WO1993008213A1

WO1993008213A1 - Nouvelle substance physiologiquement active appelee l'epimorphine, gene codant pour cette substance, et anticorps de l'epimorphine

Info

Publication number: WO1993008213A1
Application number: PCT/JP1992/001340
Authority: WO
Inventors: Yohei Hirai; Makoto Takashina; Kyoko Takebe
Original assignee: Biomaterial Research Institute Co., Ltd.
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 1993-04-29
Also published as: JPH0625295A; DE69229219T2; ATE180275T1; JP2849517B2; EP0562123B1; CA2098397C; EP0562123A4; US5726298A; DE69229219D1; CA2098397A1; EP0562123A1

Description

明細書新規生理活性物質ェピモルフイン、それをコードする遺伝子及びェピモルフィンに対する抗体

技術分野

本発明は、少なくともマウスからヒ卜に至る哺乳動物の皮膚、肺、腸等の間充織組織に広く存在し、上皮組織の形態形成に必須な生理活性物質（本発明者らはェピモルフインと命名）に関するもので、更に詳しくは、当該生理活性物質ェピモルフィン、ェピモルフィンの改変体、ェピモルフィンをコードする遺伝子、及びェピモルフィンに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に関するものである。本発明は上皮形態の異常に起因する疾患の発症機序解明ならびにそれらの疾患の診断法、治療法の開発、あるいは新たな創傷治癒法の開発に有用な手段を提供するものである。背景技術

上皮の正常な組織化、形態形成は間充織のなんらかの制御を受けていること力、ら、また上皮形態の異常に起因する疾患の多ぐはそのまわりに存在する間充織が原因となることから、古くから間充織が上皮の形態形成を支持するメカニズムについて研究がなされている。しかしながら、実際に上皮の形態形成を制御する分子の単離、精製及びその構造解析についての研究は、研究対象が複雑な系の中で時間的、空間的な制御を受けて発現する物質のために単純化された培養系での実験が難しく、未だ大きな進展が見られていない。

上皮形態の異常に起因する疾患の発症機序の解明ならびにそれらの疾患の治療法の開発等を実現するためには、間充織細胞が作る上記のような上皮形態を制御する作用を有する生理活性物質の単離、精製及びその構造解明等が不可欠の前提であり、当該分子の単離、精製及び構造解明等を早期に達成する事が当該分野における重要課題となつて t、た。

発明の概要

そこで本発明者らは、このような課題を解決することを目標として、まず形態形成の盛んに行われている実験動物マウスの胎児皮膚組織を用いて、生体内と同様な形態形成が行われ得る、生体外培養実験系を確立した。この技術の特徵は、生体から取り出 2 した細胞を上皮細胞と間充織細胞に分離した後、従来であれば、藺充織細胞の単層培養を行ってその生成物を調べる方法が採られていたのに対し、分離された間充織細胞を集塊状にして培養るにある。

本発明者らは、この培養方法を用いて、マウス胎児皮膚から分離した上皮が集塊状の間充織細胞と接触した時にのみ、生体外でも正常な形態形成を行うことを見いだした。

そこで、本発明者らはこの集塊状の間充織細胞が作り出す、上皮の形態形成を支持する物質を調べるため、集塊状で培養した間充織細胞を免疫原としてラッ卜に免疫し、得られたマウス間充織細胞に対するラットのモ 'ノクローナル抗体のうちから、マウス間充織に結合することにより上皮形態形成を阻害する作用を持つ抗体を選び出した。次に、本発明者らはこの抗体が結合する物質、即ち間充織成分中に存在し上皮の形態形成を支持する新規な物質を、この抗体を用いて探索した結果、目的どする新規生理活性物質を見い出し、更にその物質 (ェピモルフイン）を単離し、その構造、即ちその遺伝子配列とァミノ酸配列を明らかにすることに始めて成功した。さらに、本癸明者らは得られた遺伝子を用いて、マウスェピモルフインの他のアイソフォーム 2種、及びそれぞれに対応するヒトェピモルフィンとそのアイソフォーム 2種を同定することに成功した。

さらには、上記で得られた遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んだ後、動物細胞もしくは大腸菌に導入して発現させることによりェピモルフィンを人工的に作ることが可能になつた。このことは以下の方法により明らかにされた。

. これらの生成物はいずれも、上皮とェピモルフインを作れない間充織細胞株の組合せ培養実験に加えることにより、正常な上皮の形態形成を行わせる作用を有することが分かった。即ち、本発明者らはェピモルフインを作る能力をほとんど失っていることがその生成物の解析から明かな間充織細胞株と胎児の上皮組織の組合せ培養を行った場合、上皮の正常な形態形成が見られないが、この間充織細胞株にェピモルフィン遺伝子を導入して強制発現させるか、この培養実験の培養液中にェピモルフィンを加えることにより、正常な上皮の形態形成が行われる様になるという事実から、当該生成物が前記上皮の形態形成作用を有するものであることを確認した。また、本発明者らはェピモルフィンには、細胞膜結合型と分泌型が存在することを見出した。細胞膜結合型のェピモルフインは、ポリペプチドのカルボキシ末端に疎水性のアミノ酸配列を持ち、マウスェピモルフィン、その 2種のアイソフォームの内の一つであるアイソフォーム A、ヒトェピモルフィンおよびその 2種のアイソフオームの内の一つであるアイソフォーム Aが相当する。上記の細胞膜結合型のェピモルフインについて、細胞膜結合部分である疎水性蛋白質部分を含む力ルボキシ末端から 5分の 1程度までのポリぺプチドを取り除くかあるいは非疎水性ポリぺピチドに置換することにより、可溶性の、すなわち培養動物細胞から培養液中に分泌されかつ天然のェピモルフィンよりも精製分離の容易な形態の改変ェピモルフィンを作ることに成功した。これらの改変ェピモルフインは、アイソフォームを含めた 3種に共通するアミノ酸配列で構成されており、得られた改変ェピモルフインは、高い可溶性を有し、かつ天然のェピモルフインと同様に、正常な上皮の形態形成を行わせることが分かった。

さらに、本明者らは上記方法で得られたェピモルフィンの完全体もしくはその一部分を用いて、当該ェピモルフィンが由来する動物種と異なるゥサギ、ラット、マウス等の動物に免疫を行い、当該ェピモルフインに特に強く結合するポリクロ一ナル抗体及びモノクローナル抗体を得ることにも成功した。

以上の結果、本発明者らは、上皮の形態形成に必須な新規生理活性物質ェピモルフィン、及び当該ェピモルフインをコードする遺伝子の同定、遺伝子組替え技術を用いた同物質及び同物質と同等の機能を有し、かつ高い可溶性を有する改変ェピモルフィンの製造、及び同物質の発現調査や精製に利用し得るポリクローナル抗体とモノクロ一ナル抗体の製造を完成し、上皮形態の異常に起因する疾患の発症機序解明ならびにそれらの疾患の診断法、洽療法の開発、あるいは新たな創傷治癒法の開発に有用な材料を提供することが可能になった。

即ち、本発明の目的は、少なくともマウスからヒ卜に至る哺乳動物の皮膚、肺、腸等の間充織に存在し、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列と相捕的な塩基配列で構成される遺伝子プローブとハイブリダィズする遺伝子によつて発現され得る新規生理活性物質ェピモルフィンを提供することでめる。

また、本発明の目的は、ァミノ末端のアミノ酸残基の構造が、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列である前記の新規生理活性物質ェピモルフィンを提供することである。

また、本発明の目的は、ヒト由来の間充織細胞が作る、配列表の配列番号 3、 4または 5のアミノ酸配列で表される上皮の形態形成に必須な新規生理活性物質ヒトェピモルフィン、及び当該ヒトェピモルフィンのアイソフォームを提供することである。

ここで、配列表の配列番号 3は、ヒトェピモルフィンのアミノ酸配列を、配列表の配列番号 4は、別のヒトェピモルフイン（ァイソフォーム A) のアミノ酸配列を、そして配列表の配列番号 5は、別のヒトェピモルフイン (ァイソフォーム B ) のアミノ酸配列を、それぞれ示す。

また、本発明の目的は、前記ヒトェピモルフイン、及び当該ヒトェピモルフィンのァイソフォームをコードする、配列表の配列番号 6、 7、または 8の塩基配列で表される遺伝子を提供することである。

ここで、配列表の配列番号 6は、ヒトェピモルフィンをコ一ドする遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号 7は、別のヒトェピモルフィン（アイソフォーム A) をコードする遺伝子の塩基配列を、そして、配列表の配列番号 8は、別のヒトェピモルフィン（ァイソフォーム B ) をコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ示す。

また、本発明の目的は、マウス由来の間充織細胞が作る、配列表の配列番号 9、 1 0または 1 1のアミノ酸配列で表される上皮の形態形成に必須な新規生理活性物質マウスェピモルフィン、及び当該マウスェピモルフィンのァイソフォームを提供することである。

ここで、配列表の配列番号 9は、マウスェピモルフインのアミノ酸配列を、配列表の配列番号 1 0は、別のマウスェピモルフイン（ァイソフォーム A) のアミノ酸配列を、そして配列表の配列番号 1 1は、別のマウスェピモルフイン（ァイソフォーム B ) のアミノ酸配列を、それぞれ示す。

また、本発明の目的は、前記マウスェピモルフイン、及び当該マウスェピモルフインのァイソフォームをコードする、配列表の配列番号 1 2、 1 3、または 1 4の塩基配列で表される遺伝子を提供することである。ここで、配列表の配列番号 1 2は、マウスェピモルフィンをコ一ドする遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号 1 3は、別のマウスェピモルフィン（ァイソフォーム A) をコードする遺伝子の塩基配列を、そして、配列表の配列番号 1 4は、別のマウスェピモルフイン（ァイソフォーム B ) をコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ示す。

また、本発明の目的は、前記ェピモルフインのカルボキシ末端の疎水性ァミノ酸配列を含む部分を取り除くか、もしくは非疎水性ポリぺプチドに置換することにより改変した、可溶性の、改変ェピモルフインを提供することである。

また、本発明の目的は、前記ヒトェピモルフィン、及び当該ヒトェピモルフィンのアイソフォームのカルボキシ末端の疎水性ァミノ酸配列を含む部分を取り除くか、もしくは非疎水性ポリぺプチドに置換することにより改変した、可溶性の、改変ヒトェピモルフイン、及び当該改変七トェピモルフィンのァイソフォームを提供することである。

また、本明の目的は、前記マウスェピモルフイン、及び当該マウスェピモルフィンのアイソフォームのカルボキシ末端の疎水性ァミノ酸配列を含む部分を取り除くか、もしくは非疎水性ポリぺプチドに置換することにより改変した、可溶性の、改変マウスェピモルフイン、及び当該改変マウスェピモルフィンのァイソフォームを提供することである。

また、本発明の目的は、前記ェピモルフインの完全体もしくはその一部を、ェピモルフインが由来する動物種と異なる種の動物に免疫し、その動物の血清から得られるェピモルフインに対するポリクロ一ナル抗体を提供

~9ることでめる ₀

また、本発明の巨的は、前記ェピモルフインに対するモノクローナル抗体を提供することである。

また、本発明の目的は、前記ェピモルフインの完全体もしくはその一部を、ェピモルフインが由来する動物種と異なる種の動物に免疫し、その動物から取り出した抗体産生細胞を、ミエローマ細胞と融合することにより得られるェピモルフィンに対するモノクローナル抗体を提供することである

また、本発明の目的は、前記マウスェピモルフインの完全体もしくはその一部を、ラッ卜に免疫し、そのラッ卜から取り出した抗体産生細胞を、ミエローマ細胞と融合することにより得られるェピモルフィンに対するモノクローナル抗体を提供することである。

また、本発明の目的は、前記ェピモルフインに対するモノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を利用した方法で、各ェピモルフィン及び各ェピモルフィンのアイソフォームを精製する方法を提供することである。

また、本発明の目的は、前記ェピモルフインに対するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を利用した方法で、各ェピモルフィン及び各ェピモルフィンのァイソフォームを検出する方法を提供することである。

更に、本発明の目的は、上皮の形態形成に必須な新規生理活性物質である前記ェピモルフィン及びェピモルフィンのァイソフォーム（アイソフォー λ、及びアイソフォーム Β ) 、前記ェピモルフインの改変体及びェピモルフィンのァイソフォームの改変体、前記ェピモルフィン及びェピモルフィンのァイソフォームに特に強く結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体等、上皮形態の異常に起因する疾患の発症機序の解明、ならびにそれらの疾患の診断法、治療法の開発、あるいは新たな創傷治療法の開発等に有用な材料を提供することである。図面の簡単な説明

第 1図は本発明の抗体によるェピモルフィン活性阻害における形態形成の異常を示す図、第 2図は本発明の抗体による精製ェピモルフインの電気泳動パターンを示す図、第 3図はェピモルフイン c D NAを導入する場合と、しない場合の N I HZ3 T 3のェピモルフイン発現を示すゥヱスタンブロッ卜の一例を示す図、第 4図はヒトェピモルフィン、ヒトェピモルフィンァイソフォーム Aおよび Bの各 c D NA (いずれも全長）をァガロースゲルで電気泳動した結果を示す図、第 5図はェピモルフィン c DNAを導入する場合と、しない場合の N I HZ3 T 3の培養下での肺上皮形態支持能を示す組織切片示す図、第 6図は第 5図で示した上皮形態を定量化したもの、すなわち培養 4日目で上皮のうちチューブ構造を保つて成長しているものの割合を示す図、第 7図は無細胞系で合成したヒトェピモルフインを S D S— P A G Eで電気泳動した結果を示す図、第 8図は C末端に疎水領域が存在するェピモルフインと、存在しないェピモルフィンの発現様式を示すウェスタンプロッ卜の例を示す図、第 9図は C末端に疎水領域が存在するェピモルフインと、存在しないェピモルフインが、いずれも肺上皮の形態形成能を有することを示す培養実験の観察像を示す図、第 1 0図は本発明の抗体によるェピモルフィン発現様式の調査結果を示す図で、ェピモルフィンを強く ¾現している部分は明るく染まっている。

発明の詳細な説明

以下、本発明について詳述する。

本発明のェピモルフィンは、 2 7 7ないし 2 8 9個のアミノ酸からなる蛋白質をコア蛋白質とし間充織細胞により生合成される物質で、動物細胞内では修飾されて、マウスでは約 1 5 O kダノレトン、ヒトでは約 7 O kダルトン（ドデシル硫酸ナトリウムーポリァクリルァミドゲル電気泳動法による）の分子量になる。遺伝子のスプライシングにより、少なくとも 3種類のタイプが存在し、そのうちの 1種類（ェピモルフィンァイソフォーム B ) は分泌型であるが、他の 2種類（ェピモルフィン、ェピモルフィンァイソフォーム A) は 2 0ないし 3 0アミノ酸残基の疎水性蛋白質の配列をカルボキシ末端に持っため細胞膜に結合する性質を有する。これらの分子は、間充織に存在して、上皮の形態を制御する重要な機能を有する。このことは、皮膚、小腸、肺等の器官培養に、本発明を完成するのに用いた、ェピモルフィンの機能を阻害する抗体を加えた実験や、ェピモルフィンを作る能力の低下した間充織細胞と上皮組織との組合せ培養実験において、ェピモルフィンが機能しない場合は正常な上皮の組織形成が行われない事実から確認できる。さらには、このことは、上記の組合わせ培養実験にェピモルフィンを添加すると、上皮の正常な組織形成能が回復する事実からも確じ、

抗体を用いた組織染色により、すなわち、組織の切片にェピモルフインの抗体を反応発色させる方法で、ェピモルフインの分布や存在の有無を調ベると、特に胎児発生時及び組織再生時に、組織形成が進行中の上皮と間充織の境界もしくはその近傍の、あるいは上皮の分裂が旺盛な部分の近傍の間充織内に、強く発現することが分かった。例えば、胎児発生期及び再生時の皮膚組織においては、ェピモルフィンは真皮と表皮の境界部分や毛包形成を誘導すると考えられる未熟毛包先端部近くの間充織に強く発現する。また、胎児発生期の小腸や肺においては、ェピモルフインは管腔形成や分枝の行われている上皮に接する間充織で強く発現する。

このように、組織形成時に、組織形成が行われている上皮の近くの間充織内でェピモルフィンが強く発現するが、ェピモルフィンは間充織細胞でのみ作られており、その時の上皮細胞内ではェピモルフィンは作られていない。

また、マウスのェピモルフィンとヒ卜のェピモルフィンはァミノ酸レべルで約 9 0 %の相同性があり、動物種が異なっても良く保存されている分子であることが分かった。

更に、本発明者らが見出したェピモルフイン分子群はいずれも、配列表の配列番号 2で表されるァミノ酸配列をァミノ末端に共通して有しており、そのァミノ末端ァミノ酸配列は既知の生体由来蛋白質のそれとは異なることが分かった。

また、このェピモルフイン分子群に共通する、ァミノ末端アミノ酸配列部分は、その部分をコードする遺伝子レベルにおいても配列表の配列番号 1で表される塩基配列と同一もしくはほとんど同一の塩基配列を有しているため、配列表の配列番号 1で表される塩基配列の相捕鎮をプローブとして、ェビモルフイン分子群をコードするすべての遺伝子を検出同定できることが分かった。

本発明のェピモルフインは広く動物の間充織細胞から得ることができるが、本発明においては、かかるェピモルフィンの活性を損なわない範囲で単に一部のアミノ酸を除去、挿入、修飾あるいは追加する等の改変を行つたものも本発明のェピモルフインに包含されることは言うまでもない。

また、ェピモルフインをコードする遺伝子も、同じアミノ酸をコードする塩基配列への置き換えはもとより、コードされるェピモルフィンが活性を損なわない範囲で、単に一部の塩基を除去、揷入、あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明のェピモルフィンをコ一ドする遺伝子に包含される。

なお、本明細書においては、塩基配列は、相捕的な塩基配列を省略し 1 本鎖のみを記載した。本発明の、ェピモルフィン及びそれをコードする遺伝子の DN A断片は、例えば以下の様な方法によって得ることができる。

(mRN Aの調整）

まず、皮膚、小腸、肺、胎盤、へその緒等の結合組織を、あるいは間充織由来の培養株化細胞をグァニジゥムチオシァネート等の水溶液中でホモジナイズし、 C h i r gw i nらの方法 [B i o chemi s t ry, 1

8, 5294-5299 (1979) J に従って塩化セシウム平衡密度勾配遠心法、あるいは、蔗糖密度勾配遠心法によって全 RNAを沈澱として分離する。分離後、フユノール抽出、エタノール沈澱により全 RNAを精製し、これをオリゴ（dT) セルロースカラムクロマトグラフィにかけて精製して目的のェピモルフインの mRNAを含むポリ（A) 含有 mRN A

(po l y (A) mRNA) を単離し mRNA群を得る。蔗糖密度勾配遠心法によってさらにこれら mRN A群を精製し目的とするェピモルフィンの mRN Aの含量を高めて遺伝子を得る可能性を高める。

(ェピモルフインをコードする遺伝子のクローニング）

この mRNA群を原料とし、以下に詳述する通り、例えば; Iファージべクタ一を用いる Huynhらの方法 [ 「DNA CloningJ , 49〜78, I RL Press, (1984) ] により c DN Aライブラリーを作成する。 —方、事前に、 mRN Aの調整において用いる生体細胞もしくは株化細胞が由来する動物（例えば、マウス）の間充織細胞を、上記と異なる種の動物（例えば、ラット）に免疫することにより抗体を得ておく。その抗体は、主としてェピモルフィンの活性を阻害する効果を有することによりェピモルフィンに反応することを確認できた抗ェピモルフィンモノクローナル抗体である。その抗体を用いて、 Y 0 u n gらの方法！: P r 0 c. Na t 1. Ac ad. S c i. USA, 80, 1194 (1983) 〕に従って c D N Aの翻訳産物と抗体の結合の有無によりェピモルフインをコードする遺伝子を同定 ·分離する。

以下に、クローニングの手順を述べる。

(第 1段階）

上記で調整した mRN A群と、例えばオリゴ（dT) プライマー等のプライマー D N Aとをハイブリダィズさせ、逆転写酵素及び D N Aポリメラーゼ Iを用い、例えば、 Gu b 1 e rらの方法（G e n e, 25, 263 (1983) ) に従い 2本鎮 cDNAを合成する。

なお、 Gub 1 e rらの方法とは、逆転写酵素を用いて mRN Aと相捕的な cDNAの 1本鍍を合成した後、大腸菌 RNas eH, DNAポリメラーゼ Iを順次加えて、 mRNAを cDNAに置き換えた 2本鎖 c DNA を得、最後に T 4 D N Aボリメラ一ゼを加えて 2本鎖 c D N Aの両端を平滑化することによって、 2本鎮cDNAを合成する方法である。

(第 2段階）

次いで、得られた cDNA鎖の両端末に、 E c 0 R I等の酵素切断サイトを片端に持つアダプタ一を付加する。

(第 3段階）

上記の cDNA鎮を発現可能なプロモーターを有する例えば; I g t 11 などの； Iファージベクターまたはプラスミドベクターの E c oR I切断部位等に揷入して組換えスファージ D N A群または組換えブラスミド D N A 群を得る。

(第 4段階）

上記で得られた組換えスファージ D A群を材料とし、市販の例えばギガパック II ·ゴールド（S t r a t a g e n e社）などのィン ' ビ卜口 ' パッケージング ·キットを説明書に従い使用し、すなわち、変異ファージ溶原菌を含む大腸菌の溶菌液をファージ粒子形成に必要な蛋白質供給源として用いて組み換え； IDNAを粒子中に取り込んだスファージをイン · ビトロで作らせる（Hohnら， P r o c. Na t l: Ac a d. S c i . USA, 74, 3259 (1977) ) 、いわゆるィン 'ど'トロ 'パッケ一ジングを行い、組換えスファージ DN Aを有するスファージ粒子を得ることが出来る。得られた； Iファージ粒子を宿主、例えば大腸菌に感染させて導入し、スファージ粒子を増殖させる。また、組換えプラスミド DNA 群では，常法に従い、宿主、例えば大腸菌を形質転換し、増殖させる。

(第 5段階）

適当な試薬、例えば、 1 a cプロモータを有するベクターの場合イソプ口ピル^チォガラクトピラノシド（I PTG) などを用いて菌に揷入した DN Aの産物を含む蛋白質を合成させ、それをニトロセルロース等の膜に吸着させた後、抗ェピモルフイン抗体を用いて、例えば膜に抗ェピモルフィン抗体、放射性物質をラベルした二次抗体を順次反応させることにより、ェピモルフインの一部を合成しているクローンを同定する。

ェピモルフインをコードする c DN Aの一部を得た後では、その c DN Aの一部をプローブとして、例えば以下のような方法により、ェピモルフィンの非翻訳領域を含む全長 cDNAはもとより、他の動物種のェピモルフィンをコ一ドする c DN A等を容易に単離することができる。

すなわち、同定したい動物種の結合組織を用いて、（mRNAの調整）から（第 4段階）までは上記と同じ操作を行い、次の操作として以下の別法第 5段階を行う。

(別法第 5段階）

適当な核酸結合能を有する膜、例えば、ナイロン膜に DNAを移しとり、アル力リ等で変性させ、予め放射性物質等でラベルした入手済みのェピモルフィン遺伝子をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、目的のェピモルフィン遺伝子の全長もしくは一部が組込まれているクローンを同 9·るひ

得られたェピモルフインをコードする c DN Αを用いて他の動物種のェピモルフインをコードする cDNA等を単離するまた別の方法として、ポリメラーゼ'チェーン' リアクション（PCR) 法〔Me t ho d s E nzymo 1. , 155, 335-350, (1987)〕がある。即ち、ェピモルフインの遺伝子は動物種間の栢同性（ホモロジ一）が高いので、ェピモルフィンの非翻訳領域も含めた c D N Aの塩基配列中で他の物質との相同性が低い部分を未同定ェピモルフィン遺伝子を増幅させる開始部分として選び、間充織細胞から精製、調整した cDNA群に加え、ポリメラ一ゼで相捕鎖を増幅させることにより相同性の高い遺伝子としてェピモルクインのァイソフォームや他の動物種のェピモルフィンをコードする cD N Aを得ることも可能である。

(cDNAの発現)

かくして得られる cDNAの ¾現は、例えば、トランジヱントな i n V i t r oの蛋白翻訳系、具体的には、 Na tur e, 329, 836— 838 (1987) に記載されているようなァフリカツメガエルの卵母細胞内での翻訳系、あるいは、該 DNAを pUCl 9等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドン AT Gとフヱーズを合わせて接続した蛋白質発現用プラスミドを導入した大腸菌、株化動物細胞などの宿主内で行う翻訳系等を用いて行うことができる。次いで、例えば、抗ェピモルフィン抗体を結合させたァフィ二ティカラムを用いて発現された蛋白質を回収することにより、本発明のェピモルフインを得ることができる。

(改変ェピモルフィンの製造）天然のェピモルフィンと同等の機能を有し、可溶性で取扱の容易な改変ェピモルフィン得る方法については、ェピモルフィン分子自体を生化学的手法を用いて切断してもよいが、特にェピモルフィンをコ一ドする遺伝子を改変し、これを用いて改変ェピモルフィンを得る方法が好適に用いられる。この場合の具体的な手法は、特に限定されないが、例えば、疎水領域をコードする配列を制限酵素等で切断、削除することもできるし、また、連続した疎水性ァミノ酸が正しく翻訳されないようこの翻訳領域上流からフレー厶シフトを起こさせることもできる。特に、疎水性アミノ酸配列を含む部分を非疎水性ァミノ酸配列に置換する場合は、疎水性ァミノ酸配列をコードする遺伝子を削除後、所望の非疎水性ァミノ酸配列をコードする遺伝子を削除部分につなぎ込めば、容易に目的の改変ェピモルフインをコードする遺伝子が得られる。すなわち、前述の各種方法により単離された c D N Aを、動物細胞発現ベクター等に組み込み、次に、 H i n c llなどの適当な制限酵素による消化、末端平滑化、再連結の操作により、ェピモルフィンの C末端疎水領域をコードする部分を欠損もしくは非疎水性ァミノ酸配列をコードする遺伝子に置換することができる。

適当なベクター（例えば、 pBluescript II, pU C 19， C D M 8等）に連結された改変させたェピモルフィン遺伝子は、大腸菌または動物細胞等に導入され、これらの宿主を適当な条件で培養して導入遺伝子を発現させることにより改変ェピモルフィンが得られる。前者では菌のライセ一ト上清から改変ェピモルフインポリペプチドが回収される。また、後者では培養上清から改変ェピモルフインが回収されるが、これらの回収方法については、種々の方法、例えば、免疫ァフィ二ティクロマトグラフィを用いた方法等を好適に利用することができる。

かくして得られる可溶性の改変ェピモルフインもしくは改変ェピモルフィンボリぺプチドは、生理的な溶液に容易に溶解できる特性を有しているので、容易に大量生産及び精製が可能である他、種々の用途、例えば、上皮の形態異常の原因解明やその診断、治療等にそのまま使用できる利点があ上述の各種方法で得られたェピモルフインもしくはその改変体の製造ないしは精製工程は、極めて膨大且つ複雑であり、その収量の低さからも、実際の研究開発、応用開発への材料提供に大きな問題を残している。更に、ェピモルフインの測定は、バイオアツセィ（生物学的検定法）による上皮組織の形態変化を促す活性量としての測定方法では操作性及び精度に劣ることはもとより、常に測定値（活性）に干渉する成分の存在を考慮する必要がある。上記の各種方法で得られたェピモルフインを用いて、それらに特異的に結合する新規なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を得ることにより、これらの問題を解決することができる。即ち、本発明のボリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を利用することにより、ェピモルフィンの免疫学的精製手段並びにェピモルフィンの免疫学的測定手段等が提供される。本究明のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、ェピモルフィンに特異的な結合性を有することをその最大の特徵としており、かかる抗体には、ェピモルフインの活性を阻害しないないしは阻害するタイプの抗体が包含される。また、本発明のポリクローナル抗体には、抗ェピモルフイン抗血清も含まれる。

ェピモルフィンに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、前述の各種方法で得られたェピモルフィンの完全体もしくはその一部分を免疫抗原として使用して、通常の抗体の製造方法に準じて製造することができる。但し、本発明抗体の製造においては、必ずしもェピモルフインの精製標品を用、る必要はなく、これを含む細胞や組織など粗精製品を使用することも可能である。

本発明のポリクローナル抗体製造方法は、より具体的には、上記免疫抗原を、ラット、マウス、ハムスター、ゥサギ、ャギ等の哺乳動物に免疫し、以降部分採血した血清中に免疫抗原に強く結合する抗体群が検出されるまで、同様の免疫操作を繰り返す。免疫に用いる動物種は、免疫抗原の由来する動物種とは異なる動物種を用いる限り特に限定されない。免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動物に静脈内投与、皮下注射もしくは腹腔内注射等の方法により投与することにより行われる。より具体的には、リン酸緩衝生理食塩水（P B S ) 等で適当量に希釈、懸濁した免疫抗原を、所望により免疫賦活剤として通常のアジュバントを併用して、動物に 2〜2 1日毎に数回投与し、総投与量が約 1 0 0〜 5 0 0マイクログラム Z動物程度になるようにすあのが好ましい。免疫感作後の動物から血液を採取し、血清成分を分離して、目的の抗血清、即ち未精製のポリクローナル抗体を得ることができる。さらに、得られた抗血清を透析、濃硫酸アンモニゥム液での塩析出、ゲル濾過法、抗免疫グロブリン抗体結合ァフィニティクロマトグラフィ等の従来の技術を用いて抗体成分を精製し、目的のポリクローナル抗体を得る。さらに、精製された免疫抗原を用いた免疫ァフィ二ティクロマトグラフィによりポリクローナル抗体の反応特性を高めることができる。

本発明のモノクローナル抗体製造方法は、より具体的には、上記のェピモルフィンに対するポリクローナルを得る方法と同様にして、哺乳動物を免疫感作し、その動物から採取した抗体産生細胞を、哺乳動物のミエローマ細胞と融合させて融合細胞（ハイプリドーマ）群を作成し、これらより免疫抗原を認識する抗体を産生するハイプリドーマのクローンを選択し、該クローン化されたハイプリドーマにより目的とするモノクローナル抗体を産生させることにより得られる。用いる免疫感作動物種は、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、アルメニアンハムスター、マウス、ラッ卜等が有利に使用される。実験巨的での使用頻度が高いマウス由来のェピモルフィンの場合、近縁種のラットを免疫感作動物として用いても、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。抗体産生細胞としては、免疫抗原の最終免疫の約 3日後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。上記抗体産生細胞と融合されるミエロ一マ細胞としては、既に公知の種々の細胞株、例えば P 3 63 Ag8 (ATCC TI B 9)、 P3x63Ag8. U. 1 (ATCC CRL 1597)、 P 3/NS IZ1— Ag4— 1 (ATCC T I B 18)、 Sp 2Z0 - Ag l 4 (ATCC CRL 1581) . F 0 (ATCC CRL 1646) 、 P3 x 63Ag8. 653 (ATC C CRL 1580)、 S 194/5. XXO. BU. 1 (ATCC TI B 20) 等や、ラッ卜における YB2Z0 (ATCC CRL 1 662) 等が使用される。

上記抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合反応は、基本的には公知の方法、例えばミルスタインら（Milstein et al. ) の方法〔Methods -nzy mol., 73, 3-46 (1981) 〕等に準じて行い得る。より具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行われる。融合促進剤としては逼常用いられるもの、例えばポリエチレングリコール（PEG) 、センダイウィルス（HVJ) 等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の捕助剤を添加使用することもできる。抗体産生細胞とミエローマ細胞との使用数比は、通常の方法と変わりがなく、例えばミエローマ細胞に対し、免疫細胞を約 1 〜10倍程度用いればよい。上記融合時の培地としては、例えば上記ミエローマ細胞の増殖に使用される如き RPM I—1640培地、 MEM培地等の各種培地を利用でき、通常は牛胎児血清等の血清捕液を抜いておくのがよい。

融合は、上記抗体産生細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培地内でよく混合し、予め 37 °C程度に加温した PEG溶液、例えば平均分子量 1 000〜6000程度の PEGを、通常培地に約 30〜60% (W/V) の濃度で加えて混ぜ合わせることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハイプリドーマが形成される。

得られる所望のハイプリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えば H AT培地（ヒポキサンチン、アミノブテリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行われる。該 HAT培地での培養は、ハイプリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行えばよい。かくして得られるハイプリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行われる。該産生株の検索は、例えば E L I S A ( e n z y m e - 1 i nk e d i mmu no s o l v en t a s s ey) 法などの一般に抗体の検 ¾に用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、 (株） R&Dプランニング発行、 pp30〜53、昭和 57年 3月 5日〕に従って行われる。即ち、固相に塗布された免疫抗原にクローン化されたハイプリドーマの培養上清及び酵素を標識された免疫に用いた動物種の免疫グロプリンに対する抗体を順次加えては洗浄し、最後に標識された酵素により発色反応を起こす基質液を加えて発色度を調べることにより、クローン化されたハイプリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体の免疫抗原への結合能を評価できる。尚、上記検索における抗原としては精製免疫抗原を好ましく使用できる。

かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、血清入りの R P M 1 -1640等の通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で長期間保存可能である。

該ハイプリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清として、或いはハイプリド一マをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

更に、上記の方法により得られるモノクローナル抗体は、前述のポリクローナル抗体の精製と同様の操作で精製することができる。

かくして得られる本発明のボリクロ一ナル抗体及びモノクローナル抗体は、これを利用して、例えば免疫沈降法、免疫ァフィ二テイクロマトグラフィ、プロテイン Aカラム等の通常の免疫学的精製手段により、改変体を含むェピモルフインを簡易且つ特異的に精製できる。更に、放射免疫測定法（R I A) 、酵素免疫測定法（E I A) 、蛍光抗体法等の通常の免疫学的手段により、高感度、高精度に且つ高い特異性をもってェピモルフインを簡易に測定することができる。

実施例

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例 1. マウスェピモルフインに対するモノクローナル抗体の作製 a) 免疫抗原としてェピモルフインを細胞膜表面に持つマウス胎児の真皮細胞を用いた。集塊状で培養した間充織細胞ではェピモルフインが作られて上皮の形態形成を支持するが、偏平な細胞形態をとる単層培養間充織細胞ではェピモルフィンはほとんど作られず上皮の形態形成が行われないという本発明者らが見い出した知見に基ずき、以下の手順で実験動物 I CR マウス胎児 5匹分の皮膚組織から分離した間充織（真皮）細胞を集瑰状で 4日間培養した後、ホモジナイズし、生理食塩水に懸濁した。

1)妊娠 13日目の I CRマウス（日本チヤ一ルスリバ一）より摘出したマウス胎児 5匹分の皮廣組織を手術用のハサミ切り取り、生理食塩水で洗浄した。

2) 1)で準備したマウス胎児皮虜組織を 0.25%トリプシン、 10m M 〇&01₂を含む11£?£5—ハンクス液（pH7.4) 中で、 4°C条件下 12時間ィンキュベ一トした後、 20 gZnilの DNAaseを加えてゆつくりとピペッティングすることにより、シート状の表皮と単離された真皮細胞を得た。

3) 2)の細胞懸濁液を低速遠心分離することにより表皮と、上清中の真皮細胞を分離した。なお、この操作以降は 10%の牛胎児血清を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（DME) とハム F 12培地の 1 ： 1混合培地（DH培地）を用いた。

4)単離真皮細胞を培地で洗浄後、 100 Orpmで 2分間遠心分離し、得られた真皮細胞のペレツ卜からマイクロピぺットを用いて 100 /1づつを吸引して、培地上に浮かべた多孔性ヌクレポアメンブレン（13腿径、 8 01孔）上に乗せて集塊状で培養した。

5) 37°C、 5 %C0₂条件下で 4日間培養した上記真皮細胞を無血清培地中に懸濁し、洗浄後、生理食塩水中に分散したものを抗原として用いた。

この懸濁液に等量のフロインドコンプリートアジュバント（Freund complete adjuvant. Difco Laboratories. Detroit Michigan USA) をカロえてよく混合したものを、 Lewi sラットに腹腔内投与した。投与量は細胞数で約 lxl 0⁶ /匹とした。さらに、 2週間及び 3週間後に、同液を同様に投与した。最終投与の 3日後に脾臓を摘出し、得られた脾細胞を後述の実施例 13と同様の方法で、マウスミエロ一マ細胞株 P 3 X 63 A g8. U. 1 (ATCC CRL 1597) と細胞融合しハイプリドーマ群を得た。

得られたハイプリドーマ群を、実施例 13と同様の方法で限界希釈法によりクローニングした後、ェピモルフィンに結合する抗体を産生するハイブリドーマのクローンを次の方法で選別した。即ち、一次スクリ一二ングとして、上記方法により集塊状で培養した間充織細胞の溶解物と結合し、培養用プラスチックシャーレ上で単層で培養した間充織細胞の溶解物とは結合しないモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選別し、さらに、二次スクリーニングとして、免疫原に用いたェピモルフインを含むサンプルをドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルァミドゲル電気泳動（S D S -PAGE) で流した時に特異的に出現する、分子量約 150Kダルトンのェピモルフィンのバンドに反応するモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを ffestern blot法により、モノクローナル抗体（ハイブリド一マの培養上清）と放射性物資をラベルした抗ラット免疫グロプリン抗体を順次反応させて検出することにより選別した。スクリ一二ングの詳細は次のとおり。

1)—次スクリーニング：集塊状で、もしくは、単層で 10%牛胎児血清を含む DH培地で 4日間培養したマウス胎児真皮細胞を、各々 2%SD S (ドデシル硫酸ナトリウム）溶液中に溶解したものを、抗原としてドッ卜ブロット法で抗体反応を調べた。ドットブロットはバイオラッドラボラトリーズ社の Bio— Dot blotterを用いて行い、二トロセルロース膜上に上記抗原を吸着させた。同ニトロセルロース膜にハイプリドーマ培養上清、 HRP (ホースラデイシュバーオキシダーゼ）標識抗ラット免疫グロプリン抗体（2次抗体）を順次反応させ、最後にジァミノベンチジンを含む基質液を加えて発色反応させて、集塊状培養の真皮細胞に対し陽性を示し、単層培養の真皮細胞に対し陰性を示す抗体を作るハイプリドーマを選別し .た。

2)二次スクリーニング： Lae匪 liらの方法 [Nature, 227, 68 0 (1970) 1 に従い 1)で用いた集塊状培養真皮細胞溶解液を SDS 一 PAGE用サンプル液に加え、 5分間煮沸後、 4〜20%グラジェン卜ゲルで電気泳動を行った。ウェスタンブロットはテフコ社（長野、日本）の Model T. C.808を取扱説明書通りに使用して、ゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜に移し取り、同ニトロセルロース膜にハイブリドーマ上清、 ¹²⁵ Iラベル抗ラット免疫グロプリン抗体を順次反応させた。分子量マーカーで 150 Kダルトンの位置のェピモルフィンのバンドが陽性になった抗体を作るハイプリドーマを選別した。

かくして、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得た。

さらに、これらのモノクローナル抗体のうち、器官培養系に加えると上皮の耩築を阻害するもの、即ちェピモルフィンの活性部位を認識するものを下記の方法で選び出し、このハイプリドーマをクローン 12、モノクローナル抗体を mAbl 2と名付けた。即ち、形態形成が活発に行われる時期 (妊娠 11日目の肺、 13曰目の皮膚、小腸）のマウス胎児組織の器官培養を、 I CR妊娠マウスより無菌的に取り出したマウス胎児の組織切片を 10%牛胎児血清を含む DH培地上に浮かべたヌクレポァメンブレン（1 3min径、 8 m孔）上に乗せて培養する方法で行った。そのうちの半分は培地中に、 300マイクログラム Zm Iの下記 b ) に示す方法で精製したモノクローナル抗体存在下で行った。対象としてモノクローナル抗体と同様の手法で精製したラット I gGを同濃度で培地に加えたものを同時に用いた。モノクローナル抗体 mA b 12を添加した器官培養 3曰目の組織切片を第 1図に示す。コントロールでは各臓器において上皮構造が正常に構築（肺胞形成、小腸ヒダの形成等）されているのに対し、 mAb l2の存在下、即ちェピモルフインの活性を阻害した場合には、上皮組織が異常になっていることが判る。

b)上記 a) で得られたクロン 12を、 12%の牛胎児血清を含むダルべッコ変法 MEMと Ham F 12の等量混合培地（DH) (Sigma社 D8900) にて 5%炭酸ガスインキュベータ一中で 37°Cにて継代培養を行い、さらに細胞を無血清 DHにて 2回洗浄後、無血清 DH中で 1週間培養することで mA b 12を含む血清入り D Hおよび無血清 D Hをそれぞれ 6 I得た。これらを 50%硫酸アンモニゥムで塩析し PBSで透析後、抗ラット I gGカラム（アメリカンコーレックス社）でァフィ二ティ精製を行った。カラムに吸着した抗体は 0- 015N HC1で溶出後、 0.1M PBS (リン酸緩衝食塩水、 pH8.0) を ¾1えて中和した。抗体はさらに塩析後 DHで十分に透析を行い約 5 m gZm 1の精製品を得た。

実施例 2. マウスェピモルフイン cDNAの単離

マウス胎児間充織細胞から調整した mRNAをオリゴズ dT) セル口一ス（フアルマシア社）カラムにより説明書通りに用いて精製し、これを出発材料としてえ gt 11 (アマシャム社製）の系で、アマシャム社のプロトコール（PRN1280) に従い、 cDNAライブラリーを作成した。即ち、 cDNAライブラリーの作成は、ス g t 11DNAの Ec oR I切断サイ卜に c D N Aを挿入し、イン- ビドロ ·パッケージングにより； Iファージ粒子内に cDN Aを組み込んで行った。マウス胎児間充織細胞は、 I CR妊娠マウス（日本チヤ一ルスリバ一社より購入）からマウス胎児を摘出し、実施例 1と同様の方法でカルシウムの存在下でトリプシン消化を行つて間充織細胞を単離後、実施例 1中で述べられているのと同様の方法で、集塊状で 4日間培養したものを用いた。 DIRN Aの調整は次の様に行った。細胞を回収し、 5.5Mグァニジゥムチオシァネート（GTC) 溶液中でボリトロン型ホモジナイザーを用いて、細胞をホモジナイズした。遠沈管にセシウムトリフロロアセテート（CsTFA) — 0.1M EDTA液を入れ、その上に上記の溶液を重層 2 し、 23, 000ρπη、 15 で24時間

5

遠心し、 RNAのペレツトを得た。次に、ペレツ卜を 4M GTC液に溶かし、 10, 000rpm、 10分間の遠心で不溶物を除去した。上清に 1M 酢酸 100 1とエタノール 3mlを加え一 20°Cで 3時間静置後、 10， 0 00rpra、 20分間遠心し、得られた RN Aのペレツトを TE (Tris-H CI 1 OmM, EDTA lmM) 液、少量に溶かした。さらに 1M Tri s (pH9.0) 1 10倍量、 5M NaCl 1/50倍量、 10%SDS 1/20倍量、フヱノール（0.1M Tris-HCl (_PH9.0) 飽和） 1 2倍量、クロ口ホルム ·イソアミルアルコール（24 ： 1) 1Z2倍量を加えて 10分間振盪後、 300 Orpin. 10分間冷却遠心し、水層を回収した _n さらに等量のクロ口ホルム 'イソアミルアルコールを加えて同様の操作を行った。最後に、 3 M酢酸ナトリウム 1 10倍量、冷ェタノール 2. 5倍量を加えて、混和後、一 20°Cで 10時間静置し、 1500 0rpm、 10分間の遠心で RNAのペレツトを得た。；i g t 11DNAに組み込まれた該ライブラリーを感染させた大腸菌 Y1090 (アマシャム社製）をプレートに播いてプラークを形成させた後、 I PTGをコートしたニトロセルロース膜をプレート上にのせて、 I PTGにより、導入 cD N Aの產物と βガラクトシダーゼの融合蛋白を当該大腸菌に合させると同時にニトロセルロース膜に吸着させた。ニトロセルロース膜に吸着した cDNA産物のうち、実施例 1で得られた抗ェピモルフィン抗体により認識されるものを、ニトロセルロース膜に順次抗ェピモルフイン抗体、放射線物質をラベルした抗ラット免疫グロブリン抗体を反応させて検出することにより検索し、目的のェピモルフィン cDNAの一部を含むス t 11 のクローンを単離した。最後に得られた； I g t 11から単離したェピモルフィン cDNA断片をプローブとして、ス g t 11の系と同様の手法で合成した； I g t 10のcDNAラィブラリーを cDN Aクローニングシステム、 i g t l 0 (アマシャム社、 PRN. 1257) キットを用いて再度スクリ一二ングし、配列表の配列番号 15で表される、ェピモルフィンの全長をコードする c D N Aを単離した。.

配列表の配列番号 15の c D N A配列のうち、実際にァミノ酸に翻訳される領域は 153番目から 1019番目までの塩基配列部分で、さらに終止コドン 3塩基を追加した塩基配列を配列表の配列番号 12に、この cD NAがコードする蛋白質を配列表の配列番号 9に示す。

実施例 3. マウスェピモルフインの精製

a)実施例 1で得られた精製モノクローナル抗体 mAb 12 Smg/ml P BS (中性燐酸緩衝生理食塩水）を、イソプロパノール、 10mM酢酸ナトリウム、. PBSで順次洗浄したァフィゲル 10 (バイオラッドラボラトリーズ社）と 5時間 4°Cにて反応させ固定した。 Ιλ4エタノールアミンー HC1 (ρΗ8) と 1時間反応させて、未反応の官能基をブロックした後、 PBS、 DHにて十分洗浄して mAb 12固定化ァフィゲル 10を調整した。

b) I CRマウス胎児（妊娠 17曰目のもの） 30匹をホモジナイズ後 P BSにて洗浄し、 20mMチャッブス（ドータイ卜製）を加えて蛋白質を可溶化し、ェピモルフインを含むものを抽出した。 a) で調整したァフィゲル 10をカラムに注入し、抽出液を上から注いで 1晚 4°Cでィンキュベ一卜した。 PBSにてゲルを十分洗浄後、 15mMの H c 1を用いてカラム吸着物を溶出、回収して、 SDS— PAGE電気泳動を行ったところ、第 2図に示すようにェピモルフィンの精製品が得られた。

実施例 4. 動物細胞内でのェピモルフインの合成

実施例 2で得られたマウスェピモルフイン c DNAを、；5ァクチンのプ口モーターを有する動物細胞発現ベクター p ^ _a c t CAT9 [Gen e,

48, 1 - 11, (1986)〕の H i n d I I I— Hp a I部位に組み込み、この発現ベクターとハイグロマイシン耐性遺伝子 PL SVhmB [B lochlingerら， Mol. Cell. B iol.， 4, 2929〜2931 (1984) ] を同時に、 cationic liposome lipofection (ギブコ社）を用いて、内在性のェピモルフィン活性のほとんどない N I HZ3T3細胞（ATCC CRT 1658) に導入した。ハイグロマイシン B 100 g/mK 10%牛胎児血清を含む DH培地で細胞を 2週間培養し、生き残ったトランスフヱクタントを得た。実施例 1中で述べたのと同じ方法で、細胞を 2 %SDS溶液に溶かしたものを SDS— PAGE電気泳動を行、、ウェスタンブロット法でニトロセルロース膜にゲル中の蛋白質を移した。同ニトロセルロース膜に実施例 1で得たモノクローナル抗体 nAbl 2、 ¹²⁵1標識抗ラット免疫グロプリン抗体を順次反応させて、ェピモルフィンの発現 — を調べた結果、得られたトランスフヱクタントは、無処理の NIHZ3T 3より数倍〜数 10倍多い量のェピモルフィンを発現していることが確認できた（第 3図）。

次いで、実施例 3と同様の方法で発現された蛋白質を回収し、マウスェピモルフィンを得た。

実施例 5. ヒトェピモルフイン cDNAの単離

実施例 2中で述べたのと同様の方法でヒト胎盤から調製した mRN Aをオリゴ（dT) セルロースカラムにより精製し、これを出発材料として； I gt lO (アマシャム社、 PRN1257) の系で、スファージ DNAをベクターとして、その E c oR Iサイトを切断し、その部分に両端に E c o R Iアダプターを付けた c DNAを組み込む方法〔H u y n h，「DN' A CLONINGJ , IRL PRESS, (1985) 〕により、 c DNAライブラリーを作成した。当該ライブラリーを大腸菌 NM514 (ァマシャム社）に感染させ、プレートに播種した。次に、 12時間後、ナイロン膜をプレートにかぶせて、大腸菌中で複製されて、溶菌により大腸菌から放出された cDNAを移しとり、 0. 5M— NaOHで DNAを変性させ、 32Pでラベルした実施例 2で得られたマウスェピモルフイン遺伝子の翻訳領域をプローブとして、当該プローブとハイブリダィズするヒトェピモルフイン遺伝子の断片を含むクローンを単離した。最後に、得られたヒトェピモルフィン断片をプローブとして、再度、当該 cDNAライブラリ一をスクリ一二ングし、ェピモルフィンの全長をコードする c DNAを単離した。

得られた c DNAは、配列表の配列番号 3に示すァミノ酸配列を有するヒトェピモルフィンをコ一ドする配列表の配列番号 6に示す塩基配列で表される翻訳領域と 3' 及び 5' 側に非翻訳領域を含む遺伝子であり、その全長は、約 3. 0キロベースであることが、ァガロースゲル電気泳動により確認された。

同様にして、配列表の配列番号 4および 5に示すアミノ酸配列を有するヒトェピモルフィンアイソフォーム A及び Bをコードする遺伝子を単離した。

これらは、それぞれ、配列表の配列番号 7および 8に示す塩基配列を翻訳領域として含み、その全長は、それぞれ、約 2. 9キロベース及び 2. 8キロベースであること力ァガロースゲル電気泳動により確認された（第 4図）。

得られたヒトェピモルフィン c DN Aの翻訳蛋白質は実施例 2で得られたマウスェピモルフイン c DNAのそれと 90%近い相同性がみられ、ェピモルフィンは極めて種間差の少ない物質であることが分かった。

実施例 6. マウスェピモルフイン（ァイソフォーム A、 B) c DNAの単実施例 2と同じ方法でマゥス胎児間充織細胞から調整した m R N Aをォリゴ（dT) セルロースカラムにより精製し、これを出発材料として実施例 5と同様の方法で、マウスェピモルフィン cDN Aの単離を行った結果、 3種類の異なる長さの c DN Aを得、ァガロースゲル電気泳動による全長は、それぞれ約 3. 0、 2. 9、 2. 8キロベースであった。これらの c D Aの塩基配列を調べた結果、最長のものは実施例 2で得られたマウスェピモルフインと一致し、さらに、マウスェピモルフインのァイソフォームとして、配列表の配列番号 15の 942番目から 1066番目の塩基配列が削除された全長約 2. 9キロベースのァイソフォーム Aと、配列表の配列番号 15の 942番目から 1127番目の塩基配列が削除された全長約 2. 8キロベースのァイソフォーム Bがクローニングされた。前者は配列表の配列番号 15の 153番目から 941番目までと 1067番目から 1141番目までの塩基配列を直結した部分がァミノ酸に翻訳される。この c DNA配列に終止コドン 3塩基を追加した塩基配列を配列表の配列番号 13に、この cDNAがコードする蛋白質を配列表の配列番号 10に示す。

ァイソフォーム Bは、配列表の配列番号 15の 153番目から 941番目までと 1128番目から 1175番目までの塩基配列を直結した部分がアミノ酸に翻訳される。この cDNA配列に終止コドン 3塩基を追加した塩基配列を配列表の配列番号 14に、この c DNAがコードする蛋白質を配列表の配列番号 11に示す。

マウス、ヒト以外の動物種についても、各々の動物組織を用いて、実施例 5と同様の方法でェピモルフイン cDNAを単離することができる。実施例 7. ェピモルフインによる肺上皮構造の支持

実施例 4で得られたェピモルフイントランスフエクタントおよび無処理の N I HZ3 T 3細胞各々とマウス胎児から実施例 1中で述べたのと同様の方法で単離した肺上皮組織とを混合しヌクレポァメンブレン上で 3次元の培養を行った。培養数日で無処理 N I HZ3 T3細胞を用いた場合には肺上皮のチューブ形態が破壊されてしまうのに比べ、ェピモルフイントランスフクタントを用いた場合にはその形態が保たれたまま上皮が成長をつづけ、ェピモルフインが上皮組織の形態形成に極めて重要な役割を担うことが確認できた。第 5図に、 1週間後の切片の写真を、また、第 6図に上皮のうちでチューブ構造をとるものの割合を示す。

実施例 8. 無細胞系でのェピモルフインの合成

実施例 5で得られたヒトェピモルフィン c DNAを、 p B 1 u s c r i p t l lベクター（S t r a t a gen e社製）のポリクローニングサイ卜に組み込み、 RNAポリメラーゼを用いた I n Vitro E ukaryotic Tr anslation Kit ( S tratagene社）及び S t r a t a gen e社製の mC AP™RNA Capp i ng K i tをそれぞれ説明書通りに用いてェピモルフイン mRNAを合成した。次に、得られた mRNAを 35S—メチォニンの存在下でゥサギ網状赤血球ライセート（アマシャム社製）を用いた反応系で 90分間反応させて、 35 Sでラベルされたヒトェピモルフィンを合成した。

合成したヒトェピモルフィンは、配列表の配列番号 3に示す 288個のアミノ酸配列で表され、その分子量は、約 3万 3千であることが、 SDS 一 PAGE電気泳動により確認された（第 7図）。

同様にして、配列表の配列番号 4に示す 287個のアミノ酸配列及び配列表の配列番号 5に示す 277個のァミノ酸配列で表されるヒトェピモルフィンアイソフォーム A及び Bを得た。当該ヒトェピモルフィンアイソフォーム A及び Bの分子量は、それぞれ、約 3万 3千、及び 3万 2千であることが、 SD S— PAGE電気泳動により確認された。

実施例 9. 疎水性部分を欠損した可溶性改変ェピモルフィンの動物細胞での合成

実施例 2で得られたマウスェピモルフィン cDNAを、実施例 4と同様にして ;5—ァクチンのプロモーターを有する動物細胞発現ベクター P β a c t CAT9の H i nd I I I—Hp a I部位に組み込みこんだ（S a c t EPM1) o

次に、 H i n c I I、 Nh e Iによる消化、末端平滑化、再連結によりェピモルフイン C末端疎水領域をコードする部分を 100%欠損させた遺伝子を作成した（iS a c t EPM2) o yS a c t EPM1. ^ a c t EP M 2を N I HZ 3 T 3細胞に実施例 4中で述べた方法で導入してェピモルフィンの発現を調べたところ、 ^ a c t EPM1を導入したトランスフエクタントは主として細胞表面に、また、 a c t E P M 2を導入したトランスフヱクタントは主として培養液中に、それぞれ、ェピモルフインが検出され、後者では、ェピモルフィンが可溶化されていることが確認された (第 8図）。

上記で得られた 2種のェピモルフィントランスフヱクタントあるいは無処理の N I HZ3 T3細胞各々とマウス胎児から単離した肺上皮組織を混合し、ヌクレポアメンブレンに乗せて 3次元の培養を行った。培養数日で、無処理 N IH/3T 3細胞を用レ、た場合には肺上皮のチューブ形態が破壌されてしまうのに比べ、 2種のトランスフエクタントを用いた場合にはいずれも上皮形態が保たれたまま肺胞が成長をつづけ、可溶性ェピモルフィンが活性を保持していることが確認された (第 9図）。

実施例 10. 疎水性部分を欠損した可溶性改変ェピモルフインの大腸菌での合成

実施例 2で得られたマウスェピモルフィン c DNAを、 p B 1 u s c r 1 p t I I KS (十） (S t r a t a gen e社製）に組み込んだ後、 cDNAS' 側に存在する制限サイトとェキソヌクレアーゼ I I I、 Mu ng Beanヌクレアーゼを利用して、ェピモルフィン遺伝子を種々の大きさになるよう 3' 側から欠損させたものを作成した。それらのプラスミドを JM109 (宝酒造社製)の大腸菌に導入して、 I PTGを加えて遺伝子産物を^ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として発現させたところ、ェピモルフィンの C末端疏水性領域のうち 12個以上のアミノ酸に相当する遺伝子が削除されていたものでは当該菌をつぶすことにより容易に融合蛋白質が可溶化されることが判明した。また、 N末端から 231番目以降のアミノ酸を欠損したェピモルフィンでもェピモルフィン活性を有することが確認された。

実施例 11. 疎水性部分を親水性蛋白質に置換した可溶性改変ェピモルフィンの合成

実施例 5で得られたヒトェピモルフイン c D N Aの C末端疎水性領域をコードする部分を実施例 10と同様にして欠損させた。次に、 CD4— I gG遺伝子が組み込まれたベクター CDM8 [Rome o and S e ed, Ce l l, 64, 1037— 1046 ( 1991 ) 〕の C D 4領域を制限酵素で取り除き、ベクターの切断部を平滑化した後、 C末端欠損ヒトェピモルフィン c DN Aをベクターに挿入した。このベクターのうちからフレームが合ってヒトェピモルフインと I g Gの融合蛋白質の c DNA を発現できるものを大腸菌で発現させてクローニングした。

これを D e a e— De x t r an¾ [Cu r r en t P r o tひ c o I s i n Mo l e c u l e r B i o l ogy, Wi l ey I n t e r s c i en c e (1987) ) により、すなわち、ヒトェピモルフィン cDN Aを入れたベクタ一とジェチルアミノエチル（DEAE) —デキストランの混合液を培養細胞と接触させてインキュベー卜することにより、 COS— 1細胞（ATCC CRL 1650)に導入し、 3曰後に培養液を回収した。該培養液を 50%の硫酸アンモニゥムにて塩析濃縮後、 I g Gへの結合能を有するプロティン Aの結合した担体を充填したカラム（宝酒造社製）を使用して、 C末端の疎水性残基が親水性ペプチドで置換されたヒ卜ェピモルフィン一 I gG融合蛋白質を精製品として大量に回収でき当該ヒ卜ェビモルフインの改変体は、可溶性が高く、かつェピモルフィンの活性を有することが確認された。

他の動物種の改変ェピモルフィンについても、各々のェピモルフィン c

DNAを用いて、実施例 9ないし 11と同様の方法で得ることができる。実施例 12. ェピモルフィンに対するポリクローナル抗体の製造 a)実施例 5で得られたヒトェピモルフインの cDNAを用いて、実施例

10と同様の方法で、可溶性ヒトェピモルフイン一 βガラクシダーゼ融合蛋白質を大腸菌に作らせた。大腸菌をつぶした懸濁波（ライセ一卜）から溶液を分離し、さらに SDS— PAGEにかけた後、ゲルを蛋白染色して、可溶性ヒトェピモルフイン一 /5ガラクトシダーゼ融合蛋白質に相当するバンドを切り出して、.純度の高いヒトェピモルフィンー; 5ガラクトシダーゼ融合蛋白質の溶液を得た。

b) a) で得られた可溶性ヒトェピモルフイン一^ガラグトシダ一ゼ融合蛋白質溶液を等量のフロインドコンプリートアジュバントと混和し、得られた懸濁液を Lewi sラッ卜に腹腔内投与した。 2週、 3週間後に、同液を同様に投与した。最終投与の 3曰後にラッ卜の血液を採取し、常法により血清を分離し、ヒトェピモルフインに対する抗血清を得た。抗血清の活性を調べるのには、免疫原に用いた可溶性ヒトェピモルフイン一^ガラクトシダーゼ融合蛋白質をニトロセルロース膜に吸着させ、その上に段階希釈した抗血清、酵素標識抗ラット免疫グロブリン抗体を順次反応させ、最後に発色基質液を加えるドットプロット法を用いた。さらに、該抗血清を 50%硫酸アンモニゥムで塩析し PBSで透析後、抗ラット I gGカラム（アメリカンコ一レックス社）でァフィ二ティ精製を行い、ヒトェピモルフィンに対するポリクローナル抗体を得た。該ポリクローナル抗体は /5 ガラクトシダーゼに対する抗体を含むが、哺乳動の実験に用いる場合は、このまま用いて良い。該ポリクローナル抗体はヒトェピモルフィンに特異的に結合する以外に、マウス、ニヮトリ等の他の動物種のェピモルフィンにも結合した。

実施例 13. ェピモルフィンに対するモノクローナル抗体の製造

実施例 3で得られたマウスェピモルフィンを等量のフロインドコンプリートアジュバントと混和し、得られた懸濁液を L ewi sラットに腹腔内投与した。 2週、 3週間後に、同液を同様に投与した。最終投与の 3 曰後に脾臓を摘出し、脾細胞をダルベッコ変法 MEMと Ham F 12の等量混合培地（DH) で 3回洗浄した。マウスミエローマ細胞株 P3X 6 3Ag8. U. 1 (ATCC CRL 1597 ) を同様に洗浄後、その 1 10⁷個と上記脾細胞 1 x 10⁸個とを 50m l遠心管に入れ混合した。 200 G, 5分遠心後、上清をパスツールピぺッ卜で除去した。次に、細胞のペレツ卜に 37 °Cに保温したポリエチレングリコール 1500 (ベ一リンガーマンハイム山之内社製） 50% (W/V) を含む RPMI— 1 640溶液 lm 1を 1分間を要して滴下、混合し、次いで 37°Cに保温した RPMI— 1640溶液 lm lを加えて 1分間放置し、次に同液 2 m 1 を加えて 2分間放置し、更に同液 lm lを加えた。 4分間放置後、 37°C に保温した 12%牛胎児血清、 0. 05 g力価 Z1—硫酸ストレプトマイシン、 60000U/1—ペニシリン Gカリウムを含有する DH (以下これを「DH12」という）の 8m 1を加え、 200 xGで 5分間遠心分離した。上清を除去し、 37°Cに保温した DH12に、脾細胞 1 X 10⁶個 Zm 1となるように懸濁し、 24穴のマイクロプレート（コースター社）に lm 1ずつ分注し、 37 °C下に 5%炭酸ガスィンキュベータ一内で培養した。

24時間後 1- 0 X 10^_4Mヒボキサンチン、 4. 0xl 0^_7Mァミノプテリン及び 1. 6 1 CT⁵Mチミジンを含む血清入り完全 RPMI— 1 640培地（以下 ΓΗΑΤ培地」という） lm 1を各ゥエルに添加した。以後上清の半分を第 2、 3及び 4曰目にそれぞれ新しい H A T培地に代え、第 6曰目に同様に上清の半分を、 1. 0x10-⁴Mヒポキサンチン及び 1. 6x10 -⁵Mチミジンを含む血清入り完全 R P M I— 1640培地（H T 培地）に代えた。以後、 DH 12培地で増殖維持した。

かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングした。即ちハイプリドーマ 3x10²個及び Balb/c系マウス胸腺細胞 1x1 0⁸個を含むように調整した DH12培地の 20m 1を用いて、ハイプリドーマ 3個ノウエルとなるように 96ゥエルのプレー卜に播き、培養した。増殖してくるハイプリドーマを同様にハイプリドーマ 1個 Zゥェルとしてクロ一ニングし、更に増殖してくるハイプリドーマを同様にハイブリドーマ 0. 3個/ゥヱルとしてクローニングした。

目的の抗体を産生するクローンの選別は、マウスェピモルフィンに対する抗体の結合能を EL I SA法で判定することにより行った。即ち、'実施例 10で得られた可溶性マウスェピモルフインの溶液を 96穴のィムノブレート（Nunc I n t e r m e d社）に 50マイクロリツタ一ずつ分注し、 4°Cで一晚静置した後、 PBS— 0. 05%ツイ一ン 20 (洗浄液）でゥヱルを洗浄した。ブロッキング液として P B S— 5 %スキムミルク液 100マイクロリツタ一 Zゥェルを分注し室温で 1時間静置後、洗浄液でゥエルを洗浄した。ハイブリドーマの培養上清、ホースラディッシュパーォキシダーゼ標識抗ラット免疫グログリン溶液（力ッペル社）を順次、 5 0マイクロリッター Zゥエル入れて室温で 1時間反応させてから洗浄液でゥエルを洗浄する操作を行った。最後に、常用される 0—フヱニレンジァミンと過酸化水素を含む基質液 1 0 0マイクロリツター Zゥュルを分注し、 1 5分間発色反応させた後硫酸液で反応を停止させ、 4 9 2 n mの吸光度を測定した。目的のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの培養上清は未使用の培養液（陰性対照）の 3倍以上の吸光度を示した。

かくして、マウスェピモルフィンの活性部位以外の部位に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。このハイブリドーマの培養上清より、実施例 1に述べられているのと同様の方法で、マウスェピモルフィンの活性部位以外の部位 3 に結合するモノクローナル抗体を精製で

7

きた。

実施例 1 4. ェピモルフィンに対するモノクローナル抗体を用いたェビモルフィンの発現調査

マウス胎児および成獣の肺、皮膚、小腸を摘出し、 4 %パラホルムアルデヒドで固定後包埋剤を用いて凍結試料を作製した。クライオスタツ卜で厚さ 1 0マイクロメ一トルの切片を作り乾燥後に 5 %スキムミルクを含む P B S、 1 0 0倍希釈した実施例 1で得られたモノクローナル抗体 mAb l 2溶液、フルォレツセンイソチオシァネート（F I T C ) ラベルされた抗ラット免疫グロブリン抗体（タゴ社）と順次反応させ蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡により、ェピモルフィンの発現様式を調べた。なお、上記の反応の間に P B Sで十分に洗浄を行い非特異的な抗体の吸着をおさえた。第 1 0図に示すようにェピモルフィンは胎児期および成獣の臓器再生期で発現量が増大していることが確認できた。

以上に説明したように、本発明のェピモルフインは、上皮組織の形態形成作用を有する間充織成分であるので、ェピモルフインそれ自体は、先天性の上皮形態異常症はもとより、各種臓器の損傷や脱毛等後天的な上皮形態の異常の治療薬の開発等に有用である。特に、可溶性に改変したェピモルフィンは精製が容易であり、さらに所望の濃度の溶液として利用できる長所を有する。

また、ェピモルフィンをコ一ドする遺伝子は、ェピモルフィンの大量生産を可能にする他、上記疾患の診断及び治療法の開発等に極めて有用なものである。

また、ェピモルフインに対する抗体は、ェピモルフインの精製、ェピモルフィンの検岀、上記疾患の診断及び治療法の開発等に極めて有用なものである。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 3 6

配列の型核酸

鎖の数二本鎖

トポロジー直鎖状

配列の種類 c D N A

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG ACG GCG TGT AGG

配列番号： 2

配列の長さ： 1. 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys

配列番号： 3

配列の長さ： 2 8 8

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎮状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Lys Asn As Asp

5 10 15

Gly Asp Thr Val Val Val Val Glu Lys Asp Eis Phe Met Asp Asp Phe

20 25 30

Phe His Gin Val Glu Glu He Arg Asn Ser He Asp Lys lie Thr Gin

35 40 45

Tyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser lie He Leu Ser Ala Pro

50 55 60

Asn Pro Glu Gly Lys He Lys Glu Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Glu 65 70 75 80 lie Lys Lys Thr Ala Asn Lys lie Arg Ala Lys Leu Lys Ala lie Glu

85 90 95

Gin Ser Phe Asp Gin Asp Glu Ser Gly Asn. Arg Thr Ser Val Asp Leu

100 105 110

Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu llo 120 125

Ala Met Ala Glu Tyr Asn Glu Ala Gin Thr Leu Phe Arg Glu Arg Ser 130 135 140 Lys Gly Arg lie Gin Arg Gin Leu Glu lie Thr Gly Arg Thr Thr Thr 145 150 155 160

Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser lie Phe

165 170 175

Thr Ser Asp lie lie Ser Asp Ser Gin lie Thr Arg Gin Ala Leu Asn

180 185 190

Glu lie Glu Ser Arg His Lys Asp lie Met Lys Leu Glu Thr Ser lie

195 200 205

Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu Thr

210 215 220

Gin Gly Glu Met lie Asn Asn lie Glu Arg Asn Val Met Asn Ala Thr 225 230 235 240

Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala lie Lys Tyr

245 250 255

Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Trp lie lie lie Ala Val Ser Val

260 265 270

Val Leu Val Val lie lie Val Leu lie lie Gly Leu Ser Val Gly Lys

275 280 285

配列番号： 4

配列の長さ： 2 8 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎮状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Lys Asn Asp Asp δ 10 15

Gly Asp Thr Val Val Val Val Glu Lys Asp His Phe Met Asp Asp Phe

20 25 30

Phe His Gin Val Glu Glu lie Arg Asn Ser lie Asp Lys He Thr Gin

35 40 45

Tyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser lie He Leu Ser Ala Pro

50 55 60

Asn Pro Glu Gly Lys lie Lys Glu Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Glu 65 70 75 80 lie Lys Lys Thr Ala Asn Lys lie Arg Ala Lys Leu Lys Ala lie Glu

85 90 95

Gin Ser Phe Asp Gin Asp Glu Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp Leu

100 105 110

Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu

115 120 125

Ala Met Ala Glu Tyr Asn Glu Ala Gin Thr Leu Phe Arg Glu Arg Ser 130 135 140 Lys Gly Arg lie Gin Arg Gin Leu Glu lie Thr Gly Arg Thr Thr Thr

145 150 155 160

Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser lie Phe

165 170 175

Thr Ser Asp lie lie Ser Asp Ser Gin lie Thr Arg Gin Ala Leu Asn

180 185 190

Glu lie Glu Ser Arg His Lys Asp lie Met Lys Leu Glu Thr Ser lie

195 200 205

Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu Thr

210 215 220

Gin Gly Glu Met lie Asn Asn lie Glu Arg Asn Val Met Asn Ala Thr 225 230 235 240

Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala lie Lys Tyr

245 250 255

Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys Leu Met Phe lie lie lie Cys Val lie

260 265 270

Val Leu Leu Val He Leu Gly lie lie Leu Ala Thr Thr Leu Ser

275 280 285

配列番号： 5

配列の長さ： 2 7 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Lys Asn Asp Asp

5 10 15

Gly Asp Thr \^ral \^ral Val Val Glu Lys Asp His Phe Met As Asp Phe

20 25 30

Phe His Gin Val Glu Glu He Arg Asn Ser lie Asp Lys lie Thr Gin

35 40 45

Tyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser lie lie Leu Ser Ala Pro

50 55 60

85 90 95

Gin Ser Phe Asp Gin Asp Glu Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp Leu

100 105 110

Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu

115 120 125

Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser lie Phe

165 170 175

Thr Ser Asp He lie Ser Asp Ser Gin lie Thr Arg Gin Ala Leu Asn

180 185 190

Glu lie Glu Ser Arg His Lys Asp lie Met Lys Leu Glu Thr Ser lie

195 200 205

Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu Thr

210 215 220

Gin Gly Glu Met lie Asn Asn lie Glu Arg Asn Val Met Asn Ala Thr 225 230 235 240

Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala lie Lys Tyr

245 250 255

Gin Ser Lys Ala Arg Arg Gin Gin His Cys His Ser Asn His lie Pro

260 265 270

Arg Ala lie Tyr Pro

275

一一配列番号： 6

配列の長さ： 8 6 7

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D NA

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG ACG GCG TGT AGG AAG AAT GAT GAT 16 GGA GAC ACA GTT GTT GTG GTT GAG AAA GAT CAT TTC ATG GAT GAT TTC 32 TTC CAT CAG GTG GAG GAG ATT AGA AAC AGT ATT GAT AAA ATA ACT CAA 48 TAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATT CTT TCT GCA CCA 64 AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTT GAA GAT CTG AAC AAA GAA 80 ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA AAG GCT ATT GAA 96 CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG AGT GGG AAC CGG ACT TCA GTG GAT CTT 112 CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT TCG GTG CTG TCT CGG AAG TTT GTG GAA 128 GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG GCA CAG ACT CTG TTT CGG GAG CGG AGC 144 AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATA ACT GGG AGA ACC ACC ACA 160 GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCA TCC ATC TTC 176 ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATT ACT AGA CAA GCT CTC AAT 192 GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC ATC 208 CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC ATG GAC ATG GCT ATG TTT GTG GAG ACT 224 CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC ATA GAA AGA AAT GTT ATG AAT GCC ACA 240 GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA GAA GAA ACA AAA AAA GCT ATC AAA TAT 256 CAG AGC AAG GCA AGA AGG AAA AAG TGG ATA ATT ATT GCT GTG TCA GTG 272 GTT CTG GTT GTC ATA ATC GTT CTA ATT ATT GGC TTG TCA GTT GGC AAA 288 TGA 289 一 i卜

22Z OVI VOX Oil VOV VOV VOO VI3 3IV XXV V90 IIO 3IV 919 113 DXX XI3

W IIV V19 131 IXV XIV IIV 3X1 OIV Oil VVV 93V V3V ΏΟ 9VV 30V 3V0 992 IVl VVV OiV 100 VVV VVV V3V VV3 VVD VVV 103 OVO VV9 VI3 IVX 3V3

VOV 030 XVV 9IV XI9 IVV V3V WO VIV OVV OVV OXV 9XV VV9 199 OVO

V I3V 9V9 OID XXX DIV 130 OIV OVO OXV 3IX 3XV 9V0 IVO Dil 9V9 V9D 802 OXV 39V 33V 0V9 910 3VV 9IV 31V 3V9 9VV 3V3 133 V3I 0V9 31V VV9

ZQl XVV 3X3 100 VVD V9V X3V UV VV3 VOX XVD VOX VIV IXV 3V9 331 X3V 9ZT OXX OIV 001 V33 9VV 030 30V 9V9 913 3IV 9V0 WO V13 9V0 3V9 3V0 091 VOV 03V 30V VOV 039 I3V VIV 3V9 9X0 9V3 003 9V3 OIV 303 390 VVV

00V DOO DVO D03 III 313 XOV 9V3 VOO 9V9 IVV QVX DV9 330 OIV 030

2ZI VV9 OID III OVV 993 131 010 OID 93X IVO OVO D3V V9V TO VIV 003 ΖΠ 113 1V9 919 VOX I3V 900 3VV 999 IOV DVD IVD OVO IVD III 13V VV3 96 WO XIV LOO 9VV VII OVV 000 V33 IIV VVV IVV 000 IOV VVV OVV OIV 08 VV3 VVV OVV 913 IV3 VV9 113 9V9 VV3 VVV VIV VVV V99 WO 000 OVV ^9 V33 V09 131 1X3 IIV OXV 30V 3V3 OVV VVV OVV VXD WO WO HQ IVI δί^ VV3 XOV VIV VVV IVD XIV X3V OVV V3V IIV 9V9 9V0 9X0 9V3 IV3 DLL Z2 Oil XVD IVO OXV Oil XVD IVO VVV 9V0 IIO DID 113 IID VOV 3VD VOO 91 XVD XV9 IVV 9VV 33V 101 000 90V 010 3V9 VD3 OID 090 3V9 993 9XV νΝαつ： rnco m 篛本ニ： om

mm ·■ oii

0½lO/Z6df/JOd ε 80/ε6 θΜ 配列番号： 8

配列の長さ： 8 3 4

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D NA

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG AGG GCG TGT AGG AAG AAT GAT GAT 13 GGA GAC ACA GTT GTT GTG GTT GAG AAA GAT CAT TTC ATG GAT GAT TTC 32 TTC CAT CAG GTG GAG GAG ATT AGA AAC AGT ATT GAT AAA ATA ACT CAA 48 TAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATT CTT TCT GCA CCA 64 AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTT GAA GAT CTG AAC AAA GAA 80 ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA AAG GCT ATT GAA 96 CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG AGT GGG AAC CGG ACT TCA GTG GAT CTT 112 CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT TCG GTG CTG TCT CGG AAG TTT GTG GAA 128 GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG GCA CAG ACT CTG TTT CGG GAG CGG AGC 144 AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATA ACT GGG AGA ACC ACC ACA 160 GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCA TCC ATC TTC 176 ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATT ACT AGA CAA GCT CTC AAT 192 GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC ATC 208 CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC ATG GAC ATG GCT ATG TTT GTG GAG ACT 224 CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC ATA GAA AGA AAT GTT ATG AAT GCC ACA 240 GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA GAA GAA ACA AAA AAA GCT ATC AAA TAT 256 CAG AGC AAG GCA AGA AGG CAA CAA CAT TGT CAT AGC AAC CAT ATC CCA 272 AGA GCC ATT TAT CCT TGA 278 配列番号： 9

配列の長さ： 2 8 9

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Arg Asp Arg leu Pro Asp leu Thr Ala Cys Arg Thr Asn Asp Asp 1 5 10 15

Gly Asp Thr Ala Val Val lie Val Glu Lys Asp His Phe Met Asp Gly

20 25 30

Phe Phe His Gin Val Glu Glu lie Arg Ser Ser lie Ala Arg lie Ala

35 40 45

Gin His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser lie lie Leu Ser Ala

50 55 60

Pro Asn Pro Glu Gly Lys lie Lys Glu Glu Leu Glu Asp Leu Asp Lys 65 70 75 80

Glu lie Lys Lys Thr Ala Asn Arg lie Arg Gly Lys Leu Lys Ser lie

85 90 95

Glu Gin Ser Cys Asp Gin Asp Glu Asn Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp

100 105 110

Leu Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Asp Val Met Thr Glu Tyr Asn Glu Ala Gin lie Leu Phe Arg Glu Arg 130 135 140 Ser Lys Gly Arg lie Gin Arg Gin Leu Glu lie Thr Gly Arg Thr Thr 145 150 155 160

Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser lie

165 170 175

Phe lie Ser Asp He lie Ser Asp Ser Gin He Thr Arg Gin Ala Leu

180 185 190

Asn Glu lie Glu Ser Arg Eis Lys Asp lie Met Lys Leu Glu Thr Ser

配列番号： 1 0

配列の長さ： 2 8 8

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Arg Asp Arg Leu Pro As Leu Thr Ala Cys Arg Thr Asn Asp Asp 1 5 10 15

Gly Asp Thr Ala Val Val lie Val Glu Lys Asp His Phe Met Asp Gly

20 25 30

Phe Phe His Gin Val Glu Glu lie Arg Ser Ser lie Ala Arg lie Ala

35 40 45

Gin His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser He lie Leu Ser Ala

50 55 60

Pro Asn Pro Glu Gly Lys He Lys Glu Glu Leu Glu Asp Leu Asp Lys 65 70 75 80

Glu lie Lys Lys Thr Ala Asn Arg lie Arg Gly Lys Leu Lys Ser He δδ 90 95

Glu Gin Ser Cys Asp Gin Asp Glu Asn Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp

100 105 110

Leu Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Asp Val Met Thr Glu Tyr Asn Glu Ala Gin lie Leu Phe Arg Glu Arg 130 135 140 Ser Lys Gly Arg lie Gin Arg Gin Leu Glu He Thr Gly Arg Thr Thr 145 150 155 160

Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser lie

165 170 175

Phe He Ser Asp He He Ser Asp Ser Gin He Thr Arg Gin Ala Leu

180 18o 190

Asn Glu He Glu Ser Arg His Lys Asp He Met Lys Leu Glu Thr Ser

195 200 205

lie Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu

210 215 220

Thr Gin Gly Glu Met Val Asn Asn lie Glu Arg Asn Val Val Asn Ser 225 230 - 235 240

Val Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala lie Lys

245 250 255

Tyr Gin Ser Lys Ala Arg Arg Lys Val Met Phe Val Leu lie Cys Val

260 265 270

Val Thr Leu Leu Val He Leu Gly He He Leu Ala Thr Ala Leu Ser

275 280 285

配列番号： 1 1

配列の長さ： 2 7 9

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Arg Asp Arg Leu Pro Asp Leu Thr Ala Cys Arg Thr Asn Asp Asp 1 5 10 15

Gly Asp Thr Ala Val Val lie Val Glu Lys Asp His Phe Met Asp Gly

20 25 30

Phe Phe His Gin Val Glu Glu lie Arg Ser Ser lie Ala Arg lie Ala

35 40 45

Gin His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser lie lie Leu Ser Ala

50 55 60

Pro Asn Pro Glu Gly Lys lie Lys Glu Glu Leu Glu Asp Leu Asp Lys 65 70 75 80

Glu lie Lys Lys Thr Ala Asn Arg lie Arg Gly Lys Leu Lys Ser lie

85 90 95

Glu Gin Ser Cys Asp Gin Asp Glu Asn Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp

100 105 110

Leu Arg lie Arg Arg Thr Gin His Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser He

165 170 175

Phe He Ser Asp He lie Ser Asp Ser Gin lie Thr Arg Gin Ala Leu

180 185 190

Asn Glu He Glu Ser Arg His Lys As lie Met Lys Leu Glu Thr Ser

195 200 205

He Arg Glu Leu His Glu let Phe Met As Met Ala Met Phe Val Glu

210 215 220

Thr Gin Gly Glu Met Val Asn Asn lie Glu Arg Asn Val Val Asn Ser 225 230 235 240

Val Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala lie Lys

245 250 255

Tyr Gin Ser Lys Ala Arg Arg Gin Gin Eis Cys His Ser Asn Arg Thr

260 265 270

Pro Arg Ala Leu Cys Pro Arg

275

配列番号： 1 2

配列の長さ： 8 7 0

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D NA

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCC GAC CTC ACG GCG TGT AGG ACA AAC GAC GAT 16 GGA GAC ACT GCT GTC GTC ATT GTG GAG AAG GAT CAT TTC ATG GAC GGT 32 TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC AGG ATT GCT 48 CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAG AAG AAC CAC AGC ATC ATC CTG TCT GCT 64 CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC CTG GAC AAA 80 GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG TCT ATT 96 GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT 112 CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG 128 GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA 144 AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACQ 160 ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC '176 TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG CAA GCT CTC 192 AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC 208 ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG 224 ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT 240 GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA 256 TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA AAG TGG ATA ATT GCT GCT GTG GCG 272 GTG GCT GTC ATT GCC GTC CTG GCT CTA ATC ATT GGC TTG TCG GTT GGC 288 AAA TGA 290 配列番号： 1 3

配列の長さ： 8 6 7

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鐄

トポロジー：直鎮状

配列の種類： c D NA

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCC GAC CTC ACG GCG TGT AGG ACA AAC GAC GAT 16 GGA GAC ACT GCT GTC GTC ATT GTG GAG AAG GAT CAT TTC ATG GAC GGT 32 TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC AGG ATT GCT 48 CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAC AAG AAC CAC AGC ATC ATC CTG TCT GCT 64 CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC CTG GAC AAA 80 GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG TCT ATT 96 GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT 112 CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG 128 GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA 144 AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACQ 160 ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC '176 TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGC CAA GCT CTC 192 AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC 208 ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG 224 ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT 240 GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA 256 TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAG GTG ATG TTC GTC CTC ATT TGT GTA 272 GTC ACT TTG CTT GTG ATC CTT GGA ATT ATT CTC GCA ACA GCA TTG TCA 288 TAG 289 配列番号： 1 4

配列の長さ： 8 4 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c DNA

配列

ATG CGG GAC CGG CTG CCC GAC CTC ACG GCG TGT AGG ACA AAC GAC GAT 16 GGA GAC ACT GCT GTC GTC ATT GTG GAG AAG GAT CAT TTC ATG GAC GGT 32 TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC AGG ATT GCT 48 CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAG AAG AAC CAC AGC ATC ATC CTG TCT GCT 64 CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC CTG GAC AAA 80 GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG TCT ATT 96 GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT 112 CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG 128 GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA 144 AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACC 160 ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC 176 TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG CAA GCT CTC 192 AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC 208 ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG 224 ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT 240 GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA 256 TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG CAA CAG CAT TGT CAT AGC AAC CGT ACC 272 CCA AGA GCT CTT TGT CCT CGG TGA 280 配列番号： 1 5

配列の長さ： 2 9 4 0

配列の型二核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c DNA

配列

GGGCGGGCGG GCTGTGCCGT GGCAGCGCCT GCCCGAGGGA GGGCGGCGCC GCGGGGCCAG 60 GACCCCGGCA GCAAGAGGCG GCGATCGGGC CACCGGAGAG TGTGCGGCGG GGCAGCTGAG 120 CGGCGGGTGC CGCGCCCTGC TGGCCGGTGG GG 152 ATG CGG GAC CGG CTG CCC GAC CTC ACG GCG TGT AGG ACA AAC GAC GAT 200

GGA GAC ACT GCT GTC GTC ATT GTG GAG AAG GAT CAT TTC ATG GAC GGT 248

TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC AGG ATT GCT 296

CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAG AAG AAC CAC AGC ATC ATC CTG TCT GCT 344

CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC CTG GAC AAA 392

GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG TCT ATT 440

GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT 488

CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG 536

GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA 584

AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACC 632

ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC 680

TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG CAA GCT CTC 728

AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC 776

ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG 824

ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT 872 GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA 920 TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA AAG TGG ATA ATT GCT GCT GTG GCG 968 GTG GCT GTC ATT GCC GTC CTG GCT CTA ATC ATT GGC TTG TCG GTT GGC 1016 AAA 1019 TGATTGCGTA GATGGCGCTG GGTGCTTGCC TCTCCCTCAG GGTGGCAAAG GTGATGTTCG 1079 TCCTCATTTG TGTAGTCACT TTGCTTGTGA TCCTTGGAAT TATTCTCGCA ACAGCATTGT 1139 CATAGCAACC GTACCCCAAG AGCTCTTTGT CCTCGGTGAC TCCGACCATA CCTGCAGCTT 1199 AGTCAGCATC CTGTCCTTCC ACGAGTGAAC CTCAGACTCC AGGGCTAGCG CCGAGCACTG 1259 AGGTTTTTAT TGGTGATGAA GAAGAAAGCA CCGCAGAGGT TTCGTACCAT GAAACACCGC 1319 GAGCCCAGTG GATGCGACAT GCCAGCCCAG AGAGCCTGGG TCTCTCTCAA GGACACCACA 1379 GAGATTTCAC AACAGTGGCC TTGCCTTGGT AGCTTTGAAA TAGGAATGAT TGAAAAAGCC 1439 TAATTTTTAA AGACAATGTC AGTGTTAAAA ATGTATGTTG TGTGTAATTA GGGTGTGCTC 1499 TGCGCTCAGC TGGCAGTGCT GACGAAGAGA CTTCGAGCCA GGCCTGATCT CTGTTCATGT 1559 CTTGTTTGCA GAATCATCAC AGAACTGTTT TGTAAGGCAT CTGTAAGTTA AGTTCCTTAA 1619 TCTATTAACA TCTAAACTCC CTTTCTAAGC TAGACACTGC CHGCGAAGG ACAATGGGCC 1679 AGCCCCGGGC AAGCATGAAC ACTGCCTTAC AGCCCCTCAG GGCCCHCTA TAGTGCCTTC 1739 TGGTGACCCT GACTAGGAAG TGTGAGGGTC TGAAGAGCCT TGAACGTTAG CTCACGGAGG 1799 GGACAAGCAG TCACATGCCG CACTCATGTT ACTCTCCCTT GTTCATGTGA GCTGATGAAG 1859 TCTCAAGGCA AGGCGACAGT GACGATGGAC CAAACTCGGT GCTCACTAAA CTCAAGAGAA 1919 TGGCCCCGAG TACATAGCCA CTCCTGGATG GCACCTGAAG GACCAGGTCC TCAGCCCAAC 1979 ACCCACGAGT GCCCAGAGTT CCTAAGAAAC CATGAAGTGT GGGATAAAGC TGTGCACTGG 2039 TTTACACTTG TGAATAGATG GCCCAGCGAC CAAGTATGTG AAGGATACCA TGACTAGTGA 2099 ACTCTGCCAA CTGCTGACTG TGATGAGTGC TCACTCTACC CCAGCCTCAC TTGGTGGGAT 2159 ATGACGTAGC CATGCCGGGT CAGAACACCA AGTGTGAGCA AGTGCTACTG AACTATCTAA 2219 AAACCATGAT CCTTTCAGTG GTAAGTGTGC CACACTGTCA CCTCCTCACA CCTTCTGGTC 2279 TGACACCCCA TGTGCCGAGA GCTACTGCAG CAGGCTGGGC TGTGGGTCCT GGTCTAGAGT 2339 TAGCCTGTAG TGCAGCCACT CCTGGCTGAT AGCTCACCGT TCCGCAACCG GGAGCTCACC 2399 CHCCTGCCT GGAAGCTCAC ACTTCCTGTC TGGGAGCTCA CCCTTCHGC CTGGGAGCTC 2459 ACACHCCCG TCTGGGAGCT CACACHCCT TCCTGGGAGC TCACACTTCC TGCCTGGGAG 2519 CTCACCCTTC GCGCCTGGGA GCTGACACTT CCTGCCTGGG AGCTCTGAAG ATGAACCTGG 2579 GCCTTTGCAG CTCACCCTCT CTGCATCAGT CAGTGCCATC GGATTTAGCT GCAGAGACCA 2639 TGCGTACCAC CCAGGCTCCC ACCACCCACA GCCAGGTGTC CCTCCAGTCC AGCCTGAGCC 2699 CHGGCCTGC AGTGTGCTCG CAGAGCGCTC AGGAGACCTC TCGACCAGGC AGGCAGCTGA 2759 ATCTGGAT T CCAGTGAATC AGGGGTGTGT GGGTGACTGA GTCAGCACTC CAGATACATC 2819 TCTCTGCTGA CTTCATAGCC ΤΑΤΠΑΑΑΑΑ TATATTTACA GATTCCCTTG TTACCTTTTC 2879 CAAGCATTTC HCAAATATT TTGTGTTTAC ATTAAAAAGT TCTCAGAGAT GCAAAAAAAA 2939 A 2940

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 1の塩基配列と相補的な塩基配列で構成される遺伝子プローブとハイブリダィズする遺伝子によって発現され得る新規生理活性物質ェピモルフィン。

2. ヒト由来の間充織細胞が作る、前記請求項 1記載の生理活性物質ェピモルフィン。

3. マウス由来の間充織細胞が作る、前記請求項 1記載の生理活性物質ェピモルフィン。

4. ァミノ末端のァミノ酸残基の配列が配列表の配列番号 2である前記請求項 1記載の生理活性物質ェピモルフィン。

5. ヒト由来の間充織細胞が作る、前記請求項 4記載の生理活性物質ェピモルフィン。

6. マウス由来の間充織細胞が作る、前記請求項 4記載の生理活性物質ェピモルフィン。

7. 配列表配列番号 3、 4および 5のうちのいずれかのアミノ酸配列で表される、前記請求項 5記載のヒトェピモルフイン。

8. 配列表配列番号 6、 7および 8のうちのいずれかの塩基配列で表される、前記請求項 7記載のヒトェピモルフインをコードする遺伝子。

9. 配列表配列番号 9、 1 0および 1 1のうちのいずれかのアミノ酸配列で表される、前記請求項 6記載のマウスェピモルフィン。

1 0. 配列表配列番号 1 2、 1 3および 1 4のうちのいずれかの塩基配列で表される、前記請求項 9記載のマウスェピモルフィンをコ一ドする遺伝子。

1 1. 前記請求項 1記載のェピモルフィンのポリべプチドのカルボキシ末端琼水性部分を欠損もしくは非疎水性ポリぺプチドに置換した改変ェピモルフィン。

1 2. 前記請求項 7記载のヒ卜ェビモルフィンのポリぺプチドの N末端より 2 3 0番目ないし 2 6 3番目以降の C末端アミノ酸残基を欠損もしくは非疎水性.ポリぺプチドに置換した、前記請求項 1 1記載のヒ卜改変ェピモルフィン。

1 3. 前記請求項 9記載のマウスェピモルフインのポリべプチドの N末端より 2 3 1番目ないし 2 6 4番目以降の C末端アミノ酸残基を欠損もしくは非驟水性ポリぺプチドに置換した、前記請求項 1 1記載のマウス改変ェピモノレフイン。

1 4. 前記請求項 1記載のェピモルフィンの完全体もしくはその一部分を、ェピモルフインが由来する動物種と異なる種の動物に免疫し、その動物の血清から得られるェピモルフィンに対するポリクローナル抗体。

1 5. 前記請求項 1記載のェピモルフインに対するモノクローナル抗体。

1 6. 前記請求項 1記載のェピモルフインの完全体もしくはその一部分を、ェピモルフインが由来する動物種と異なる種の勤物に免疫し、その動物から取り出した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合することにより得られる、前記請求項 1 5記載の、ェピモルフインに対するモノクローナル抗体 0

1 7. 前記請求項 3記載のマウスェピモルフィンの完全体もしくはその —部分をラットに免疫し、そのラッ卜から取り出した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合することにより得られる、前記請求項 1 6記載の、ェピモルフィンに対するモノクローナル抗体。

1 8. 前記請求項 1 5記載のェピモルフインに対する ΐノクローナル抗体を用いて、抗原抗体反応を利用した方法でェピモルフインを精製するェピモルフイン精製法。

1 9. 前記請求項 1 4もしくは 1 5記載のェピモルフィンに対するポリクロ一ナル抗体もしくはモノクローナル抗体を用いて、抗原抗体反応を利用した方法でェピモルフィンを検出するェピモルフィン検出法。