WO1993011769A1 - Carcinostatic - Google Patents

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WO1993011769A1
WO1993011769A1 PCT/JP1992/001597 JP9201597W WO9311769A1 WO 1993011769 A1 WO1993011769 A1 WO 1993011769A1 JP 9201597 W JP9201597 W JP 9201597W WO 9311769 A1 WO9311769 A1 WO 9311769A1
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WO
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human
tnf
derivative
ifn
cells
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Application number
PCT/JP1992/001597
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English (en)
French (fr)
Inventor
Satoru Nakai
Koutoku Aihara
Hideo Tanaka
Hitomi Mori
Kazuyoshi Kawai
Michiaki Tominaga
Masakazu Adachi
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd filed Critical Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd
Priority to JP5510777A priority Critical patent/JP2597953B2/ja
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutically useful sitekines and
  • an anticancer drug comprising a nod and a carbostyril derivative
  • a carbostyril derivative represented by the following general formula (1) and ⁇ or a salt thereof are used as active ingredients.
  • an anticancer agent As an anticancer agent.
  • Stimulated lymphocytes, monocytes and macrophages are living organisms
  • cytokines affects not only the immune system but also various functions of the living body, and is closely related to the development, differentiation, homeostasis, and pathophysiology of the living body.
  • Many sitekines have been found. At present, based on the similarity of their actions, 20 site-like proteins have been developed based on similarities in several groups, such as interferon (IFN), interleukin (IL), colony stimulating factor (CSF), tumor It is divided into necrosis factor (TNF), tumor growth factor (TGF), etc., and the site cytokines in each group are further subdivided by their actions. Many of these sitekines have a common action, and for example, it is said that all of IL-1, IL-12, IFN, TNF, etc. have thermogenic antitumor activity.
  • IFN interferon
  • IL interleukin
  • CSF colony stimulating factor
  • TGF tumor growth factor
  • TGF tumor growth factor
  • IL-14 acts on T cells, NK cells, monocytes and macrophages, etc.
  • IL-15, IL-6 and IL-7 are all specific T cells in the experimental tumor system. [Clinician, 11 (10) 5 (1991)].
  • IL is currently known from IL-1 to IL-12, and most of them have sugar chains and have cell proliferation, activation and differentiation inducing actions.
  • TNF is expected as an antitumor agent as a substance that does not damage normal cells and selectively kills cancer cells. It has not only the aforementioned antitumor effect but also a wide variety of effects such as immunology and neurophysiology. It has been reported that For example, it inhibits lipoprotein lipase (LPL) activity of fat globules and increases blood triglycerides, which are well known as cachectin effects.
  • LPL lipoprotein lipase
  • LT Lymphotoxin
  • TNF— TNF is replaced by TNF— . It is known that the LT is produced from human T cell hybridomas by a gene recombination method [Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Sho 644-62898, Sho 63-183998, No. 63-8399, Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-151118, etc.].
  • TNF is a polypeptide consisting of 157 amino acids and having a molecular weight of about 1,700,000. Its gene is obtained by the method of Shirai et al., Ie, from the blood of animals (rabbits). The TNF protein was extracted, its primary structure was determined, and the corresponding cDNA was cloned by selecting from a normal human cell gene library [Shirai'T., Et al., Nature, 313, .803-806 (1985)]. Various methods are known for the cloning of TN FiDNA. [ Komura Munemura et al., Cancer and Chemotherapy 11 (1) 160-162 (1985);
  • TNF protein was extracted from the culture supernatant of a human monocyte-derived leukemia cell line (HL60, U933), and a DNA probe was prepared based on the primary structure.
  • Methods for selecting cDNA obtained from a probe [Fennica, D., et al. Nature, 312, 724-R 29 (1984); Wang, A.W., et al-, Science. 228.149-154 . (1985);.
  • TGF-yS [transforming growth factor- ⁇ ] was purified as a factor that causes malignant transformation of cells, and two homologous peptides with a molecular weight of 12.5 kd were disulfated. Molecular weight, cross-linked by
  • TGF-3 is also present in a precursor protein consisting of 391 amino acids, and is composed of 112 amino acids.
  • a C-terminal peptide consisting of noric acid has been reported to be produced by cleavage with protease
  • TGF-1 / 5 is also present in normal cells, and it has been revealed that it has growth inhibitory activity in many cell types.
  • Revised Cell Biol., 6, 597-641 TGF- ⁇ has been widely considered to act as a regulator of proliferation and differentiation in living organisms.
  • IFN Interferon
  • Type is a cell that produces Sendai virus-induced leukocytes. It has a molecular weight of about 1500 to 21000 and consists of 166 amino acids. The type is a double-stranded RNA-induced fibroblast as a producing cell and has a molecular weight of
  • the amino acid sequence consists of 166 amino acids of 200000, and the amino acid sequence is about 30% identical to the ⁇ -form, and its IFN receptor is also common to the ⁇ -form.
  • Type 7 is a mitogen-induced ⁇ cell, which is a major producer cell, and consists of 146 amino acids with molecular weights of 20000 and 2500, whose amino acid sequence is as described above. It is completely different from ⁇ -type and type, and the IFN receptor is also different. Initially, the action of IFN was species-specific and it was difficult to mass-produce human cells.
  • JP-A-26-39229 describes a method for producing natural type IFN.
  • -Above ⁇ FN has a clinical effect on renal cancer, multiple myeloma, brain tumor, melanoma and chronic hepatitis ⁇ , etc. 0% before and after.
  • ⁇ type IF New has 2 0-1 0 0 times and strong antitumor activity in animal experiments in proportion to the ⁇ -type or ⁇ -type [JL.Cran e, et al, J.Natl -.. Cancer Inst, 61,871 (1987); JEBlalock et al-, Cell Immunol., 9, 390 (1980)], although the effect was expected, but it was equivalent to the type and ⁇ type.
  • Side effects are common in all IFs, especially influenza-like symptoms such as fever and chills, hepatic dysfunction, and a decrease in leukocytes.These side effects make it difficult to administer high doses and long-term administration. ing.
  • IL-11 is a protein factor produced mainly from monocytes and macrophages, and has a molecular weight of about 1200 to 180,000. Lipeptide [SB Izel, et al., Immunol. Rev., 63, 51-71 (1982)].
  • the IL-11 acts on various cells, exhibits various biological activities, and plays an important role in almost all biological reactions such as immunity, inflammation, hematopoiesis, endocrine, and brain nerves.
  • the isoelectric point is divided into pI5 and p2, with the former being called the pattern and the latter being called the pattern.
  • Mi acid sequence is species identical type differences connexion six 0-7 0% and high homology, even among the same species The homology is low at 25% between ⁇ -type and type. It has also been reported that IL-11 binds to the same receptor of ⁇ -type and type co-cell membranes [Lowenthal, K., et al-, J. Exp. Med., 164, 1060 (1986)]. 1 a direct growth inhibition against various tumor cells, cells ⁇ ⁇ : exhibit activity [.... Onozaki, K , et al, J Immunol, 135, 3962 (198.5)], also the anti-tumor effects , Et al., Jpn.
  • IL-11 natural IL-1 can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-174'022. Production of IL_1 by genetic recombination is described in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Sho 63-152, 398 and Hei 2-16772, Europe State Patent Publication No. 237,073, European Patent Publication No.
  • IL- 2 is 1 9 7 6 years Morgan (Morgan) et al discovered in the T cell ⁇ factors present in peripheral dust lymphocytes culture supernatant was lectins stimulated Te cowpea in the [Mor gan, DA -, Et al. 'Science, 193, 1007-1008 (1976)] 0
  • IL-12 promotes thymocyte cell tearing, cytotoxic ⁇ cell activation, ⁇ cell differentiation. It was revealed that the substance is a substance with a molecular weight of 154 and consisting of 133 amino acids having activities such as induction, ⁇ cell activation, and LA ⁇ activity [Taniguchi.T., Et. Al. al-, Nature, 302, 305-310
  • Natural IL-12 can be produced by culturing human peripheral blood lymphocyte or other IL-2 producing cell lines [see US Pat. No. 4,401,756].
  • the recombinant IL-2 can be produced by the method described in JP-A-61-78799. Initially, IL-12 was administered systemically and locally in anticipation of its antitumor activity, but compared to side effects such as fever, general malaise, decreased blood pressure, eosinophilia, and increased serum pyrilrubin levels. However, the effect was not as expected.
  • IL-6 induces differentiation without proliferating B cells, It is a site power factor that promotes the production of ⁇ -cell differentiation factor.
  • the IL-6 is a protein of 1,844 amino acids synthesized from five precursors consisting of 212 amino acids, and has a molecular weight of 2,100. It is produced by stimulating ⁇ cells, ⁇ cells, macrophages, fibroblasts and many other cells with mitogen, IL-1, TNF, IFN- ⁇ , LPS, etc. You. Its functions are known to be diverse such as B cell differentiation, T cell proliferation and differentiation, induction of killer T cells, induction of acute phase proteins, proliferation of pluripotent stem cells, and megakaryocyte differentiation [Hirano, T. , et al., Therapeutics, (1) 49-52
  • IL-7 was introduced by Namen et al. In 1988, when stromal cells capable of supporting the growth of pre-B cells were expanded. It was found to produce a humoral factor having a proliferative activity, and purified and cloned [Namen, AE., Et al., Nature, 333,571 (1988);]. IL-7 is produced by bone marrow and thymic stromal cells, and is a protein of molecular weight 800,000 consisting of 72 amino acids. Its functions are the proliferation and differentiation of B precursor cells, Proliferation and differentiation of T cells, enhancement of killer T cell activity, induction of LAK cells, activation of monocytes, etc. have been reported. Its production by genetic recombination is described in US Pat. No. 4,965,195.
  • IL-4 differentiates B cells of the immune system into antibody-producing plasma cells, stimulates the differentiation and proliferation of thymic T cells, and acts as a factor having mast cell proliferation.
  • Noma) et al. Lymphokine with a molecular weight of 1500-190,000 amino acids, cloned almost simultaneously by Lee et al. [Noma, Y., et al., Nature, 319, 640 (1986); Lee, F., et al-, Proc. atl. Acad. Sci .. USA, 83, 2061 (1986)] 0
  • the production method of the IL-4 For example, a method of expressing cells using CH0 cells is described in U.S. Pat.No. 5,304,133, and IL-14 is considered to be applicable to infectious diseases, cancer and autoimmune diseases.
  • O ot al.
  • IL-15 is involved in the growth of antibody-producing lymphocyte B cells. It was identified as a T cell-replacement factor (TRF) that induces differentiation [Takatsu, K., et al., J. Immunol., 125, 2646 (1980)], and the TRF was activated. In addition to promoting the proliferation and differentiation of metabolized B cells, it has been shown that bone marrow cells induce the proliferation and differentiation of eosinophils [Suda, Toshio, Clinical Immunity, 521 (1989)]. Human IL-5 cDNA was isolated using the IL-15 cDNA as a probe [Azuma. C., et al., Nucleic Acids Res., 14,
  • the IL-15 is composed of 115 amino acids and has a molecular weight of 460,000 (a dimer of 230,000). Proliferation of B cells, differentiation into antibody-producing cells, proliferation and differentiation of eosinophils, induction of IL-12 receptor expression, induction of killer T cells, etc. there effects Ru [Takatsu Kiyoshikokorozashi, therapeutics, ⁇ (1) 45 - 48 (1 99 0)]. As a production method, a method for expression from CH0 cells by a genetic recombination method is described in JP-A-3-27295, and IL-18 is a type of leukocyte.
  • LPS lipopolysaccharide
  • IL-19 stimulates the proliferation of megakaryoblastic cell line (M07E), a progenitor of platelets, and is a different humoral factor from GM-CSF and IL-2.
  • CDNA was isolated from the culture supernatant of a T cell line infected with HTLV-I (CM J.2) [Yang, YC, et al., Blood, 74 (6) 1880-188 (1989 )]. It is a protein consisting of 144 amino acids and is a mouse T cell growth stimulating factor With high homology [ Van Snick J., et al-, J. Exp. Med. 169 (1) 363-368 (1989) 1.
  • the IL-9 is produced from CD4 + T cells by stimulating mitogen, and the proliferation of helper T cells, proliferation of megakaryoblastic cell lines, promotion of erythroid stem cell differentiation, and promotion of myeloid cell lines A proliferative effect has been reported, and it is said that it may be the same substance as the T cell growth factor P-40.
  • the method of cloning and expression is described in PCT Publication No. 91014432.
  • IL- 1 0, the mower one (Moore) Raniyo Ri tau Eta 1 helper T cells than isolated, T cells Karamea over inhibit cyclic Tokay emissions synthesis inhibitory factor (Cytokine Synthesis Inhibitory Factor production of IFN
  • the reported IL-10 was a molecular weight consisting of 160 amino acids.
  • IL-11 is produced by bone marrow osteoblasts as a factor that increases IL-13-dependent hematopoietic stem cell blast colony It is reported as a cytokin consisting of 199 amino acids with a molecular weight of about 20000, and is capable of expanding plasma cell lines, differentiating B cells, expanding hematopoietic stem cell blast colonies, and macrophage. Academia has been reported to induce differentiation of megakaryocytes, etc. 5 [Kazuo Oshimi, clinician, H (10) 5-9 (1991); PaUl , SR, et al., Proc. Natl. Acad Sci., US.A., 87 (19) 7512-7516 (1990)]. Regarding the cDNA and the production method of the IL-11, a method of expressing it in C0S cells and the like are described in PCT Publication No. 907.495.
  • 0 IL-11 is a cytotoxic lymphocyte maturation factor
  • cytotoxic lymphocyte maturation factor is a cytokine that stimulates the proliferation of PHA-stimulated human peripheral blood lymphocytes and the increased interaction with low concentrations of IL-12 induced by LAK cells. It is an active protein having a molecular weight of about 7500 and a disulfide bond of 54000 and 3500 molecules.
  • the IL-1 12 is a lymphoblastoid cell
  • TNF TNF
  • side effects such as chills, horror, fever, and a decrease in blood pressure, and it is not possible to administer an amount that can be expected to have antitumor effects.
  • IFN also has a low clinical efficacy rate of about 20%, and is indicated. Patients are also limited to specific diseases, and influenza-like symptoms such as fever and chills of each IFN are observed, and it is difficult to administer high doses due to these side effects, and the degree of satisfaction as initially expected has not been obtained. In the current situation.
  • IL-11 and IL-12 have an anti-proliferative effect on tumor cells, but in clinical trials using anti-tumor agents containing IL-11 as an active ingredient, fever, gastrointestinal symptoms, ⁇ neglected, hypotension, and this showing the side effects of muscle pain, etc. have been reported [H. a. Aarvey, et al., Proc., ASC0., 24, 46 (1983)] 0
  • IL one 1 Has been expected for the treatment of cancer, but due to the above-mentioned side effects, it is necessary to give up trials of large dose administration.
  • IL-12 alone has almost no effect and is currently mainly used in LAK therapy.
  • LAK therapy the patient's own peripheral blood lymphocytes are usually used as a material for LAK cells. It is necessary to collect spheres, infiltrating lymphocytes in tumors, lymphocytes in cancerous pleural ascites, etc. beforehand and culture them with IL-12, and culturing requires a large amount of culture solution and culture space. The cultivation period takes 1 to 2 weeks, depending on the material, and it takes another 1 to 2 weeks to grow to the desired number of cells. Culture must be continued for a week, and there are many problems in terms of time before treatment and treatment equipment. Moreover, there are various problems with LAK therapy, such as high frequency of fever, gastrointestinal symptoms, weight gain due to fluid retention, eosinophilia, and anemia.
  • ILs have an action of differentiating and proliferating various cells, are used as an adjunctive therapy for cancer and as an enhancer for platelets, granulocytes, etc., and are associated with inflammation such as neutrophils and eosinophils IL is currently being investigated only as a therapeutic agent for autoimmune diseases, particularly rheumatism and vasculitis.
  • the carbostyril derivative represented by the following general formula (1) is already known to be useful as an intense force, as described in, for example, Japanese Patent Publication No. 1-43747.
  • the present applicants have previously found that the derivative has an anticancer effect and an ability to induce cell differentiation, which are difficult to predict from a cardiotonic effect, and have made an invention based on this finding.
  • Completed and filed a patent application Japanese Patent Application No. 3-1658287.
  • the present inventors have conducted further studies on the anticancer effect and the cell differentiation-inducing ability of the above derivative, and as a result, have found that the derivative and TNF and other various site proteins described above, especially
  • TNF alone, IFN alone, IL alone or TGF- ⁇ alone does not exhibit the antitumor activity at a low dose.
  • tumor growth inhibitory effects and cell differentiation An induction-promoting effect can be obtained, and as a result, the dose of the above-mentioned cytokins such as TNF, IFNIL, and TGF- ⁇ can be significantly reduced, and a powerful anti-cancer effect and an effect of inducing differentiation of cells can be obtained at an early stage. I found it to appear.
  • the present inventors have also found that the rubostyryl derivative represented by the general formula (1) can be used in combination with a retinoid such as retinoic acid in the same manner as in combination with the above-described cytokine.
  • a desired anti-cancer agent is provided by exhibiting an anti-cancer effect and a cell differentiation-inducing effect.
  • a site kinase having an antitumor effect in particular, a site kinase selected from TNF, IFN, TGF- ⁇ , and IL, and a carbohydrate represented by the following general formula (1)
  • An anticancer agent characterized by containing a rill derivative and Z or a salt thereof as an active ingredient is provided.
  • R may have, on the phenyl ring, one to three groups selected from a lower alkoxy group and a lower alkyl group
  • the carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyryl skeleton represents a single bond or a double bond.
  • an anticancer agent characterized by containing a retinoid and a carbostyril derivative represented by the above general formula (1) and Z or a salt thereof as active ingredients. .
  • the carbostyril derivative is 6-
  • the above-mentioned anticancer agent, wherein the human TNF is natural human TNF-H, human recombinant TNF- ⁇ or human TNF- ⁇ derivative having human TNF- ⁇ activity.
  • the anticancer agent is a human Bok IFN one r derivatives having activity, site Kai down the native human
  • the above-described anticancer agent which is a human IL-11 derivative having human IL-1 ⁇ , recombinant human IL-1; S or human IL-11 ⁇ activity having human IL-1 ⁇ activity, and cytokin is a natural human TGF.
  • the present invention provides the above anticancer agent, which is a recombinant human TGF- or human TGF- ⁇ derivative having human TGF-activity, and the above-mentioned anticancer agent, wherein the retinoid is retinoic acid.
  • an anticancer drug comprising the carbostyril derivative represented by the above general formula (1) and ⁇ or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the above-mentioned cytokine and rosin or retinoide as active ingredients
  • a method for treating a cancer by administering a pharmacologically effective amount of the compound to a patient.
  • the lower alkoxy group defined includes, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, tert- Examples of a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms such as butoxy, pentyloxy, and hexyloxy groups, and lower alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropynole, butynole. And tert-butizolepentinoles, hexyl groups and the like, and straight-chain or branched-chain alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • benzoyl group which may have 1 to 3 groups selected from benzoyl, benzoyl, 2-methoxybenzoyl, 3-methoxybenzoyl, 4-methoxybenzoyl, 2-ethoxybenzo Inole, 3—ethoxybenzoyl, 4—ethoxyquinbenzole, 3—isopropoxybenzoyl, 4—butoxybenzoinole, 2—pentinoleoxybenzol, ⁇ 3—hexyloxybenzoinole , 3,4—Dimethoxybenzoyl, 2,5—Dimethoxybenzoyl, 3,4,5—Trimethoxybenzoyl, 2—Methylbenzoyl, 3—Methylbenzoinole, 4—Methylbenzoyl, 2—Ethynolbenzoyl, 3 —Echinorebenzoinole, 4 —Echinorebenzo
  • carbostyryl derivatives particularly preferred are, for example, 6— [4— (3,4—dimethoxybenzoyl) 1-1—piperazinyl] —3,4—dihydrocarbostyryl , 7 — [4-(3, 4, 5 — trimethoxybenz Zyl) 1- 1-piperazinyl] 1,3,4-dihydroxybostyryl, 7- [4— (3,4-dimethoxybenzoyl) 1-1-piperazinyl] 1,3,4-dihydrocarbostyryl, 6— [4- (4-ethoxyquinbenzoyl) -1-piperazinyl] —3,4-dihydrocarbostyril and salts thereof.
  • TNF is not particularly limited as long as it has TNF activity, and may be natural or recombinant TNF produced by genetic recombination. Either may be used. That is, the TNF may be any of TNF-, TNF- and LT, and includes natural or recombinant forms thereof.
  • the above-mentioned TNF is a culture supernatant containing human TNF induced in vitro and a purified product thereof, a recombinant human TNF produced according to a genetic recombination technique, and some amino acids such as these. Any of the same compounds such as synthetic peptides having an acid sequence may be used.
  • the above-mentioned recombinant TNF is prepared by a conventional method, for example, human.
  • a vector containing TNF or a gene encoding the same is prepared, a host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is cultured to obtain an expression product. It can be manufactured by refinement. Examples of the microorganism used as the host include E. coli. the above In gene recombination technology, TNF can also be obtained by transforming animal cells using animal cells instead of microorganisms and expressing them by culturing them. Here, as the animal cells, for example, C0S cells can be exemplified. In the above-mentioned gene recombination technology, the gene to be used is not particularly limited as long as it is various human cells capable of producing human TNF.
  • the gene to be used is derived from mR ⁇ isolated from the HL-60 cell line. Okayamano Kuig method [Okayama H. and Berg, P., Molecular and Cellular Biology, 2, 161 (1982)] ⁇ Gubra-Hoffman method [GubJLer'V. And
  • TGF- ⁇ and IFN in the site cytokine as the other active ingredient may be various types having TGF- / 3 activity and IFN activity similarly to the above-mentioned TNF.
  • Produced by natural or genetic recombination Recombinant TGF- and IFN produced can be used.
  • IFN may be any of type, ⁇ type, and type a.
  • human TGF- ⁇ or IFN-containing culture supernatant and in vitro purified human TGF- ⁇ or IFN-containing human TGF- or INF produced according to the gene recombination technique are also known.
  • all such synthetic peptides having an amino acid sequence, and the above-mentioned gene recombination technique can be carried out by a conventional method, for example, human TGF-; S or IFN.
  • a vector containing a gene encoding the same effect is prepared, a host cell is transformed with the vector, the resulting transformant is cultured to obtain an expression product, and this is purified. it can.
  • the modification of human TGF-8 or IFN to a part of human TGF-S or IFN or the production of human TGF-3 or IFN derivative can be carried out according to the already known gene recombination technique and according to the above-mentioned literature and publications.
  • IL-1 and -2 are not particularly limited as long as they have each IL activity, as in the above-mentioned TNF and IFN. May be recombinant ILs produced by Further, IL-1 may be either IL-1 or IL-. These are also known in vitro, similar to TNF and IFN.
  • Culture supernatant containing induced human IL ⁇ purified and purified product
  • the production method according to the above-described gene recombination technique may also include, for example, preparing a vector containing human IL or a gene encoding the same, and transforming the host thread with the vector. Then, the resulting transformant is cultured, the expression product is obtained by culturing, and the resulting product is purified.
  • a part of human IL to human IL can be modified, and a method for producing a human IL derivative can be carried out according to a known gene recombination technique and according to the above-mentioned literature and publications.
  • the anticancer agent of the present invention comprises a sitekine and a carbostyril derivative represented by the general formula (1) and Z or a salt thereof, particularly, TNF, TGF-3, IFN, each IL power, and a sitekine selected from the above.
  • the carbostyril derivative and Z or a salt thereof may be administered after being adjusted so as to be contained in an unusual preparation. It is adjusted as separate preparations, and two preparations may be administered. In any case, as is clear from the pharmacological test results described in the Examples described later, one of the site-actin and the carbostyril derivative and Z or a salt thereof have an inhibitory effect on the growth of the other tumor cell.
  • the ratio between the two can be selected from a wide range as appropriate.
  • the amount of cytokine used as an active ingredient is usually 0.1 to 100% as protein per day per adult; about g Z body , preferably 1 to
  • the compound of the general formula (.1) is usually about 3 mg Zbody to 180 mg per day, preferably about 1 Omg per day.
  • Z body ⁇ 3 more detail 0 0 mg Z bod y about may be selected from the range o, the TNF-alpha within the rhino Bokuryokui down, - day 1 X 1 0 2 units Z bod y ⁇ 1 X 1 0 7 units Zbody about, like properly in 1 X 1 0 units Zbody ⁇ 1 X 1 0 6 unit / body about the desired arbitrary used in an range.
  • active ingredient amount per day for an adult when its clinical use is typically 1 X 1 0 Units / body ⁇ 1 X 1 0 7 units
  • IFN IFN- a, IFN- ⁇ or IFN- ⁇
  • the amount of active ingredient per day for an adult is generally 1 X 1 0 5 units Zbody ⁇ 1 X 1 0 9 units Zbody about, good ⁇
  • the daily amount of the active ingredient for an adult is generally about 0.01 zg Zbody to 100 ⁇ g / body, preferably about 0.1 l / zg / body to 10 ⁇ g Zbody. It is desirable to set it within the range.
  • the daily amount of the active ingredient for an adult is generally about 0.028 g Z bod y ⁇ 280 / g Zbody, preferably 0.28 // g Zbody 28 / / g Z b. It is desirable to set the range to about dy.
  • the daily dose for adults is generally in the range of about 0.1 l / g Zbody to 100 g body, and preferably in the range of about 1 / zg / body to 100 g / body.
  • the amount of the active ingredient per day for an adult is generally in the range of about 0.4 / g body to 400 ⁇ g / body, preferably about 4 g Zbody 40 // g / body. It is desirable that
  • TNF-a, TGF—, LT, IFN, and IL-1 to IL-12 all interact with the compound of general formula (1) to inhibit tumor cell proliferation and induce cell differentiation.
  • the compound of the general formula (1) is used at a clinical dose commonly used in this field. In such a case, the clinical dose normally used for each of the site cytokines can be reduced to about 1 to 1 Z 1 to 9 to 10 times.
  • TNF-H, IFN-, IFN-S, IFN-A, I, L-11, IL-2, etc. should be administered in the lowest possible dose within the above-mentioned effective dose range from the viewpoint of avoiding the above-mentioned side effects. Is preferred.
  • the compound of the general formula (1) in the anticancer agent comprising the compound of the general formula (1) of the present invention and T N- ⁇ as active ingredients
  • the administration ratio of TNF to ⁇ is not particularly limited as long as both are used within the above-mentioned ranges of the amounts of the active ingredients, and may be appropriately selected from a wide range.
  • the compound represented by the general formula (1) is used.
  • (Mg Zbody) ⁇ NF-a (unit / body) is 5 x
  • the dose ratio is generally from 0.015 to the compound of the general formula (1) (mg / body) / TGF- ⁇ ( ⁇ g / body).
  • the administration ratio is generally (1) compounds of (mg / body) ZIFN (Unit Zbody) about 1 0 1 to 1 0 7, is properly preferred to rather further preferred about 1 0 one half to one 0 6 1 0 one 3 - Desirably, the ratio is about 10 ".
  • the administration ratio is preferably the same as that for TNF- ⁇ .
  • the administration ratio of the compound of the general formula (1) to IL-12 is such that the compound of the general formula (1) (mg / body) / IL-2 (mg / body) is i. 1 ⁇ ;!. 8 x 1 0 7 degree favored properly 1. 8 xl 0 2 ⁇ l . 8 x 1 0 6 mm, further preferred properly 1. and 8 xl 0 3 ⁇ l. 8 x 1 0 " degree It is desirable to do it.
  • the anticancer agent of the present invention also includes those containing a carbostyril derivative of the general formula (1) and retinoid as active ingredients.
  • the retinoid used together with the carbostyril derivative of the general formula (1) includes various derivatives of vitamin A (retinoyl) including retinoic acid produced from vitamin A in the body. Included.
  • Examples include, in addition to retinoic acid, retinols, retinal, retinyl esters, and known synthetic homologues of vitamin A.
  • the ring in the homolog may be an aromatic ring or a heteroaromatic ring, and the side chain and the terminal group may be optionally substituted, oxidized and reduced, and the alkali metal and alkaline earth of retinoic acid.
  • Metal salts are also included in the above retinoids. Specific examples of such are etretinate, iso-retretinoin
  • isotretinoin, 13-cis retinoic acid) , poly play phosphate, poly play phosphate derivative (E_ 5 iie), all one transformer one retinoic acid (g retinoic) or the like can be exemplified.
  • Methods for producing the above retinoids are known.
  • retinoid derivatives are disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 61-275265, 61-275265, and It can be manufactured with reference to Japanese Patent Publication No. Sho. Vitamin A deficiency can cause abnormal differentiation, but in 1925 Alba and
  • retinoic acid produced several derivatives of vitamin A and demonstrated that retinoic acid suppresses chemical carcinogenesis in mouse skin. Ft ⁇ "Bollag, W., Eur. J. Cancer-, 8 , 689 (1972)]
  • the retinoide exhibits a vitamin A-like effect without causing toxic symptoms unlike oral administration of vitamin A, and is effective against various skin diseases and cancers. It has been reported that retinoic acid is expected to have an effect, has a certain degree of differentiation ability against many cancer cells such as HeLa cells, malignant melanoma cells, etc., and has an anticancer effect.
  • Retinoic acid which has the ability to differentiate cancer cells as described above, is one of the molecules that suppresses its development, and research on cancer treatment and its relationship with retinoic acid are notable. Much research has been done, and clinical trials have been made [Iwao Hiratsuka et al.
  • the anticancer agent of the present invention using the above-mentioned retinoid is prepared so that at least one of the carbostyril derivative and its salt and the retinoid are contained in a single preparation as in the case of using the above-mentioned cytokine. It is also possible to formulate each of these separately and use both formulations. In any case, the combination ratio (combination ratio) of the two can be appropriately selected from a wide range.
  • the retinoid as an active ingredient is usually selected from an amount of about 0.01 to about 0 mg Zkg per day, and is used in combination with this.
  • the carbostyril derivative (and salt thereof) of the general formula (1) is usually about 3 to 1800 mg Z body weight per adult person per day, preferably about 10 to 10 mg / day.
  • the amount should be selected from the range of about 300 mg / body weight.
  • any of the above-mentioned retinoids such as retinoic acid and the compound of the general formula (1) reciprocally enhance tumor cell growth inhibitory action and cell differentiation inducing action.
  • the compound of the general formula (1) is used at a clinical dose commonly used in this field, the normally used clinical dose of retinoid is about 110 to 9 times 10 times. Can be reduced. From the viewpoint of avoiding the above-mentioned side effects, it is preferable to administer retinoid in the lowest possible dose within the above-mentioned effective dose range.
  • the administration ratio of the compound of the general formula (1) and the retinoid in the anticancer drug containing the compound of the general formula (1) and the retinoid of the present invention as the active ingredients is such that both are within the above-mentioned amounts of the active ingredients.
  • the compound of the general formula (1) (mg / body) and the retinoide (mg / body) are o.
  • the anticancer agent of the present invention is used in various administration forms commonly used in this field according to the purpose of use.
  • solutions, emulsions, and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood.
  • human serum albumin which is usually L-type amino acid and / or saccharide, and a surfactant are used, whereby the active ingredient, especially cytokin, for example, TNF — A, TGF— S, IFN— HI, IFN—, IFN-a, IL-11, LT, IL-2, IL-13, IL-4, IL-5, IL-6 IL-17, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 And the stability of IL-112 can be improved.
  • cytokin for example, TNF — A, TGF— S, IFN— HI, IFN—, IFN-a, IL-11, LT, IL-2, IL-13, IL-4, IL-5, IL-6 IL-17, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11
  • the stability of IL-112 can be improved.
  • the sugar is not particularly limited and includes, for example, monosaccharides such as glucose, malnose, galactose, and fructose; sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol; Disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, and polysaccharides such as dextran and hydroxypropyl starch can be used. These can be used alone or in combination of two or more. Among them, sucrose, mantoose, mannitol, inositol, dextran and the like are particularly preferred.
  • the surfactant is not particularly limited, and any of an ionic surfactant and a nonionic surfactant can be used. Among them, a polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester-based surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether Surfactants such as glycerides, sorbitan monoacyl esters, and fatty acid glycerides can be preferably used.
  • the added amount of the above saccharides is TNF itself or its derivative (TNF-active substance), TGF- ⁇ itself or Is the derivative thereof (TGF-; 5 active), LT itself or the derivative thereof (LT active), IFN (IFN- ⁇ , IFN- or IFN- ⁇ itself or the derivative thereof (IFN active), IL (1) itself or the aforementioned derivative (IL-11 active), IL-2 itself or its derivative (IL-12 active), IL-3 itself or its derivative (IL-13 active) IL-14 itself or a derivative thereof (IL-14 active), IL-5 itself or a derivative thereof (IL-5 active), IL-16 itself or a derivative thereof (IL-6 activity) ), IL-7 itself or its derivative (IL-17 active), IL-18 itself or its derivative (IL-8 active), IL-9 itself or its derivative (IL-19 active) IL-10 itself or its derivative (IL-10 active), IL-11 , Or its derivative (IL-11 active) and IL-12 or its derivative (IL-112 active) in each case, about 0 More than O lmg, preferably about
  • the range is preferably about 0.001 to 0.1 mg. That's right.
  • the amount of human serum albumin to be added is about 0.001 mg or more per l ⁇ g of each of the above-mentioned active substances, preferably about 0.01 to 1 mg. It is appropriate to use about 0.01 to 10 mg of the amic acid per 1 / zg of each of the above-mentioned active substances (the total amount thereof when two or more kinds are mixed).
  • the amounts of the compound of the general formula (1) and the cytokine or retinide contained as an active ingredient in the pharmaceutical preparation of the present invention are not particularly limited, and are appropriately selected in a wide range, but are usually selected from a wide range. It is appropriate that the total amount of the active ingredients in the product is in the range of about 1 to 70% by weight, preferably about 1 to 30% by weight.
  • the anticancer agent of the present invention can be the same as a usual pharmaceutical composition of this kind, and may optionally contain other pharmacologically active ingredients and components commonly used in pharmaceutical preparations.
  • ordinary sulfur-containing reducing agents are preferable from the viewpoint of further increasing the stabilization of site cytokines such as TNF-active substances.
  • Specific examples of the sulfur-reduced sulfur include cystine, peracetyl homocystin, choctic acid, thioglycolic acid and salts thereof, thioethanolamine, thioglycerol, sodium thiosulfate, and the like.
  • Thiolactate, dithiothreitol, Preferable examples include relatively mild reducing agents such as glutathione. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of these additives is not particularly limited, but is preferably about 0.001 mg or more, preferably about 0.01 to about 0 mg L per 1 g of the site-active inactive substance (when two or more kinds are used in combination). Is the total amount of them).
  • the anticancer agent of the present invention is suitably made isotonic with a buffer to form a stable isotonic preparation.
  • a buffer used here include, for example, typically sodium citrate monocitrate, sodium citrate-sodium phosphate, acetic acid-sodium acetate, and citrate.
  • various buffer solutions such as borax having a pH of about 4 to 8, and preferably about 5 to 6 are preferable.
  • the anticancer agent of the present invention comprises, for example, usually a pharmacologically effective amount of a TNF- ⁇ active substance, a TGF-active substance, IFN (IFN- ⁇ ,
  • IF ⁇ - or IF ⁇ - ⁇ Active, L ⁇ active, IL-11 active, IL-2 active, IL-13 active, IL-14 active, IL-5 active, IL-6 Activator, IL-17 Activator, IL-18 Activator, IL-19 Activator, IL-10 Activator, IL-11 Activator or IL-11 Activator and ⁇ ⁇ or Retinoid, General Formula A suitable pharmaceutical preparation carrier is blended together with the compound represented by (1) and the above-mentioned specific compounding ingredients, and the composition is adjusted to the form of a pharmaceutical composition.
  • any excipient or diluent such as a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant and the like which are commonly used for adjusting the preparation according to the use form can be used.
  • the form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is an effective form containing the active ingredient, and may be a solid preparation such as tablets, powders, granules, and pills. It may be in the form of an injection such as a suspension or an emulsion. In addition, these can be dried products which can be made liquid by adding an appropriate carrier before use. Any of these pharmaceutical compositions can be prepared according to a conventional method.
  • compositions comprising a cytokine as an active ingredient of the anticancer agent of the present invention, for example, TNF-, and a carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, each of the active ingredients is a single ingredient. May be administered separately in the form of two drugs, or they may be combined in the same preparation and administered as a single drug.
  • cytokine is preferably used as a pharmaceutical preparation in the form of an injection containing the active ingredient as an active ingredient.
  • the carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, which is one of the active ingredients of the present invention can be administered, for example, orally or parenterally by any of the conventionally known administration routes. Can be administered in a controlled manner. At present, oral administration is preferred, and the production of the above oral and parenteral pharmaceutical preparations is disclosed in Japanese Patent Publication No. 1-41128. This can be done with reference to the description.
  • the administration method of the pharmaceutical preparation thus obtained is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, sex, other conditions, and the degree of disease.
  • a suitable administration route according to the form of the pharmaceutical composition for example, a pharmaceutical preparation in the form of an injection is administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration, etc., and in a solid form!
  • Pharmaceutical formulations can be administered orally or enterally.
  • the administration method includes, for example, orally administering a carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, which is one of the active ingredients of the present invention, or administering an intravenous or intramuscular pharmaceutical preparation in the form of an injection.
  • the above pharmaceutical preparation in the form of an injection containing TNF-, TGF-, IFN-a, IFN-IFN- ⁇ , LT, IL-1, IL-16, etc. is intravenously, intramuscularly, subcutaneously, or intracutaneously. It can also be administered by internal administration or the like.
  • the active ingredient of the anticancer drug of the present invention, a potent rubostyryl derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof and a retinoid may be combined in the same preparation and orally administered as a single preparation. You can also.
  • the administration can be divided into once a day or three to four times a day, and the pharmaceutical preparations containing the active ingredients can be administered simultaneously or separately at different times. Further, the combination preparation of the active ingredient of the present invention can be administered once a day or divided into three to four times a day.
  • the carbostyril derivative of the general formula (1) and / or a salt thereof which is the anticancer agent of the present invention or one of the active ingredients, can be used as a chemotherapeutic agent for cancer regardless of the preparation form or administration route.
  • it can be used in combination with various known anticancer drugs or its active ingredient compounds, and can also be used in combination with conventionally known radiation therapy or hyperthermia.
  • the anticancer agent of the present invention has excellent anticancer activity due to the synergistic action of the carbostyril derivative of the general formula (1) and Z or a salt thereof with cytokine and Z or retinoic if as described above.
  • the effect of the above-mentioned chemotherapeutic agent or radiation therapy used together can be further promoted, and the synergistic effect of the combined use with the above can be exerted. Therefore, even when the amount of the chemotherapeutic agent used in combination is considerably smaller than the normally used effective amount, a sufficient cancer therapeutic effect can be obtained, whereby the known chemotherapeutic agent such as an anticancer agent or the like can be obtained. This is extremely advantageous because it can reduce the side effects seen in the implementation of various treatment methods.
  • chemotherapeutic agents examples include 5-fluorouracil (5-1FU, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), mitomycin (Mitomycin-C, manufactured by Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), and endoki.
  • 5-fluorouracil 5-1FU, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
  • mitomycin Mitomycin-C, manufactured by Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.
  • endoki examples include Sun (Endoxaii, manufactured by Shionogi & Co., Ltd., Toyomicin, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.), etc.
  • site cytokines particularly TNF-, TGF- ⁇ , IFN (IFN-, IFN-yS or IFN-a), LT, IL-11, IL-2, IL-2, IL-13, IL-4. IL-5. IL-6. IL-7. IL-8.
  • IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 and Z or retinoid and general formula (1) When combined with a carbostyril derivative and / or a salt thereof, the antitumor activity of each is remarkably enhanced, the effect of promoting cell differentiation induction is exerted, and TNF-a, TGF- ⁇ , IFN ( IFN- ⁇ , IFN- or IFN-a),: LT, IL1, IL-2, IL-3, IL-4 IL-15, IL-16, IL-17, IL-7, IL-8, IL-9, Even at low doses where IL-10, IL-11, IL-12, and retinoid alone do not exert their antitumor effects, they have an inhibitory effect on tumor cell growth and cell proliferation. Induction of differentiation An anticancer effect such as advancing effect can be obtained. As a result, it becomes possible to drastically reduce the doses of various site cytokines and retinoids and to reduce the side effects.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of testing the cell growth inhibitory effect of the anticancer agent of the present invention on human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) according to Pharmacological Test Example 3.
  • FIGS. 2 to 5 show the results of the test of the effect of the anticancer agent of the present invention on the morphological changes (induction of differentiation into macrophage system) of HL-60 cells performed in accordance with Pharmacological Test Example 4.
  • 3 is a photograph replacing a drawing, showing a morphology (microscopic observation of the cells after Giemsa staining).
  • Test Example 1 each of the above test compounds was dissolved in 1N hydrochloric acid, diluted with FCS (fetal bovine serum, manufactured by Gibco) to prepare an lmgZml solution, and the solutions were added to 10% FCS. Addition 1?] ⁇ Add to 1-164 medium (FLOW), neutralize with 1NNa0H, and culture medium only, to each concentration of 10 and 30 zg / m1 Prepared and used.
  • FCS fetal bovine serum, manufactured by Gibco
  • each of the above test compounds was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS 0) to prepare a 10 mg Zml solution, and the solution was added to 10% FCS-added RPMI-164 0 medium (manufactured by Flow) and adjusted to 1.88, 7.5 and 30 ⁇ g Zm1 for use.
  • DMS 0 dimethyl sulfoxide
  • FCS-added RPMI-164 0 medium manufactured by Flow
  • retinoic acid (all-trans * retinoic acid, manufactured by Sigma) is added with 10% FCS.
  • RPMI - 1 6 4 was diluted with 0 medium was utilized in preparing the 1 0- ° and 1 0- 7 M concentration.
  • TNF-H (recombinant human TNF-H obtained from expression in E. coli, specific activity: 2 X 1 0 7 units mg, manufactured by Zenzaimu Co.), 1 0% FCS added RPMI - diluted with 1 6 4 0 medium was utilized in preparing the 1 0 0 0 Units / m 1 concentration.
  • HL-60 is a human leukemia cell line established by Robert Gallo et al.
  • the above cells were prepared at 1 x 10 cells to Zm1 and stained with fluorescein isocyanate (FITC) -labeled anti-human CD11 antibody (Mol, manufactured by Cole Yuichisha), followed by flow cytometry. Fluorescence intensity was measured by Prof. Inore II (manufactured by Coulter Inc.) using the Tri-method.
  • the inhibitory effect on cell proliferation in each of the AZ group, ATRA group and the combination group obtained as described above was calculated based on the results of the control group as the percentage of increase / decrease in cell proliferation inhibition relative to the reference value (0) ( %) Is shown in Table 1.
  • the results obtained for the CD11 expression level are shown in Table 2 as relative values with respect to the control group with the CD1,1 expression level of 100%. table 1
  • each test compound at a predetermined concentration to each well, and add RPMI — 1640 medium supplemented with 10% FCS containing 100 units / ml of TNF (labeled +). ) or without the addition (first and display), and cultured 3 7 ° C, 5% C 0 2 3 days below.
  • DMS 0 without addition of the test compound
  • 100 units of TNF- were added.
  • a group for culturing in the same manner was set up with (+) or without (1) adding Zml.
  • MTT reagent [3- (4,5-dimethyl-12-thiazoyl) -12,5-divinyl-12H-terazolyl bromide (Wako Pure Chemical Industries) was added to each well. Dulbecco's medium to a concentration of mg / m 1
  • PBS (_) manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • PBS (_) manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • SDS-containing 0. 0 1 NHC 1 solution by 1 0 0 // 1 each Uweru and cultured overnight at further 3 7 ° C, 5% C 0 2 presence.
  • Test compound «0. Compound ⁇ wriggness (/ ml)
  • control In the absence of TNF- ⁇ (1), the value of the DMS-added group (control) is shown as a percentage (%) of increase / decrease in growth inhibition with respect to (0).
  • Pharmacological test example 3 Efficacy test on human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells)
  • AZ 6- [4- (3,4-dimethoxybenzyl) -1 1-piperazinyl] -13,4-dihydrodynamic rubostilil (hereinafter referred to as "AZ") as a test compound was dissolved in 1N hydrochloric acid. After dissolution, the solution was diluted with FCS (fetal calf serum, Gibco) to prepare a 1 mg / ml solution. The solution was added to RPMI-164 medium (Flow) with 10% FCS, neutralized with 1N-NaOH, and adjusted to a concentration of 30 / g1 before use. The pharmacological test was performed using this in combination with various site strengths adjusted as described below.
  • FCS fetal calf serum, Gibco
  • the TNF-alpha, recombinant human obtained by expressing the E. coli TN: F- alpha (specific activity 2 X 1 0 7 units Zm g, undercard manufactured I beam, Ltd.) was used.
  • the TNF cells were diluted with RPMI-164 medium supplemented with 10% FCS to adjust to 1000 units Zm1.
  • the human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) are the same as those used in the pharmacological test example 1.
  • Zm l containing the group - was added separately, respectively it into four groups of (AZ + TNF group), and cultured 3 7 ° C, 5% C 0 2 6 days under. After the culture, the cell suspension in each well was removed, mixed with a phosphate buffer containing 0.2% Tribumble (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the number of unstained viable cells was counted under a microscope.
  • Figure 1 shows the results.
  • the vertical axis represents the number of viable cells counted and (XI 0 5 pieces Zm 1).
  • the A ⁇ + TNF- ⁇ group of the present invention showed a remarkable cell growth inhibitory effect as compared with the control group, the AZ group and the TNF- ⁇ group.
  • the TNF- ⁇ group promoted the early induction of differentiation into macrophage as a morphological change.
  • HL-60 cells were cultured in the same manner as in Pharmacological Test Example 3, and the cell concentration was adjusted to 5 x 1 ( ⁇ cells Zml).
  • the control group AZ30 / g Zm Group l, TNF- ⁇ 1000 unit, 4 groups, Zm1 group and AZ + TNF- ⁇ combination group, were cultured for 3 days After culturing, each cell suspension was transferred to an Eppendorf tube and placed in a 0.2 ⁇ l tube. After staining with a phosphoric acid buffer solution containing% trypan blue, the number of viable cells was counted using a hemocytometer.
  • the cells were adjusted to 1 X 1 0 7 cells / ml, Part 1 0 0 ⁇ 1 has fluorescein isocyanate (FITC) -labeled anti-human CD11 antibody (Mo1; manufactured by Coulter Inc.) 5 ⁇ 1 or FITC-labeled anti-human CD14 antibody (Leu ⁇ 13, (Kutton Dinson) (201) was added, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes in a dark place. After the reaction, the plate was washed twice with PBS (phosphate buffer, Nissui Pharmaceutical) containing 0.1% BSA (bovine serum alpmin, manufactured by Sigma), and finally suspended in 5001. After that, the fluorescence intensity was measured by a flow cytometry method using Prof. Inore II (manufactured by Coulter Inc.).
  • FITC fluorescein isocyanate
  • the cell line (A375S2 strain: ATCCCRL1872) obtained by the subculture was washed twice with PBS ('solution (Nissui Pharmaceutical)) and 0.05% After detaching the cells with PUSIN (FLOW) and pipetting, Eagle's-MEM (E-MEM) medium (Nissui Pharmaceutical) + 10% FBS (Gibco)
  • E-MEM Eagle's-MEM
  • FBS FBS
  • the cell line (A375S2 strain: ATCCCRL 1872) obtained by the subculture was washed twice with a PBS (—) solution (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), % After detaching the cells with Tribcine (Fluo), the cells are removed by pipetting into a culture solution of E-MEM medium (Nissui Pharmaceutical) + 10% FBS (Gibco). Suspended. The cells which had been centrifugally washed at 25 ° C, 1200 rotations and 5 minutes (05PR-22, manufactured by Hitachi, Ltd.) were suspended again in the same culture solution. After staining with 0.2% trypan blue (Wako Pure Chemical Industries) solution, The number of viable cells was counted under an optical microscope (BH-2, manufactured by Olympus Optical) and diluted to 2 ⁇ 10 4 cells Zm 1.
  • 0, 1, 3, 1 0 , 3 0 g Zm plus l become amounts of AZ including A 3 7 5 S 2 cell suspension (2 X 1 0 4 cells Zm l) by 0. 1 m 1 .
  • ATCCHB 806 is washed twice with PBS (—) solution (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and the cells are detached with 0.05% trypsin (Flow Co.), followed by pipetting.
  • PBS (-) solution (Nissui Pharmaceutical) 0.0 1 111 1 / Uweru each Uweru the Zu' pressurized tut further 3 7 ° (, and cultured for 3 hours in 5% C 0 2 conditions.
  • M indicates the amount of the dye incorporated into the cells of the treatment group
  • C indicates the amount of the dye incorporated into the cells of the control group.
  • the cultured cells were stained for nuclei with Hext 332 58 dye (Hoechst stain kit, manufactured by Flow), and cell proliferation was observed under a fluorescence microscope (Nikon icrophot FXA). The results of the rates are shown in Table 7 below. Table 7
  • TNF — 1 1 x 10 unit Z m 1 wiwin 800.01 mg / m 1 dextran 4 0 15 mgm 1 Cystin O. lmg Zml HSA (human serum albumin) 1 Omg Zml Add each of the above components to the above concentration in a 0.01 M sodium citrate-monocitrate buffer ( pH 6.0), mix, filter the mixture (use a 0.22 zm membrane filter), aseptically dispens 1 ml of the filtrate into vials, and freeze. After drying, an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection was prepared.
  • the preparation (2) When the preparation (2) is used, it is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).
  • HSA human serum albumin
  • LT (TNF— ⁇ ) 1 x 10 "unit / ml twine 800.0.0 1 m / m 1 dextran 400 15 mg / m 1 cysteine O. lmg Zm l HSA ( (Human serum albumin) 1.0 mg Zm 1
  • Each of the above components was added to 0.01 M sodium citrate-monocitrate buffer (pH 6.0) at the above concentrations. The mixture is filtered, the mixture is filtered (using a 0.22 / zm membrane filter), and the filtrate is aseptically dispensed into vials in lml portions, freeze-dried, and prepared for injection.
  • An anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention was prepared.
  • the preparation (4) When used, the preparation (4) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).
  • HSA Human serum albumin
  • the preparation (5) is dissolved in 1 ml of physiological saline, and is used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • HSA Human serum albumin
  • the preparation (6) When used, the preparation (6) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously with or separately from the preparation of the above (1).
  • HSA human serum albumin 1 1, 0 mg / 1
  • HSA human serum albumin 1
  • a concentration of 0.01 M sodium citrate-monocitrate buffer (pH 6.0) mix the mixture, filter the mixture (use 0.22 in membrane filter), aseptically pipette the filtrate into vials 1 ml at a time and freeze.
  • an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection was prepared.
  • the preparation (7) When used, the preparation (7) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • the preparation (8) When used, the preparation (8) is dissolved in 1 ml of physiological saline, and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • Interleukin 20 0.28 gZ m I Low-in 80 00.0 1 mg / m 1 Dextran 4 0 15 mg / m 1 Sistine 0.1 mg / m 1
  • HSA human serum albumin
  • the preparation (9) When used, the preparation (9) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • Interleukin-one 40 ⁇ g / m I-win 800 0 .1 m / m 1 Dextran 4 0 15 mg Zm 1 Sistine 0.1 mg / m 1
  • HSA Human serum albumin 1.0 mg / m1
  • the above components were added to a concentration of 0.01 M sodium citrate-monocitrate buffer (pH 6.0), mix, filter the mixture (0.22; use zm membrane filter), and aseptically dispense the filtrate into vials in 1 ml portions. Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection.
  • the preparation (10) When used, the preparation (10) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • HSA human serum albumin
  • the preparation (11) When used, the preparation (11) is dissolved in physiological saline (lm1) and used simultaneously or separately with the preparation (1).
  • HSA human serum albumin
  • the preparation (12) When used, the preparation (12) is dissolved in physiological saline (ImL) and used simultaneously or separately with the preparation (1).
  • Interlokin-1 75 0 / g ⁇ m 1 Twin 8 0 0 .0 1 mg / m 1
  • Dextran '4 0 15 mg / m 1
  • HSA Human serum albumin
  • the preparation (1'3) When used, the preparation (1'3) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1). (14)
  • Interleukin 1 85 0 ⁇ g m 1 Tween 800 0 1 0 m / m 1 Dextran 4 0 15 mg m 1 Sistine 0.1 mg Zm 1
  • HSA human serum albumin
  • the preparation (1.4) is dissolved in physiological saline 1 in 1 and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • Interleukin 95 0 ⁇ g Zm 1 Wien 800 0 1 0 mg / m 1
  • Dextran 4 0 15 mg / m 1
  • HSA human serum albumin
  • the preparation (15) When used, the preparation (15) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • Interleukin 1 105 ⁇ g / ⁇ 8 800 80.0.1 1 mg / m1 Dextran 4 0 1 5 mg / m1 Sistin 0.1.1 mg / m1
  • HSA Human serum albumin 1.0 mg Zm1
  • the above components were added to the above concentrations in 0.01 M sodium citrate-monocitrate buffer (p H6.0), mix, filter the mixture (using a 0.22 / m membrane filter), aseptically dispens 1 ml of the filtrate into vials, and freeze-dry.
  • an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection was prepared.
  • the preparation (16) When used, the preparation (16) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1). It is.
  • Interleukin 1 150 g / m 1 Wien 800 0 1 0 mg / m 1 Dextran 4 0 15 mg g m 1 Sistine 0.1 mg / 1
  • HSA Human serum albumin
  • the preparation (17) When used, the preparation (17) is dissolved in physiological saline (1 ⁇ 1) and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • Interleukin 1 2 0 ⁇ g / m I Wien 800 0 1 0 mg / m 1 Dextran 4 0 15 mg / m 1 Sistine 0.1 mg- / m I
  • HS ⁇ human serum albumin 1.0 mg / m I
  • HS ⁇ human serum albumin 1.0 mg / m I
  • a 0.01 M sodium citrate buffer solution pH 6.0
  • the filtrate was aseptically dispensed into vials in lml portions and freeze-dried to obtain the active ingredient of the anticancer agent of the present invention in the form of a preparation for injection.
  • An anticancer agent containing one was prepared.
  • this preparation (18) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).
  • the core is treated with varnish and talc is sprayed to prevent moisture absorption.
  • An undercoat layer is coated around the core. Apply a sufficient number of varnish coats for internal use. In order to make the tablet completely round and smooth, apply an additional subbing layer and a smooth coating. Color coating until the desired color is obtained Overturn. After drying, the coated tablets are polished to prepare a key pad of uniform gloss.
  • the anticancer agent of the present invention is useful as a therapeutic agent for cancer based on its unique antitumor effect and ability to induce cell differentiation.

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Description

、
1
明 細 書
制 癌 剤
技 術 分 野
本発明は、 医薬上有用なサイ トカイ ン及び Ζ又はレチ
5 ノィ ドとカルボスチ リル誘導体とを配合した制癌剤に関 し、 殊にヒ ト腫瘍壊死因子一 αと下記一般式 （ 1 ) で表 されるカルボスチ リ ル誘導体及び Ζ又はその塩とを有効 成分と して含有する制癌剤に関する。
刺激を受けたリ ンパ球や単球、 マク ロフ ァージが生物
10 学的な活性を有する様々な蛋白性因子を産生し、 それら を介して免疫系の応答の調節 （開始—増殖—抑制—終了） が修飾されるこ とが次第に明らかとなり、 之等生体の免 疫応答、 炎症反応、 造血反応等の生体機能の発現を制御 する蛋白性因子をサイ トカイ ンと総称する'よ う になって lc き す- [Balkwill.F.R. ,et al - , Immunol .Today, 10 , 299
(1989)] 。 更に、 之等サイ トカイ ンの作用は免疫系に限 らず、 生体の様々な機能に影響を及ぼし、 生体の発生、 分化、 恒常性維持や病体生理と も関連深いこ とが明らか にされ、 多数のサイ トカイ ンが見出されている。 現在、 20 該サイ ト力イ ンはその作用の類似性を基に、 幾つかのグ ループ、 例えばイ ンターフ ヱ ロ ン （ I F N) 、 イ ンタ一 ロイキン （ I L) 、 コロニー刺激因子 （ C S F ) 、 腫瘍 壊死因子 （TN F) 、 腫瘍増殖因子 （T G F) 等に分け られており、 之等各グループ内のサイ トカイ ンもそれら の持つ作用により更に細分されている。 之等サイ トカイ ン中には、 共通した作用を示すものが少なく なく、 例え 5 ば I L— 1、 I L一 2、 I F N、 T N F等はいずれも発 熱性ゃ抗腫瘍活性があるとされている。
之等の内で I L一 4は、 T細胞、 N K細胞、 単球 · マ クロファージ等に作用し、 I L一 5、 I L— 6、 I L - 7はいずれも実験腫瘍系で特異的キラ一 T細胞を誘導す0 るとされている [臨床医， 11(10)5(1991) ] 。 尚、 I L は、 現在 I L— 1〜 I L一 1 2まで知られており、 その 多くが糖鎖を有し、 細胞の増殖、 活性化、 分化誘導作用 を有して.いる。
T ]vT J? Tumor Necrosis Factor ) は、 1 9 ァ 5年に5 米国のカーズゥェゾレら [Cars ell, E . A. , et al . , Proc - Natl.Acad.Sci. 'U.S.A.， ，3666 (19了 5) ] により、 予め
' B C Gで感染させ、 次いでェン ド トキシンで処理したマ ウスの血清中より、 移植した MethA肉腫による癌を壊死 させる生理活性蛋白質と して発見された。 該 T N Fは、 ' 正常細胞を障害せず、 癌細胞を選択的に殺傷する物質と して抗腫瘍剤と して期待された。 またこれは上記抗腫瘍 作用のみならず、 免疫 · 神経生理等多岐に渡る作用を有 することが報告されている。 例えば、 脂肪球の リ ポプロ ティ ンリパーゼ （ L P L ) 活性を阻害して、 血中 ト リ グ リセ リ ドを高め、 これがカケクチン作用と してよ く 知ら fx
れている [Beutler.B. ,et al . , ature, 316 , 552-554
5 (1985)] 。 その他、 線維芽細胞に対する増殖作用 [Peetre, C . , et al . , J.Clin. Invest . , 78 , 1694-1700 (1986) ] や、 I L - 1 [Kurt-Jones, E. A. ,et al . , J . Immunol - , 139, 2317-2324 (1987 ) ] ヽ — g
[Kohase.M. , et al. , Cel 1 , 5 , 659-666 ( 1986 ) ] 、 C S F !0 [Broudy , V. C . , et al . , Proc . atl . Acad .Sci..U.S.A. ,83 7467-7471 (1986) ] ヽ コラゲナーゼ、 プロスタグラ ンデ ィ ン [Dayer, J,M. ,et al - , J. Exp. Med. , 162 ，2163 - 2168
(1985)] 等の産生刺激、 血管内皮細胞における H L A抗 原の発 促 p [Collins, T. ,et al . , Proc. Natl .Acad. 15 Sci ..U.S.A. , 83, 446-450 (1986)1 ヽ プロテオグリ カ ンの 合成抑制と吸収活性 [Saklatvala， J-，et al . , Nature, 322 ,547-549 (1986)1 等の作用を有するこ とが明らかに されている。
一方、 L T ( リ ンホ トキシ ン ； Lymphotoxin ) は、 リ 20 ンパ球による細胞障害作用のメ デイ エ一夕一と して発現 されたが、 T N Fと分子構造が類似し、 その作用もよ く 似ているこ とが判り、 T N F— （ T N Fを T N F— ひ と呼ぶ） と呼ばれるようになった。 該 L Tはヒ ト T細胞 ハイプリ ドーマより遺伝子組換え法により作製する方法 が知られている [特開昭 6 4— 6 2 9 8夸、 特開昭 6 3 一 8 3 9 8号、 特開昭 6 3 — 8 3 9 9号、 特開昭 6 2— 1 5 1 1 8 2号公報等参照] 。
TN F (T N F— α) は、 ア ミ ノ酸 1 5 7個からなる 分子量約 1 7 0 0 0のポリペプチ ドであり、 その遺伝子 はシライ らの方法、 即ち動物 （家兎） の血中から T N F 蛋白を抽出し、 その一次構造を決めた上で、 対応する c D NAを正常ヒ ト細胞遺伝子ライブラ リ ーから選出す る方法により クローニングされた [Shirai'T.，et al. , Nature, 313 , .803-806 (1985 ) ] 。 TN F i D NAのクロ —ニングは、 種々の方法が知られている [宗村庚修ほか、 癌と化学療法' 11(1) 160-162 (1985) ； 特開昭 6 0—
1 8 5 7 9 9号公報 ； 特開昭 6 0— 2 3 2 0 9 7号公報 等参照] 。 更に他の方法と して、 ヒ ト単球由来白血病細 胞株 （H L 6 0， U 9 3 7 ) の培養上清から T N F蛋白 を抽出し、 その一次構造に基き D N Aプローブを作製し、 同プローブから得た c D N Aを選ぶ方法等 [Fennica，D.， et al..Nature, 312 , 724 -了 29 (1984) ; Wang , A . W . , et al - , Science. 228 .149-154(1985)； Marmenout', A . , et al - , Eur, J..Biochem. ,152, 515 - 522〔1986) ] も知られている 0 また、 遺伝子組換え技術による ヒ ト T N F変異体の製造 について,は、 特開昭 6 1 - 2 9 4 0 0 0号公報及び特開 昭 6 3 — 1 1 9 6 9 2号公報に記載されている。
上記遺伝子組換え法により、 T N Fの大量生産が可能 となり、 悪性腫瘍に対して臨床試験が行なわれたが、 そ の効果より も多く の副作用、 主と して悪寒、 戦慄、 発熱 血圧低下、 血小板減少、 肝機能障害等が問題となり、 中 でも血圧低下力く M T D (maximal torelance dose を規 定する因子となった （ヒ ト T N F 5 0万単位， 0 . 2 5 m g ) 。 また、 効果の点でも動物実験で見られたような 著効例は'少なく 、 全身投与では 5 %程度の反応例が認め られるにすぎなかった [田ロ鐡男， 癌と化学療法， 1 ， 3491-3497 (1986) ;Blick,M. ,et al . , Cancer Res.，47，
2986-2989 (1987) ] 。 之等は当初報告された副作用の影 響で、 投与量が抗腫瘍効果の期待できる量をはるかに下 回っていることが原因とされている。
T G F - yS [腫瘍化増殖因子一 3 (transforming growth factor - ^ ) ] は、 細胞の悪性形質転換を起こす 因子と して精製され、 分子量 1 2 . 5 k dの 2本の相同 ペプチ ド'がジスルフ ィ ド結合により架橋された、 分子量
2 5 k dの蛋白質である。 該 T G F — 3は、 また 3 9 1 個のア ミ ノ酸からなる前駆体蛋白質中の 1 1 2個のア ミ ノ酸からなる C末端ペプチ ドが、 プロテア一ゼによって 切新されて生じたものであると報告されている
「Derynck，: . , et al. , Nature, 316， 701 (1985) ] 0 最近、 c D N Aの解析から T G F — ^には、 5つのサブ タイプが存在することが明らかにされた [Kim，S- -:
Experimental Medicine, _7, 55 (1989) ] o 上記 T G F 一 /5は、 その後の研究により正常細胞にも存在し、 これ が多く の細胞種において増殖阻害活性をもつことが明ら かにされ、 該 T G F — ^は生体において広く增殖や分化 の制御因子と して働いていると考えられるようになって ナ- [Massague, J. , Annu . Rev. Cell Biol . , 6, 597-641
(1990) ] 。 その製造方法と しては、 ヒ 胎盤から単離 した c D.N Aに基づき T G F— ^の構造を決定し、 これ より C H 0細胞を用いて組換えヒ ト T G F — を製造す る方法が知られている （米国特許第 48 8 6 747号公 報、 特開昭 6 1— 21 9 3 9 5号公報等 照） 。
I F N (Interferon) は、 ウィ ルス等の刺激を受けた 細胞がつく りだす抗ウィルス物質と して発見された
[Nagano, Y- , et al -， R . Soc . Biol . , 148, 1700 (1954)； I saacs.A. , et al . , Proc . Roy . Soc . B . , 147 , 258 (1957)] o ヒ ト I F Nには、 a、 ^及びァ型の 3 όのタイプが知 られ、 α.型はセンダイウ ィ ルス誘発白血球を産生細胞と して得られ、 分子量が約 1 5 0 0 0〜 2 1 0 0 0で 1 6 6個のア ミ ノ酸からなっている。 型は 2本鎖 R N A誘発線維芽細胞を産生細胞と し、 分子量が
2 2 0 0 0の 1 6 6個のア ミ ノ酸からなり、 ア ミ ノ酸配 列は上記 α型と約 3 0 %—致しており、 その I F N レセ プターも α型と共通である。 7型はマイ ト ジェ ン誘発 Τ 細胞が主たる産生細胞で、 分子量が 2 0 0 0 0及び 2 5 0 0 0の 1 4 6個のア ミ ノ酸からなり、 そのア ミ ノ 酸配列は前記 α型、 型と全く 異なり、 I F Nレセプタ 一も異なっている。 当初 I F Nの作用は動物種特異性が あり、 ヒ ト細胞の大量培養化も困難であつたが、
1 9 8 0,年代に入り、 ヒ ト細胞の大量培養技術が確率さ れたことによ'り、 ヒ ト α型及び 型 I F Nの細胞培養法 による量産も成功した。 その後遺伝子組換え技術を用い た組換え型ヒ 卜 I F Νの量産が可能となり、 臨床応用化 が実現した。 天然型の α型ヒ ト I F Nの量産法と しては ヒ ト急性白血病細胞株中から、 ウィルス誘発による高力 価の 型 I F N産生細胞を用いる方法が、 特開昭 5 4 — 9 8 3 0 7号、 特開昭 5 5 — 4 7 6 2 9号、 特開昭 5 5 — 6 2 0 2 4号公報等に記載されている。 ヒ ト ；β型
I F Nの遺伝子組換え技術を用いた製造法は、 欧州公開 特許出願 8 1 — 2 8 0 3 3号、 欧州公開特許出願 8 1 - 3 2 1 1 3 4号、 欧州公開特許出願 8 1— 3 4 3 0 7号、 ベルギー特許 8 1 - 8 3 7 3 9 7号等に詳述されている。 ヒ ト 7型 I F Nの製造法は、 グレイ らが犬腸菌及び
C 0 S細胞に導入して発現させる方法を報告している
[Gray, P. W. , et al. Nature, 295 , 503-508 (1982)] n ま た特開昭 5 5 - 9 8 1 1 8号及び特開昭 6 1—
2 6 3 9 2 9号公報には、 天然型ァ— I F Nの製造法が 記載されている。 - 上記 ί F Nは腎癌、 多発性骨髄腫、 脳腫瘍、 メ ラノ一 マ及び慢性 Β型肝炎等に対して臨床効果が認められ、 そ の有効率は当初の期待程ではないがいずれも約 2 0 %前 後である。 ァ型 I F Νは α型や ^型に比 して動物実験 での抗腫瘍活性が 2 0〜 1 0 0倍と強い [J-L.Crane，et al . , J.Natl - Cancer Inst. , 61,871(1987)； J.E.Blalock et al - , Cell Immunol . , 9, 390 (1980)] こと力ヽら、 その 効果が期待されたが、 型及び^型と同等であった。 副 作用は各 I F Ν共多く、 特に発熱、 悪寒等のィ ンフルェ ンザ様 ί状を始め、 肝機能障害、 白血球の減少が現れ、 該副作用により、 高用量の投与及び長期投与は困難とさ れている。
I L一 1は、 主に単球やマクロフ ァー から産生され る蛋白性因子で分子量 1 2 0 0 0〜 1 8 0 0 0程度のポ リペプチ ドである [ S . B . izel , et al . , Immunol . Rev . , 63,51-71 (1982)] 。 該 I L一 1 は種々の細胞に働き、 様 々な生物活性を示し、 免疫、 炎症、 造血、 内分泌、 脳神 経等の殆ど全ての生体反応に重要な役割を果たしている 該 I L一 1は、 等電点により p I 5 と 7 2つに分けら れ、 前者はひ型、 後者は 型と呼ばれている
[Oppenheim, J.J. , et al - , Immunol . Today，—7，45 (1986)：
Dinarello, C. A. , Adv. Immuno. , 44 , 153 (1988) ] 0 ァ ミ ノ 酸配列は、 同一型では動物種が違つても 6 0〜 7 0 %と 相同性が高いが、 同一種間でも α型と 型では 2 5 %と 相同性は低い。 また I L一 1は α型、 型共細胞膜の同 一レセプターに結合すると報告されている [Lowenthal, K. ,et al - , J. Exp. Med. , 164 , 1060 (1986) ] . 更に I L 一 1は種々の腫瘍細胞に対して直接的な増殖阻害、 細胞 致^ :活性を示し [ Onozaki , K . , et al . , J . Immunol . , 135 , 3962 (198.5)] 、 また抗腫瘍効果を示すこ とも報告されて いる [ akamura , S . , et al . , Jpn . J - Cancer Res . , 77， 767 (1986)： North, R.J. , et al - , J. Exp. Med. , 168 , 2031 (1988)] 。 I L一 1の内で天然型 I L— 1 は特開昭 6 2 — 1 7 4' 0 2 2号公報に記載の方法により得る こ とがで きる。 遺伝子組換えによる I L _ 1の製造は、 特開昭 6 3— 1 5 2 3 9 8号、 特開平 2— 1 6 7 2 9 8号、 欧 州特許公開第 2 3 7 0 7 3号、 欧州特許公開第
1 8 7 9 9 1号公報等に記載されている。
I L— 2は、 1 9 7 6年モルガン （Morgan) らによつ てレクチン刺激された末梢血リ ンパ球培養上清中に存在 する T細胞增殖因子と して発見された [Morgan，D.A -， et al. 'Science, 193 , 1007-1008(1976)] 0 該 I L一 2 は Τ細胞增殖活性以外にも、 胸線細胞の 裂促進、 細胞 傷害性 Τ細胞の活性化、 Β細胞分化誘導、 ΝΚ細胞活性 化、 L A Κ活性誘導等の活性を持つ 1 3 3個のアミ ノ酸 からなる分子量 1 5 4 2 0の物質であることが明らかと な一た [Taniguchi.T. , et al - , Nature, 302 , 305-310
(1983)] 。 '
天然 I L一 2は、 ヒ ト末梢血リ ンパ球又は他の I L — 2産生細胞ライ ンの培養により製造できる [米国特許 44 0 1 7 5 6号明細書参照] 。 また遺伝子組換え型 I L— 2は、 特開昭 6 1— 7 8 7 9 9号公報に記載の方 法により製造できる。 当初 I L一 2は、 その抗腫瘍活性 を期待して全身投与及び局所投与されたが、 発熱、 全身 倦怠感、 血圧低下、 好酸球增多、 血清ピリルビン値の上 昇等の副作用に比較して、 効果は期待した程ではなかつ た。
I L— 6は、 B細胞を増殖せずに分化を誘導し、 抗体 の産生を促進するサイ ト力イ ンであり、 β細胞分化因子.
Β細胞刺激因子 2 と呼ばれ、 1 9 8 6年にその c D N A 力くク ロ—ニンク、' れた [Hirano , T . , et al . , Nature , 324 ,
73 (1986)] 。 該 I L— 6は 2 1 2個のア ミ ノ酸からなる 5 前駆体から合成されるア ミ ノ酸 1 8 4個 蛋白質で分子 量は 2 1 0 0 0である。 これは Β細胞を始め、 Τ細胞、 マク ロフ ァ ージ、 線維芽細胞等の多く の細胞をマイ ト ジ ェ ン、 I L— 1、 T N F、 I F N― ^、 L P S等により 刺激することにより産生される。 その機能は B細胞の分 10 化、 T細胞の増殖 · 分化、 キラー T細胞の誘導、 急性期 蛋白の誘導、 多能性幹細胞の増殖、 巨核球の分化等種々 知られている [Hirano，T. ,et al . , 治療学， （1)49 - 52
(1990)] 。 その製造法と しては遺伝子組換え法による大 腸菌からの製造法が欧州特許公開第 3 5 1 8 7 6号公報
15 に記載されている。 また Ν末端がプロ リ ンである天然型 I L一 6の遺伝子組換え法による製造法が、 特開平 3 — 1 3 0 0 8 8号公報に記載されている。 上記 I L— 6は 自己免疫疾患との関連及び血小板増加作用が注目され、 また免疫賦活剤との併用による抗癌剤と しての開発も検■*
20 討されている。
I L— 7は、 1 9 8 8年にナメ ン （ Namen ) らにより プレ B細胞の増殖支持能力を持つス ト ローマ細胞が、 増 殖活性を有する液性因子を産生するこ とを見出し、 その 精製、 クロ一ニングにより得られた [Namen, A-E. , et al. , Nature, 333,571 (1988) ；] 。 該 I Lュ 7は骨髄及び 胸腺ス トローマ細胞より産生され、 7 2個のア ミ ノ酸か らなる分子量 8 0 0 0の蛋白で、 その機能と しては B前 駆細胞の増殖 · 分化、 T細胞の増殖 · 分化、 キラ一 T細 胞の活性増強、 L AK細胞の誘導、 単球の活性化等が報 告されている。 その遺伝子組換え法による製造は米国特 許第 4 9 6 5 1 9 5号明細書に記載されている。
I L— 4は、 I L一 6 と同じく免疫系の B細胞を抗体 産生形質細胞に分化させる他、 胸腺 T細胞の分化増殖を 剌激し、 肥満細胞の増殖作用をもつ因子と して、 ノーマ (Noma) ら、 リー （Lee ) らにより ほぼ同時にクロー二 ングされたア ミ ノ酸 1 5 3個、 分子量 1 5 0 0 0〜 1 9 0 0 0の リ ンホカイ ンである [Noma，Y.，et al. , Nature, 319， 640 (1986) ; Lee， F . , et al - , Proc . atl . Acad.Sci..U.S.A. , 83,2061(1986) ] 0 該 I L— 4の製 造法と しては C H 0細胞を利用して発現させる方法が米 国特許第 5 0 3 4 1 3 3号に記載されており、 I L一 4 は感染症、 癌及び自己免疫疾患への適応が考えられてい O
I L一 5は、 抗体を産生する リ ンパ球 B細胞の増殖と 分化を誘導するサイ ト力イ ン （T cell- replacing factor:TRF)と して同定され [Takatsu,K. ,et al . , J. Immunol. , 125 ,2646 (1980) ] 、 該 T R Fが活性化 B細 胞の増殖や分化を促進させるのみならず、 骨髄細胞より 好酸球の増殖分化を誘導するこ と等が明 かにされ [須 田年生， 臨床免疫， 521 (1989)] 、 マウス I L一 5 c D N Aをプロ一ブにしてヒ ト I L— 5 c D N Aが単離 され [ Azuma . C . , et al . , Nucleic Acids■ Res . , 14，
9149 (1986)] 。 該 I L一 5はア ミ ノ酸 1 1 5個からなり 分子量が 4 6 0 0 0 ( 2 3 0 0 0の二量体） のサイ ト力 イ ンであり、 抗原 （ウ ィ ルス、 結核菌等の病原微生物、 アレルゲン等） により産生され、 B細胞の増殖 · 抗体産 生細胞への分化、 好酸球の増殖， 分化、 I L一 2 レセプ ターの発現誘導、 キラ— T細胞の誘導補助等の作用があ る [高津聖志， 治療学， ϋ(1)45-48 (1990)] 。 その製造 法と して.は、 遺伝子組換え法による C H 0細胞からの発 現方法が特開平 3— 2 7 2 9 5号公報に記載されている, I L一 8は、 白血球の 1種の好中球を活性化するサイ トカイ ンと して、 リ ポポ リサッカライ ド （L P S ) 刺激 単球培養上清から分離された。 該 I L一 8は L P Sの他 T N F、 I L— 1、 I L— 3、 GM— C S F等により刺 激されて、 単球の他、 肺胞マク ロフ ァ ージ、 線維芽細胞 P 1 7
' 1 4
上皮細胞、 肝細胞からも分泌される 7 2個のア ミ ノ酸か らなる分子量, 8 0 0 0のサイ 卜力イ ンであり、 松島らに よりその c D NAがクローニングされた [Matsushima， K. ,et al. , J.Exp. ed. , 167, 1883 (1988) ] 0 ¾ I L - 8は好中球遊走能の亢進、 好中球活性化、 T細胞遊走能 の亢進、 好塩基球遊走能の亢進、 好塩基球活性化等の作 用を有し、 リ ウマチ様関節炎等の炎症性疾患との係りが 注目 れている [ West ick, J . , et al . , Immunology
Today, 10 , 146 (1989)； Baggiolini , .， et al.， J.Clin.
Invest. , 84, 1045 (1989) ； 松島綱治， Medical
Immunology, 18, 9 (1989)； B.B.R.C. , 169， 165 (1990)] 0 その大腸菌を用いた大量発現系については、 フル夕らの 方法 [Furuta,R. , et al . , J . Biochem . , 106 ,436 (1989)]
ι
が知られ、 また I L— 8の誘導体べプチ ドが P C T公開 特許第 9 1 0 8 2 3 1号公報に記載されている。
I L一 9は、 血小板の前駆細胞である巨核芽球性細胞 株 （M07 E) の増殖を剌激し、 GM— C S F、 I L - 2とは異なる液性因子と して、 成人 T細胞白血病ウィル ス （H T L V— I ) 感染 T細胞株 （ C M J.2 ) の培養上 清から、 その 'c D N Aが分離された [Yang，Y-C，et al.， Blood, 74 (6)1880-188 (1989)] 。 これはア ミ ノ酸 1 4 4 個からなる蛋白で、 マウス T細胞増殖刺激因子 P— 4 0 と高い相同性を持つ [Van Snick J. ,et al - , J. Exp. Med. 169 (1) 363-368 (1989) 1 。 該 I L — 9は C D 4 + T細胞 よりマイ ト ジヱ ン刺激により産生され、 ヘルパ一 T細胞 の増殖、 巨核芽球性細胞株の増殖、 赤血球系幹細胞の分 化促進、 骨髄系細胞株の増殖作用が報告され、 上記 T細 胞成長因子 P— 4 0 と同一物質ではないかと言われてい る。 その'クロ一ニング及び発現方法は、 P C T公開特許 第 9 0 1 4 4 3 2号公報に記載されている。
I L— 1 0は、 モア一 （Moore ) らによ り τΗ 1ヘル パー Τ細胞より単離された、 Τ細胞からめァ ー I F Nの 産生を抑制するサイ トカイ ン合成阻害因子 （Cytokine Synthesis Inhibitory Factor; CSIF) して報告； ¾れた 該 I L— 1 0はア ミ ノ酸 1 6 0個からなる分子量
1 8 7 0 0のサイ ト力イ ンで、 T細胞の他、 B細胞や肥 満細胞株からも産生され、 その作用は 7 — I F Nを始め 種々のザイ ト力イ ンの産生を抑制する他、 T細胞や肥満 細胞の増殖作用も持つとされている。 その製造は、 上記 モアーらによる c D N Aのク ローニング及び C O S細胞 からの発現による遺伝子組換え法に従う ： ίとができる [Moore, K.W. , et al .， Science， 248 , 1230-1234 (1990) ]
I L— 11は、 I L一 3依存性造血幹細胞芽球コロニ —を増加する因子と して、 骨髄ス ト 口一マ細胞より産生 される分子量約 2 0 0 0 0の 1 9 9個のア ミ ノ酸からな るサイ トカイ ンとして報告され、 形質細胞株の増殖、 B 細胞の分化、 造血幹細胞芽球コロニーの増殖、 マクロフ ァージの分化誘導、 巨核球の分化等の作用が報告されて 5 いる [押味和夫， 臨床医， H(10)5-9(1991) ;PaUl，S.R.， et al . ,Proc. Natl. Acad. Sci. ,U.S .A. , 87 (19)7512-7516 (1990)] 。 該' I L - 1 1の c D NA及び製造法について は、 C 0 S細胞で発現させる方法等が P C T公開特許第 9 1 0 7· 4 9 5号公報に記載されている。
0 I L一 1 2は、 細胞障害性リ ンパ球成熟因子
( cytotoxic lymphocyte maturation factor； CL F ) と して、 P H A剌激ヒ ト末梢血リ ンパ球の 殖や L A K細 胞の誘導する低濃度の I L一 2で相互作用増加を刺激す るサイ トカイ ンと して報告され、 分子量約 7 5 0 0 0で5 4 0 0 0 0分子と 3 5 0 0 0分子とがジスルフィ ド結合 した活性蛋白である。 該 I L一 1 2はリ ンパ芽球様 Β細
" 胞株 N C— 3 7からその c D NAがクローニングされ、
C O S細胞中に発現されたサイ 卜力イ ンである
[Chizzonte , R . , et al . , J. Immunology, 147 (5)1548-o 1556 (1991) ;Gubler，U.，et al . , Proc . at 1. Acad . Sci . ,
U.S.A. , 88(10)4143-4147(1991) ] 。 上記各種サイ 卜力イ ンの内、 T N Fは前記したように 悪寒、 戦慄、 発熱、 血圧低下等の副作用が強く 、 抗腫瘍 効果が期待できる量の投与が不可能な現状にあり、 また I F Nも臨床の有効率が約 2 0 %と低く 、 適応となる疾 患も特定の疾患に限られ、 各 I F N共発熱、 悪寒等のィ ンフルェンザ様症状が見られ、 之等副作用より高用量の 投与は困難で、 当初期待された程の満足度は得られてい ない現状にある。
I L 一 1及び I L 一 2 は両者共腫瘍細胞に対し増殖抑 制効果を有しているが、 I L 一 1 を有効成分とする抗腫 瘍剤を投与した臨床試験では、 発熱、 胃腸症状、 全身倦 怠、 低血圧、 筋肉痛等の副作用を示すこ とが報告されて いる [ H . A . Aarvey , et a l .， Proc .， ASC0 .， 24， 46 ( 1983 ) ] 0 このため I L 一 1 は癌の治療に対し期待されていたもの の、 上記副作用より大量投与等の試みを断念せざるを得 ない現状にある。 また I L 一 2はそれ単独では効果が殆 どなく、 現在 L A K療法での利用が主流となっているが、 該 L A K療法では、 L A K細胞の材料と して通常、 患者 自身の末梢血'リ ンパ球、 腫瘍内浸潤リ ンパ球、 癌性胸膜 腹水中の リ ンパ球等を予め採取した後、 I L 一 2 と共に 培養する必要があり、 またその培養には大量の培養液と 培養スペースが必要で培養期間は材料にもよるが 1 〜 2 週間を要し、 目的の細胞数まで増殖するのに更に 1 〜 2 週間培養し続けなければならず、 治療前の時間や治療設 備の点等で多く の問題がある。 しかも L A K療法におい ても高頻度に発熱、 胃腸症状、 体液貯留による体重増加、 好酸球增加、 貧血等の副作用が出現するなど様々な問題 がある。
また、 他の I Lは各種細胞の分化 · 増殖作用を持ちな がら、 癌の捕助療法や血小板、 顆粒球等の増加剤と して、 また好中球や好酸球等炎症と関連のある I Lは自己免疫 疾患、 特にリ ウマチ、 血管炎等の'治療剤としての検討が なされているにすぎない現状にある。
上記のようにサイ トカイ ン単独では、 現在の臨床用量
(副作用による投与スケジュールの限界）. では、 癌治療 に対して満足する効果が得られないため、 その副作用の 軽減と効果の増大を企てるために様々な併用療法が試み られつつある。 例えば、 上記 I L— 2 と L A K細胞の併 用療法や I F N — びや I F N — との併用療法、 I F N と抗癌剤のビンブラスチンとの併用療法等が報告されて いるが、 之等併用により飛躍的に効果が増大したという 報告はなく、 むしろ副作用が相加 · 相乗的に増大すると いう報告がなされている [梅田隆、 他、 治療学、 11〔ェ） 75-79 (1990 ) ] 0
T N Fについては、 T N Fと各種抗癌剤、 I F N—ァ、 I L一 2、 温熱療法、 G— C S F等との併用で、 抗腫瘍 性の相乗効果が報告されている [Watanabe.N -， et al . , Cancer Res . ,48,650-653(1988) ;Niitsu,Y. ,et al. , Cancer Res. , 48, 654-657(1988)； Watanabe.N. , et al . , Immunopharmacol . Immunotoxicol . , 10 , 117-127 (1988)； Winkelhake, J.L. ,et al . , Cancer Res . , 47 , 3948-3953 (1987)] '。
一方、 後記一般式 （ 1 ) で表されるカルボスチ リル誘 導体は、 例えば特公平 1 — 4 3 7 4 7号公報に記載され る通り、 強心 と して有用であるこ とが既に公知である 力 本願人らは上記誘導体につき研究を重ねた結果、 先 に該誘導体が強心作用からは予測困難な制癌作用及び細 胞の分化誘導能を有する こ とを見出し、 この知見に基づ く発明を完成し特許出願した （特願平 3— 1 6 2 5 8 7 号） 。
本発明者らは、 上記誘導体の制癌効果及び細胞の分化 誘導能につき更に研究を重ねた結果、 該誘導体と T N F 一ひ及びその他の前記した各種サイ トカイ ン、 特に
T N F、 I F N、 I L、 T G F— S等との併用によれば、 実に驚く べきこ とに、 T N F単独、 I F N単独、 I L単 独或いは T G F— ^単独ではその抗腫瘍活性が出現しな い低用量においても、 腫瘍の増殖抑制効果や細胞の分化 誘導促進効果が得られ、 その結果、 上記 T N F、 I F N I L、 T G F— ^等のサイ トカイ ンの投与量を大幅に低 減させ得、 しかも早期に強力な制癌効果^び細胞の分化 誘導効果が現れることを見出した。
本発明者らはまた、 上記一般式 （ 1 ) で表わされる力 ルボスチリル誘導体が、 これをレチノイ ン酸等のレチノ ィ ドと併用することによつても、 上記サイ トカイ ンとの 併用と同様に、 制癌作用及び細胞の分化餘導作用が奏さ れ、 所望の制癌剤が提供されることを見出した。
発 明 の 開 示
本発明によれば、 抗腫瘍作用を持つサイ 卜力イ ン、 特 に TN F、 I F N、 T G F— ^及び I L力 ら選ばれるサ ィ トカイ ンと、 下記一般式 （1 ) で表されるカルボスチ リル誘導体及び Z又はその塩とを有効成分と して含有す ることを特徴とする制癌剤が提供される。
N N - R
Figure imgf000022_0001
[式中 Rはフヱニル環上に低級アルコキ 基及び低級ァ ルキル基から選ばれる基の 1〜 3個を有することのある ベンゾィル基を示す。 カルボスチ リ ル骨格の 3位と 4位 との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。 ]
また、 本発明によればレチノ ィ ドと上記一般式 （ 1 ) で表わされるカルボスチ リ ル誘導体及び Z又はその塩と を有効成分と して含有する こ とを特徴とする制癌剤が提 供される。
特に本発明によれば、 カルボスチ リ ル誘導体が 6 —
[ 4 - ( 3， 4 ー ジメ トキシベ ンゾィル） 一 1 — ピペラ ジニル] — 3， 4 ー ジ ヒ ドロ カルボスチ リ ル、 7 — [ 4 一 （ 3， 4， 5 — ト リ メ トキ シベ ンゾィ ル） 一 1 — ピぺ ラジニル] — 3， 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル、 7—
[ 4 - ( 3 , 4 — ジメ トキシベン ゾィ ル） 一 1 — ピペラ ジニル] — 3 , 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル及び 6—
[ 4— ( 4 —エ トキシベンゾィ ル） 一 1 ー ピペラ ジニル] 一 3， 4 — ジヒ ドロカルボスチ リ ルから選ばれる少な く と も 1種である上記制癌剤、 サイ ト カイ ンがヒ ト T N F である上記制癌剤、 ヒ ト T N Fが天然型ヒ ト T N F — ひ 、 遺伝子組換え型ヒ ト T N F— α も し く は ヒ ト T N F — ひ 活性を有する ヒ 卜 T N F— α誘導体である上記制癌剤、 サイ ト 力イ ンが天然型ヒ ト I F N— 7 、 組換え型ヒ ト I F N— 7 又はヒ ト I F N— 7 活性を有する ヒ 卜 I F N 一 r誘導体である上記制癌剤、 サイ ト カイ ンが天然型ヒ 卜 I L— 1 ^、 組換え型ヒ ト I L— 1 ;S又は ヒ ト I L — 1 ^活性を有する ヒ ト I L 一 1 誘導体である上記制癌 剤、 サイ トカイ ンが天然型ヒ ト T G F — 、 組換え型ヒ ト T G F — 又はヒ ト T G F — 活性を有する ヒ 卜 T G F - β誘導体である上記制癌剤、 及びレチノィ ドが レチノィ ン酸である上記制癌剤が提供される。
更に本発明によれば、 上記一般式 （ 1 ) で表わされる カルボスチリル誘導体及び Ζ又はその医薬と して許容さ れる塩と、 上記サイ トカイ ン及びノ又はレチノィ ドとを 有効成分として含有する制癌剤の薬理有効量を患者に投 与して癌を治療する方法が提供される。
本発明制癌剤の有効成分の一つとするカルボスチ リル 誘導体を表わす上記一般式 （ 1 ) において、 定義される 低級アルコキシ基と しては、 例えばメ トキシ、 エ トキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブ トキシ、 t e r t ーブ トキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシ基等の炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を、 また低級ァ ルキル基しては、 例えばメチル、 ェチル、 プロ ピル、 ィ ソ プロ ピノレ、 ブチノレ、 tert—ブチゾレヽ ペ ンチノレ、 へキ シ ル基等の炭素.数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖伏アルキル基を 例示できる。
フェニル環上に低級アルコキシ基及び低級アルキル基 から選ばれる基の 1〜 3個を有する こ と あるべンゾィ ル基と しては、 例えばべンゾィル、 2 —メ トキシベンゾ ィル、 3 —メ トキシベンゾィル、 4 —メ トキシベンゾィ ル、 2 —エ トキシベンゾィノレ、 3 —エ トキシベンゾィ ル、 4 —エ トキンベンゾィノレ、 3 —イ ソプロポキシベンゾィ ゾレ、 4 —ブ トキシベンゾィノレ、 2 —ペンチノレォキシベン ゾィル、 ^ 3 — へキシルォキシベ ンゾィノレ、 3， 4 — ジメ トキシベンゾィル、 2， 5 — ジメ トキシベンゾィル、 3， 4， 5 — ト リ メ トキシベンゾィル、 2 —メ チルベンゾィ ル、 3 —メ チルベンゾィノレ、 4 —メ チル ンゾィル、 2 —ェチノレべンゾィル、 3 —ェチノレべンゾィノレ、 4 —ェチ ノレベンゾィノレ、 3 —イ ソプロ ピルべンゾィ ル、 4 ーブチ ルベンゾィル、 2 —ペンチルベンゾィル、 3 —へキシル ベンゾィル、 3， 4 — ジメ チルベンゾィ ル、 2 , 5 — ジ メ チルベンゾィ ル、 3， 4， 5 — ト リ メ チルベンゾィル 基等の、 ·フユニル環上に置換基と して上記低級アルコキ シ基及び低級アルキル基から選ばれる基を 1〜 3個有す る こ とのあるベンゾィル基を例示でき る。
上記カルボスチ リ ル誘導体の内で特に好ま しいもの と しては、 例えば 6 — [ 4— ( 3 , 4 — ジメ トキシベンゾ ィル） 一 1 — ピペラ ジニル] — 3， 4 — ジ ヒ ドロカルボ スチ リ ル、 7 — [ 4 - ( 3 , 4 , 5 — ト リ メ トキシベン ゾィル） 一 1 ー ピペラ ジニル] 一 3， 4—ジヒ ドロカル ボスチ リ ル、 7— [4— （3， 4ー ジメ トキシベンゾィ ル） 一 1ー ピペラ ジニル] 一 3 , 4—ジヒ ドロカルボス チリル、 6— [4— ( 4—エ トキンベンゾィル） 一 1— ピペラジニル ] — 3 , 4—ジヒ ドロカルボスチ リ ル及び それらの塩を例示できる。
本発明制癌剤において他方の有効成分とするサイ トカ イ ンの内で、 TN Fと しては、 T N F活性を有する限り 特に限定はなく 、 天然型或いは遺伝子組換えにより産生 された組換え型 T N Fのいずれでもよい。 即ち該 T N F は、 TN F— 、 T N F— 及び L Tのいずれでもよく 、 之等の天然型或いは組換え型が包含される。 上記 T N F は既に公知の ンビ トロで誘導されたヒ ト T N Fを含有 する培養上清及びその精製品、 遺伝子組換え技術に従い 製造された組換え型ヒ ト T N F及び之等の一部のア ミ ノ 酸配列を有する合成べプチ ド等の同効物のいずれでもよ い。 上記組換え型 T N Fは通常の方法、 例えばヒ ト
TN F乃至その同効物をコー ドする遺伝子を含むベクタ 一を作製し、 該ベク ターで宿主細胞を形質転換し、 得ら れる形質転換体を培養して発現物を得、 この発現物を精 製することにより製造できる。 上記宿主として利用され る微生物と しては、 例えば大腸菌等を例示できる。 上記 遺伝子組換え技術において、 微生物の替わりに動物細胞 を用いて、 該動物細胞を形質転換し、 その培養により発 現させ も T N Fを得るこ とができ る。 こ こで動物細胞 と しては、 例えば C 0 S細胞を例示できる。 また、 上記 遺伝子組換え技術において、 使用する遺伝子は、 ヒ ト T N F産生能を有する各種のヒ ト細胞で れば特に限定 はなく、 例えば H L— 6 0細胞株より分離された m R Ν Αから、 ォカャマーノく一グ法 [ Okayama H . and Berg， P .， Molecular and Cellular Biology , 2 ，161 (1982)] ゃグブラ——ホフマ ン法 [GubJLer'V. and
Hoffman, B.J. , Gene , 25 , 263 (1983 ) ] 等 ίこ従 、調整される ものを^用できる。 上記遺伝子組換え技術において大腸 菌を用いる方法と しては、 ベニ力 （Pennica ) らの方法 [Pennies, D. , Nature, 312 ,724 (1984)] を例示できる。 更にヒ ト T N F乃至ヒ ト T N Fの一部の改変或いはヒ ト T N F誘導体の製造は、 既に公知の遺伝子組換え技術に 従い、 前記した文献及び公報に従い実施するこ とができ O
また、 本発明制癌剤において他方の有効成分とするサ ィ トカイ ンの内で T G F— ^及び I F Nと しては、 上記 T N F と同様に、 T G F— /3活性及び I F N活性を有す るそれぞれの各種の天然型或いは遺伝子組換えにより産 生される組換え型 T G F— 及び I F Nを利用できる。 また、 I F Nは、 型、 ^型、 ァ型のいずれでもよい。 之等も前記 T N Fと同様に既に公知のイ ンビ トロで誘導 されたヒ ト T G F— ^又は I F Nを含有する培養上清及 びその精製品、 遺伝子組換え技術に従い製造されたヒ 卜 T G F— 又は I N F及び之等の一部のァ ミ ノ酸配列を 有する合成ぺプチ ド等のすべてを包含し、 上記遺伝子組 換え技術は、 前記 T N Fと同様に、 通常 方法、 例えば ヒ 卜 T G F—； S又は I F N乃至その同効物をコー ドする 遺伝子を含むベクターを作製し、 該ベクターで宿主細胞 を形質転換し、 得られる形質転換体を培^して発現物を 得、 これを精製するこ とにより実施できる。 ヒ 卜 T G F — 8又は I F N乃至ヒ 卜 T G F— S又は I F Nの一部の 改変乃至ヒ ト T G F— 3又は I F N誘導体の製造も既に 公知の遺伝子組換え技術に従い、 前記した文献及び公報 に従い実施できる。
更にサイ ト力イ ンの内で、 I L— 1、 — 2等の各 種の I Lも、 上記 T N F、 I F Nと同様に、 各 I L活性 を有する限り特に限定はなく 、 天然型或いは遺伝子組換 えにより産生される組換え型の各 I Lでよい。 更に I L — 1は I L— 1 及び I L— のどちらでもよい。 之等 も前記 T N F、 I F Nと同様に既に公知のイ ンビ トロで 誘導されたヒ ト I Lを包含する培養上清^:びその精製品 遺伝子組換え技術に従い製造されたヒ ト I L及び之等の 一部のァ ミ ノ酸配列を有する合成べプチ ド等の同効物の いずれでもよ く 、 上記遺伝子組換え技術に従う製造法も 例えばヒ ト I L乃至その同効物をコー ドする遺伝子を含 むべクタ一を作製し、 該ベクタ一で宿主糸由胞を形質転換 し、 得ら,れる形質転換体を培養し、 培養により発現物を 得、 これを精製することにより実施できる。 ヒ ト I L乃 至ヒ ト I Lの一部の改変、 ヒ ト I L誘導体の製造法も、 既に公知の遺伝子組換え技術に従い、 前記した文献及び 公報に従い実施できる。
本発明制癌剤は、 サイ トカイ ンと一般式 （ 1 ) で表さ れるカルボスチ リ ル誘導体及び Z又はその塩、 特に、 T N F、 T G F— 3、 I F N、 各 I L力、ら選ばれるサイ トカイ ンと上記カルボスチ リ ル誘導体及び Z又はその塩 とが、 卑一の製剤中に含まれるように調整されて投与さ れもよく、 上記サイ トカイ ンとカルボスチ リ ル誘導体及 びノ又はその塩とのそれぞれが別個の製剤と して調整さ れ、 之等 2つの製剤を投与してもよい。 いずれの場合も サイ ト力イ ンとカルボスチ リル誘導体及び Z又はその塩 は、 後述する実施例に記載の薬理試験結果から も明らか なように、 相互に一方が他方の腫瘍細胞増殖抑制作用を 始めとする制癌作用を増強するため、 両者の割合は広範 囲から適宜選択できる。 本発明制癌剤を臨床使用するに際し、 有効成分とする サイ トカイ ンの使用量は、 通常成人一日当り蛋白量とし て 0. 1 〜 1 0 0 0 ; g Zbody程度、 好ま しく は 1 〜
1 0 0 g Zbody程度の範囲から選択されるのがよく 、 また一般式 （.1 ) の化合物は、 通常一日当り 3 m g Z body〜 1 8 0 0 m gノ body程度、 好ま しく は 1 O m g Z body〜 3 0 0 m g Zbody程度の範囲から選択されるのが よい o より詳しく は、 上記サイ 卜力イ ンの内で T N F— αは、 —日当り 1 X 1 02 単位 Zbody〜 1 X 1 07 単位 Zbody 程度、 好ま しく は 1 X 1 0 単位 Zbody〜 1 X 1 06 単 位 /body程度の範囲で用いられるのが望ま しい。 L Tの 場合、 その臨床使用時の成人に対する一日当りの有効成 分量は、 一般に 1 X 1 0 単位 /body〜 1 X 1 07 単位
Zbody程度、 好ま しく は 1 X 1 0 単位 zbody〜 1 X
1 06 単位 Zbody程度の範囲から選択されるのが望ま し い。 I F N ( I F N— a、 I F N— ^又は I F N—ァ） の場合、 成人に対する一日当りの有効成分量は、 一般に 1 X 1 05 単位 Zbody〜 1 X 1 09 単位 Zbody程度、 好 ί
ま しく は 1 X 1 0 ° 単位 Zbody〜 5 X 1 07 単位 /body 程度の範囲とするのが望ま しい。 I L— 1の場合、 成人 に対する一日当りの有効成分量は、 一般に 0. 0 1 z g Zbody〜 1 0 0 ^ g /body程度、 好ま しく は 0. l /z g /body〜 1 0 μ g Zbody程度の範囲とするのが望ま しい。 I L一 2の場合、 成人に対する一日当りの有効成分量は、 一般に 0. 0 2 8 g Zbody〜 2 8 0 / g Zbody程度、 好ま し く は 0. 2 8 // g Zbody 2 8 // g Zb。dy程度の 範囲とするのが望ま しい。 I L— 3、 I L— 4、 I L— 5、 I L - 6. I L一 7、 I L一 8、 I L— 9、 I L - 1 0、 I L— 1 1、 I L— 1 2の場合、 成人に対する一 日当りの有効成分量は、 一般に 0. l // g Zbody〜 1 0 0 0 g body程度、 好ま し く は 1 /z g /body〜 1 0 0 g /body程度の範囲とするのが望ま しい。
また T G F— 5の場合、 成人に対する一日当りの有効 成分量は、 一般に 0. 4 / g body〜 4 0 0 ^ g /body 程度、 好ま しく は 4 g Zbody 4 0 // g /body程度の 範囲とするのが望ま しい。
上記 T N F - a、 T G F— 、 L T、 I F N、 I L— 1〜 I L— 1 2は、 いずれも前述した如く 、 一般式 （ 1 ) の化合物と相互に、 腫瘍細胞増殖抑制作用及び細胞の分 化誘導作用を増強するため、 該一般式 （ 1 ) の化合物を この分野で通常採用されている臨床投与量で使用する場 合は、 之等各サイ トカイ ンの通常採用されている臨床投 与量を 1 Z 1 ひ 0倍〜 9 Z 1 0倍程度に減少させること ができる。
また、 T N F — ひ 、 I F N— 、 I F N— S、 I F N ー ァ 、 I, L一 1、 I L — 2等は、 前記副作用を回避する 観点から、 上記有効量範囲内のできるだけ低容量で投与 するのが好ま しい。
本発明の一般式 （ 1 ) の化合物と T N — α とを有効 成分とする制癌剤における一般式 （ 1 ) の化合物と
T N F —. αとの投与比率は、 両者をそれぞれの上記有効 成分量範囲内で使用する限り特に制限はなく 、 広い範囲 から適宜選択 ればよいが、 一般には一般式 〔 1 ) の化 合物 （m g Zbody) τ N F - a (単位 /body) が 5 x
1 0—6 5程度、 好ま しく は 5 x 1 0一5〜 5 x 1 0 _1程 度、 更に好ま しく は 5 X 1 0 〜 5 X 1 0— 2程度とする のが望ましい。 一般式 （ 1 ) の化合物と T G F — ^ との 場合の投与比率は、 一般に一般式 （ 1 ) 化合物 （m g /body) /T G F - β ( β g /body) 力く 0. 0 1 5〜
1 5 0 0程度、 好ま しく は 0. 1 5〜： L 5 0程度、 更に 好ま しぐは 1. 5 〜 1 5程度とするのが望ま しい。 一般 式 （ 1 ) の化合物と I F N ( I F N— 、 I F N— 8、 又は I F N—ァ） との場合の投与比率は、 一般に一般式 ( 1 ) の化合物 （m g /body) Z I F N (単位 Zbody) が 1 0―1〜 1 0— 7程度、 好ま し く は 1 0一2〜 1 0—6程度 更に好ま しく は 1 0一3〜 1 0 "程度とするのが望ま しい 一般式 （ 1 ) の化合物と L Tとの場合の投与比率は、 上 記 T N F — αの場合と同様の比率とするのが望ま しい。 一般式 （ 1 ) の化合物と I L 一 1 との場合の投与比率は 一般に一般式 （ 1 ) の化合物 （m g /body) / I L - 1 (m g /body) が δ Χ ΐ ί^ δ Χ ΐ Ο 7 程度、 好ま し く は 5 x l 02 〜 5 x l 06 程度、 更に好ま し く は 5 X 1 03 〜 5 X 1 0 " 程度とするのが望ま しい。 一般式 ( 1 ) の化合物と I L 一 2 との場合の投与比率は、 一般 に一般式 （ 1 ) の化合物 （m g /body) / I L - 2 (m g /body) が i . 8 x 1 (？ 1 〜；！ . 8 x 1 07 程度 好ま しく は 1 . 8 x l 02 〜 l . 8 x 1 06 程度、 更に 好ま しく は 1. 8 x l 03 〜 l . 8 x 1 0 " 程度とする のが望ま しい。
更に一般式 （ 1 ) の化合物と I L 一 3、 I L — 4、 I L — 5、 I L - 6 s I L - 7. I L 一 8、 I L — 9、 I TL — 1 0、 I L — 1 1及び I L 一 1 2のそれぞれとの 場合の投与比率は、 一般に一般式 （ 1 ) の化合物 （m g /body) /各 I L (m g /body) が 1 01 〜 1 07 程度 好ま しく は 1 02 〜 1 0 ° 程度、 更に好ま し く は 1 03 〜 1 05 程度とするのが望ま しい。
また本発明制癌剤には、 一般式 （ 1 ) のカルボスチリ ル誘導体と レチノィ ドとを有効成分とするものも包含さ れる。 ここで一般式 （ 1 ) のカルボスチリル誘導体と併 用される レチノイ ドには、 体内でビタ ミ ン Aから生産さ れる レチノイ ン酸を含む各種のビタ ミ ン A (レチノ一ル） の誘導体が包含される。
その例と しては、 レチノ イ ン酸の他、 レチノ ール、 レ チナ一ル、 レチニルエステル並びにビタ ミ ン Aの既知の 合成同族体が包含される。 該同族体における環は芳香環 及びへテロ芳香環であることができ、 側鎖、 末端基は随 時置換、 酸化、 還元されていてもよく、 またレチノイ ン 酸のアルカ リ金属及びアルカ リ土類金属塩も上記レチノ ィ ドに包含される。 それらの具体例と しては、 エ ト レチ ネー ト （etretinate) 、 イ ソ ト レチノ イ ン
isotretinoin , 13-cis retinoic acid) 、 ポリ プレイ ン酸、 ポリ プレイ ン酸誘導体 （E_5iie) 、 オール一 トラ ンス一レチノイ ン酸 （ ト レチノイ ン） 等を例示できる。 上記レチノ ィ ドの製法は既知であり、 例えばレチノ ィ ド 誘導体は、 特開昭 6 1— 2 7 5 2 6 5号公報、 特開昭 6 1 - 2 7 5 2 6 6号公報、 特開昭 6 4 - 5 0 0 1 9 0 号公報等を参考にして製造できる。 ビタ ミ ン Aはその欠乏により分化の異常が引き起こさ れるこ とが、 1 9 2 5年に既にヮルバとホウヱ
(Wolbach & Howe) により見出されている。 ポオラグ
(Bollag) は、 ビタ ミ ン Aの誘導体を幾つか作成して、 レチノィ ン酸がマウス皮膚における化学発癌を抑える効 果 明らカヽ f t~ 「Bollag，W.， Eur . J . Cancer - , 8， 689 (1972) ] 。 上記レチノ イ ドは、 ビタ ミ ン Aの経口投与 のよ う に中毒症状を起こすこ となく 、 ビタ ミ ン A様作用 を示し、 各種の皮膚疾患や癌等への効果が期待され、 レ チノイ ン酸によって多く の癌細胞、 例えば H e L a細胞、 悪性黒色腫細胞等に対してある程度の分化能をもち、 制 癌効果をもつこ とが報告された。 上記のよ う に癌細胞を 分化させ得る能力をもつレチノ イ ン酸は、 発生を抑制す る分子のひとつであり、 癌治療の研究と レチノ イ ン酸と の関係の研究は注目に値する ものとなり多く の研究がな され、 更に臨床に応用する試みもなされた [平塚巌他、 川久保病院医報， 1 (3) 109-112 (1989) ； 三井宣夫， 中部日本整形外科災害外科学会雑誌， ^ ） 26-27 (1990) ； ニノ宮三生， 岐阜大学医学部紀要， ^ (6) 836 -848 (1987) ] 。 その結果、 レチノ イ ン酸のみであって も、 ある程度癌の治療効果が認められた [Menger，H.， et al.， Blood, 12 (2) 567-572 (1988)； Castaigne, S . et al-， Blood, 76 (8) 1704-1709 (1990)等参照] 力くヽ これはその大量投与に伴う催奇形成やビタ ミ ン A過剰症、 骨異常等の副作用の問題が認められ、 その使用基準が検 討されている [沢田海彦， 現代医療， ^ (増3) 428-432 (1990) ] 0
上記レチノィ ドを利用 した本発明制癌剤は、 前記サイ トカイ ンを利用したそれと同様に、 カルボスチリル誘導 体及びその塩類の少なく とも一種と レチノィ ドとが単一 製剤中に含まれるように調製されてもよく、 之等のそれ ぞれを別個に製剤化して両製剤を利用することもできる。 いずれの場合も、 両者の併用割合 （配合割合） は、 広範 囲から適宜選択できる。 例えば、 本発明制癌剤の臨床利 用に際して、 有効成分とする レチノ ィ ドは、 通常一日当 り約 0. 01〜： L 0 m g Zk g程度が投与される量から 選択され、 これと併用される一般式 （1) のカルボスチ リル誘導体 （及び之等の塩） は、 通常成人一人一日当り 約 3〜1800m g Z体重程度、 好ま しく は約 1 0〜
300 m g/体重程度の範囲から選択される量とされる のがよい。
上記レチノイ ン酸等のレチノ ィ ドは、 いずれも前述し た如く、 一般式 （1) の化合物と相互に、 腫瘍細胞増殖 抑制作用及び細胞の分化誘導作用を増強するため、 該一 般式 （1 ) の化合物をこの分野で通常採用されている臨 床投与量で使用する場合は、 レチノ イ ドの通常採用され ている臨床投与量を 1 1 0 0倍〜 9Z 1 0倍程度に減 少させるこ とができる。 尚、 レチノィ ドは、 前記副作用 を回避する観点から、 上記有効量範囲内のできるだけ低 容量で投与するのが好ま しい。
本発明の一般式 （ 1 ) の化合物と レチノ ィ ドとを有効 成分とする制癌剤における一般式 （ 1 ) の化合物と レチ ノィ ドとの投与比率は、 両者をそれぞれの上記有効成分 量範囲内で使用する限り特に制限はなく 、 広い範囲から 適宜選択すればよいが、 一般には一般式 （ 1 ) の化合物 (m g /body) レチノ ィ ド （m g /body) が o . 丄〜
1 0 0 0程度、 好ま し く は：！〜 1 0 0程度、 更に好ま し く は 1 0程度とするのが望ま しい。
本発明制癌剤は、 その使用目的に応じ、 この分野で慣 用されている各種の投与形態で使用される。 例えば注射 剤と して調整される場合には、 液剤、 乳剤及び懸濁剤は 殺菌され、 且つ血液と等張であるのが好ま しい。
本発明製剤の製造に際しては、 人血清アルブミ ンゃ通 常の L一型ア ミ ノ酸及び 又は糖類と界面活性剤を使用 するこ とによ り、 有効成分、 就中サイ トカイ ン、 例えば T N F— a、 T G F— S、 I F N— ひ、 I F N— 、 I F N— ァ、 I L一 1、 L T、 I L — 2、 I L 一 3、 I L一 4、 I L — 5、 I L - 6 I L 一 7、 I L — 8、 I L — 9、 I L — 1 0、 I L一 1 1及び I L 一 1 2 の安 定性を向上させ得る。
上記ァ ミ ノ酸と しては、 通常の注射剤等に慣用されて いるもの、 例えば、 グリ シン、 システィ ン等をいずれも 使用できる。 上記糖と しては、 特に限定はなく 、 例えば グルコース、 マルノ ース、 ガラク 卜ース、 果糖等の単糖 類、 マンニ トール、 イ ノ シ ト一ル、 キシリ 卜一ル等の糖 アルコール、 ショ糖、 マル ト一ス、 乳糖等の二糖類、 デ キス トラン、 ヒ ドロキシプロ ピルスターチ等の多糖類等 を使用でき、 之等は一種単独でも、 二種以上混合しても 用い得る。 之等の中で特にショ糖、 マン トース、 マンニ トール、 イノ シ トール、 デキス トラ ン等は好ま しい。 ま た、 界面活性剤と しても特に限定はなく 、 イオン性及び 非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、 就中、 ポリ ォキシエチレングリ コールソルビ夕 ンアルキルエステル 系、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、 ソルビ夕 ンモノ ァシルエステル系、 脂肪酸グリセ リ ド系等の界面 活性剤を好ま しく利用できる。
上記糖類の添加量は、 T N F — そのもの又はその前 記誘導体 （T N F — ひ活性物） 、 T G F — ^そのもの又 はその前記誘導体 （T G F— ;5活性物） 、 L Tその もの 又はその前記誘導体 （L T活性物） 、 I F N ( I F N - α、 I F N— 又は I F N— τ そのもの又はその前記 誘導体 （ I F N活性物） 、 I L一 1その もの又はその前 記誘導体 （ I L一 1活性物） 、 I L— 2そのもの又はそ の前記誘導体 （ I L一 2活性物） 、 I L— 3そのもの又 はその前記誘導体 （ I L一 3活性物） 、 I L一 4そのも の又はその前記誘導体 （ I L一 4活性物） 、 I L— 5そ のもの又はその前記誘導体 （ I L— 5活性物） 、 I L一 6そのもの又はその前記誘導体 （ I L— 6活性物） 、 I L— 7そのもの又はその前記誘導体 （ I L一 7活性 物） 、 I L一 8そのもの又はその前記誘導体 （ I L— 8 活性物） 、 I L— 9そのもの又はその前記誘導体 （ I L 一 9活性物） 、 I L一 1 0そのもの又はその前記誘導体 ( I L— 1 0活性物） 、 I L— 1 1その もの又はその前 記誘導体 （ I L— 1 1活性物） 及び I L— 1 2その もの 又はその前記誘導体 （ I L一 1 2活性物） のいずれの場 合でも、 之等各活性物の 当り約 0. O l m g程度 以上、 好ま しく は約 0. l〜 1 0 m g程度の範囲とする のが適当である。 界面活性剤の添加量は、 上記各活性物 1 /z g当り約 0. O O O O l m g程度以上、 好ま し く は 約 0. 0 0 0 1〜 0. O l m g程度の範囲とするのが適 当である。 また人血清アルブミ ンの添加量は上記各活性 物 l ^ g当り約 0. O O O l m g程度以上、 好ま しく は 約 0. 0 01〜l m g程度の範囲とするのが適当である。 ァミ ノ酸では上記各活性物 1 /z g当り約 0. 0 0 1〜 1 0 m g程度 （ 2種以上配合する場合はそれらの合計量） とするのが適当である。
本発明の医薬製剤中に有効成分と して含まれる一般式 ( 1 ) の化合物及びサイ トカイ ン又はレチノ ィ ドの量は、 それぞれ特に限定されず広い範囲に適宜選択されるが、 通常全組成物中有効成分総量と して約 1〜 7 0重量％、 好ま しく は約 1〜 3 0重量％程度の範囲とするのが適当 である。
本発明の制癌剤は、 通常のこの種医薬組成物と同様の ものとすることができ、 他の薬理的有効成分や製剤上の 慣用成分等を任意に配合してもよい。
特に、 本発明制癌剤に配合できる他の成分と しては、 例えば T N F— 活性物等のサイ トカイ ンの安定化を更 に増加させる面より、 通常の含硫還元剤が好ま しい。 該 含硫還と しては、 具体的にはシスティ ン、 Ν—ァセチル ホモシスティ ン、 チォク ト酸、 チォグリ コール酸及び之 等の塩類、 チォエタノ ールァ ミ ン、 チォグリセロール、 チォ硫酸ナ ト リ ウム、 チォ乳酸、 ジチオスレィ トール、 グルタチオ ン等の比較的温和な還元剤等を好ま しく 例示 でき、 之等は一種単独でも利用でき、 2種以上併用する こ ともできる。 之等の添加量は特に制限されないが、 サ イ ト力イ ン活性物 1 g当り約 0. O O l m g程度以上、 好ま しく は 0. 0 1〜： L 0 m g程度 （ 2種以上併用する 場合はそれらの合計量） とするのが適当である。
本発明の制癌剤は、 また、 緩衝液で等張化して安定な 等張化製剤とされるのが適当である。 こ こで用いられる 緩衝液と しては、 例えば代表的には、 クェン酸一クェン 酸ナ ト リ ウム、 クェン酸— リ ン酸ナ ト リ ウム、 酢酸—酢 酸ナ ト リ ウム、 クェン酸—ホウ砂等の p H 4〜 8程度、 好ま しぐは p H 5〜 6程度の各種緩衝液を例示できる。
本発明制癌剤は、 例えば通常薬理有効量の T N F— α 活性物、 T G F— 活性物、 I F N ( I F N— α、
I F Ν— 又は I F Ν— ァ） 活性物、 L Τ活性物、 I L 一 1活性物、 I L— 2活性物、 I L一 3活性物、 I L一 4活性物、 I L— 5活性物、 I L— 6活性物、 I L一 7 活性物、 I L一 8活性物、 I L一 9活性物、 I L一 1 0 活性物、 I L一 1 1活性物又は I L一 1 2活性物及び Ζ 又はレチノ イ ド、 一般式 （ 1 ) で表される化合物及び前 記特定の配合成分と共に、 適当な医薬製剤担体を配合し て製剤組成物の形態に調整される。 該製剤担体と しては 使用形態に応じた製剤の調整に通常慣用される充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤等の賦形剤乃至希釈剤 をいずれも使用できる。 製剤組成物の形態は、 これが有 効成分を効果的に含有する伏態であれば特に限定はなく、 錠剤、 粉末剤、 顆粒剤、 丸剤等の固型剤であってもよく、 液剤、 懸濁剤、 乳剤等の注射剤形態であってもよい。 ま た、 これらは使用前に適当な担体の添加により液伏とな し得る乾燥品とすることもできる。 之等の製剤組成物は いずれも常法に従い調整され得る。
本発明の制癌剤の有効成分とするサイ トカイ ン、 例え ば T N F— と、 一般式 （ 1 ) で表わされるカルボスチ リル誘導体又はその塩からなる医薬製剤は、 之等各有効 成分をそれぞれ単独の成分と して含有する 2剤の形態で それぞれ別個に投与しても、 また両者を同一製剤に配合 して一剤で投与してもよい。 特に例えばサイ トカイ ンは、 これ有効成分とする注射剤形態の医薬製剤と して用いら れるのが好ま しい。 また、 本発明の一方の有効成分であ る一般式 （ 1 ) で表されるカルボスチリル誘導体又はそ の塩は、 従来公知の投与ルー トのいずれかによつて、 例 えば経口的又は非経口的に投与することができる。 目下 のところ好ま しいのは経口投与であり、 上記経口及び非 経口の医薬製剤の製造は特公平 1— 4 1 1 2 8号公報の 記載を参考にして実施するこ とができる。
かく して得られる医薬製剤の投与方法は特に制限はな く、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別、 その他の条件、 疾患の程度に応じて決定される。
該製剤組成物の形態に応じた適当な投与経路、 例えば 注射剤形態の医薬製剤は、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内 腹腔内投与等により投与され、 固剤形態の ！ 医薬製剤は、 経口又は経腸投与され得る。 該投与方法は、 例えば本発 明の一方の有効成分である一般式 （ 1 ) で表されるカル ボスチリル誘導体又はその塩を経口的に投与し、 或いは 注射剤形態の医薬製剤を静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与等に投与し、 一方のサイ トカイ ン、 例えば
T N F -な、 T G F - 、 I F N— a、 I F N ヽ I F N — ァ、 L T、 I L— 1、 I L 一 6等を含有する上 記注射剤形態の医薬製剤を静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内 腹腔内投与等により投与するこ と もでき 。 また、 本発 明制癌剤の有効成分である一般式 （ 1 ) で表わされる力 ルボスチ リル誘導体又はその塩と レチノィ ドとの両者を 同一製剤に配合して一剤と して経口的に投与するこ と も できる。 該投与は、 一日 1回又は一日 3〜 4回に分ける こともでき、 それぞれ有効成分を含有する医薬製剤を同 時に、 或いは別々に時間をかえて投与するこ と もできる また、 本発明の有効成分の配合剤を一日 1回又一日は 3 〜 4回に分けて投与することもできる。
更に、 本発明制癌剤又はその一方の有効成分である一 般式 （1 ) のカルボスチリル誘導体及び/又はその塩は、 之等の製剤形態や投与経路によることなく、 之等を癌の 化学療法剤と して従来より知られている各種の抗癌剤乃 至その有効成分化合物と併用することもでき、 また従来 公知の放射線療法や温熱療法等と併用することもできる。 かかる併用によれば、 本発明制癌剤自体が、 前述したよ うに一般式 （ 1 ) のカルボスチリル誘導体及び Z又はそ の塩とサイ トカイ ン及び Z又はレチノィ if との相乗作用 によって、 優れた制癌効果を奏し得るに加えて、 上記併 用される化学療法剤や放射線療法等の効果を一層助長し て、 之等との併用による相乗効果をも発揮させ得る。 従 つて、 之等の併用される化学療法剤を通常用いられてい る有効量より もかなり少量とする場合でも充分な癌治療 効果が得られ、 これによつて公知の制癌剤等の化学療法 剤乃至各種治療方法の実施にみられる副作用の軽減化を はかることができ、 非常に有利である。 上記併用できる 化学療法剤と しては、 例えば 5 —フルォロウラ シル （ 5 一 F U、 協和発酵工業株式会社製） 、 マイ トマイ シン (Mitomycin - C 、 大鵬薬品工業株式会社製） 、 エン ドキ サン （Endoxaii 、 塩野義製薬株式会社製ノ 、 ト ヨマイ シ ン （Toyomicin 、 武田薬品工業株式会社製） 等を例示で さる o
本発明によれば、 サイ トカイ ン、 特に T N F — 、 T G F— ^、 I F N ( I F N— 、 I F N— yS又は I F N— ァ） 、 L T、 I L一 1、 I L - 2. I L一 3、 I L - 4. I L - 5. I L - 6. I L - 7. I L - 8. I L— 9、 I L— 1 0、 I L— 1 1、 I L— 1 2及び Z 又はレチノ ィ ドと、 一般式 （ 1 ) で表されるカルボスチ リル誘導体及び 又はその塩とを併用するこ とにより、 それぞれの抗腫瘍活性が相互に著しく増強され、 また細 胞の分化誘導促進効果が発揮され、 T N F— a、 T G F — β、 I F N ( I F N— α、 I F N— 、 又は I F N— ァ） 、 ： L T、 I L 1、 I L - 2、 I L - 3、 I L - 4 I L一 5、 I L一 6、 I L一 7、 I L — 8、 I L— 9、 I L— 1 0、 I L一 1 1、 I L— 1 2、 レチ ノ イ ドのそ れぞれ単独では抗腫瘍効果が発揮されないような低い投 与量においても、 腫瘍細胞の増殖抑制効果や細胞の分化 誘導促進効果等の制癌効果が得られる。 その結果、 之等 各種のサイ トカイ ンゃレチノ イ ドの投与量の大幅な低減 及び前記副作用の軽減が可能となる。
図面の簡単な説明 図 1は薬理試験例 3に従う ヒ ト前骨髄性白血病細胞 (H L— 6 0細胞） に対する本発明制癌剤の細胞増殖抑 制効果を試験した結果を示すグラフである。
図 2乃至図 5は薬理試験例 4に従い行なわれた H L— 6 0細胞の形態学的変化 （マクロフ ァージ系への分化誘 導） に及ぼす本発明制癌剤の効果試験の結果と しての、 生物の形態 （ギムザ染色後の上記細胞の顕微鏡観察結果） を示す図面に代わる写真である。
' 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明制癌剤の薬理試験例を挙げる。
薬理試験例 1
カルボスチリル誘導体と して以下に示す供試化合物
N o . I〜！ を、 レチノ イ ドと して下記レチノ イ ン酸を、 またサイ ト カイ ンと して下記 T N F— をそれぞれ用い て、 次の薬理試験を行なった。
I . 6 - [ 4 - ( 3 , 4—ジメ トキシベンゾィル） 一 1— ピペラ ジニル] — 3 , 4—ジヒ ドロカルボスチ リ ル H . 7— [4— (3， 4, 5 — ト リ メ トキシベンゾィ ル） 一 1— ピペラ ジニル] — 3 , 4—ジヒ ドロカルボス チ リ ル
m. 7 - [4— ( 3， 4— ジメ トキシベンゾィ ル） 一 1 ー ピペラ ジニル 1 一 3， 4ー ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル IV. 6— [ 4一 （ 4—エ ト キシベンゾィ ル） 一 1 — ピ ペラ ジニル] — 3 , 4— ジ ヒ ドロ 力ノレボスチ リ ル
本試験例 1においては、 上記各供試化合物を 1 N塩酸 に溶解後、 F C S (牛胎児血清、 ギブコ社製） で希釈し て、 l m gZm l 溶液を調製し、 同溶液を 1 0 % F C S 添加1 ? ]^ 1 ー 1 6 4 0培地 （フ ロ ー社製） に添加して、 1 N N a 0 Hで中和後、 培地のみ、 1 0及び 3 0 z g /m 1 の各濃度に調製して利用した。
また後記薬理試験例 2においては、 上記各供試化合物 をジメチルスルホキシ ド （ D M S 0 ) に溶解して 1 0 m g Zm l 溶液を調製し、 同溶液を 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地 （フ ロ ー社製） に添加して、 1. 8 8、 7. 5及び 3 0 ^ g Zm 1 の各濃度に調製し て利用 した。
レチノ イ ド
レチノ イ ドと しては、 レチノ イ ン酸 （オール ト ラ ンス * レチノ イ ン酸、 シグマ社製） を 1 0 % F C S添加
R P M I — 1 6 4 0培地で希釈して、 1 0— °及び 1 0— 7 M濃度に調製して利用 した。
サイ ト 力イ ン
サイ ト力イ ンと しては、 T N F— ひ （大腸菌に発現さ せて得られた組換え体ヒ ト T N F— ひ 、 比活性 ： 2 X 1 07 単位 m g、 ゼンザィム社製） を、 1 0 % F C S 添加 R P M I — 1 6 4 0培地で希釈して、 1 0 0 0単位 /m 1 濃度に調製して利用した。
本薬理試験例において、 ヒ 卜前骨髄性白血病細胞
(H L— 6 0 ) は、 ガロ （Robert Gallo) らにより樹立 されたヒ ト白血病細胞株で、 その細胞の性質は文献
[Gallo'R. ， et al. , Blood, 54, 713 (1979) ] に記載され ており、 アメ リ カ ンタイ プカルチヤ 一コ レク シ ョ ン
(A T C C) に 「A T C C N o . C C L— 2 4 0」 な る寄託番号で受託されている。
上記 H L— 6 0を 1 0 %F C S添加 R P M I —
1 6 4 0培地 （ギブコ社製） にて、 3 7 °C、 5 % C 02 下で培養して、 細胞数が 1 X 1 05 個 1 の濃度とな るように調製した。
次に、 6穴のマイ クロプレー ト （コースター社製） の 各穴に、 上記で調製した培地のみを添加 （対照群） 、 培 地中に供試化合物 N 0 . I を 1 0又は 3 0 /z g/m I含 めて添加 （A Z群） 及びオール トラ ンス ' レチノ イ ン酸 ( A T R A) を 1 0— 7M又は 1 0— 6M添加 （ A T R A群） し、 プレー 卜を 3 7 °C、 5 % C 02 下に 5 日間培養した。 培養後、 各穴の細胞浮遊液を取り、 エツペン ドルフチュ —ブに取り出し、 生細胞数をコールターカウ ンター （コ ールタール社製） にて測定した。
6
上記細胞を 1 X 1 0 個 Zm 1 に調製し、 フルォ レセ イ ンイ ソチアネー ト （F I T C) 標識抗ヒ ト C D 1 1抗 体 （M o l、 コール夕一社製） にて染色後、 フ ローサイ トメ ト リ 一法による、 プロフ アイノレ I I (コールタ一社 製） にて、 蛍光強度を測定した。 上記で得られた A Z群、 A T R A群及び両者の併用群 の各群における細胞増殖に対する抑制効果を、 対照群の 結果を基準と して、 該基準値 （ 0 ) に対する細胞増殖抑 制増減百分率 （％) にて表 1 に示す。 一 ， また C D 1 1発現量について得られた結果は、 対照群 の C D 1, 1発現量を 1 0 0 %と して、 これに対する相対 値にて表 2に示す。 表 1
0 10 30
ATRA 0 M 0土 0 0土 0 23士 0 10 -7 M 0士 0 8土 0 31土 0 10- 6M 15土 0 23± 0.2 38± 0.4 表 2
Figure imgf000050_0001
上記表 1及び表 2より、 本発明制癌剤 （即ち上記 A Z とレチノイ ン酸との併用） によれば、 レチノイン酸
(A T R A群） の癌細胞増殖抑制能及び分化誘導能がい ずれも更に高められることが明らかである。
薬理試験例 2
H L— 6 0を 9 6ゥヱルプレー トの各ゥヱルに入れ、 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地にて、 3 7 °C、 5 M C 02 下で培養し、 細胞濃度を 1 X 1 03 個/ m I になるように調製した。
次に、 各ゥエルに各供試化合物を所定濃度で加え、 更 に T N F— ひ 1 0 0 0単位/ m 1 を含む 1 0 % F C S添 加 R P M I — 1 6 4 0培地を加える （+と表示） か又は 加えることなく （一と表示） 、 3 7 °C、 5 % C 02 下で 3 日間培養した。 尚、 対照群と して、 D M S 0 (供試化 合物無添加） を添加し、 更に T N F— の 1 0 0 0単位 Zm l を加える力、 （ + ) 又は加える こ とな く （一） 、 同 様に培養する群を設けた。
上記培養後、 各ゥエルに MT T試薬 [ 3— （ 4 , 5 - ジメ チル一 2—チアゾィル） 一 2， 5— ジフ ヱニル一 2 H · テラゾリ ゥムブロマイ ド （和光純薬社製） を 2. 5 m g /m 1 濃度となるようにダルべッ コの培地
(P B S (_) 、 日水製薬社製） に溶解し、 濾過滅菌した もの] 1 0 / 1 を添加し、 3 7 °C、 5 % C 02 存在下に 3時間培養し、 次いで 1 0 % S D S含有 0. 0 1 N H C 1溶液を各ゥヱルに 1 0 0 // 1 ずつ加え、 更に 3 7 °C、 5 % C 02 存在下で一晩培養した。
培養後、 タイ 夕一テッ クマルチスキャ ン （タイ 夕一テ ッ ク社製） を用いて、 各ゥヱルの吸光度 （O D 5 8 0 n m) を測定した。
得られた結果を表 3に示す。
3
供試化合 « 0. 化合 ί蠢度（ / m l )
1 . 8 8 7 . 5 3 0
DMSO 0 . 0 0 . 0 0 . 0
+ 2 6 . 5 3 3 . 5 7 0 . 2 π 一 1 2 . 2 0 . 7 5 8 . 4
+ 1 9 . 6 3 6 . 3 7 5 . 7 π 0 . 5 9 . 8 3 2 . 6
+ 2 5 . 2 3 3 . 7 5 7 . 4 w 0 . 1 3 . 4 3 4 . 0
1 9 . 9 3 4 . 6 6 8 . 6 尚、 上記結果 （各供試化合物の各濃度における値） は
T N F - α非存在下 （一） における D M S ◦添加群 （対 照） の値を基準 （ 0 ) と して、 これに対する増殖抑制の 増減百分率 （％) にて示したものである。
之等各表より、 各供試化合物を T N F — ひ と併用 した 場合は、 いずれも T N F — α単独の場合より一層強い癌 細胞増殖抑制作用が認められ、 このことから、 上記各供 試化合物が T N F - aの癌細胞増殖抑制効果を一層助長 することが明らかとなった。
薬理試験例 3 ヒ ト前骨髄性白血病細胞 （H L— 6 0細胞） に対する効 果試験
供試化合物と して 6— [ 4一 （ 3， 4 —ジメ トキシべ ンゾィル） 一 1 — ピペラジニル] 一 3 , 4—ジヒ ドロ力 ルボスチリ ル （以下、 「 A Z」 という） を 1 N塩酸に溶 解後、 F C S (牛胎児血清、 ギブコ社製） で希釈し、 1 m g /m l溶液を調整した。 同溶液を 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地 （フ ロー社製） に添加し、 1 N — N a O Hで中和した後、 3 0 / g 1 の濃度に調整 して利用し、 これを下記の通り調整された各種サイ ト力 イ ンと併用して本薬理試験を行なった。
サイ トカイ ンの調製
T N F— αは、 大腸菌に発現させて得られた組換え体 ヒ ト T N: F— α (比活性 2 X 1 07 単位 Zm g、 ゼンザ ィム社製） を用いた。 該 T N F— ひを 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地で希釈して、 1 0 0 0単位 Z m 1 に調整した。
ヒ ト前骨髄性白血病細胞 （H L— 6 0細胞） は、 前記 薬理試験例 1で用いたものと同一である。
上記 H L— 6 0細胞を 1 0 % F C S添加 R P M I - 1 6 4 0培地にて 3 7 °C、 5 % C 02 下で培養し、 細胞 数が 1 X 1 0 Ό 個 Z m 1 の濃度になるように調整した。 P TJP92 157
5 2 次に、 6穴のマイ ク ロプレー ト （コ一 夕一社製） の 各穴に上記 1 ) 及び 2 ) で調整した上記培地のみの群
(コ ン 卜 口一ル群、 Control ) 、 培地中に A Zを 3 0
β g /m I含む群 （A Z群） 、 培地中に T N F — αを
1 0 0 0単位 Ζπι 1含む群 （T N F — び群） 及び培地中 に Α Ζを 3 0 g Zm l及び T N F — ひを 1 0 0 0単位
Zm l含む群 （A Z + T N F — 群） の 4群に分けそれ ぞれ添加した後、 3 7 °C、 5 % C 02 下で 6 日間培養し た。 培養後、 各穴の細胞浮遊液を取り、 0. 2 % ト リバ ンブル一含有リ ン酸緩衝液 （和光純薬社製） と混合し、 顕微鏡下に未染色の生細胞数を計測した。
その結果を図 1に示す。 該図において、 縦軸はカウン トされた生細胞数 （X I 05 個 Zm 1 ) を示す。
該図より、 コ ン ト ロール群、 A Z群及び T N F — α群 に比較して、 本発明の A Ζ + T N F — α群は、 著しい細 胞の増殖抑制効果を示した。
薬理試験例 4
H L - 6 0細胞に対する Α Ζと T N F — α との併甩効果 ギムザ試薬 （メルク社製） をリ ン酸緩衝液 （ P H
6. 4 ) で、 2 6倍に希釈してギムザ染色液と した。
上記薬理試験例 3 と同様にして 4群に分けて、 同条件 下で 6 日間培養した後、 細胞をスライ ドグラス上に添加 し、 メ タノール （和光純薬社製） 固定した。 風乾後、 ギ ムザ染色を行ない、 顕微鏡下で形態学的観察を行なつた, ギムザ染色の結果を図 2〜図 5に示す。
該図 （形態学的観察の結果） より、 コ ン ト ロール群 (図 2 ) 、 A Z群 （図 3 ) 、 T N F— α群 （図 4 ) 及び A Z + T N F— α群 （図 5 ) を比較すると、 Α Ζ +
T N F— α群は他の 3群に比較して、 形態学的変化と し てマク ロフ ァ ージ系への分化誘導が早期に促進されてい るこ とが認められた。
薬理試験例 5
H L - 6 0細胞の増殖と発現マーカーに対する A Z及び T N F - αの併用効果試験
H L— 6 0細胞を薬理試験例 3 と同様に して培養し、 細胞濃度を 5 x 1 (Τ 個 Zm l に調整し、 同条件下で、 コ ン ト ロール群、 A Z 3 0 / g Zm l 群、 T N F— α 1 0 0 0単位 Zm 1 群及び A Z + T N F— α併用群の 4 群を 3 日間培養した。 培養後、 各培養細胞浮遊液をエツ ペン ドルフチューブに取り、 0. 2 % ト リ パンブルー含 有リ ン酸緩衝液で染色した後、 生細胞数を血球計算盤に て計測した。
上記細胞を 1 X 1 07 個/ m l に調整し、 その 1 0 0 〃 1 にフルォ レセイ ンイ ソチアネー ト （ F I T C ) 標識 抗ヒ ト C D 1 1抗体 （M o 1 、 コールタ一社製） 5 β 1 あるいは F I T C標識抗ヒ ト C D 1 4抗体 （ L e u Μ 1 3、 べク ト ン · ディ ンソ ン社製） 2 0 1 を添加し、 氷 上で 3 0分間暗所にて反応させた。 反応後、 0. 1 % B S A (牛血清アルプミ ン、 シグマ社製） 含有 P B S (リ ン酸緩衝液、 日水製薬社製） で 2回洗浄し、 最終的 に 5 0 0 1 に懸濁させた後、 フローサイ トメ ト リ ー法 による、 プロフアイノレ I I (コールター社製） にて蛍光 強度を測定した。
その結果を表 4に示す。
表 4
Figure imgf000056_0001
該表より、 コ ン ト ロール群、 A Z群、 T N F — び群及 び A Z + T N F — び群を比較すると、 A Z + T N F — 群 （併用群） では、 他の 3群に比較して早期より細胞増 殖抑制効果が認められ、 単球 · マク ロフ ァ ージ系への分 化誘導をより促進しているこ とが認められた。
薬理試験例 6
A 3 7 5 S 2 ヒ トメ ラノ 一マ細胞に対する A Z と I F N 一 7 との併用効果試験
継代培養によって得られた細胞株 （A 3 7 5 S 2株 ： A T C C C R L 1 8 7 2 ) を、 P B S ( ' 溶液 （日水 製薬社製） で 2回洗浄し、 0. 0 5 % ト リ プシ ン （フ ロ 一社製） で細胞を剥がした後、 ピペッティ ングにより、 イーグ ス M E M (Eagle's-MEM, E - M E M) 培地 （日 水製薬社製） + 1 0 % F B S (ギブコ社製） の培養液に 細胞を懸濁させた。 2 5 °C、 1 2 0 0回転、 5分間の遠 心洗浄 （ 0 5 P R— 2 2型、 日立製作所社製） した細胞 を再び同培養液に懸濁させた。 0. 2 % ト リパンブルー (和光純薬社製） 溶液にて染色後、 生細胞数を光学顕微 鏡 （B H— 2、 ォ リ ンパス光学工業社製） 下で計測し、 2 X 1 04 細胞 Zm 1 に希釈調製した。
9 6 ゥ ヱルマイ ク ロプレー 卜 （コ一ニング社製） 上の 各ゥエルに培養液 （ E — M E M + 1 0 % F B S ) を
0. 1 m 1 ノウェルずつ添加した。 次にマイ ク ロプレー 卜の 1行目に 1 2 0 g Zm l の A Z O . 1 m l ずつを 加え、 同 A Zの 2倍段階希釈を 2行目以降 1 1行目まで 繰り返した。 このように希釈系列を作った 9 6 ゥヱルマ イク口プレー トのすべてのゥエルに、 最終濃度が 0、 2. 5、 2 5、 2 5 0 UZm l となる量の I F N— ァ (林原生物研究所社製） を含む A 3 7 5 S 2細胞浮遊液 (2 X 1 04 細胞 Zm l ) を 0. 1 m lずつ加えた。 このマイクロプレー トを 3 7 °C、 5 %C 02 条件下で 7日間 C 02 イ ンキュベータ一 （ナブコ社製） で培養し た。 培養後、 0. 0 5 %ニュー トラルレッ ド （メルク社 製） を含む E—ME M溶液を各ゥヱルに 0. I m g/ゥ ェルずつ加え、 更に 3 7 °C、 5 % C 02 条件下に 2時間 培養した。
その後、 培地をすてて P B S C_) 溶液を各ゥエルに添 加し、 洗浄操作を行なった。 抽出液 （ 0. 1 M
N a H2 P 04 緩衝液 + 5 0 %エタノ ール、 和光純薬社 製） を各ゥヱルに 0. 1 m 1ノウヱルずつ添加し、 マイ クロ ミ キサー （MX— 4、 三光純薬社製） で攪拌後、 O D 5 4 0 n mの吸光度 （タイターテッ クマルチスキヤ ン MMC、 フロー社製） を測定した。 この吸光度から、 生細胞に取り込まれた色素量を測定し、 下式に従って細 胞増殖率 （％) を求めた。
細胞増殖率 （％) =MXC X 1 0 0 [式中 Mは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、 Cは コ ン ト ロール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。 ] 得られた結果を下記表 5に示す。
表 5
I F N - r A Z ( ju g /m 1 )
(U /m 1 ) 0 0.407 0.815
0 100.0± 4.9 87.4± 4.9 82.2± 3.8
2. 5 93.0± 3 · 2 86.2± 2.0 75.2± 6.5
2 5 67.7± 5.1 62.3± 4.0 45.7 ± 3.2
2 5 0 32.3± 3.2 29.1± 4.5 21 · 0± 5.0
I F N - r A Z ( g /m 1 )
(U/m 1 ) 1.63 3.25 7.5
0 62.7 ± 8.3 47.5± 4.1 25.1± 1.6
2. 5 56.1± 2 · 8 36.2± 1.9 20.6± 1.8
2 5 33.3± 5.8 16.0± 1.8 9.6± 0.6
2 5 0 20.4+ 4.9 12.4土 0.7 10.4± 1.1
Figure imgf000060_0001
上記表 5より、 A 3 7 5 S 2細胞に対する増殖抑制作 用において、 I F N—ァ と A Zとの併用効果が確認され た。
薬理試験例 7
A 3 7 5 S 2 ヒ トメ ラノ一マ細胞に対する A Zと I L一 1 との併用効果試験
継代培養によつて得られた細胞株 （A 3 7 5 S 2株 ： A T C C C R L 1 8 7 2 ) を、 P B S (— ) 溶液 （日水 製薬社製） で 2回洗浄し、 0. 0 5 % 卜 リブシ ン （フ ロ —社製） で細胞を剥がした後、 ピベッティ ングにより、 E— MEM培地 （日水製薬社製） + 1 0 %F B S (ギブ コ社製） の培養液に細胞を懸濁させた。 2 5 °C、 1 2 0 0回転、 5分間の遠心洗浄 （ 0 5 P R— 2 2型、 日立製 作所社製） した細胞を再び同培養液に懸濁させた。 0. 2 %ト リパンブルー （和光純薬社製） 溶液にて染色後、 生細胞数を光学顕微鏡 （B H - 2、 ォ リ ンパス光学工業 社製） 下で計測し、 2 X 1 04 細胞 Zm 1 に希釈調製し た。
9 6ゥヱルマイ ク ロプレー ト （コ一ニング社製） 上の 各ゥヱルに培養液 （E— M E M+ 1 0 % F B S ) を
0. 1 m l /ゥヱルずつ添加した。 次にマイ ク ロプレー トの A列に 0. 4 11 8ノ11 1 の 1 1^ー 1を 0. 1 m l ず つを加え、 同 I L一 1の 2倍段階希釈を H列まで繰り返 した。 このよ う に希釈系列を作った 9 6 ゥヱルマイ ク ロ プレー トの 1行目以外のすべてのゥヱル 、 最終濃度が
0、 1、 3、 1 0、 3 0 g Zm l となる量の A Zを含 む A 3 7 5 S 2細胞浮遊液 （2 X 1 04 細胞 Zm l ) を 0. 1 m 1ずつ加えた。
このマイ ク ロプレー トを 3 7 °C、 5 % C 02 条件下で 4日間 C 02 イ ンキュベータ一 （ナブコ社製） で培養し た。 培^後、 ◦ . 0 5 %ニュー トラルレッ ド （メルク社 製） を含む E— M E M溶液を各ゥヱルに 0. l m g Zゥ ヱルずつ加え、 更に 3 7 °C、 5 % C 02 条件下に 2時間
¾ した O
その後、 培地をすてて P B S (— ) 溶液を各ゥヱルに添 加し、 洗浄操作を行なった。 抽出液 （ 0. 1 M
N a H 2 P 04 緩衝液 + 5 0 %エタ ノ ール、 和光純薬社 製） を各ゥヱルに 0. 1 m 1 Zゥエルずつ添加し、 マイ クロ ミキサー （MX— 4、 三光純薬社製） で攪拌後、 0 D 5 4 0 n mの吸光度 （タイ夕一テックマルチスキヤ ン MM C、 フ ロー社製） を測定した。 この吸光度から、 生細胞に取り込まれた色素量を測定し、 下式に従って細 胞増殖率 （％) を求めた。 細胞増殖率 （ ） =MXC X 1 0 0 [式中 Mは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、 Cは コ ン ト口.ール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。 ] 卜
得られた結果を下記表 6に示す。 表 6
A Z I L一 1 (p g/m 1 )
(^g/ml) 0 3.13
0 100.0±1.5 115.6± 2.6 112.5± 1.3
1 93.2±3.9 97.3±1.8 87.4± 2.5
3 80.5±0.9 68.7±0.8 63.0± 3.7
1 0 51.3± 5.9 42.7± 2.6 32.1+0.8
3 ひ 36.2± 1. 2 20.9 + 0.8 13.7± 1.1 Δ 7 I L— 1 ( g /m 1 )
(f «l σS / m ui 1 ^ 6.25 12.5 25
π υ 106.8+ 0.9 77.3+ 1.8 44.6+ 2.3 丄 75.8± 1.3 42.3± 1 · 5 17.1± 1.8
3 49.5± 1.3 23 · 3± 1.4 7.6± 0.5
1 0 19 · 5± 0.2 10.2土 0.2 5.6± 0.1
3 0 8.2± 0 · 1 6.1± 0.9 4.5± 1.1
Figure imgf000063_0001
上記表 6より、 A 3 7 5 S 2細胞に対する増殖抑制作 用において、 I L一 1 と A Z との併用効果が確認された 薬理試験例 8
H e p 3 B細胞に対する A Z と T G F— 3との併用効果 継代培養によって得られた細胞株 （H e p 3 B株 ： P T 1
6 2
A T C C H B 8 0 6 4) を、 P B S (— ) 溶液 （日水製 薬社製） で 2回洗浄し、 0. 0 5 % ト リ プシン （フ ロー 社製） で細胞を剥がした後、 ピペッティ ングにより、 ダ ルべッ コ— ME M培地 （フロー社製） + 1 %非必須ア ミ ノ酸 （フ ロ一社製） + 2 mM L—グルタ ミ ン （フ ロー 社製） の培地 細胞を懸濁させた。 2 5 °C、 1 2 0 0回 転、 5分間の遠心洗浄 （0 5 P R— 2 2型、 日立製作所 社製） にて 3回洗浄後、 細胞を再び同培地に懸濁させた。 0. 2 % ト リパンブルー （和光純薬社製） 溶液にて染色 後、 生細胞数を光学顕微鏡 （B H— 2、 オ リ ンパス光学 工業社製） 下で計測し、 1 X 1 06 細胞 Zm 1 に希釈調 製した。
9 6ウェルマイ ク 口プレー ト （コ一二ング社製） 上の 各ゥヱルに、 0、 0. 5及び 1. 5 n gZm l の T G F 一 並びに 0、 0. 3、 1、 3、 1 0及び 3 0 g/ m l の A Zを、 それぞれ 0. 0 2 5 m l Zゥエルずつ添 加した。 次にすべてのゥヱルに、 H e p 3 B細胞浮遊液 (1 X 1 0° 細胞/ m l ) を 0. 0 5 m lずつ加えた。 このマイ ク ロプレー トを 3 7 °C、 5 % C 02 条件下で 24時間 C 02 イ ンキュベーター （ナブコ社製） で培養 した。 培養後、 2. 5 m g/m l の MT T (3 — (4, 5—ジメ チルー 2—チアゾリ ル） 一 2， 5—ジフ エニル - 2 H テ トラゾリ ゥム、 和光純薬社製） を含む
P B S (— ) 溶液 （日水製薬社製） を各ゥヱルに 0. 0 1 111 1 /ゥヱルずっ加ぇ、 更に 3 7 °( 、 5 % C 02 条件下 に 3時間培養した。
その後、 溶出液 （ 1 0 % S D S + 0. 0 1 N H C 1 和光純薬社製） を各ゥエルに 0. 1 m 1 /ゥェルずつ添 加し、 O D 5 8 0 n mの吸光度 （タイ ターテッ クマルチ スキャ ン MM C、 フ ロー社製） を測定した。 この吸光度 から、 生細胞に取り込まれた色素量を測定し、 下式に従 つて細胞増殖率 （％) を求めた。
細胞増殖率，（ ） =M/C X 1 0 0
[式中 Mは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、 Cは コ ン トロール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。 ] また、 培養した上記細胞をへキス ト 3 3 2 5 8色素 (Hoechst stain kit,フ ロー社製） にて核染色し、 蛍光 顕微鏡 （ニコ ン（Nikon icrophot FXA) ) 下で観察した 細胞増殖率の結果を下記表 7に示す。 表 7
Figure imgf000066_0001
また核染色後の蛍光顕微鏡観察の結果より、 A Z及び T G F — ^をそれぞれ単独で用いて作用させた場合、 ク ロマチンの凝集、 核濃縮が認められ、 両者を併用した場 合には更にその程度の増強が観察された。 従って、 H e p 3 B細胞に対する量薬剤の細胞傷害作用がアポ ト 一シスに基計づく ものであり、 両者を併用 した場合にアポ トーシスが更に増強されるこ とが示唆された。
以上より、 H e p 3 B細胞に対する増殖抑制作用にお いて、 T G F — ^ と A Z との併用効果が確認された。
以下、'カルボスチ リ ル誘導体とサイ ト 力イ ン との併用 による本発明制癌剤の製剤例を挙げる。
製剤例 1
( 1 )
6 - [ 4 - ( 3 , 4 — ジメ 卜キシベンゾィル） 一 1 — ピ ペラ ジニル 1 — 3， 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル
5 m g デンプン 1 3 2 m g マグネシウムステア レー ト 1 8 m g 乳糖 4 5 m g
2 0 0 m g
1錠中、 上記組成物の錠剤を製造した
( 2 )
T N F — ひ 1 x 1 0 単位 Z m 1 ッウイ ー ン 8 0 0 . 0 1 m g / m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g m 1 システィ ン O . l m g Zm l H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1 O m g Zm l 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （0. 2 2 z mメ ンブラ ン フィ ルタ一使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （2 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶 解して、 上記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され る O
( 3 )
Figure imgf000068_0001
ッウィ ーン 8 0 0. 0 1 m g / 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g m 1 システィ ン 0. 1 m g m I
H S A (ヒ 卜血清アルブミ ン） 1. 0 m /m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸ークェン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 mメ ンブラ ン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。 該製剤 （ 3 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m l に溶 解して、 上記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され る o
( 4 )
L T (T N F— ^) 1 x 1 0 " 単位/ m l ッウ ィ ー ン 8 0 0. 0 1 m /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g /m 1 システィ ン O . l m g Zm l H S A (ヒ ト血清ァルブ ミ ン） 1. 0 m g Zm 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 /z mメ ンブラ ン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 4 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶 解して、 上記'（ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され o
( 5 )
イ ンタ ー ロ イ キ ン 一 1 ^ 0. 0 8 ^ g /m 1 ッウ イ ーン 8 0 O . O l m g Zm l デキス トラ ン 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g / m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クエン^—クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 z mメ ンブラ ン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつパイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製 形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 5 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶 解して、 前記，（ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され る O
( 6 )
ガンマ一 ' イ ンタ一フエロ ン 4 2単位 Zm 1 ッウイ ーン 8 0 0. 0 1 m g / 1 デキス トラ ン 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A 〔ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g /m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 mメ ンブラ ン フィ ルタ一使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 6 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m l に溶 解して、'前記 （ 1 ) の製剤と同時に、 又は別々に利用さ れ 。
( 7 )
ァノレフ ァ ' イ ンタ ーフ ェ ロ ン 4 5単位/ m 1 ッウ ィ ー ン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 o m g / m 1 システィ ン 0. I m g Zm l
H S A (ヒ ト血清アルブ ミ ン） 1 , 0 m g / 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェ ン酸一ク ェ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 inメ ンブラ ン フ ィ ルタ 一使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 7 ) は、 これを用時、 生理食塩水 l m l に溶 解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され る。
( 8 )
ベ—夕 — · ィ ン夕 一フ エ ロ ン 4 8単位 Zm 1 ッウイ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス 卜 ラ ン 4 0 1 5 m /m 1 システィ ン 0. 1 m g /m l H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g / 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 i mメ ンブラ ン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 8 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶 解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され 0
( 9 )
イ ンターロイキン一 2 0. 2 8 gZ m I ッウ イ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ 卜血清アルブ ミ ン） 1. 0 m g /m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸ークェン酸ナ 卜 リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 /z mメ ンブラ ン フ ィ ルタ ー使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 9 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶 解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用され る 0
( 1 0 )
イ ンタ 一ロイ キ ン一 4 0 β g / m I ッ ウ ィ ー ン 8 0 0 . 0 1 m /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g Z m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ ト血清アルブ ミ ン 1 . 0 m g / m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェ ン酸一 ク ェ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 ;z mメ ンブラ ン フ ィ ルタ ー使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 1 0 ) は、 これを用時、 生理食塩水 l m l に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
( 1 1 ) イ ンタ一ロイキン一 5 5 0 ^ g / m 1 ッウイ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m /m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g /m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 *( 0. 2 2 /z mメ ンブラン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （1 1 ) は、 これを用時、 生理食塩水 l m 1 に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
(1 2)
イ ンタ一ロイキン一 6 5 0 g m 1 ッウイ ーン 8 0 0. 0 1 m /m 1 デキス トラ ン 4 0 1 5 m /m 1 システィ ン 0. 1 g / m 1
H S A (ヒ 卜血清アルブミ ン） 1. 0 m g / m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸ークェン酸ナ 卜 リ ゥム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 z mメ ンブラ ン フ ィ ルタ 一使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。
該製剤 （ 1 2 ) は、 これを用時、 生理食塩水 l m l に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
( 1 3 )
イ ンタ ーロイ キ ン一 7 5 0 / g κ m 1 ッウ ィ ー ン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン' 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g Z m 1
H S A (ヒ ト血清アルブ ミ ン） 1. 0 m g m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸一ク ェ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 // mメ ンブラ ン フ ィ ルタ ー使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （ 1 '3 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる (1 4)
イ ンタ一ロイキン一 8 5 0 ^ g m 1 ッウイ ー ン 8 0 0. 0 1 m /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g m 1 システィ ン 0. 1 m g Zm 1
H S A (ヒ 卜血清アルブミ ン） 1. 0 m /m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸ークェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. メ ンブラン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （1.4) は、 これを用時、 生理食塩水 1 in 1 に 溶解して、 前記 （1) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる o
(1 )
イ ンタ一ロイキン一 9 5 0 ^ g Zm 1 ッウィ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス 卜ラ ン 4 0 1 5 m g /m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g / m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M ク ェ ン酸一クェ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 mメ ンブラ ン フ ィ ルタ 一使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （ 1 5 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる 0
( 1 6 )
イ ンタ 一ロイ キ ン一 1 0 5 Ό g / \ ッウ ィ ー ン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
H S A (ヒ 卜血清アルブ ミ ン 1. 0 m g Z m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェ ン酸一ク ェン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 / mメ ンブラ ン フィ ルダー使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （ 1 6 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
( 1 7 )
イ ンタ一ロイキン一 1 1 5 0 g / m 1 ッウィ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス トラ ン 4 0 1 5 m g m 1 システィ ン 0. 1 m g / 1
H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M クェン酸ーク 'ェン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. メ ンブラン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に 1 m 1 ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （1 7 ) は、 これを用時、 生理食塩水 1 πι 1 に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
(18)
イ ンタ一ロイキン一 1 2 0 Ό g / m I ッウイ ーン 8 0 0. 0 1 m g /m 1 デキス ト ラ ン 4 0 1 5 m g / m 1 システィ ン 0. 1 m g- / m I
H S Α (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g / m I 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 M ク ェン酸一ク ェ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に 加えて混合し、 混合物を瀘過 （ 0. 2 2 /z mメ ンブラ ン フィ ルター使用） 後、 瀘液を無菌的に l m l ずつバイァ ル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明 の制癌剤の有効成分の一方を含む制癌剤を調製した。
該製剤 （ 1 8 ) は、 これを用時、 生理食塩水 l m l に 溶解して、 前記 （ 1 ) の製剤と同時に又は別々に利用さ れる。
( 1 9 )
1 一ベン.ジル'一 6 — 〔 4 一 （ 3 , 4 — ジメ ト キ シベ ンゾ ィ ル） 一 1 — ピペラ ジニル〕 一 3， 4 — ジ ヒ ドロ カルボ スチ リ ノレ 1 5 0 g オール ' ト ラ ンス ' レチノ イ ン酸 1 5 g アビセル （商標名， 旭化成 （株） 製） 4 0 g コー ンスタ ーチ 3 0 g ステア リ ン酸マグネ シウ ム 2 g ヒ ドロキシプロ ピノレメ チノレセルロ ース 1 0 g ポ リ エチ レ ング リ コ ール一 6 0 0 0 3 g ヒマ シ油 4 0 g メ タ ノ ール 4 0 g 上記カルボスチ リ ル誘導体、 オール ト ラ ンス ， レチ ノ イ ン酸、 ア ビセル、 コーンスターチ及 ステア リ ン酸 マグネシウムを混合研磨後、 糖衣 R l 0 mmのキネで打 錠する。 得られた錠剤をヒ ドロキシプロ ピルメ チルセル ロース、 ポ リ エチ レングリ コール一 6 0 0 0、 ヒマシ油 及びメ タノ ールからなるフイ ノレムコ一ティ. ング剤で被覆 を行ない、 フィ ルムコーティ ング錠を製造する。
(2 0 )
1—ベンジルー 6— 〔4一 （3 , 4— ジメ トキシべンゾ ィル） 一 1ー ピペラジニル〕 一 3， 4ージヒ ドロカルボ スチ リ ゾレ 1 5 0. 0 g オール · トラ ンス ' レチノ イ ン酸 1 5. 0 g クェン酸 - 1. 0 g ラク トース 3 3. 5 g リ ン酸ニ力ルシゥ厶 7 0. 0 g プル口ニッ ク F— 6 8 3 0. 0 g ラウ リ ル硫酸ナ ト リ ウム 1 5. 0 g ポ リ ビニゾレピロ リ ドン 1 5. 0 g ポ リエチレングリ コール （カルボワ ッ クス 1 5 0 0 )
4. 5 g ポ リエチレングリ コール （カルボワ ッ ク ス 6 0 0 0 )
4 5. 0 g コーンスターチ 3 0. 0 g 乾燥ラウ リル硫酸ナ ト リ ウム 3 . 0 g 乾燥ステア リ ン酸マグネシウム 3 . 0 g エタノ一ノレ 適 量 上記力ルボスチリ ル誘導体、 オール ' トラ ンス ' レチ ノイ ン酸クェ ン酸、 ラク トース、 リ ン酸二カルシウム、 プルロニ,ッ ク F— 6 8及びラウ リル硫酸チ h リ ゥムを混 合する。 混合物を N o . 6 0 ス ク リ ー ンにて篩別し、 ポ リ ビニル.ピロ リ ドン、 カルボワ ッ クス 1 5 0 0及び力ル ボヮッ グス 6 0 0 0を含むアルコール性溶液で湿式粒状 化する。 必要に応じてアルコールを添加し、 粉末をべ一 ス ト状塊にする。 コーンスターチを添加し、 均一な粒子 が形成されるまで混合を続ける。 N o . 1 0 ス ク リ ー ン を通過させ、 ト レイに入れ、 1 0 0 °Cのオーブンで 1 2 〜 1 4時間乾燥する。 乾燥粒子を N 0 . 1 6 ス ク リ ー ン で篩別し、 乾燥ラゥ リ ル硫酸ナ ト リ ゥム及び乾燥ステア リ ン酸マグネシウムを加え、 混合し、 打錠機で所望の形 状に圧縮成形する。
上記芯部をワニスで処理し、 タルクを散布して湿気の 吸収を防止する。 芯部の周囲に下塗り層を被覆する。 内 服用のために充分な回数のワニス被覆を行なう。 錠剤を 完全に丸く且つ滑らかにするために、 更に下塗り層及び 平滑被覆を適用する。 所望の色合が得られるまで着色被 覆を行なう。 乾燥後、 被覆錠剤を磨いて均一な光沢の鍵 剤を調製する。
産業上の利用可能性
本発明の制癌剤は、 その特有の抗腫瘍作用、 細胞分化 誘導能に基づいて、 癌の治療剤と して有用である。

Claims

一般式
Ν Ν - R
α青
Figure imgf000083_0001
の
[式中 Rはフ エニル環上に低級範アルコキシ基及び低級ァ ルキル基から選ばれる基の 1 3個を有するこ とのあ るベンゾィル基を示す。 カルボスチ リ ル骨格の 3位と 4位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。 ] で表されるカルボスチ リ ル誘導体及びノ又はその医薬 と して許容される塩と、 サイ ト カイ ン及び 又はレチ ノィ ドとを有効成分と して含有するこ とを特徴とする 制癌剤。
. カルボスチ リ ル誘導体が 6— [ 4 一 （ 3 , 4 —ジ メ トキシベンゾィノレ） 一 1 — ピペラ ジニル] 一 3 , 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル、 Ί 一 [ 4— ( 3 4 , 5 — ト リ メ トキシベンゾィノレ） _ 1 ー ピペラ ジニル] ―
3 , 4 — ジ ヒ ドロ カルボスチ リ ル、 7 — [ 4 - ( 3 ,
4 — ジメ トキシベンゾィ ノレ） 一 1 ー ピペラ ジニル] ― 3 , 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル及び 6 _ [ 4 — （ 4 δ 2 '
—エ トキシベンゾィル） 一 1 ーピペラジニル] — 3 , 4—ジヒ ドロカルボスチリルから選ばれる少なく と も 1種である請求の範囲 1に記載の制癌剤。
3. サイ ト力イ ンがヒ 卜 T N F— ひ 、 ヒ ト T N F— 、 5 ヒ ト I F N— α、 ヒ 卜 I F Ν— yS、 ヒ ト I F N— ァ、 ヒ ト I L一 1 α、 ヒ ト I L— 1 ^3及びヒ 卜 T G F—；5 から選ばれる少なく とも 1種である請求の範囲 1に記 載の制癌剤。
4. レチノイ ドがレチノイ ン酸、 レチノ一ル、 レチナ0 ール及びレチニルエステルから選ばれる少なく とも 1 種である請求の範囲 1に記載の制癌剤。
5. サイ トカイ ンが天然型ヒ ト T N F— な 、 組換え型 ヒ ト T N F— 又はヒ ト T N F— α活性を有する ヒ ト T N F - α誘導体である請求の範囲 3に記載の制癌剤。5 6. サイ ト力イ ンが天然型ヒ ト I F Ν— ァ、 組換え型 ヒ ト I F N— ァ又はヒ ト I F N— ァ活性を有する ヒ ト ' I F Ν - 7誘導体である請求の範囲 3に記載の制癌剤。
7. サイ ト力イ ンが天然型ヒ ト I L一 1 3、 組換え型 ヒ ト I L一 1 又はヒ ト I L— 1 ^活性を有する ヒ 卜0 I L - 1 ^誘導体である請求の範囲 3に記載の制癌剤。
8. サイ 卜力イ ンが天然型ヒ 卜 T G F— ^、 組換え型 ヒ ト T G F— ^又はヒ 卜 T G F— /?活性を有する ヒ 卜 T G F—； 3誘導体である請求の範囲 3 に記載の制癌剤 . 一般式
N N - R
Figure imgf000085_0001
[式中 Rはフ ニニル環上に低級アルコキシ基及び低級ァ ルキル基から選ばれる基の 1〜 3個を有する こ とのあ るベンゾィル基を示す。 カルボスチ リ ル骨格の 3位と 4位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。 ] で表されるカルボスチ リ ル誘導体及び Z又はその医薬 と して許容される塩と、 サイ ト カイ ン及び/又は レチ ノ ィ ドとを有効成分と して含有する制癌剤の薬理有効 量を患者に投与して癌を治療する方法。
0 . カルボスチ リ ル誘導体が 6— [ 4 一 （ 3， 4 — ジメ トキシベンゾィル） 一 1 — ピペラ ジニル Ί — 3，
4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル、 7— [ 4 - ( 3 , 4 , 5 — ト リ メ トキシベンゾィ ル） _ 1 — ピペラ ジニル] — 3， 4 — ジ ヒ ドロカルボスチ リ ル、 7 — [ 4 — ( 3 4 ー ジメ トキシベンゾィノレ） 一 1 ー ピペラ ジニル] ― 3 , 4 — ジ ヒ ドロ力ノレボスチ リ ル及び 6 — [ 4 — （ 4 —エトキシベンゾィル） 一 1—ピペラジニル] 一 3, 4ージヒ ドロカルボスチリノレから選ばれる少なく とも 1種である請求の範囲 9に記載の癌の治療方法。
1 1. サイ ト力イ ンがヒ ト T N F— な 、 ヒ ト T N F— 、 ヒ 卜 I F N— α、 ヒ ト I F N— 、 ヒ ト I F N— ァ 、 ヒ ト I L一 1 、 ヒ ト I L— 1 ^及びヒ ト T G F 一 y8から選ばれる少なく とも 1種である請求の範囲 9 に記載の癌の治療方法。
1 2. レチノイ ドがレチノイ ン酸、 レチノ 一ル、 レチ ナ一ル及びレチニルエステルから選ばれる少なく とも
1種である請求の範囲 9に記載の癌の治療方法。
1 3. サイ トカイ ンが天然型ヒ 卜 T N F— α、 組換え 型ヒ ト T N F— α又はヒ ト T N F— ひ活性を有する ヒ ト T N F— 誘導体である請求の範囲 9に記載の癌の 治療方法。
1 4. 'サイ トカイ ンが天然型ヒ ト I F Ν— 7、 組換え 型ヒ ト I F N—ァ又はヒ 卜 r F N— ァ活性を有する ヒ ト I F N— ァ誘導体である請求の範囲 1 1に記載の癌 の治療方法。
1 5. サイ 卜力イ ンが天然型ヒ ト I L— 1 、 組換え 型ヒ ト I L一 1 ^又はヒ ト I L一 1 /9活性を有する ヒ ト I L— 1 ^誘導体である請求の範囲 1 1に記載の癌 の治療方法。
6. サイ トカイ ンが天然型ヒ ト T G F― ^、 組換え 型ヒ 卜 T G F— 又はヒ ト T G F— ^活性を有する ヒ ト T G F— 誘導体である請求の範囲 1 1に記載の癌 の治療方法。
7. サイ ト力イ ンの薬理有効量が成人一人一日当り蛋 白量と して' 0. 1〜 ： L O O O ^ gZ体重の範囲から選 択され、 レチノ イ ドのそれが 0. 0 1〜 1 0 m g/ k gの,範囲から選択され、 また一般式 （ 1 ) のカルボ スチリル誘導体又はその塩のそれが 3〜 1 8 0 0 m gZ体重の範囲から選択される請求の範囲 9に記載の癌 の治療方法。
8. サイ ト力イ ンの薬理有効量が成人一人一日当り蛋 白量として 1〜 1 0 0 β gZ体重の範囲から選択され、 レチノイ ドのそれが 0. 0 1〜： L O m gZk gの範囲 から選択され、 また一般式 （ 1 ) のカルボスチリ ル誘 導体又はその塩のそれが 1 0〜 3 0 O m gZ体重の範 囲から,選択される請求の範囲 9に記載の癌の治療方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0623598A1 (en) * 1992-08-19 1994-11-09 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Apoptosis regulator
US5504093A (en) * 1994-08-01 1996-04-02 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for inhibiting nucleoside and nucleobase transport in mammalian cells, and method for inhibition of DNA virus replication
WO1998046229A1 (fr) * 1995-06-21 1998-10-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Inhibiteurs de la production d'il-8 et du mcaf
WO1998048807A1 (fr) * 1997-04-25 1998-11-05 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Inhibiteurs de la synthese de l'hyaluronate
WO2003066076A1 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 Sundory Co., Ltd. Procede de protection d'un corps vivant de facteurs exterieurs, et composition associee

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5777676A (en) * 1980-10-31 1982-05-15 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Carbostyril derivative
JPH02304027A (ja) * 1989-04-11 1990-12-17 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh 前新生物性病変の全身的治療のための少なくとも１種のサイトカインを含む製剤組成物の使用
JPH0399011A (ja) * 1989-08-10 1991-04-24 Efamol Holdings Plc 医薬組成物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5777676A (en) * 1980-10-31 1982-05-15 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Carbostyril derivative
JPH02304027A (ja) * 1989-04-11 1990-12-17 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh 前新生物性病変の全身的治療のための少なくとも１種のサイトカインを含む製剤組成物の使用
JPH0399011A (ja) * 1989-08-10 1991-04-24 Efamol Holdings Plc 医薬組成物

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0623598A1 (en) * 1992-08-19 1994-11-09 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Apoptosis regulator
EP0623598A4 (en) * 1992-08-19 1997-05-02 Otsuka Pharma Co Ltd APOPTOSIS REGULATOR.
US5691341A (en) * 1992-08-19 1997-11-25 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Apoptosis regulating composition
US5504093A (en) * 1994-08-01 1996-04-02 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for inhibiting nucleoside and nucleobase transport in mammalian cells, and method for inhibition of DNA virus replication
US5670520A (en) * 1994-08-01 1997-09-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for inhibiting virus replication in mammalian cells using carbostyil derivatives
WO1998046229A1 (fr) * 1995-06-21 1998-10-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Inhibiteurs de la production d'il-8 et du mcaf
WO1998048807A1 (fr) * 1997-04-25 1998-11-05 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Inhibiteurs de la synthese de l'hyaluronate
WO2003066076A1 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 Sundory Co., Ltd. Procede de protection d'un corps vivant de facteurs exterieurs, et composition associee

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