3 図 B) は pVgl— dhfrに類似しているが、 ヒトゲノム Cfc断片および gpt遣伝子を含 有している。 C4G1Hおよび L鎖可変領域の誘導体は P CRによって c DN Aから 調製した。 5 'プライマーは ATGコ ドンで開始して V領域とハイブリ 、ソ ド形成しそ して Xbal部位を含有していた； 3 'プライマーは J領域の最後の 15個のヌ ク レオチ ドとハイブリ ッ ド形成しそしてスプライス供与シグナルおよぴ Xbal部位を含有し ていた （Queen等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、 10029 (1989)、 これは本明 細書に参考と して組み入れる）。 修飾した V領域は定常領域の CMVプロモーターと 部分的ィ ン トロンとの間のそれぞれのプラス ミ ドべクターの Xbal部位中にクロー ン化した。
キメ ラ抗体を発現させるために、 H鎖および力ヅパ鎖プラスミ ドはエレク ト口 ポレーシヨ ンによ り Sp2/0マウス ミ エローマ細胞に ト ラ ンスフエ ク ト し、 gpt発現 で選択した。 最大量の完全抗体を分泌するクローンは EUSA法で検出した。 精製し たキメラ C4G1抗体は GP II b/III a抗原を発現する HEL 92.1.7細胞と結合し、 こ れはフローサイ トメ ト リ一によって、 示された 〔第 4図〕 。 ヒ ト型化抗体のコ ンピューターモデル構築
ヒ ト型化抗体中で髙結合親和性を保持するために、 Queen等の一般的な方法に従 つた （Queen等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86> 10029 (1989) および WO 90/0 7861参照、 これらは本明細書に参考と して組み入れる）。 ヒ ト抗体が元々のマウス 抗体と相同であればあるほど、 マウス CDR抗体をヒ ト フ レームワーク と組み合 わせるこ とによって、 親和性を減少させる歪みを CD R抗体中に導入する可能性 がますます少なく なる。 通常は、 H鎖と L鎖の組合せの不適合性の可能性を減少 させるように、 フ レームワーク配列を提供するためには同一のヒ ト抗体から得ら れる H鎖および L鎖が選択される。 N B R Fタ ンパク質配列データベースによる配列 ホモロジー検索に基づいて (MicroGenie Sequence Analysis Software CBeckman) で実施した）、 C4G1のヒ ト型化用のフ レームワーク配列を提供するために Eu抗体を 選択した。
C4G1可変領域のモデルを構築するためにコンピュータープログラム ENCAD CM. Levitt, J. Mol. Biol. J6 , 595 (1983)、 これは本明細書に参考と して組み入れ る） を使用した。 このモデルを使用して、 CD R (下記 4のカテゴリー） と相互 作用できるほど CD Rに十分近接した C4G1フ レームワーク中のァミ ノ酸を決定し た。 ヒト型化 L鎖および H鎖 C4G1可変領域を設計するために、 アミノ酸は各位置 でその位置が下記の 5つのカテゴリーの 1つまたはそれ以上の範囲内にない限り， Εϋ抗体と同一であるように選択した ：
( 1 ) 位置が C D R内にある、
〔2 ) Euァミノ酸がその位置でヒ ト抗体に稀であり、 一方 C4G1ァミノ酸がその 位置でヒト抗体に典型的である、
( 3 ) 位置が C D Rにぴったり隣接している、
〔4 ) 上記モデルが、 アミノ酸は抗原結合領域 （C D R ) と物理的に近接する ことができることを示唆する。
カテゴリー 〔2 ) では、 「稀である」 は Eu L鎖および H鎖と同一のサブグループ CKabat等、 前掲で定義されている） においてヒ ト配列の約 20%未満で生じるアミ ノ酸を含むように解新され、 そして 「典型的」 は上記サブグループにおいてヒト 配列の約 25%以上ではあるが一般的には 50%以上で生じるアミノ酸を含むように 解釈される。 これらのカテゴリーの位置では、 マウス C4G1抗体から得られるアミ ノ酸を使用した。 更に、 位置が 5番目のカテゴリ一、 即ち、
〔 5 ) Euアミノ酸がその位置ではヒト抗体において非常に稀であり、 そして C4 G1ァミノ酸は異なっているが稀である場合、
この場合は、 その位置のヒト抗体に典型的なァミノ酸を使用することができる。 各カテゴリ一内のァミノ酸は表 1に示す。 幾つかのァミノ酸は 1つ以上のカテ ゴリー内にあることができる。 ヒ ト型化 C4G1 L鎖および H鎖可変領域の最終配列 は、 マウス C4G1配列と比較して、 第 5図 A、 Bに示す。
カテゴリ一 L鎖 H鎖
1 24- 34, 50— 56、 89— 97 31— 35、 50— 66、 99—108
- 48, 63 · 93、 98、 109、 110、 113
一一 30、 98、 109
7、 22、 48、 70、 71、 87 27、 28、 30、 48、 70、 72
98、 109 1 11 ヒ ト型化抗体の合成
ヒ ト型化抗体の遺伝子を構築するために、 ヒ ト型化 Hおよび L鎖のタ ンパク質 配列をコードするヌ ク レオチ ド、配列を選択した。 これには典型的な免疫グロプリ ンシグナルペプチ ドが含まれ、 一般的にはマウス配列中に見られるコ ドンを使用 した。 幾つかの縮退コ ドンを変化させて制限酵素認識部位を創製するかまたは望 ま し く ない制限酵素認識部位を除去した。 このヌ ク レオチ ド配列はまた、 キメ ラ 遣伝子で使用される同一のスプライス供与シグナルおよび各末端の Xba l部位も有 していた。 各遺伝子は 4つの部分的に重複する合成ォリ ゴヌク レオチ ドから構築 した。 各可変領域遣伝子用に、 ス ト ラン ド間で交互に重複した 2重の重複オリゴ ヌク レオチ ドを合成した。 これはア ミ ノ酸翻訳領域の配列並びにシグナルぺプチ ドおよびスプライス供与シグナルを有していた （第 6図）。 オリ ゴヌ ク レオチ ドは アプライ ド パイォシステムズ （App l i ed B i osystems) 380B DNA合成機で合成した < 各オリゴヌク レオチ ドは約 110〜140塩基の長さであり、 約 15塩基を重複させた。
2本鎖 D N Aフラグメ ン トは各オリ ゴヌ ク レオチ ド対から K ienowポリ メラーゼで 合成し、 制限酵素で消化し、 PUC18ベクターに連結しそして配列決定した。 次いで， それぞれ正しい半分の配列を有する 2つのフラグメ ン トを pVgl— dhfrまたは pVk発 現ベクターの Xba I部位に正しい方向で連結して完全な H鎖および L鎖遣伝子を製 造した。 例えば、 ヒ ト型化 C4G1可変領域遣伝子は pVgl— dhfrの Xba Iフラグメ ン ト に含まれる。 反応は当該技術分野で周知の条件下で実施した （Mani at i s等、 前掲）。 ヒ ト型化 C4G1抗体の完全 H鎖および L鎖の予想されるアミ ノ酸配列は第 5図 Cお よび第 5図 Dに示す。
H鎖および L鎖プラス ミ ドはエレク トロポレーシヨ ンによゥて Sp2/0マウスミエ ローマ細胞中に ト ラ ンスフエク トさせ、 そして細胞は gpt発現で選択した。 クロー 'ンは培養上清液中のヒ ト抗体産生を EU SA法でスク リーニングし、 そして抗体は産 生量の最も多いクローンから精製した。 抗体はスタフイ ロコッカスプロティ ン A 一セフ ァロース CL-4B ( Pharmac i a) の力ラムに組織培養上清液を通過させて精製 した。 結合抗体は 0. 2M グリ シン- HC 1、 pH3. 0で溶出し、 そして 1Mト リ ス、 pH8. 0で 中和した。 緩衝液は PD10カラム （Pharmacia) を通過させることによって PBSに交 換した。 ヒ ト型化 Fabおよび F(ab')2フラグメ ン 卜の製造
2つの別のベタタ一をヒ ト型化 Fabおよび F(ab')2フラグメン トを製造するため に構築した 〔第 7図 Aおよび第 7図 B)。 ベクターを使用して直接製造した組換え F(ab')2フラグメ ン トを酵素消化で製造した P(ab') 2フラグメ ン ト と区別するため に、 組換えフラグメントは F(ab')2— 1と称する。 Xba 〖部位から反時計回りで Bam HI部位まで、 これらのプラスミ ドは pVgl-dhfrと同一である 〔第 3図 A)。 しかし 乍ら、 完全なヒ ト C ァ 1遺伝子の代わりに、 プラスミ ド pHFab.Dは CH1ェクソンお よびヒンジェクソンの最初の 5個のァミノ酸、 続いて停止コ ドンおよびスプライ ス供与シグナルしか有しておらず、 そしてプラスミ ド pHF(ab')2.Dは CH1、 ヒンジ および C の最初の 2個のアミノ酸 〔ヒンジの 1部としてスブライスに架橋する コ ドンを計数して） 、 銃いて停止コ ドンおよびスブライス供与シグナルしか有し ていない。 両プラスミ ド共に、 最終ェクソンの後に 162塩基対の Sai I— Bam HIフ ラグメン トが続いており、 これはマウスァ 2a定常領域遺伝子の CH3ェクソンのす ぐ後の領域から'得られそしてボリ ァデニル化シグナルを含有している。 次いで、 上記のヒ ト型化 C4G1H鎖可変領域遗伝子を含有する Xba 〖フラグメ ン トはプラスミ ド pHFab.Dおよび pHF(al )2.Dの各々の Xba I部位中に正しい方向で揷入した。 ブラ スミ ドは全て、 遺伝子工学分野の熟練者に周知のオリゴヌ ク レオチ ド合成および P CRを含む標準的な方法で構築した。 ヒ ト型化 C4G1 Fabおよび F(ab')2— 1フラ グメント中の H鎖の予想アミノ酸配列は第 7図 Cおよび第 7図 Dに示す； これら フラグメン ト中の L鎖は完全抗体中の L鎖と同一である（第 5図 C) 。
各 H鎖遗伝子を含有するプラスミ ドはヒト型化 C4G1L鎖遺伝子を含有するブラ スミ ドとそれぞれ一緒にエレク 卜ロポレーシヨ ンによつて Sp2/0細胞に トランスフ ェク トさせ、 そして細胞は gpt発現で選択した。 クローンは培養上淸液中のヒ ト抗 体フラグメン トを ELISA法でスクリーニングし、 そしてヒ ト型化 C4G1抗体 Fabまた は F(ab')2— 1フラグメン トは最大産生量を与えるクローンから精製した。 各フラ グメン トについて、 漓縮培養上清液は最初 20ιπΜの ト リス緩衝液、 ρΗ 8.6中で0£ £ ーセファロースカラムを通過させ、 非吸着画分を更に精製に供した。 Fabフラグメ ン トは CM-セファロースおよびフエ二ルーセフ ァロースで更に精製したが、 一方!7 (ab ') 2— 1フラグメ ン トは CM-セファロースおよびフエ二ルーセファ ロース並びに S-200で更に精製して当該技術分野で周知の方法を使用して Fab'他のオリゴマーか ら F(ab')2— 1を分離した。 当該技術分野で既知の他のタ ンパク質製造および精製 方法も使用するこ とができる。 例えば、 F(ab')2-1の DEAE-セファロ一ス非吸着 フラクショ ンは F(ab')2-1の収量を増加させるために lOmMの還元グルタチオン中 p H 9.0でイ ンキュベー トするこ とができる。
ヒ ト型化 C4G1抗体およびフラグメ ン トはまた他の僅かにまたはかなり異なる方 法で精製するこ と もできる。 各場合において、 細胞は 10, 000 gで 10分間遠心して 培養液から分離し、 上清液は 0.45 ιηフィ ルターでろ過し、 そしてその後、 全抗体 については 30， 000そしてフラグメ ン トについては 10, 000の分子量力ヅ トオフ （MW CO) 膜を使用して約 20倍に濃縮した。 例えば、 全ヒ ト型化 C4G1抗体を製造するた めに、 濃縮培養上清液を 1 Mの ト リ スで pH7.5に調整し、 10, 000 gで 10分間遠心し、 そして 0.45/ mフ ィ ルターでろ過した。 次いで試料は、 平衡および洗浄緩衝被と し て 0.15M NaCK 0.05M ト リ ス、 pH7.5、 2mM EDTAを使用してプロテイ ン A—セフ ァ ロース FFカラム （Pharmacia) にアプライ した。 抗体はト リス塩酸で pH 3.5に調整 した 0.1Mの酢酸で溶出し、 そして集めたフラクシヨ ンは ト リスで pH 7.5に調整し た。 次いで、 集めたものを無菌透析チューブを使用して PBSで透析し、 そして 0.2 〃mフ ィ ルターを使用してフ ィ ルター滅菌した。
サルでのェクスビボ実験用のヒ ト型化 C4G1 Fabフラグメ ン トを精製するために、 濃縮培養上清液は 20mM ト リ ス、 pH 8.6でフ ィ ルタ一ろ過し、 10, 000 gで 10分間遠 心し、 そして 0.45// B1フィルターでろ過した。 試料は lOmM ト リス、 ρΗ 8.6で平衡 化した DEAEセファロース （Pharmacia) カラムにアプライ し、 そして非吸着画分を 集めた。 DEAEプールのバッファを MESで 10mMにし、 そして H C 1で pH 6.5に調整し た。 次いで、 試料を 10mM MES、 pH 6.5で平衡化した CMセファロース （Pharmacia) カラムにアプライ し、 O〜500mM NaCl勾配で溶出した。 Fabフラグメ ン トは最初の ピークに含まれていた。 このビークフラクショ ンのブールは 10, 000MWC0膜を使用 して濃縮し、 そして PBSで平衡化したセフア ク リル S-200 (Pharmacia) カラムに アブライ した。 ビークフラクショ ンを集め、 そして 0.2/ίπιのフィルターを使用し てフィルター滅菌した。
ヒ ト型化 C4G1 F(ab')2— 1フラグメ ン トは次のように製造しそして精製すること ができる。 濃縮培養上清液は 20mM ト リス、 pH 8.6でフィルターろ過し、 10, 000 g で 10分間遠心し、 そして 0.45〃mフィ ルターでろ過する。 試料は 10mM ト リス、 pH 8.6で平衡化した DEAEセファロース （Pharmacia) カラムにアプライ し、 そして非 吸着画分を集める。 0£ £プールば10, 000 MWC0膜を使用して約 10倍に濃縮し、 酢酸 で pH 5.0に調整し、 そして沈殿物を遠心で除去する。 次いで、 試料は ト リスで pH 9.0に調整し、 lOmM 還元グルタチオンを加えそして 22°Cで 30分間ィ ンキュベ一 ト する。 次いで、 試料は 0.1M トリス、 pH 9.0に対し 4°Cで 16時間透析し、 その結果 約 30%の ab')2— 1が形成される。 次いで、 試料は 10, 000 MWC0膜を使用して約 1 0倍に濃縮し、 そしてセフアクリル S-200カラムに入れる。 90kDaのピークを集め、 そして 0.2 mフィルターを使用してフィルター滅菌する。
より高産生のヒ ト型化 C4G1抗体およびフラグメ ン ト産生する細胞株は産生細胞 株を高い濃度のメ ト トレキセ一ト中でイ ンキュベートすることによつて得られる CSinonsen等、 前掲）。 或いは、 Fabおよび F(ab') 2フラグメ ントは、 上記の組換え 方法の代わりに当該技術分野で周知の方法を使用して、 完全ヒ ト型化 C4G1抗体の 酵素消化によって製造することができる （Antibodies. A Laboratory Manual, H alowおよび Lane編、 Cold Spring Harbor Laboratory、 1988、 これは本明細書に参 考として組み入れる）。
例えば、 ヒ ト型化 C4G1 F(ab')2のも う 1つの形態、 即ち F(ab') 2— 2と称する形 態は以下のようなペプシン消化によって製造した。 ヒ ト型化 C4G1 IgG産生細胞の 培養上清液ぼ 1M ト リスで pH 8.5に調整し、 そして 50mM ト リス pH 8.5、 150mM NaCK 2mM EDTAで平衡化したプロテイ ン A親和性膜デパイス （Nygene) に適用し た。 全抗体は 0.1M グリ シン一 HCi pH 2.5で溶出し、 そして集めたフラクショ ンは 1M トリスで pH 3.5に調整した。 このようにして製造した IgGはブタ胃粘膜から得 られるべブシン （Sigma) で消化した。 ペプシンは 0.1M グリ シン一 HCl pH 3.5に 溶解させ、 そして IgG溶液に加えた （酵素： IgG 比率 （w/w〕 1 ： 100である）。 反 応混合物は 37でで 3時間反転させながらイ ンキュベート し、 そして反応は 1M ト リスを加えて pH 8.0に調整するこ とによって停止させた。 次いで、 ペプシン消化 フラクショ ンは 0.75M (NH4)2S04に調整し、 そして 50mM CH3C00Na pH 6.0、 0.75 (NH4)2S04で平衡化したフヱニルー 5PW CTosoh) カラムにアプライ した。 試料は、 0.75Mから 0Mまでの （NH4)2S04の直線的勾配で溶出した。 F (ab' ) 2— 2は主ピークに 含まれていた。
ヒ ト型化抗体の特性解析
ヒ ト型化 C4G1抗体についてマウスおよびキメ ラ抗体と比較してその性質を検討 した。 ヒ ト型化抗体は、 キメ ラ抗体と同様の方法でフルォロサイ トメ ト リ一分析 した結果 HEL 92.1.7細胞と結合し （第 4図）、 これはヒ ト型化抗体が G P 11 b /I I l a抗原を認識するこ とを示していた。
精製したヒ ト型化 C4G1抗体、 Fabフラグメ ン ト、 F(ab')2— 1フラグメ ン トおよび F(ab') 2— 2フラグメ ン トは還元し、 そして SDS-PAGEを行った。 完全抗体はおおよ その分子量 25kDaおよび 50kDaの 2つのパン ドを示し、 そして Fabおよび F(ab') 2— 1フラグメ ン トは約 25kDaのダブレッ トのパン ドを示した。 ヒ ト型化 C4G1 F(ab') 2 一 2フラグメ ン トは SDS-PAGEで F(ab')2— 1フラグメ ン ト と同じ易動性を示した。 こ れらの結果はァミ ノ酸組成から算出された L鎖および H鎖または H鎖フラグメ ン トの分子量と矛盾しなかった。
ヒ ト型化 C4G1抗体、 Fabフラグメ ン トおよび F(ab') 2— 1フラグメ ン トの親和性は マウス C4G1抗体およびフラグメ ン ト との競合的結合によって測定した。 精製した ヒ ト血小板を G P II b/III a抗原の供給源と して使用した。 血小板は、 フ イ コー ルーハイパク （Ficol卜 hypaque) での遠心によって正常なヒ ト提供者から得られ るパフィーコー トから精製した。 競合させるヒ ト型化またはマウス抗体若し く は フラグメ ン トは量を変えて 4.5ngの放射性ョゥ素標識ト レーサー C4G1抗体 〔3.5〃 Ci/〃g) に加え、 そして 3 X 107個の血小板と共に 0.2mlの改変タイ ロード緩衝液 中室温で 1時間イ ンキュベート した。 細胞は 2 mlの氷冷緩衝液で洗浄し、 そして 遠心しペレツ ト化した。 放射活性を測定し、 そして結合および遊離 ト レーサー抗 体の澳度を計算した （第 8図）0 種々の抗体およびフラグメ ン トの結合親和性は Q ueen等、 Proc. Nat. Acad. Sci. USA M、 10029 (1989) と同様にして計算した。 この結果は、 それぞれヒ ト型化とマウスの C4G1抗体 〔第 8図 A)、 ヒ ト型化とマウ スの C4G1 Fabフラグメント 〔第 8図 B)、 およびヒト型化とマウスの C4G1 F(ab') 2フラグメン ト 〔第 8図 C) の間の結合親和性に有意な差異のないことを明らかに 示している。 競合結合実験を GPIIb/illa抗原の供給源として HEL 92.1.7細胞 で行い、 同じ結果が得られた。 更に、 これら細胞への実際の結合親和性は全て約 Ιί^Μ·1またぼそれ ¾上であつた。
マウスとヒ ト型化 ( G1抗体およびフラグメン トが血小板凝集を阻止する能力を 測定した。 各抗体またはフラグメントは 5 gZmiの最終濃度で、 新たに採血した クェン酸添加血液を 200X gで 10分間遠心して製造した血小板に富む血漿 〔P RP〕 に加え、 そして 37でで攪拌し乍ら 5分間インキュベートした。 ADPは凝集を開始さ せるため 4.6 Μの終濃度で加えた。 血小板凝集は、 シェンコ （Sienco) 二チャン ネル凝集計、 モデル DP-247Fまたは HEMA- TRACERを使用して光透過率によってモニ ターした。 ヒ ト型化とマウスの C4G1抗体の凝集阻止能力 〔第 9図） またはそれぞ れヒト型化とマウスの Fabおよび 〔Fab')2— 1フラグメントの凝集阻止能力に有意 な差異はなかつた。 そしてヒ ト型化 C4G1 F(ab')2— 1と F(ab')2-2フラグメン トの 凝集阻止能力に有意な差異はなかった。
マウス及びヒ 卜型化 C4G1抗体のヒ トさい帯静脈内皮細胞 〔HU VE C〕 への結 合を、 GPIIIaに特異的なマウスモノ クローナル抗体 B6A3の結合と比較し、 調べ た。 HEL 92.1.7細胞への抗体の結合も調べた。 抗体は上述したように放射標識し た C3.5uCi/Cig) 。 500〃 1HUVE Cあるいは HEL 92.1.7 (2 XlOVml 2 XI OVmK 2 XIOVEO の懸濁液を 1.5mlエツペン ドルフチューブ中、 室温あるいは 4でで各モノクローナル抗体の lOOfmolと 90分間ィンキュペー ト した。 インキュぺ ーション後、 エツペンドルフ遠心チューブ中のシリコンオイルの上へチューブ内 容物を移し、 室温で 2分間、 10,000gで遠心した。 ペレツ トと上淸を、 ガンマカウ ンターで別々に測定した。 非特異的結合を、 100倍量の非標識抗体で測定し、 特異 的結合を出す為に総結合量から差し引いた。 マウス及びヒ ト型化 C4G1モノクロー ナル抗体が、 2 Xl05/inl、 2 Xl06/inlの細胞濃度で、 マウス Β6Α3と同程度に HEL 92.1.7細胞に特異的結合を示した。 一方、 マウス Β6Α3は 2 X106/ralで HU VEC に特異的に結合したが、 マウス及びヒ ト型化 C4G1は、 いずれの細胞溏度でも HU V E Cに特異的結合を示さなかった。 ェクスビボの ADP誘導血小板凝集阻止活性
. サルでヒ ト型化 C4G1 Fabと F(ab')2フラグメ ン トのェクスビボ血小板凝集阻止能 力を測定した。 全て健康なヒ ト提供者から得られた血小板はヒ ト型化 C4G1に応答 するが、 ある種のァカゲザルから得られた血小板はヒ ト型化 C4G1に応答しなかつ た。 それ故、 ヒ ト型化 C4G1に応答する血小板を有するァカゲザルだけを本実験用 に選択した。
各フラグメ ン トは 5miの生理食塩水溶液に懸濁し、 そしてァカゲザル （雄、 体 重 2.8〜5.0kg) に静脈内に投与した。 プラセボ対照では、 5 mlの生理食塩水溶液 を投与した。 血液は塩酸ケタ ミ ンによる麻酔下で投与 1時間後に集め、 そして直 ちにクェン酸を添加し、 そして 200 gで 10分間遠心した。 上清液を P R P (多血小 板血漿） と した。 先血小板血漿 （P P P) は、 P RPを得た残りの血液を 2000gで 遠心して調製した。 P R Pは P P Pで希釈して血小板数を 3
Figure imgf000031_0001
にした。 凝集を開始させるため ADPは 20 Mの最終濃度で加えた。 血小板凝集は光透過に よってモニターした。
ヒ ト型化 C4G1 Fabおよび F(a ）2-1フラグメ ン トで処理したサルから得られた血 小板で血小板凝集は完全に阻止された。 F(alD') 2-1フラグメ ン トは 0.5mg/体重 kgの 投与量で血小板凝集を完全に阻止した。 これらフラグメ ン トでの処理はサルで重 篤な血小板減少症を生じさせなかった。
前述のこ とから、 本発明のヒ ト型化免疫グロプリ ンは他の GPIIb/IIIa特異 的抗体を超える多数の利点を提供すると評価されよう。 マウスモノ ク ローナル抗 体と比較して、 本発明のヒ ト型化免疫グロプリ ンは実質的により少ない異種アミ ノ酸配列を'含有している。 ヒ ト患者への注射後に抗原性を生じせしめる可能性が 減少しているこ とは有意な治療上の改善を示している。
全ての刊行物および特許出願は、 個々の刊行物または特許出願を特にそして個 々に指摘して参考と して組み入れる場合と同じ程度に本明細書に参考と して組み 入れる。 本発明は明確化および理解の目的で説明および実施例によって幾らか詳 細に記載しているが、 ある種の変更および修正が請求の範囲の範囲内で実施され 得ることは明白である ,

Claims

請求の範囲
1. 糖タ ンパク質 GP IIb/IIIaェピ トープと特異的に反応するヒ ト型化免疫 グロブリ ンを含んで成る組成物。
2. 免疫グロブリ ンが 2対の L/H鎖二量体からなり、 その際各鎖が可変領域 および定常領域を含んで成る請求の範囲第 1項に記載の組成物。
3. 少なく と も 1つの鎖の可変領域が非ヒ ト免疫グロプリ ン鎖から得られる 3 つの相補性決定領域 （C DR) を含んで成る請求の範囲第 2項に記載の組成物。
4. 免疫グロプリ ンが Fabである請求の範囲第 1項に記載の組成物。
5. 免疫グロブリ ンが F (ab ') 2である請求の範囲第 1項に記載の組成物。
6. GPIIb/IIIaタ ンパク質と特異的に反応するマウスモノ ク口一ナル抗体 と該タ ンパク質の結合を阻止し得る実質的に純粋であり、 且つマウスモノ ク ロ一 ナル抗体から得られる少なく とも 1つの相補性決定領域 （CDR) を含んで成る ヒ ト型化免疫グロプリ ンを含んで成る組成物。
7. ヒ ト型化免疫グロブリ ンが約 lCTM— 1またはそれよ り強い結合親和性を示す 請求の範囲第 1項または 6項に記載の組成物。
8. ヒ ト型化免疫グロブリ ンが、 それぞれマウスモノ ク ローナル抗体から得ら れる 3つの CDRを有する全長の Lおよび H鎖を含んで成る請求の範囲第 1項ま たは 6項に記載の組成物。
9. ヒ トフ レームワークおよび該フ レームワークとは天然には関係のない 1つ またはそれ以上の外来相補性決定領域 （CDR) を含んで成り、 糖タ ンパク質 II b /III aと結合することができる組換え免疫グロプリ ン組成物。
10. 免疫グロプリ ンが Fabまたは F(ab')2である請求の範囲第 9項に記載の組成
11. 外来 CDRの全てが免疫グロプリ ンの H鎖上に位置している請求の範囲第 9項に記載の組成物。
12. 免疫グロプリ ンが IgGiアイ ソタイプである請求の範囲第 9項に記載の組成 物。
13. 成熟 L鎖および H鎖可変領域タ ンパク質配列が第 5図 A及び Bの上部列の 配列と実質的に同じである請求の範囲第 9'項に記載の組成物。
14. Lおよび H鎖がフ レームワーク領域及びフ レームワーク領域とは異なる免 疫グロプリン分子から得られる相補性決定領域 〔CDR) を含んで成る GP lib /III a糖タンパク質上のェピトープと特異的に反応し得るヒ ト型化免疫グロプリ ン。
15. 少なく とも約 HTM—1の親和性を有する請求の範囲第 項に記載のヒ ト型化 免疫グロブリン。
16. ァゴニス トに応答して起きるヒ ト血小板の凝集を阻止できる請求の範囲第 14項に記載の免疫グロブリ ン。
17. 血管内皮細胞上にェピトープが存在しないかまたは少ない請求の範囲第 14 項に記載のヒ ト型化免疫グロプリン。
18. ヒト型化免疫グロブリンが Fabまたは F(ab')2である請求の範囲第 14、 15、
16または 17項に記載のヒ ト型化免疫グロプリン。
19. 2対の L鎖 ZH鎖二量体を含んで成る請求の範囲第 14、 15、 16または 17項 に記載のヒト型化免疫グロブリン。
20. フ レームワーク領域が少なく とも 2つのヒ ト免疫グロブリンから得られる アミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第 14、 15、 16または 17項に記載の免疫グロ ブリン。
21. CDRがマウス免疫グロブリ ンから得られる請求の範囲第 14、 15、 16また は 17項に記載の免疫グロブリン。
22. G P 11 b /111 aタンパク質と結合できヒ トフレームワーク中においてマウ スモノクローナル抗体 C4G1から得られる 1つまだはそれ以上の相補性決定領域
CCDR) を含んで成るヒト型化免疫グロブリ ン。
23. ヒトフ レームワークが Eu免疫グロプリンフ レームワークと実質的に同じで ある請求の範囲第 22項に記載のヒ ト型化免疫グロプリン。
24. 第 5図 A上部列に示される成熟 L鎖可変領域配列および第 5図 B上部列に 示される成熟 H鎖可変領域配列を有する請求の範囲第 22項に記載のヒ ト型化免疫 グロブリン。
25. 免疫グロブリ ンが Fabまたは P(ab')2である請求の範囲第 22項または 24項に 記載のヒ ト型化免疫グロプリ ン。
26. 第 5図 Cに示される成熟 L鎖配列および第 5図 Dに示される成熟 H鎖配列 を有する請求の範囲第 22項に記載のヒ ト型化免疫グロプリ ン。
27. 請求の範囲第 24項または 26項に記載のヒ ト型化免疫グロブリ ンの酵素消化 によって得るこ とができるヒ ト型化免疫グロプリ ン。
28. 免疫グロブリ ンが F(ab')2である請求の範囲第 27項に記載のヒ ト型化免疫グ 口ブリ ン。
29. 免疫グロブリ ン力 SFabである請求の範囲第 27項に記載のヒ ト型化免疫グロプ リ ン。
30. 免疫グロプリ ンが IgGiアイ ソタイプである請求の範囲第 24項に記載のヒ ト 型化免疫グロプリ ン。
31. ァゴニス ト に応答して起きる ヒ ト血小板の凝集を阻止できる請求の範囲第 22項または 24項に記載のヒ ト型化免疫グロプリ ン。
32. ミエローマ細胞中で産生される請求の範囲第 または 22項に記載の免疫グ 口ブリ ン。
33. ヒ トフ レームワークをコー ドする第 1の配列および 1つまたはそれ以上の マウス免疫グロプリ ンの相補性決定領域 （CD R〕 をコー ドする第 2の配列を含 んで成り、 発現によって糖タ ンパク質 GP lib /III aェピ トーブと特異的に結合 しそしてァゴニス ト刺激に応答して起きるヒ ト血小板の凝集を阻止できる免疫グ 口プリ ンが産生させられるポリ ヌク レオチ ド。
34. 免疫グロプリ ンが IgGiアイ ソタイプである請求の範囲第 33項に記載のポリ ヌ ク レオチ ド。
35. 免疫グロプリ ンが Fabまたは F(ab')2である請求の範囲第 33項に記載のポリ ヌ ク レオチ ド。
36. 第 5図 A上部列に示される成熟 L鎖可変配列をコー ドする配列および第 5 図 B上部列に示される成熟 H鎖可変配列をコー ドする配列を含んで成る請求の範 囲第 33項に記載のポリ ヌ ク レオチ ド。
37. 請求の範囲第 33項記載のポリ ヌク レオチ ドを含んで成る発現ベクター。
38. 請求の範囲第 37項記載の発現ベクターで ト ラ ンスフ ヱ ク トされた細胞株。
39. G P l i b /I I I aタンパク質に結合できそしてヒ ト血小板の凝集を阻止でき るヒトフレームワークおよび 1つまたはそれ以上のマウス免疫グロプリン相補性 決定領域 （C D R) を含んで成るヒ ト型化免疫グロプリンの成熟 L鎖または成熟 H鎖をコ一ドする配列を含有するポリヌク レオチ ド。
40. 第 5図 A上部列に示される成熟 L鎖可変領域または第 5図 B上部列に示さ れる成熟 H鎖可変領域をコードする配列を含んで成る請求の範囲第 39項に記載の ボリヌクレオチ ド。
41. 第 5図 Cに示される成熟 L鎖をコードする配列または第 5図 Dに示される 成熟 H鎖をコードする配列を含んで成る請求の範囲第 39項に記載のポリヌクレオ チド。
42. 請求の範囲第 39項記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現べクタ一。
43. 請求の範囲第 40項記載のポリヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第 42項 に記載の発現べクタ一。
44. 請求の範囲第 41項記載のポリヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第 42項 に記載の発現ベクター。
45. 第 1のベクターが成熟 L鎖をコードする配列を含んで成りそして第 2のべ クタ一が成熟 H鎖をコードする配列を含んで成る請求の範囲第 42項記載の 2種類 の発現べクタ一でトランスフ ク ト した細胞株。
46. 第 1のベクターが第 5図 A上部列に示されるタンパク質配列をコ一ドする 配列を含んで成りそして第 2のべクターが第 5図 B上部列に示されるタンパク質 配列をコードする配列を含んで成る請求の範囲第 45項に記載の細胞株。
47. 第 1のベクターが第 5図 Cに示されるタンパク質配列をコードする配列を 含んで成りそして第 2のベクターが第 5図 Dに示されるタンパク質配列をコード する配列を含んで成る請求の範囲第 45項に記載の細胞株。
48. 請求の範囲第 14または 22項記載のヒト型化免疫グロプリンを含んで成る血 拴塞拴性疾患治療剤。
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