WO1992009889A1

WO1992009889A1 - Procede de preparation d'un porteur pour la chromatographie liquide a echange de cations, et procede de determination quantitative de l'hemoglobine saccharifiee a l'aide dudit porteur

Info

Publication number: WO1992009889A1
Application number: PCT/JP1990/001522
Authority: WO
Inventors: Kazuyuki Oishi; Kazutoshi Yamazaki; Toshiki Kawabe; Masahiro Takechi; Makoto Takahara
Original assignee: Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1990-11-21
Publication date: 1992-06-11

Description

¾ 害カチォン交換液体ク πマトグラフィ一用担体の製造方法および該担体を用いた糖化ヘモグロビンの定量方法

技術分 ^

本発明は、カチォン交換液体ク "マトグラフィ一に適した担体の製造方法、および該製造法によって得られた担体を用いる糖化へモグロビンの定量法に関する。

背景技術

各種物質の分雜または検出に液体ク "マトグラフィ一が使用され、生体試料からのタンパクの分離など、特に親水性物質の分離あるいは検出には、イオン交換ク πマトグラフィーが利用されている。ィォン交換クロマトグラフィ一法はィ才ン交換基を有する担体を用い、分離対象成分ィォンの担体に対するィォン結合強度の差違によって分離する方法である。ィ才ン交換基としてカルボキシル Sを用いたものは弱カチォン交換クロマトグラフィーとして、タンパクやペプチドの分析に有用である。

このような担体を用いたィォン交換クロマトグラフィ一により、例えば、血中の糖化ヘモグロビンが測定されている。糖化ヘモグロビンは、赤血球中のへモグ口ビンが非酵素的に血液中のグルコースと反応して形成される。糖化へモグロビンを測定することにより血液中のダルコースの平均濃度がわかるため、該糖化へモグ nビンの測定は糖尿病の診断に広く用いられている。糖化ヘモグロビンは、現在では、主として上記担体を用いた高速液体ク πマトグラフィー（以下 H PL C とする）により定量が行なわれている。 HPLC法によれば、従来の力ラムクロマトグラフィー法、電気泳動法、比色法などに比べて迅速な測定が可能である。

一般に、弱カチォン交換ク口マトグラフィ一用担体としては、有機ポリマー系担体または無機系担体が使用されている。有機ポリマー系担体として最もよく用いられているゲルには、スチレンージビニルベンゼンの架橋共重合体粒子の表面に力ルポキシル基を導入した担体がある。このような担体は、スチレンージビニルべンゼン架撟共重合体粒子に化学反応によりカルボキシル基を導入して得られる。例えば、上記共重合体粒子をク口口メチルエーテルなどで処理することにより共重合体中のスチレンのベンゼン環にハロゲン化アルキルを導入し、これを加水分解し酸化することにより、カルボキシル基が導入される。

上言己ゲルの.他、スチレンと、ジビニルペンゼンと、カルボキシル基を有する早量体との架檫共重合体粒子もある。さらに、特開昭 58-221164号には、テトラメチロールメタントリアタリレートなどのァクリル酸またはメタクリル酸のエステルと、アタリル酸またはメタクリル酸との共重合体でなる担体が開示されている。このような担体は、通常、上記特開昭

58-221164号に開示された方法で、例えば、上記架橋共重合体粒子については、架橋性単量体およびカルボキシル基を有する単量体に重合開始剤を加えて懸濁重合することによって調製される。あるいは、スチレン、ジビニルベンゼンおよび加水分解反応により力ルボキシル基を生成し得る官能基（以下、「加水分解性の基」とする）を有する単量体とを共重合させた後、加水分解反応によりこの官能基をカルボキシル基に変換した粒子も用いられ得る。このような担体の耐圧性を向上させるには架樣度をあげる必要があるが、架榛部分が疎水性なので、架標度をあげるとゲルの疎水性が増し、タンパクの非特異的吸着が生じる。このため架橋剤量が制限され、十分な耐圧性を得ることが難しい。さらに上記方法で得られた担体は、重合体粒子内の全体に力ルボキシル基が分散して存在するため、水性溶媒中では膨潤，収縮しやすく、このような理由からも耐圧性が不充分である。

上記担体を糖化へモグロビンの高速液体ク πマトグラフィ一による定量に用いると、次に示す欠点がある。

一般に糖化ヘモグロビンの定量は、溶離液として溶出力の弱い液（以下第 1液とする）と溶出力の強い液（以下第 2液とする）との二種を用いてステップあるいは連続ダラジェント法により実施される。第 1液は、担体粒子中の遊離カルボキシル基を増加させる。これにより試料中の糖化へモグロビン以外のヘモグロビンは担体に保持ざれ、糖化ヘモグロビンは分離されて溶出する。第 2液はイオン強度が大きいため、遊離カルボキシル基が塩となる。そのため、保持されていた糖化へモグロビン以外のへモグ πビンが速やかに溶出する。

しかし、上記担体、特に、疎水性および親水性のモノマ一 (カルボキシル基もしくはカルボキシル基を生じ得るモノマ一）を用いて調製された担体においては、主として親水性モノマーに起因するィォン交換基が担体粒子全体に分布する。このような担体に第 2液を接触させると、担休が膨潤して力ラム内の圧力が高くなる。ひとつの検体を測定した後、次の検体を測定のためには、第 1液を流してカルボキシル基を遊離型に宸す操作が必要とされる。このときに、担体内部に存在するィォン交換基を充分に遊離型にもどすためには相当量の第 1液を流す必要があるため測定時間が長くなる。ポリマ一系担体を用いた HPLCにより糖化ヘモグロビンを比較的高速で測定できるようになつたが、さらに測定速度を上げようとすると上記のように、担休内のィォン交換基が充分に交換しない、あるいは、担体が膨潤するという理由から、分雜性能が低下する。高精度での分離を行なうには、溶雜速度を低下させる必要がある。

他方、一般の生体試料からのタンパクの分離用に用いられる無機系の担体としては、特開昭 63 75558号に多孔性シリ力ゲルの表面にカルボキシル基が化学結合したシ »J力系担体が開示されている。この担休は、耐圧性に優れ、比較的高速処理が可能で分雜能に優れる。しかし、このゲルは表面の残存シラノール基の影簪によりタンパクなどの塩基性基を有する物質を吸着する特性を有する。さらにシリカゲルは酸およびアル力リで溶解するため、溶雜液の P Hが 3〜 8に限定される。

さらに、上記弱カチオン交換ク口マトグラフィ一用担体に使用され得、比較的耐圧性に俊れた担体を得る方法として、特開昭 56-151712、特開昭 59-18705号、特開昭 62-63856号および特開昭 63-79064号公報に、いわゆるシード重合法が開示されている。これは、架橋重合体粒子に重合開始剤および単量体を含浸させて、これをさらに懸重合に供し、二層構造の粒子を得ようとする方法である。この方法において、架橋重合体粒子に含浸させる単量体としてカルボキシル基を有する単量体を用いれば、弱力チ才ン交換クロマトグラフィー用担体が得られる。また、加水分解性の基を生成し得る官能基をもつ単量体を含浸させて重合し、その後加水分解しても同様の弱カチオン交換クロマトグラフィー用担体が得られる。しかし、得られる粒子内部にカルボキシル基が存在するため、上記と同様の理由により、水系溶媒中で膨潤または収縮しやすく、徒って耐圧性が不充分である。さらに、このような担体を用いた場合に、液体クロマトグラフィ一の分雜性能が悪い、もしくは分雜時間が長くかかるという欠点がある。

( ^下余白）

，の開示

本発明のカチォン交換液体クロマトグラフィ一用担体の第

1の製造法は、上記背景技術の項に記した種々の問題点を解決するものであり、

重合開始剤の付着した疎水性架橋重合体粒子を分散させた水性分散液を提供する工程；および

該水性分散液にカルボキシル基を有する重合性単量体を添加し、該疎水性架橋重合体粒子の表面部分で該単量体を重合させ、該疎水性架樣重合体粒子の表面部分に力ルポキシル基を有する重合体の層が形成された被覆重合体粒子を得る工程を包含する。

好適な実施態様においては、上記疎水性架椟重合体は、少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体を単独重合もしくは共重合させることにより、または少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体と少なくとも 1種の疎水性非架橋性単量体とを共重合させることにより得られる。

好適な実施態様においては、上記疎水性架椟性単量体は、ジ（メタ）ァクリル酸エステル、多価アルコールのポリ（メタ）ァクリル酸エステル、および少なくとも 2個のビニル基を有する芳香族系化合物でなる群から選択される少なくとも

1種である。

好適な実施態様においては、上記疎水性非架撟性単量体は、 (メタ）ァクル酸エステル、齚酸ビニル、およびスチレン系単量体でなる群から選択される少なくとも 1種である。好適な実施態様においては、上記カルボキシル基を有する重合性単量体は、ァクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、およびク π トン酸でなる群から選択される少なくとも 1種である。

好適な実施態様においては、上記被覆重合休粒子は、実質的に細孔を持たない、もしくは 10， 000 A以下の平均半径の細 ¾を有する多孔性粒子である。

好適な実施態様においては、上記製造法においては、上記重合開始剤の付着した疎水性架撟重合体が分散した水性分散液が、疎水性架撟性単量体を合む単量体を重合開始剤とともに反応させて得られる。

本発明のカチォン交換液体ク πマトグラフィ一用担体の第 2の製造法は、重合開始剤の付着した、加水分解性の基を持たない疎水性架悸重合体粒子を分散させた水性分散液を提供する工程；該水性分散液に、加水分解反応によりカルボキシル基を生成し得る官能基を有する単量体を添加して溶解させ- 該重合体粒子の表面部分で垓単量体を重合させ、該疎水性架榛重合体粒子の表面部分に、該官能基を有する重合体の層を形成する工程；および該官能基を加水分解し、粒子表面に力ルポキシル基を有する被覆重合体粒子を得る工程を包舍する ₍ 好適な実施態様においては、上記第 2の方法において、疎水性架撟重合体は、少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体を単独重合もしくは共重合させることにより、または少なくとも 1種の疎水性架樓性単量体と少なくとも 1種の疎水性非架檨牲単量体とを共重合させることにより得られる。

好適な実施態様においては、上記第 2の方法において、疎水性架榛性単量体は少なくとも 2個のビニル基を有する芳香族系化合物である。

好適な実施態様においては、上記第 2の方法において、疎水性非架檫性単量体はスチレン系単量体である。

好適な実施態様においては、上記第 2の方法において、加永分解反応によりカルボキシル基を生成し得る官能基を有する単量体は、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）ァクリルァミド、および（メタ）アタリロニトリルでなる群から選択される。

好適な実施態様においては、上記第 2の製造法における被覆重合体は、実質的に細孔を持たない、もしくは ΙΟ, ΟΟΟ Α以下の平均半径の細孔を有する多孔性粒子である。

好適な実施態様においては、上記第 2の方法においては、上記重合開始剤の付着した疎水性架橋重合体が分散した水性分散液は、加水分解性の基を持たない疎水性架橋性単量体を含む単量体を重合開始剤とともに反応させて得られる。

液体ク口マトグラフィ一により試料中の糖化へモグロビンを定量する本発明の方法においては、該液体ク口マトグラフィ一に使用する担体が、上記第 1または第 2の製造法により得られる。

従って、本発明は、以下の目的を達成し得る ·'

(1)タンバクなどの親水性物質の分雜に適したカチオン交換液体クロマトグラフィ一用担体であって、耐圧性が高く、膨潤 · 収縮が少なく、かつタンパクなどの非特異吸着が少ない担体を製造する方法を提供すること；

(2〉H PLCにより糖化へモグ πビンを短時間のうちに高精度で分離 ·定量する方法を提供すること；および

(3)力ラム操作時に力ラム压を上昇させることがなく、溶離液との平衡化が速やかであり、かつタンパクなどを非特異吸着させることのない担体を用いて、 L Cにより糖化へモグロビンを効果的に定量する方法を提供すること。

(以下余白〉

図面の簡単な説明

第 1図、第 3図、第 5図、第 8図、第 10図および第 12図は. それぞれ実施例 1、実施例 2および比較例 1、実施例 5、実施例 6および比較例 5で得られた担体を充塡した力ラムを用いて血液中の糖化へモグロビンの分析-を行った時に得られたクロマトグラムを示す。

第 2図、第 4図、第 6図および第 7図は、それぞれ実施例 1、実施例 2、比較例 1および比較例 3で得られた担体を充塡したカラムを用いてタンパクの分析を行った時に得られたクマトグラムを示す。

第 9図、第 11図および第 13〜15図は、それぞれ実施例 5、実施例 6および比較例 5〜 7で得られた担体を充塡した力ラムを用いて種々のタンパクの分離を行った時に得られたク口マトグラムを示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明の第 1および第 2の製造法において使用される疎水性架镜重合体粒子の素材としては、少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体を単独重合もしくは共重合させて得られる疎水性架橋重合体、または少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体と少なくとも 1種の疎水性非架撟性単量体との共重合体が用いられる。

第 1の製造法において使用される疎水性架檫性単量体としては、例えばエチレングリコールジ（メタ）ァクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ〉アタリレート、プロピレングリコールジ（メタ〉アタリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ〉ァクリレートなどのジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アタリレートなどの多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルペンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビュルナフタレンなどの 2個以上のビニル基を有する芳香族系化合物などが用いられる。上記第 1の製造法において使用される睐水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架榛性の重合性単量体であれば、いずれもが使用され得る。例えばメチル（メタ）ァクリレート、ェチル（メタ）ァクリレート、プロビル（メタ）アタリレート、イソプロビル (メタ）アタリレート、ブチル（メタ）ァクリレート、 t 一ブチル（メタ）アタリレートなどの（メタ）アタリル酸エステル；酢酸ビュル；およびスチレン、メチルスチレンなどのスチレン系単量体が用いられる。上記架檨性および非架橋性の単量体を混合して用いる場合には、架橋性単量体が全単量体 100重量部に対し 10重量部以上、好ましくは 20重量部以上となるように使用される。

本発明の第 1の製造法において、疎水性架橋重合体粒子の表面に形成されるカルボキシル基を有する重合体の層を形成するのに使用される単量体としては、カルボキシル基を有する単量体が用いられる。それには、例えば、ァクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、クロトン酸またはその他のカルボキシル基を有する重合性単量体が用いられる。上記カルボキシル基を有する重合性単量体は、必要に応じて 2種以上が混合して用いられ得る。このような単量体の使用量は単量体の種類によって異なるが、疎水性架橋重合体 100 重量部に対して 5〜80重量部の割合が適当である。

本発明の第 2の製造法（加水分解法）において使用される、加水分解性の基を持たない踩水性架橋重合体粒子の素材としては、疎水性架檨性単量体を（共）重合させて得られる（共）重合体または疎永 &桀撟単壘抹疎水 tt 如堉杜単垦体の共重合体が用いられる。上記疎水性架橋性単量体および疎水性非架插性単量体は、それぞれ単独で、あるいは 2種以上が組みあわせて用いられ得る。上記疎水性架橋性単量体としては、例えばジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレンなどの 2個以上のビュル基を有する芳香族系化合物などが用いられる。上記疎水性非架榛性単量体としては、例えばスチレン、メチルスチレンなどのスチレン系単量体が用いられる。上記架横性および非架樣性の単量体を混合して用いる場合には、架橋性単量体が全単量体 100重量部に対し 10重量部以ヒ、好ましくは 20重量部以上となるように使用される。

本発明の第 2の製造方法で、疎水性架檫重合体粒子を被覆する重合体を形成するために用いられる単量体は、加水分解性の基を有する単量体である。このような単量体としては、ァク ¹ Jル酸メチル、メタクリル酸メチルなどの、アタリル酸またはメタクリル酸（以下、（メタ）アクリル酸とする）のアルキルエステル類；（メタ）アクリルアミド、（メタ）ァタリロニトリルなどが挙げられる。上記加水分解性の基を有する単量体は、必要に応じて 2種以上が混合して用いられ得る。加水分解性の基を有する単量体の使用量は、単量体の種類によって異なるが、疎水性架檫重合体〗00重量部に対して 5〜80重量部の割合が好ましい。

本発明の第 1または第 2の製造法により液体クロマトグラフィー用担体を調製するには、まず、次のような方法により疎水性架檫重合体粒子を調製する。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸蜀重合法により調製され得る。例えば、上記疎水性架橾性単量体および必要に応じて疎水性非架樣性単量体と重合開始剤とを混合する。必要に応じてこれらは希釈剤に溶解させる。単量体を希釈剤に溶解させると、得られる重合体粒子中に希釈剤である有機溶媒が分散して存在するため、重合終了後に有機溶媒を除去することにより、多孔性の球状粒子が得られる。希釈剤として上記疎水性単量体混合物と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用することにより、多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変化させることが可能である。疎水性架樓重合体粒子は多孔性である必要はないので、必ずしも希釈剤を添加する必要はない。希釈剤を使用する場合には、通常、単量体混合物 100 重量都に対して 200 重量部以下の割合で使用される。この単量体の希釈液、または、単量体と重合開始剤とを、ポリビニルアルコール、リン酸力ルシゥムなどの懸蜀安定剤を溶解させた水溶液に添加し、窒素置換後攪拌しながら 40〜 100 に加熱することにより懸濁重合を行う。

ここで用いられる重合開始剤、および得られた疎水性架榛重合体粒子に付着させる（後述）重合開始剤は、ラジカルを発生する触媒であり、疎水性であれば特に限定されない。例えばベンゾィルパーォヰサイド、ァセチルバーォキサイド、クメンパーォキサイドなどの有機過酸化物；ァゾビスィソブチロニトリル、了ゾビスィソブチ口アミドなどの了ゾ化合物など既知のラジカル発生触媒のいずれもが使用され得る。

希釈剤としては、上記単量体を溶解させ、かつその重合体を溶解しない有機溶媒のいずれもが使用可能である。例えば、トルエン、キシレン、ジェチルペンゼン、ドデシルベンゼンなどの芳番族炭化水素類；へキサン、へブタン、オクタン、デカンなどの飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、へキシルアルコール、ォクチルアルコールなどのアルコ一ル類力あげられる。

次に、得られた疎水性架檫重合体粒子に重合開始剤を付着させる。ここで、「疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を " 付着" させる」とは、踩水性架檫重合体粒子の表面に重合開始剤を付着させること、または該粒子表面に重合開始剤を付着させかつ粒子の表面付近に該重合開始剤を舍浸させることを指していう。重合開始剤を付着させるには、該重合開始剤を、低沸点で、かつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶媒に溶解させ、これに上記疎水性架檫重合体粒子を浸清する。このことにより重合開始剤が粒子中に浸透する。これを必要に応じて重合開始剤の分解点以下の温度で加熱して、溶媒を留去すれば重合開始剤を疎水性架檨重合体粒子中に含有する粒子が得られる。本発明の第 1 の製造法においてはまず、この重合開始剤付着粒子を、上記力ルポキシル基を有する重合性単量体が溶解する水性分散媒中に分散させ、あるいは、該粒子が分散する水性媒体中に上記単量体を添加し、溶解させる次に、窒素置換し攪拌下に加熱して重合反応を行なう。水性分散媒には疎水性架橋重合体の分散性を安定させるため、力ルポキシメチルセルロース、ポリビニルアルコールなどの分散安定剤を添加してもよい。重合の温度および時間は、反応させる上記単量体の種類と、重合開始剤の種類によっても異なるが、 40〜： 100 I：で 0. 5 〜40時間 ¾度である。

上記重合開始剤を付着させた架橋重合体粒子をカルボキシル基を有する単量体の重合反応に供する方法の他、疎水性架橋重合体粒子の調製に引き続いてカルボキシル基を有する重合性単量体を反応させる連続法によっても上記二層構造の重合体粒子が調製され得る。この方法においては、まず、上記架檳重合体粒子を調製するための重合反応を開始させる。重合がある程度進行し、かつ未反応の重合開始剤が残存しているときに上記の単量体を反応系に加える。このような状態においては、系内の油相および生成した疎水性架檫重合体粒子内部に重合開始剤が存在するため、引き続いて上記の単量体の重合が起こり、しかも該疎水性架橋重合体粒子の表面部分を被覆する形でカルボキシル基を有する重合体の層が形成される。

上記各方法で得られた重合体粒-了-を熱水、有機溶媒などで十分洗浄し、粒子に舍有されている、あるいは付着している懸濁安定剤、溶媒、残存単量体などを除去する。さらに必要に応じて粒子を分級して、カチオン交換液体クロマトグラフィ一用の担体が得られる。

本発明の第 2の製造法においては、上記重合開始剤付着粒子を上記加水分解性の基を有する単量体が溶解する分散媒中に分散させ、あるいは、該粒子が分散する分散媒中に加水分解性の基を有する単量体を添加し、溶解させて、窒素置換後攪拌下に加熱して重合を行なう。この重合により、加水分解性の基を有する単量体が疎水性架橋重合体粒子の表面で重合し、該粒子を被覆する。分散媒としては加水分解性の基を有する単量体を溶解し得る水または有機溶媒、あるいは両者の混合物が使用される。分散媒中における疎水性架橋重合体の分散性を安定化させるため、力ルボキシメチルセル口ース、ポリビニールアルコールなどの分散安定剤を使用してもよい。重合の温度および時間は、反応させる加水分解性の基を有する単量体の種類と、重合開始剤の種類によっても異なるが、 40〜1ひ 0 でで 0. 5〜40時間程度である。以上の方法により、上記二層構造の重合体粒子が調製される。

上記重合開始剤を付着させた疎水性架樣重合体粒子を加水分解性の基を有する単量体の重合反応に供する方法の他、疎水性架橋重合体粒子の調製に引き続いて加水分解性の基を有する単量体を反応させる連続法によっても卜.記二層構造の重合体粒子が調製され得る。この方法においては、まず、上記疎水性架橘重合体粒子を讕製するための重合反応を開始させる。重合がある程度進行し、かつ未反応の単量体が残存しているときに上記加水分解性の基を有する単量体を反応系に加える。このような状態においては、系内の油相および生成した疎水性架樣重合体粒子内部に重合開始剤が存在するため、引き続いて加水分解性の基を有する単量体の重合が起こり、しかも該疎水性架撟重合体粒子の表面部分を被覆する形で、加水分解性の基を有する重合体の層が形成される。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒などで十分洗浄し、粒子に含有されている、あるいは付着している懸濁安定剤、溶媒、残存単量体などを除去する。

得られた重合体粒子を酸触媒またはアル力リ触媒により、例えば、 40〜100 :で 0. 5〜50時間処理して加水分解を行うことにより、粒子表面の被覆層に存在する加水分解性の官能基が加水分解されて、カルボキシル基となる。例えば、加水分解性の基を有する単量体としてァクリル酸メチルを用いた場合には、重合体粒子を水酸化ナトリゥムの 15〜25重量％メタノール溶液中で 60〜 80での温度で 4 ~ 20時間反応させることによって粒子表面の- C00CH ₃ 基は力ルポキシル基となる。加水分解反応後、重合体粒子を濾取し、水洗して乾燥し、さらに必要に応じて粒子を分級して、弱カチオン交換クロマトグラフィ一用の担体が得られる。

本発明方法によって得られる扭体の平均粒径は、疎水性架橋重合体調製時の攪拌速度、分散溶媒の種類、量、疎水性単量体の種類などにより異なるが、通常、 l〜1000 u m 、好ましくは 2〜100 ii m の範囲である。前述のように本発明の担体は多孔性である必要はないが、多孔性である場合はその平均細孔半径は 10, 000 A以下、好ましくは 5, 000 A以下である c 本発明の製造法により得られる担体は、疎水性架榛重合体を骨格とし、カルボキシル基を 'する重合体で該疎水性架橋重合体の表面部分が被覆された 2層構造の重合体粒子である。力ルポキシル基を有する重合体からなる被 S層の平均的な厚さは、 10〜 300 Aであることが好ましい。被覆層の厚さは、後述の実施例中に記載の「被覆層の平均厚さの測定方法」に従って測定される。平均厚さが 10 Λより小さい場合は被覆が不完全であり、疎水性架檨重合体粒子の表面が露出している部分が生じやすい。このような露出部分があると、被分離物質（例えば、タンパク）が担体に非特異的に吸着する可能性がある。平均厚さが 300 Aを越える場合は、被覆層自身の膨潤 ·収縮が大きくなり、分析中に、担体の分離能が低下したり、圧力が上昇したりする。さらに、溶雜液との平衡化に時間がかかるようになるために分析時間が長くなるか、 *るいは、分雜能が低下する。

本癸明の製造法により得られる担体粒子は、骨格部分に架樓度の高い重合体を用いているので、機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れる。さらに、この担体の骨格部分には親水性の基が存在しないため、膨潤および収縮の度合が極めて低い。表面はカルボキシル基を有する親水性の重合体で被覆されるためタンパクなどの非特異的吸着がない。適当なカルボキシル基を有する単量体を選択することにより、粒子表面の親水性の度合、イオン交換能などが調節できるので、分折あるいは分雜を目的とする親水性物質の種類に応じた所望の力チォン交換用の担体が得られうる。この担体は広い P H範囲において使用することが可能である。さらに、上記のように耐圧性が大きく、膨潤 ·収縮の度合が極めて低いため、粒径の微小化が図れ、その結果、高精度での分離が可能となる。髙圧条件下での使用が可能なため、分析が迅速になされ得る。

このようにして得られた担体を用いて、血中の糖化へモグ σビンの測定が行われる。木発明方法により糖化へモグロビンの測定を行なうには、まず、試料の血液を必要に応じて溶血させる。これを、上記担体が充塡されたカラムにかけ、通常の液体ク口マトグラフィ一の手法により糖化へモグロビンの定量を行なう。適当な緩衝液を選択することにより、試料中の糖化へモグロビン、次いで他のへモグロビンが分離されて順次溶出される。

本発明方法に用いられる担体は、疎水性架樣重合体を骨格とし、カルボキシル基を有する重合体で該疎水性架檫重合体の表面部分が被覆された 2層構造の重合体粒子からなる。骨格部分とレて架橋度の高い重合体を用いることによって、機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れた液体ク口マトグラフィー用担体を得ることができる。この担体の骨格部分には親水性の基が存在しないため、膨潤および収縮の度合が極めて低い。したがって糖化ヘモグロビンの定量において、第 2液通液時の圧力上昇が極めて少ない。表面部分のみがカルボキシル基を有する重合体層で覆われているため、担体のィォン交換能が髙く、さらに、カルボキシル基の平衡化も非常に速い。そのため糖化ヘモグロビンの分離性能が優れ、短時間での測定が可能となる。さらにタンパクの非特異的吸着も全く認められない。

(以下余白）

(実施例）

以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた担体の物性測定および性能評価の方法は次の通りである。

「被覆層の平均厚さの測定方法」

担体に用いる被覆重合体粒子をエポキシ樹脂に包埋した後、 Re ichert-Jung社製ミクロトー厶 ULTRACUTEを用いて厚さ約 900 Aの切片を得る。この切片を、硝酸銀溶液（容量分析用、和光純薬工業㈱製）を用いてラベル化し、曰本電子㈱製透過型電子顕微鏡 JEM100Sにて観察および写真撮影を行い、力ルポキシル基の分布状態を評価し、被覆層の平均厚さを測定した。「担体の評価方法 J

得られた担体を内径 6 mmおよび長さ 75咖のステンレス製力ラムに充塡し、耐圧性および水に対する膨潤性を調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し、流速を変えて流速と圧力損失との関係より測定した。膨潤性は、イオン強度の異なる液を流した時の力ラ厶圧の変化より求めた。

京都電子工業㈱製電位差自動滴定装置 AT- 310によりゲル表面のカルボキシル基を定量した。

次に、カルロ · エルバ社製自動表面積測定装置 S0RPT0MAT I C 1800により、担体の比表面積および細孔分布を測定した。

さらに㈱京都第一科学製 H i-ΑϋΤΟ A _{l c} でヒト血液の分析を行い分離能などを従来品と比較した。測定方法は次の通りである。ヒト血液検体として、同一人（健常人）の血液を採取後直ちにへパリンを添加したものを用いた。血液検体は、本装置付属の専用溶血液 21L (ノニォン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液）によって、自動的に 290倍に希釈、溶血される。溶離液は本装置付属の専用試薬である A液（P H5. 9のリン酸緩衝液）、 B液（PH7. 2のリン酸緩衝液）および C液（PH5. 9のリン酸緩衝液）を使用した。ここで A液は、背景技術の項で! ¾ 明した第 1液（溶出力の弱い液）に相当する。保持力の弱い担体を評価する場合には、上記 A液をさらに丄〜J 0倍の範囲に稀釈した溶雜袂を用いて、最も良い分離条件を求めた。この分雜条件を用いて分雜能の評価を行った。別に、積水化学工業㈱製液体ク πマトグラフィーシステム SSLC-20 を用いて、数種のタンパクを含有する検体のタンパクの分離を行った。実施例 1

スチレン（疎水性非架橋性単量体） 100 g、ジビニルペンゼン（疎水性架橾性単量体） 200 gおよびペンゾィルバーオキサイド（重合開始剤). l gをトルエン 200 gに溶解させた。これを 4 %ポリビニルアルコール水溶液 2. 5 に添加して、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下で 80t:に加熱し懸濁重合を行った。 80でで 8時間重合した後、生成物を熱水およびァセトンで頫次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架榛重合体粒子を得た。

この疎水性架撟重合体粒子 200 gをべンゾィルバーオキサィド 0. 5 gが溶解しているァセトン 1 に付着して該重合開始剤を付着させた。次に、ァセトンを 20tにおいて減圧下で留去した。 1 %ポリ,ビュルアルコール水溶液 2，5 に上記の付着処理した疎水性架橋重合体を懸蜀させ、攪拌しながらァクリル酸 50gを添加し、窒素置換後 80 :で 2時間重合反応を行った。生成物を熱水およびァセトンで順次洗浄し、乾燥し、微小なポリマー粒子 180gを得た。これを日清エンジニアリング㈱製空気分极機ターボクラシフアイァ TC-15Nにより分級して粒径が 8〜10 ίπι の粒子を集め、担体を得た。これを内径 6 ぉょび長さ75鲰のステンレス製カラムに充塡した。充塡は精製永 35m£にゲル（担体） 2 gを取り 5分間攪拌した後、 2. Om£Z分で定流量充填することにより行った。

上記の方法により耐圧性および膨潤性の評価を行った。耐圧性評価においては、 150kgZcnfまで圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験においては、溶離液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mM のリン酸緩衝液に変えた場合にもカラム圧力の上昇は認められなかった。

滴定により上記担体のイオン交換能を定量したところ、 0.8 meq/gであった。担体を硝酸銀溶液で処理して上記の方法にしたがって被覆層の厚さを測定したところ、約 80Aであった。比表面積は 50mVg、平均細孔^径は 40Aであった。

さらに、㈱京都第一科学製 Hi- AUTO A,_cでヒト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 1図に示す。第 1図および後述の第 3図、第 5図、第 8図、第 10図、第 12 図において、 1は HbA,_aおよび A_lb、 2は胎児性 Hb(P)、 3は不安定型 HbA，_c、 4は安定型 HbA_lc、そして 5は HbA。に起因するビークである。ここで、 HbA _{l c} (安定型と不安定型との合計）は次式で算出される。

ビーク 3および 4の面積の合計

HfaA , c (%) = X 100

Hbピーク（ 1、 2、 3、 4

および 5 ) の総面積同一口ットの検体を用いて 3000回測定をくり返した後もクロマトグラムに変化はなく、 HhA _{l c}の測定値にも変化はなかつた。

さらに積水化学工業㈱製液体ク口マトグラフシステム SSLC -20 を用い、数種のタンパク（S igma 社製）を含有する検体の分析を行った。溶雜は、 50mMリン酸鍰锻液 (pH 7. 0、以下 D液と表す）；および D液と 500mM NaCl (pR7. 0) との等量混合物（以下 E液と表す）を用い、 D液 100%から E液 100% への二アグラジェント法により行った。その結果得られたクロマトグラムを第 2図に示す。第 2図および後述の第 4図、第 6図、および第 7図において、ピーク 6はミオグロビン（ゥマ骨格由来）、 7は α -キモトリプシノーゲン（ゥシ滕臓由来）、 8はリボヌクレアーゼ Α (ゥシ獰據由来）、そして 9はりゾチーム（ニヮトリ卵白由来）に起因するビークである。

実施例 2

踩水性架樣性単量体としてジヱチレングリコ一ルジメタクリレート 300 g、そして希釈剤としてトルエンに代えてイソァミルアルコール 200 gを用い、実施例 1 に準じて疎水性架橋重合体粒子を調製した。さらに、カルボキシル基を有する単量体としてメタクリル酸 50 gを用い、実施例 1 と同様の操作法により微小なポリマー粒子 190gを得た。これを分級して粒径 8〜10/ mの担体を得た。

実施例 1 と同様の評価を行った結果、耐圧性については 150 kg/cm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験においては、溶離液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mM の、) ン酸緩衝液に変えた場合にも、力ラム圧力の上昇は認められなかつた。滴定により測定した担休のイオン交換能は、 0.7meq/gであった。担体粒子を硝酸銀溶液で処理して測定された被覆層の厚さは、約 100Aであった。比表面積は 30m² 、平均細孔半径は 20Aであった。次に、㈱京都第一科学製 Hi-AUTO A,_c でヒト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 3図に示す。同一 π ットの検体を用いて、測定を 3000 回くり返した後のクロマトグラムおよび測定値に変化はなかつた。さらに積水化学工業㈱製液体クロマトグラフ SSLC - 20 を用いてタンパクの分雠を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 4図に示す。

実施例 3

この実施例では、疎水性架檫重合体粒子の調製に続いて力ルボキシル基を有する単量体を反応させる連続した重合法を採用した。

疎水性非架橋性単量体としてスチレン 100g、疎水性架橋性単量体としてジビュルベンゼン 200gおよびべンゾィルバーォキサイド 1 gをトルエン 200gに溶解させた。これを 4 % ポリビュルアルコール水溶液 2.5£ に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた後、窒素置換下で 80tに加熱し懸濁重合を行った。 80 :で 2時間重合した後、アクリル酸 50gを添加した。さらに 80tで 2時間重合し生成物を熱水および了セトンで順次洗浄し、乾燥し、微小なポリマー粒子 260gを得た。これを分扱し、粒径 8〜10 u mのポリマー粒子を集め、担体を得た。得られた担体を実施例 1と同様の方法で評価した。耐圧性については 150 kgZcm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験においては、溶雔液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mM のリン酸緩衝液に変えた場合にも、力ラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のィォン交換能を測定したところ、 0.7meq/gであった。被覆層の厚さは、約 80人であった。比表面積は 70m²/g、平均細孔半径は 50Aであつた。次に、賴京都第一科学製 Hi-AUTO A,_cでヒト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムは第 1図と同様であった。さらに、積水化学工業㈱製液体クロマトグラフ SSI -20を用いてタンパクの分離を行った。その結果得られたクロマトグラムは第 2図と同様であった。

実施例 4

トリエチレングリコールジメタクリレート（踩水性架撟性単量体） 450g、テトラメチロールメタントリアタリレート（疎水性架橋性単量体） 50gおよびペンゾィルパ—ォキサイド (重合開始剤） 1.5gを混合し均一系とした。この混合物を 4% ポリビュルアルコール水溶液 2. 5£ に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた。反応系を窒素置換した後、 80でに加熱し 1時間懸蘅重合を行った。これを 30で以下に冷却し、メタクリル酸を 300g添加し溶解させた。反応混合物を再び 80 t に昇温させ、 1時間重合した。生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄して乾燥し、微小なポリマー粒子 450gを得た。実施例 1 と同様に分級して粒径が 6〜 9 u mの粒子を集め、担体を得た。これを実施例 1 と同様に評価した。

耐圧性評価においては、 600kg/cm²まで圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験においては、溶雜液を 40raMのリン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合にも力ラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のイオン交換能を定量としたところ 0. 05meq/gであった。担体を硝酸銀溶液で処理して測定された被膜層の厚さは、約 90人であった。比表面積は 0. 5m²/gであり、細孔は存在しなかった。

㈱京都第一科学製 H i- ΑϋΤΟ A _{l c}でヒト血液の分析を行った。その結果得られたク口マトグラムは第 1図と同様であった。測定を 3000回繰り返した後のク口マトグラムおよび HbA _{l c}の測定値に変化はなかった。

さらに積水化学工業㈱製液体ク口マトグラフシステム SSLC

-20を用い数種のタンパクを舍む試料を用いて上記と同じ条件で分離を行った。その結果得られたクロマトグラムは第 2 図と同様であった。

比較例 1 スチレン 100g、ジビニルペンゼン 200g、アクリル酸 150gおよびペンゾィルパーォキサイド lgをトルェン 270gに溶解し、 4 %ポリビニルアルコール水溶液 2. 5 に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた後、 80でに加熱し懸蘅重合した。

8時間重合した後、生成物を実施例 1 と同様の操作により微小なポリマー粒子 420gを得た。これを分級し、粒径 6〜 9 / . mの担体を得た。

実施例 1と同様に、この担体の評価を行った結果、耐圧性については 80kg/cm ²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験においては、溶雜液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mM のリン酸緩衝液に変えた場合に、力ラム圧力が 20l(_gZc(n ³上昇した。このように、本比較例で得られた担体粒子は、実施例 1の担体粒子に比較して耐圧性および耐膨潤性が劣ることが明らかである。滴定によりこの担体のィォン交換能を測定したところ、 1. Omeq/gであった。比表面積は δθπι ²/^ そして細孔半径は 40 Aであつた。担体粒子の被覆層の厚さを測定するための硝酸銀溶液処理を行ったところ、担体粒子の内部にもカルボキシル基が存在していることがわかった。次に、㈱京都第一科学製 H i-AUTO A _{l c}でヒト血液の分析を行った。ただし A液を用いると保持時間が早くなるため、 A液を希釈して溶雜条件をテストした。その結果、 A液を 1. 67倍に希釈して使用したときに最適のバターンが得られることがわかった。得られたクロマトグラムを第 5図に示す。さらに、積水化学工業㈱製液体クロマトグラフ SSLC- 20を用いてタンパクの分雜を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 6図に示す。第 5図および第 6図を、第 1図および第 2図と比較すると、この担体は、明らかにタンパクおよび糖化ヘモグロビンの保持力が弱く、分雜能が劣つていることが明らかである。特に HbFおよび不安定型 HbA _{l c}が安定型 HbA , _cと完全に分離され得ないので、これらをそれぞれ測定することができない。上記測定を 3000回繰り返すと分離能が悪くなり、 HbA _{l c}の測定値が初期饈'の 70%にまで低下した。このように、この担体を繰り返して使用した場合には正確な測定植を得ることが困難である。実施例 1 に準じて疎水性架椟重合休を調製した。さらに力ルボキシル基を有する単量体としてァクリル酸 300 gを用い、実施例 1 と同様に重合したところ、反応中に凝集が起こり、钦貿の微小ポリマー粒子 180gが得られた。このポリマー粒子を実施例丄と问棣分級し、力 7ムに允旗しょうとしたと _ ろ、粒子が软質なため充塡液が流れず充塡することができなかった。滴定によりこの担体粒子のイオン交換能を調べたところ 1. 2meq/gであった。比表面積は 0. 6m²/gであり、細孔は存在しなかった。硝酸銀溶液で処理して担体粒子の被覆層の厚みを測定したところ、約 400 Aあった。

比較例 3

実施例 1 に準じて疎水性架檎重合体を調製した。さらに力ルポキシル基を有する単量体としてァクリル酸 10 gを用い、実施例 1と同様に操作し、微小なポリマー粒子 180gを得た。これを分扱し粒径 6〜 9 ιηの担体を得た。次いで、この担体の評俯を行った。

その結果、耐圧性については 150k_gZcm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験においては、溶雜液を 40mMの

'；ン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合にも、カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体粒子のィォン交換能を定量したところ 0. 005meq/gであった。比表面積は、 70m²/g、平均細孔半径は 60人であった。担体を硝酸鋇溶液で処理して上記の方法にしたがって被覆層の厚さを測定したところ、約 8 Aであり、表面の一部に被覆されていない箇所が観察された。

さらに穰水化学工業㈱製液体クロマトグラフ SSLC - 20 を用い、数種のタンパクを含む試料のタンパクの分離を行った。その結果得られたク口マトグラムを第 7図に示す。溶出の順序が第 2図と異なるのは、非被覆層部分とタンパクとの間に疎水性相互作用が生じるためと考えられる。

比较例 4

トリエチレングリコールジメタタリレート（疎水性架樣性単量体） 450g、テトラメチロールメタントリアタリレート（竦水铨架樓性単量体） 50gおよびベンゾィルパーォキサイド (重量開始剤） 1. 5gを混合し均一系とした。この混合物を 4% ボリビニルアルコール水溶液 2. 5 に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた。反応系を窒素置換した後、 80でに加熟し 8時間魅简重合を行った。重合終了後、生成物を熱水およびァセトンで順次洗浄し、乾燥して疎水性架檨重合体を得 0

この疎水性架欉重合体粒子 300gを、ベンゾィルパーォキサィド 0.5gおよびメタクリル酸 180gが溶解しているァセトン 1

£ に浸漬して、ペンゾィルパーォキサイドおよびメタクリル酸を舍浸させた。次にァセトンを 20X において減下で留去した。 5gのポリビニルアルコールを含む 20%塩化ナトリウム水溶液 2 £ に上記の含浸処理した疎水性架橋重合体を懸濁させ、窒素置換後 80でで 5時間重合反応を行った。生成物を熱水及びァセトンで順次洗浄して乾燥し、微小なポリマー粒子 460gを得た。実施例 1 と同様の操作により分級して粒径が 6 〜 9 xmの粒子を集め、担体を得た。これを実施例 1 と同様に評価した。

耐圧性については 400kg/m²まで圧力損失が流速と比例した。膨濶性試験においては、溶雜液を 40mMのリン酸緩衝液から 200 mMのリン酸緩衝液に変えた場合に、力ラム圧力は 15kg/cm²上昇した。このように本比較例で得られる担体は、実施例 4の担体に比較して耐圧性および耐膨潤性に劣ることが明らかである。滴定によりイオン交換能を測定したところ、 0.2meq/g であった。比表面積は Ο. δπι²/^ であり、細孔は存在しなかつ ^■ ο

㈱京都第一科学製 Hi- AUTO A_lcでヒト血液の分析を行った。但しこの担体は保持力が弱いため、 A液を希釈して溶雠条件をテストした。その結果、 A液を 2倍に稀釈して分離を行つたときに最適なパターンが得られた。得られたクロマトグラムは第 5図と同様であった。第 1図に比較すると、明らかにこの担体は分雜能が劣っていることがわかる。 3000検体測定したときのクロマトグラムからは、分離能がさらに悪くなり、 i!bA _{l c}の測定楦が初期値の 60%にまで低下することがわかつ次に、積水化学工業睇製液体クロマトグラフシステム SSIX - 20を用い数種のタンパクを含む試料を用いて上記と同じ条件で分雜を行った。その結果得られたクロマトグラムは第 6 図と同様であった。第 2図に比铰すると、本比較例の担体は、明らかに分雜能が劣っていることがわかる。

実施例 5

実施例 1に準じて疎水性架檨重合体を調製した。この疎水性架橒重合体粒子 200gを、ァセチルパーォキサイド（重合開始剤） 0. 5gが溶解しているァセトン 1 £ に浸瀆して該重合開始剤を付着させた。次に、アセトンを 20 :において減圧下で留去した。 50%メタノール水溶液 2 £ に上記の浸漬処理した疎水性架榛重合体を分散させ、攪袢しながらァクリル酸メチル（加水分解性の基を有する単量体） 50gを添加し、窒素置換後 70tで 5時間重合反応を行った。生成物を熱水およびァセトンで頗次洗浄し、乾燥し、微小なポリマー粒子 180gを得た。得られた徴小のポリマー粒子の 150gを、水酸化ナトリウ厶の 20重量％メタノール溶液 500m£中に添加し、 75tにて 5 時間加熱してポリアクリル酸メチルに起因する樹脂のエステル部分を加水分解した。反応混合物を室温まで冷却した後、重合体粒子を糠取して、数回洗浄し乾燥した。得られたポリマー粒子を、日清エンジニアリング㈱製空気分級機ターボクラシファイア TC- 15N により分級して粒径が 8〜： 10〃 mの粒子を集め、これを内径 6關および長さ 75mmのステンレス製力ラムに充填した。充塡は精製水 35； ^に担体粒子 2gを取り 5分間攪拌した後、 2. Om£Z分で定流量充塡することにより行つた。

この担体を実施例 1の方法により評価した。耐圧性評価においては、 150kg/cm²まで圧力損失が流速と比例した。膨濶性試験においては、溶雜液を 40mMのリン酸緩衝液から 200πιΜ のリン酸緩衝液に変えた場合にも、カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のイオン交換能を測定したところ 0. 7meq/gであった。担体を上記の方法により硝酸銀溶液で処理して、被覆層の平均厚さを測定したところ、約 ΙΟΟ λ であった。比表面積は 50m²/g、平均細孔半径は 30 Aであった。㈱京都第一科学製 H i- AUTO A _{I C}でヒト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 8図に示す。測定を 3000 回操り返した場合にもクロマトグラムおよび HbA , _cの測定值に変化はなかった。さらに積水化学工業㈱製液体クマトグラフシステム SSLC-20を用い、数種のタンパクを舍む試料の分離を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 9図に示す。第 9図及び後述の第 11図および第 13図において、ビーク 10はミォグロビン、 11はトリブシノ一ゲン、 12はリボヌクレアーゼ、 13はチトクローム C、そして 14はリゾチームに起因するビークである。

実施 6

実施例 1に準じて疎水性架橋重合体を調製した。この疎水性架镜重合体粒子 200gをァセチルバーォキサイド（重合開始剤） 0. 5gが溶解しているァセトン 1 £ に浸漬して、該重合開始剤を付着させた。次に、アセトンを 20 :において滅圧下で留去した。 50%メタノール水溶液 2 £ に上記の浸瀵処理した踩水性架樣重合体を懸濁させ、攪拃しながらアタリロニトリル（加水分解性の基を有する単量体） 50gを添加し、窒素置換後 70 t:で 10時間重合反応を行った。生成物を熱水およびァセトンで順次洗浄し、乾燥し、微小なポリマー粒子 180gを得た。このポリマー粒子を実施例 5と同様に加水分解処理した。得られたポリマー粒子を分級して粒が 8〜： 10 x mの担体を得た。この担体を実施例 1と同様の方法で評価した。

その結果、耐圧性については 150kg/cm ²まで圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験においては、溶雜液を 40mMのリン酸緩衝液から 200rnMのリン酸緩衝液に変えた場合にも力ラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のイオン交換能を測定したところ 0. 8meq/gであった。担体を硝酸銀溶液で処理して被覆層の平均厚さを測定したところ、約 70 Aであつた。比表面積は 50m ²/g、平均細孔半径は 30 Aであった。実施例 1と同様にしてヒト血液の分雜を行った。その結果得られたクロマトグラムを第 10図に示す。測定を 3000回操り返した後のクロマトグラムおよび測定値に変化はなかった。次に実施例 5 と同様にして数種のタンパクを含む試料の分離を行つた。得られたクロマトグラムを， 11図に示す。

実施例 7

この実施例では、踩水性架橘重合体粒子の調製に続いて加水分解性の基を有する単量体を反応させる、連続法を採用しスチレン 100g、ジビニルベンゼン 200gおよびべンゾィルパ一オキサイド lgをトルエン 200gに溶解させた。これを 4 %ポリビュルアルコール水溶液 2. 5 に添加して、攪袢して油相を均一に分散させた後、窒素置換下で 80tに加熱して懸闺重合を行った。 2時間重合した後、アクリルアミド（加水分解性の基を有する単量体） 50gを上記の系に添加し、さらに 80 : で 2時間重合させた。生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥し、微小なポリマー粒子 260gを得た。このポリマ一粒子 200gを水酸化ナトリゥムの 20重環:％メタノール溶液 500 m£に加え、 75でで 10時間加熱した。反応混合物を室温に冷却した後、数回水洗し、乾燥した。得られたポリマー粒子を実施例 1 と同様の方法で分級し、粒径 8〜： I0 u mの担体を得た。これを実施例 1 と同様の方法で評価した。

その結果、耐圧性については 150kg/cm²まで圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験においては、溶雠液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合にも力ラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のイオン交換能を測定したところ 0. 7meq/gであった。比表面積は 60m ²/g、平均細孔半径 40 Aであった。担体を硝酸銀溶液で処理して、被覆層の平均厚さを測定したところ、約 80 Aであった。実施例 1と同様にしてヒト血液の分析、および実施例 5と同様にして種々のタンパクを含む試料の分離を行った。その結果、得られたク口マトグラムは第 8図および第 9図と同様であつた。ヒト血液の分折を 3000回操り返した後のク口マトグラムおよび測定值に変化はなかった。

実施例 8

この実施例においても、踩水性架橋重合体粒子の調製に続いて加水分解性の基を有する単量体を反応させる、連続法を fit し 7 。

スチレン 100g、ジビニルペンゼン 20ひ gおよびベンゾィルパ —オキサイド lgをトルエン 200gに溶解させた。これを 4 %ポリビニルアルコール水溶液 2 に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた後、窒素置換下で 80 に加熱し懸濁重合を行った。 4時間重合させた後、 2-ヒドロキシェチルメタクリレート（加水分解性の基を有する単量体） 50gを上記の系に添加し、さらに 80でで 2時間重合させた。生成物を熱水およびァセトンで順次洗浄し、乾燥し微小なポリマー粒子 260gを得た。得られたボリマー粒子を実施例 5と同様の方法で加水分解処理に供し、分級して 8 〜 10 / mの担体を得た。これを実施例 1と同様の方法で評価した。その結果、耐圧性については 150kg/cm ²まで圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験においては、溶雜液を 40πιΜのリン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合にも力ラ厶の圧力の上昇は認められなかった。滴定により担体のィォン交換能を測定したところ 0. 6(n qe/gであった。比表面積は 60m ²/g- 平均細孔半径は 40 Aであった。担体を硝酸銀溶液で処理して、上記の方法に従って被覆層の平均厚さを測定したところ、約 100 Aであった。実施例 1 と同様にしてヒト血液の分析、および実施例 5と同様にして種々のタンパクを含む試料の分離を打つた。その鈷采、得られたク κ トグラムは笫 8図および第 9図と同様であった。ヒト血液の分析を 3000回操り返した後のク口マトグラムおよび測定値に変化はなかった。

比較例 5

スチレン 100g、ジビニルベンゼン 200g、アクリル酸メチル (加水分解性の基を有する単量） 70gおよびァセチルパーォキサイド lgをトルェン 200gに溶解させた。これを 4 %ポリビニルアルコール水溶液 2. 5 に添加して、攪拌して油相を均一に分散させた後、 70 tに加熱し懸蜀重合した。 8時間重合した後、微小なポリマー粒子 340gを得た。生成物を実施例 5 と同様の操作により加水分解処理に供した。実施例 1 と同様に分級し、粒径が 6〜 9 mの担体粒子を得た。これを実施例 1 と同様に評価した。

耐圧性については、 80kg/cm ²まで圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験においては、溶離液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合に、力ラム圧力が 20 kg/cm ² 上昇した。このように、本比較例の担体は、実施例 5の担体より耐圧性および耐膨潤性に劣ることが明らかである。滴定によりこの担体粒子のィォン交換能を測定したところ、 1. 0meq/g であった。比表面積は 60m ²/g、平均細孔半径は 30人であった。被覆層の平均厚さを測定するための、硝酸銀溶液処理を行つたところ、力ルポキシル基が担体粒子内に一様に存在していることがわかった。さらに実施例 1と同様にヒト血液の分析を行った。その結果を第 12図に示す。この担体は保持力が弱いため Λ液も稀釈して涪離条件をテストした" その結巢、 A 液を 1. 43倍に稀釈して使用したときに最適のパターンが得られた。第 12図を第 8図に比较すると、この担体は明らかに分雜能が劣っていることがわかる。ヒト血液の分析を 3000回繰り返した後のクロマトグラムからは、分離能がさらに低下し、 HbA , _cの測定値も初期植の 60%にまで低下していることがわかった。次に、実施例 5と同様にして数種のタンパクを含む試料の分雜を行った。その結果を第 13図に示す。第 13図を第

9図と比较すると、この担体は明らかに分雜能が劣っていることがわかる。

比較例 6

実施例 1に準じて疎水性架檫重合体粒子を調製した。加水分解性の基を有する単量体としてァクリル酸メチル 300gを用いて実施例 5と同様に操作して重合させ、上記疎水性架撟重合粒子を被覆し、微小なポリマー粒子 180gを得た。生成物を実施例 5と同様の操作により加水分解処理に供した。実施例 1 と同様に分极し粒径 6 〜 9 mの担体粒子を得た。これを実施例 1 と同様の方法により評価をした。

その結果、耐圧性については 150 k g/cm ²まで圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験においては、溶離液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mM のリン酸緩衝液に変えた場合に、カラム圧力が 25kg/cm ²上昇した。これは、木比較例の担体粒子においては、カルボキシル基を有する被覆層が厚いため、耐膨潤性に劣るためと思われる。滴定によって担体のイオン交換能を測定したところ、 1. 2meq/gであった。担体粒子を硝酸銀溶液で処理して、被稷層の平均厚さを測定したところ、約 400 A であった。比表面積は 1. 5ni ²/gであった。被覆層が厚く、細孔はほとんど存在しなかった。

実施例 5と同様に、数種のタンパクを含む試料の分離を行つた。その結果、得られたクロマトグラムを第 14図に示す。第 14図から、本比較例の担体は、実施例 5および 6の担体 (第 9図および第 11図〉に比べ保持力が弱いことがわかる。これは上述のようにこのポリマー粒子に細孔がほとんど存在せず、表面積が小さいためであると考えられる。

比較例 7

実施例 1 に準じて疎水性架檫重合体粒子を調製した。加水分解性の基を有する単量体としてァクリル酸メチル 10gを用いて実施例 5と同様に操作して重合させ、上記疎水性架欉重合粒子を被覆し、微小なポリマー粒子 180gを得た。生成物を実施例 5と同様の操作により加水分解処理に供した。実施例 1 と同様に分級し粒径が 6〜 9 ja mの担体粒子を得た。これを実施例 1 と同様の方法により評価をした。

その結果、耐圧性については 150kg/cni ²まで圧力損失と流速が比例した。膨涠性試験においては、溶離液を 40mMのリン酸緩衝液から 200mMのリン酸緩衝液に変えた場合にも、カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定によつて担体粒子のィォン交換能を測定したところ 0. lmeq/gであった。比表面積 70m ²/g、平均細孔半径は 60 Aであった。担体粒子を硝酸銀溶液で処理して、被覆層の平均厚さを測定したところ、約 8 A であった。担体粒子表面の一部に、被覆されていない箇所が存在した。

実施例 5と同様に数種のタンパクを含む試料の分離を行つた。その結果、得られたクロマトグラムを第 15図に示す。第 15図のクロマトグラムにおいては、第 9図および第 11図と溶出順が異なっているが、これは上記疎水性架橋重合体粒子の被覆が不十分なため、疎水性相互作用が働くためと考えられる。

産業上の利用可能性

本発明によれば、このように、耐圧性に優れ、かつ膨濶ぉよび収綰が少なくタンパクの非特異的吸着がない、カチオン交換液体クロマトグラフィー用の担体が得られる。このような担体は、各種親水性物質の単雜もしくは分析に広範囲に利用され得る。このような担体は、特に糖化ヘモグロビンの定量に有効であり、高精度でかつ短時間のうちに糖化へモグロビンの定量がなされる。血液中の糖化へモグロビンを測定することにより、糖尿病の診断などが迅速かつ正確になされ得る 0

(以下余白）

Claims

請求の範囲

1 . 重合開始剤の付着した疎水性架橋重合体粒子を分散させた水性分散液を提供する工程；および

該水性分散液に力ルボキシル基を有する重合性単量体を添加し、該疎水性架矯重合体粒子の表面部分で該単量体を重合させ、該疎水性架樓重合体粒子の表面部分にカルボキシル基を有する重合体の暦が形成された被覆重合体粒子を得る工程を包含するカチォン交換液体ク口マトグラフィ一用担体の製造法。

2 . 前記疎水性架橋重合体が、少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体を単独重合もしくは共重合させることにより、または少なくとも 1種の疎水性架橾性単量体と少なくとも 1種の疎水性非架橋性単量体とを共重合させることにより得られる、請求項 1に記載の製造法。

3 . 前記疎水性架檁性単量体が、ジ（メタ）アクリル酸ェステル、多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル、および少なくとも 2個のビニル基を有する芳香族系化合物でなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項 2に記載の製造法。

4 . 前記疎水性非架镙性単量体が、（メタ）アクリル酸ェステル、酢酸ビュル、およびスチレン系単量体でなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項 2に記載の製造法。

5 . 前記琼水性架橋重合体を讕製するのに用いられる疎水性架檫性単量体が全単量体 100重量部に対して 10重量部以上の割合で用いられる、 ¾求 2に記載の製造法。

6 . 前記カルボキシル基を有する重合性単量体が、ァクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、およびクロトン酸でなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項

1 に記載の製造法。

7 . 前記カルボキシル基を有する-重合性単量体が、前記疎水性架榛重合体粒子 100 重量部に対して 5〜80重量部の割合で添加される、請求項 1 に記載の製造法。

8 . 前記重合開始剤が有機過酸化物およびァゾ化合物でなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項 1 に記載の製造法。

9 . 前記重合時の応液の温度が 40〜： 100 であり、反応時間が 0. 5〜40時間である、請求頊 1 に記載の製造法。

10. 前記被覆重合体粒子の平均粒径が 1〜： 1000 m である，請求項 1 に記載の製造法。

11. 前記被覆重合体粒子が実質的に細孔を持たない、もしくは 10, 000 A以下の平均半径の細孔を有する多孔性粒子である、請求項 1 に記載の製造法。

12. 前記重合開始剤の付着した疎水性架橋重合体が分散した水性分散液が、疎水性架橋性単量体を含む単量体を重合開始剤とともに反応させて得られる、請求項 1 に記載の製造法 <

13. 重合開始剤の付着した、加水分解性の基を持たない疎水性架橋重合体粒子を分散.させた水性分散液を提供する工程該永性分散液に、加水分解反応により力ルボキシル基を生成し得る官能基を有する単量体を添加して溶解させ、該重合体粒子の表面部分で該単量体を重合させ、該疎水性架矯重合钵粒子の表面部分に、該官能基を有する重合体の層を形成する工程；および

該官能基を加水分解し、粒子表面にカルボキシル基を有する被覆重合体粒子を得る工程；

を包含するカチオン交換液体ク口マトグラフィー用担体の製造法。

14. 前記疎水性架搐重合体が、少なくとも 1種の疎水性架榛性単量体を単独重合もしくは共重合させることにより、または少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体と少なくとも 1種の疎水性菲架橋性単量体とを共重合させることにより得られる、請求項 13に記載の製造法。 .

15. 前記疎水性架橋性単量体が少なくとも 2個のビニル基を有する芳香族系化合物である、請求項 14に記載の製造法。

16. 前記疎水牲非架樣性単量体がスチレン系単量体である請求項 14に記載の製造法。

17. 前記竦水性架搐重合体を調製するのに用いられる疎水性架樣性単量体が全単量体 100重量部に対して 10重量部以上の割合で用いられる、請求項 14に記載の製造法。

18. 前記加水分解反応により力ルポキシル基を生成し得る官能基を有する単量体が、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリルアミド、および（メタ）アタリロニトリルでなる群から選択される請求項 13に記載の製造法。

19. 前記加水分解により力ルボキシル基を生成し得る官能基を有する単置体が、前記疎水性架檫重合体粒子 100 重量部に対して 5〜80重量部の割合で添加される、請求項 13に記載の製造法。

20. 前記重合時の反応液の温度が 40〜100 でであり、反応時間が 0. 5〜40時間である、請求項 13に記載の製造法。

21. 前記加水分解反応が、前記加水分解反応によりカルボキシル基が生成し得る官能基を有する重合体の層が形成された疎水性架樣重合体粒子を、酸またはアル力リ溶液中で処理することにより行われる、請求項 13に記載の製造法。

22. 前記被覆重合体粒子の平均粒径が 1 〜1000 ju m である、請求項 13に記載の製造法。

23. 前記被覆重合体粒子が実質的に細孔を持たない、もしくは 10, 000 A以下の平均半径の細孔を有する多孔性粒子である、請求項 13に記載の製造法。

24. 前記重合開始剤の付着した疎水性架檎重合体が分散した水性分散液が、加水分解性の基を持たない疎水性架榛性単量体を含む単量体を重合開始剤とともに反応させて得られる、請求項 13に記載の製造法。

25. 液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化へモグロビンを定量する方法であって、

該液体クロマトグラフィ一に使用する担体が、請求項 1 の製造法により得られる、糖化ヘモグロビンの定量法。

26. 液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化へモグロビンを定量する方法であつて、

該液体クロマトグラフィ一に使用する担体が、請求項 13の製造法により得られる、糖化ヘモグロビンの定量法。