DE3843493C1

DE3843493C1 -

Info

Publication number: DE3843493C1
Application number: DE19883843493
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr. 3150 Peine De Klaar; Michael Dr. 3000 Hannover De Kloss
Original assignee: Pharma Biotechnologie Hannover 3000 Hannover De GmbH
Current assignee: Pharma Biotechnologie Hannover 3000 Hannover De GmbH
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1988-12-23
Publication date: 1989-12-21
Also published as: WO1990007570A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 angegebene Verfah ren zur Kultivierung von wandlosen Zellen in einem Bioreaktor. Die Ansprüche 2 bis 11 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens.

Biotechnologisch hergestellte Produkte aus Zellkultu ren erlangen immer größere Bedeutung, insbesondere auf dem medizinisch-pharmazeutischen Sektor. Die Kultivierung von Gewebezellen im industriellen Maß stab ist jedoch bislang recht umständlich im Gegen satz zu weniger anspruchsvollen Bakterien und Hefe zellkulturen. Erwähnt seien damit verbundene Proble me, wie ausreichende Belüftung, Sterilität der Kul tur-Austausch des Mediums und insbesondere die mecha nische Belastung der Gewebezellen zwecks ausreichen der Durchmischung des Kulturmediums. Als recht nütz lich haben sich Fließbett- oder auch Mehrphasen-Wir bel-Reaktoren erwiesen (Large Scale Cell Culture Technology edited by Björn K. Lydersen, Hanser Publi shers, Munich, Vienna, New York). Diese Vorrichtungen sind recht kompliziert im Aufbau und daher störanfäl lig sowie schwer zu handhaben. Ein Hauptproblem bei der Kultivierung von Gewebezellen, die wandlos sind, beruht auf ihrer extrem schwachen Stabilität gegen über mechanischen Belastungen, wie sie bei den Kul tivierungsmethoden nach dem Stand der Technik unver meidlich auftreten.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Kultivierung wand loser Zellen, wobei insbesondere starke mechanische Beanspruchung der Zellen verhindert wird und trotzdem ausreichende Belüftung und Durchmischung sowie Vermi schung der Kulturflüssigkeit erreicht wird. Die Bega sung des Reaktors kann im Kopfraum oder aber auch direkt im Medium erfolgen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren bei dem das Kulturmedium umgewälzt wird, indem von der Submerskultur wandloser Zellen ein Teil des Mediums im Reaktor kontinuierlich mit einer Um wälzvorrichtung, vorzugsweise einem Propeller, am Boden des Reaktorgefäßes in einen nach oben offenen und über die Umwälzvorrichtung mit dem Kesselinhalt in Verbindung stehenden Ringraum zwischen Leitkörper und Kesselwand des Reaktors verbracht, nach oben be fördert und von oben zu der im Reaktorgefäß befind lichen Hauptmenge des Reaktorinhalts gegeben wird.

Vorzugsweise wird das Umpumpen des Reaktorinhalts so durchgeführt, daß die im Ringraum auftretenden Strö mungsverhältnisse turbulenter oder laminarer Natur sind. Der hohlmantelartige Ringraum des Bioreaktors kann auch als Anordnung von Rohren mit verschiedenen Durchmessern gestaltet werden. Durch geeignete Ver fahrensführung kann der abgezweigte Teil des Mediums auf die Hauptmenge des Reaktorinhalts unter Bildung einer Trombe gegossen werden.

Diese Verfahrensführung hat den Vorteil, daß die In nenfläche der Trombe das Aufsteigen des Schaums ver hindert. Die Ausbildung einer Trombe kann jedoch durch Überfüllung des Reaktors über den Rand des Ring raumes hinaus verhindert werden. Die Begasung des Re aktorraums erfolgt vorzugsweise im Kopfraum des Bio reaktors. Durch die Begasung kann eine ausreichende Versorgung mit den notwendigen Gasen, wie Sauerstoff und CO₂ gewährleistet werden. Die pH-Regulierung mit Kohlendioxid kann durch Begasung des Reaktors im Kopfraum oder aber auch direkt des Mediums erfolgen.

Unter bestimmten Bedingungen ist es vorteilhaft, die Strömungsgeschwindigkeit des Mediums im Ringraum auf die vorhandene Zellzahl abzustimmen. Diese Abstimmung erfolgt über die Umwälzvorrichtung, zum Beispiel durch die Drehzahl des Propellers. Als Bestimmungsmethode für die Zelldichte können sämtliche dazu geeigneten Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise Mes sung der optischen Dichte oder der Fluoreszenz. Eine zuverlässige Steuerung der Fließgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Zellzahl läßt sich jedoch auch mit der Fließinjektionsanalyse realisieren.

Bei üblicher Betriebsführung wird in bevorzugter Weise das Medium mindestens 0,2× pro Minute umgewälzt. Besonders bevorzugt ist eine Umwälzfrequenz von 0,2 bis 50 min^-1.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise die Fermentation von wand losen Zellen. Die erfindungsgemäße Verfahrensführung erreicht eine Durchmischung des Kulturmediums, ohne die Zellen mechanisch zu zerstören. Das erfindungs gemäße Verfahren kann auf alle Kultivierungsmethoden, also auch auf Trägern adsorbierte oder immobilisierte Zellen angewendet werden. Somit steht ein leistungs fähiges System zur Kultivierung von wandlosen Zellen zur Verfügung. Die Erfindung wird an Hand des folgen den Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Erythrozyten werden in 7 Liter Fermentationsmedium (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2) angesetzt. Die Temperatur beträgt etwa 25°C. Unmittelbar nach dem Animpfen des Bioreaktors mit Schafsblut werden 2 Proben entnommen. Die erste Probe dient zur Bestim mung des Hämoglobingehaltes im Überstand zur Zeit der Animpfung. Die zweite Probe wird als Referenz für die Dauer des gesamten Experiments in einem Röhrchen be lassen. Nach Abschluß des Experiments wird der freie Hämoglobingehalt bestimmt. Die mechanische Zerstörung der Zellen wird über die Freisetzung von Hämoglobin im Überstand bestimmt durch Messung bei 540 nm. Der Maximalwert der Erythrozytenlyse wird nach osmoti schem Aufschluß der Organellen im Wasser bestimmt. Vor der Messung der optischen Dichte werden die Pro ben bei 1000 UPM für 10 Minuten in einer Laborzentri fuge zentrifugiert. Als Bioreaktor wird ein handels üblicher Umwurf-Fermenter verwendet. In dieser Anordnung wird dann die mechanische Zerstörung der Zellen in Abhän gigkeit der Geschwindigkeit des Pumpenrades (Propel ler) bestimmt. Die entsprechenden Werte bei einer Pumpenradgeschwindigkeit von 250 UPM sowie die dazu gehörige Nullwertbestimmung zum Animpfzeitpunkt ist in der Tabelle wiedergegeben.

Tabelle

Untersuchungen zur Membranstabilität

Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß bei einer Pum penradgeschwindigkeit von 250 UPM die Zahl der Zellen im Bioreaktor gegenüber der Referenz nicht verändert ist unter Berücksichtigung der Meßungenauigkeit der Methode.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung von wandlosen Zellen in einem Bioreaktor, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium umgewälzt wird, indem von der Submerskultur wandloser Zellen ein Teil des Me diums im Reaktor kontinuierlich mit einer Umwälz vorrichtung, vorzugsweise einem Propeller, am Boden des Reaktorgefäßes in einen nach oben offe nen und über die Umwälzvorrichtung mit dem Kes selinhalt in Verbindung stehenden Ringraum zwi schen Leitkörper und Kesselwand des Reaktors ver bracht, nach oben befördert und von oben zu der im Reaktorgefäß befindlichen Hauptmenge des Reak torinhalts gegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das Umpumpen des Reaktorinhalts bedingten Strömungsverhältnisse turbulenter oder laminarer Natur sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, da durch gekennzeichnet, daß der Ringraum durch Rohre verschiedener Durchmesser ersetzt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da durch gekennzeichnet, daß der abgezweigte Teil des Mediums auf die Hauptmenge des Reaktorin halts unter Bildung eine Thrombe gegossen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, daß bei Überfüllung des Reaktors die Aus bildung einer Thrombe unterbleibt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, daß die Belüftung durch Begasung im Kopfraum oder direkt im Medium des Bioreaktors erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, da durch gekennzeichnet, daß die pH-Regelung mit Kohlendioxid im Kopfraum oder direkt im Medium erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, da durch gekennzeichnet, daß die Strömungsgeschwin digkeit des Mediums im Ringraum in Abhängigkeit von der vorhandenen Zellzahl gesteuert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich net, daß als Meßsignal die optische Dichte und/ oder Fluoreszenz verwendet wird und/oder die Steuerung mittels Fließinjektionsanalyse ge schieht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, da durch gekennzeichnet, daß das Medium mindestens 0,2× pro Minute umgewälzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich net, daß das Medium mit einer Frequenz von 0,2 bis 50 min^-1 umgewälzt wird.