WO1990007570A1 - Verfahren zur kultivierung von zellen in einem bioreaktor - Google Patents

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WO1990007570A1 PCT/EP1989/001561 EP8901561W WO9007570A1 WO 1990007570 A1 WO1990007570 A1 WO 1990007570A1 EP 8901561 W EP8901561 W EP 8901561W WO 9007570 A1 WO9007570 A1 WO 9007570A1
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medium
cells
bioreactor
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Jürgen Klaar
Michael Kloss
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Pharma Biotechnologie Hannover Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing cells in a bioreactor.
  • Biotechnologically manufactured products from cell cultures are becoming increasingly important, particularly in the medical-pharmaceutical sector.
  • the cultivation of tissue cells on an industrial scale has so far been quite cumbersome, in contrast to less demanding bacteria and yeast cell cultures. Problems related to this are mentioned, such as adequate ventilation, sterility of the culture exchange of the medium and in particular the mechanical stress on the tissue cells in order to ensure adequate mixing of the culture medium.
  • Fluidized bed or also multi-phase vortex reactors have proven to be quite useful (Large Scale Cell Culture Technology edited by Björn K. Lydersen, Hanser Publishers, Kunststoff, Vienna, New York). These devices are quite complicated in structure and therefore prone to failure and difficult to handle. Fin main problem in the cultivation of tissue cells. • .11: .- are based on their extremely weak stability against mechanical loads, as they inevitably occur in the cultivation methods according to the prior art.
  • the object on which the invention is based is to provide a method for the cultivation of wallless cells, in particular strong mechanical stress on the cells being prevented and nevertheless adequate aeration and mixing and mixing of the culture fluid being achieved.
  • the reactor can be gassed in the headspace or directly in the medium.
  • this object is achieved by a method in which the culture medium is overturned, since part of the medium in the reactor of the submerged culture of wall-less cells is continuously in the reactor with a circulation device, preferably a propeller, at the bottom of the reactor vessel into an open top and brought via the circulating device to the vessel contents in connection with the annular space between the guide body and the vessel wall of the reactor, conveyed upwards and added from above to the main amount of the reactor contents located in the reactor vessel.
  • a circulation device preferably a propeller
  • the pumping around of the reactor contents is preferably carried out in such a way that the flow conditions occurring in the annular space are turbulent or laminar in nature.
  • the hollow antel-like annular space of the bioreactor can also be designed as an arrangement of tubes with different diameters.
  • the branched-off part of the medium can be poured onto the main amount of the reactor contents with the formation of a trumpet by suitable process control.
  • the reactor space is preferably gassed in the head space of the bioreactor. Fumigation can ensure an adequate supply of the necessary gases, such as oxygen and CO. be guaranteed.
  • the pH regulation with carbon dioxide can be done by gassing the reactor in the head space or directly from the medium. Under certain conditions, it is advantageous to match the flow velocity of the medium in the annular space to the number of cells present. This adjustment takes place via the circulation device, for example by the speed of the propeller. All methods suitable for this purpose can be used as the determination method for the cell density, such as, for example, measuring the optical density or the fluorescence. A reliable control of the flow rate depending on the number of cells can also be achieved with the flow injection analysis.
  • the medium is preferably circulated at least 0.2 times per minute.
  • Be ⁇ Sonders preferably a Ummélzfreguenz is from 0.2 to 50 min.
  • the method according to the invention enables the fermentation of wallless cells in a particularly advantageous manner.
  • the procedure according to the invention achieves a thorough mixing of the culture medium without mechanically destroying the cells.
  • the method according to the invention can be applied to all cultivation methods / thus also -i. -T carriers adsorbed or immobilized cells. A powerful system for the cultivation of wallless cells is thus available.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • Erythrocytes are prepared in 7 liters of fermentation medium (phosphate-buffered saline, pH 7.2). The temperature is about 25 "C. Immediately after inoculating the bioreactor with sheep blood, 2 samples are taken. The first sample is used to determine the hemoglobin content in the supernatant at the time of inoculation second sample is left in a tube for reference for the duration of the entire experiment. After the experiment is completed, the free hemoglobin content is determined. The mechanical destruction of the cells is determined by the release of hemoglobin in the supernatant by measurement at 540 nm. The maximum value of erythrocyte lysis is determined after osmotic disruption of the organelles in water.
  • fermentation medium phosphate-buffered saline, pH 7.2
  • the samples are centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes in a laboratory centrifuge.
  • a commercial overturning fermenter (manufacturer, Rosenmund, Liestal Switzerland) is used as the bioreactor.
  • the mechanical destruction of the cells is determined depending on the speed of the pump wheel (propeller). The corresponding values at a pump wheel speed of 250 rpm and the associated zero value determination at the time of inoculation are shown in the table.
  • the table shows that at a pump wheel speed of 250 rpm, the number of cells in the bioreactor has not changed compared to the reference, taking into account the measurement inaccuracy of the method.

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Abstract

Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Bioreaktor, wobei das Kulturmedium umgeworfen wird, indem von der Submerskultur wandloser Zellen ein Teil des Mediums im Reaktor kontinuierlich mit einer Umwälzvorrichtung, vorzugsweise einem Propeller, am Boden des Reaktorgefäßes in einen nach oben offenen und über die Umwälzvorrichtung mit dem Kesselinhalt in Verbindung stehenden Ringraum zwischen Leitkörper und Kesselwand des Reaktors verbracht, nach oben befördert und von oben zu der im Reaktorgefäß befindlichen Hauptmenge des Reaktorinhalts gegeben wird.

Description

- \ -
Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Bioreaktσr
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Bioreaktor.
Biotechnologisch hergestellte Produkte aus Zellkulturen erlangen immer größere Bedeutung, insbesondere auf dem medizinisch-pharmazeutischen Sektor. Die Kultivierung von Gewebezellen im industriellen Maßstab ist jedoch bislang recht umständlich im Gegensatz zu weniger an¬ spruchsvollen Bakterien und Hefezellkulturen. .Erwähnt seien damit verbundene Probleme, wie ausreichende Be- lüftung, Sterilität der Kultur-Austausch des Mediums und insbesondere die mechanische Belastung der Gewebezellen zwecks ausreichender Durchmischung des Kulturmediums. Als recht nützlich haben sich Fließbett- oder auch Mehr¬ phasen-Wirbel-Reaktoren erwiesen (Large Scale Cell Cul- ture Technology edited by Björn K. Lydersen, Hanser Publishers, Munich, Vienna, New York) . Diese Vorrich¬ tungen sind recht kompliziert im Aufbau und daher stör¬ anfällig sowie schwer zu handhaben. Fin Hauptproblem bei der Kultivierung von Gewebezallen. •.11 : .- ndlos sind, beruht auf ihrer extrem schwachen Stabilität gegenüber mechanischen Belastungen, wie sie bei den Kultivierungs¬ methoden nach dem Stand der Technik unvermeidlich auf¬ treten.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist die Be¬ reitstellung eines Verfahrens zur Kultivierung wandloser Zellen, wobei insbesondere starke mechanische Bean¬ spruchung der Zellen verhindert wird und trotzdem aus¬ reichende Belüftung und Durchmischung sowie Vermischung der Kulturflüssigkeit erreicht wird. Die Begasung des Reaktors kann im Kopfraum oder aber auch direkt im Medium erfolgen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Ver¬ fahren bei dem das Kulturmedium umgeworfen wird, -indem von der Submerskultur wandloser Zellen ein Teil des Mediums im Reaktor kontinuierlich mit einer Umwälzvor¬ richtung, vorzugsweise einem Propeller, am Boden des Reaktorgefäßes in einen nach oben offenen und über die UmwälzVorrichtung mit dem Kesselinhalt in Verbindung stehenden Ringraum zwischen Leitkörper und Kesselwand des Reaktors verbracht, nach oben befördert und von oben zu der im Reaktorgefäß befindlichen Hauptmenge des Reak¬ torinhalts gegeben wird.
Vorzugsweise wird das Umpumpen des Reaktorinhalts so durchgeführt, daß die im Ringraum auftretenden Stömungs- verhältnisse turbulenter oder laminarer Natur sind.- Der hohl antelartige Ringraum des Bioreaktors kann auch als Aήordung von Rohren mit verschiedenen Durchmessern ge¬ staltet werden. Durch geeignete Verfahrensführung kann der abgezweigte Teil des Mediums auf die Hauptmenge des Reaktorinhalts unter Bildung einer Trombe gegossen werden.
Diese Varfa rensführung hat den Vorteil, .- άic Innen¬ fläche der Trombe das Aufsteigen des Schaums verhindert. Die Ausbildung einer Trombe kann jedoch durch Überfüllung des Reaktors über den Rand des Ringrau es hinaus verhin-- dert werden. Die Begasung des Reaktorraums erfolgt vor¬ zugsweise im Kopfräum des Bioreaktors. Durch die Begasung kann eine ausreichende Versorgung mit den notwendigen Gasen, wie Sauerstoff und CO. gewährleistet werden. Die pH-Regulierung mit Kohlendioxid kann durch Begasung des Reaktors im Kopfraum oder aber auch direkt des Mediums erfolgen. Unter bestimmten Bedingungen ist es vorteilhaft, die Strömungsgeschwindigkeit des Mediums im Ringraum auf die vorhandene Zellzahl abzustimmen. Diese Abstimmung erfolgt über die UmwälzVorrichtung, zum Beispiel durch die Dreh¬ zahl des Propellers. Als Bestimmungsmethode für die Zell¬ dichte können sämtliche dazu geeigneten Verfahren einge¬ setzt werden, wie beispielsweise Messung der optische Dichte oder der Fluoreszenz. Eine zuverlässige Steuerung der Fließgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Zellzahl läßt sich jedoch auch mit der Fließinjektionsanalyse realisieren.
Bei üblicher Betriebsführung wird in bevorzugter Weise das Medium mindestens 0,2 x pro Minute umgewälzt. Be¬ sonders bevorzugt ist eine Umwälzfreguenz von 0,2 bis 50 min" .
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise die Fermentation von wandlosen Zellen. Die erfindungεgemäße Verfahrensführung erreicht eine Durchmiεchung des Kulturmediums, ohne die Zellen mechanisch zu zerstören. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf alle Kultivierungsmethoden/ also auch -i .-t Trägern adsorbierte oder immobilisierte Zellen angewendet werden. Somit steht ein leistungsfähiges System zur Kulti¬ vierung von wandlosen Zellen zur Verfügung. Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel
Erythrozyten werden in 7 Liter Fermentationsmedium (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2) angesetzt. Die Temperatur beträgt etwa 25 "C. Unmittelbar nach dem An¬ impfen des Bioreaktors mit Schafsblut werden 2 Proben entnommen. Die erste Probe dient zur Bestimmung des Hämo¬ globingehaltes im Überstand zur Zeit der Animpfung. Die zweite Probe wird als Referenz für die Dauer des gesamten Experiments in einem Röhrchen belassen. Nach Abschluß des Experiments wird der freie Hämoglobingehalt bestimmt. Die mechanische Zerstörung der Zellen wird über die Frei¬ setzung von Hämoglobin im überstand bestimmt durch Messung bei 540 nm. Der Maximalwert der Erythrozytenlyse wird nach osmotischem Aufschluß der Organellen im Wasser bestimmt. Vor der Messung der optischen Dichte werden die Proben bei 1000 UPM für 10 Minuten in einer Labor¬ zentrifuge zentrifugiert. Als Bioreaktor wird ein handels¬ üblicher Umwurf-Fermenter (Hersteller, Fa. Rosenmund, Liestal Schweiz) verwendet. In dieser Anordnung wird dann die mechanische Zerstörung der Zellen in Abhängig- keit der Geschwindigkeit des Pumpenrades (Propeller) bestimmt. Die entsprechenden Werte bei einer Pumpenrad- geschwindigkeit von 250 UPM sowie die dazu gehörige Null¬ wertbestimmung zum AnimpfZeitpunkt ist in der Tabelle wiedergegeben.
Tabelle: Untersuchun en zur Membranstabilität
Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß bei einer Pumpen¬ radgeschwindigkeit von 250 UPM die Zahl der Zellen im Bioreaktor gegenüber der Referenz nicht verändert ist unter Berücksichtigung der Meßungenauigkeit der Methode.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Kultivierung von wandlosen Zellen in einem Bioreaktor dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium umgeworfen wird, .indem von der Submerskultur wandloser Zellen ein Teil des Me¬ diums im Reaktor kontinuierlich mit einer Umwälz¬ vorrichtung, vorzugsweise einem Propeller, am Boden des Reaktorgefäßes in einen nach oben offe¬ nen und über die UmwälzVorrichtung mit dem Kes¬ selinhalt in Verbindung stehenden Ringraum zwi¬ schen Leitkörper und Kesselwand des Reaktors ver¬ bracht, nach oben befördert und von oben zu der im Reaktorgefäß befindlichen Hauptmenge des Reak¬ torinhalts gegeben wird.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das Umpumpen des Reaktorinhalts bedingten Strömungsverhältnisse turbulenter oder laminarer Natur sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, da¬ durch gekennzeichnet, daß . der Ringraum durch Rohre verschiedener Durchmesser ersetzt ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da¬ durch gekennzeichnet, daß der abgezweigte Teil des Mediums auf die Hauptmenge des Reaktorinhalts unter Bildung eine Thro be gegossen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich¬ net, daß bei Überfüllung des Reaktors die Aus¬ bildung einer Thrombe unterbleibt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da¬ durch gekennzeichnet, daß die Belüftung durch Begasung im Kopfraum oder direkt im Medium des Bioreaktors erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, da¬ durch gekennzeichnet, daß die pH-Regelung mit Kohlendioxid im Kopfraum oder direkt im Medium erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, da¬ durch gekennzeichnet, daß die Strömungsgeschwin¬ digkeit des Mediums im Ringraum in Abhängigkeit von der vorhandenen Zellzahl gesteuert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich¬ net, daß als Meßsignal die optische Dichte und/ oder Fluoreszenz verwendet wird und/oder die Steuerung mittels Fließinjektionsanalyse ge¬ schieht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, da¬ durch gekennzeichnet, daß das Medium mindestens 0,2 x pro Minute umgewälzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich¬ net, daß das Medium mit einer Frequenz von 0,2 bis 50 min" umgeworfen wird.
PCT/EP1989/001561 1988-12-23 1989-12-19 Verfahren zur kultivierung von zellen in einem bioreaktor WO1990007570A1 (de)

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