Vecteur viraux d' intégration et d' expression.
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux d'intégration et d'expression d'un gènehétérologue dans des cellules aviaires et constitue un développement de l'invention, objet des demandes de brevet FR 84 15764 et EP 178 996 (85 40 1999) auxquelles il conviendra de se reporter pour la meilleure intelligence de la présente demande.
La présente invention concerne également des plasmides d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules compétentes.
La présente invention concerne en outre des cellules infectées ou transfectées par ces vecteurs viraux ou plasmides.
Enfin, la présente invention concerne un procédé de production d'une protéine par culture de ces cellules infectées ou transfectées, ainsi qu'un procédé de modification génétique d'animaux à l'aide de ces vecteurs viraux.
Le génome rétroviral représente une structure intégrée qui pilote un fonctionnement cyclique ; l'une des phases de ce fonctionnement comporte une intégration régulière du génome viral dans l'ADN cellulaire. A cette caractéristique sont associées d'autres propriétés qui, par divers mécanismes, confèrent à certains de ces virus des propriétés pathogènes vis-à-vis de leurs hôtes.
Un objectif de la présente invention est d'utiliser certaines propriétés des structures retrovirales pour transférer des gènes à des animaux entiers, dans leurs structures somatiques, en vue de "thérapie génique", ou dans leurs structures germinales, en vue de transmission
à la descendance. Pour atteindre cet objectif, il faut décomposer le fonctionnement de la structure rétrovirale afin de n'en conserver que les composant dont l'utilisation est justifiée, par l'objectif recherché. Simultanément, on éliminera toutes les parties susceptibles d'exercer des effets pathogènes. En particulier, on devra proscrire absolument toute transmission, aux sujets cibles, d'oncogènes potentiellement dangereux ou de structures capables de permettre à la multiplication virale de se poursuivre chez la cible choisie.
Un but de l'invention est en effet d'obtenir des vecteurs viraux capables d'un rendement de transfert élevé, utilisables pour infecter l'animal et, pour ce faire, d 'obtenir que les virus, activement multipliés in vitro, soient capables de s'insérer dans l'animai mais deviennent incapables de s'y multiplier.
Un but de la présente invention est donc de produire des vecteurs débarassés de séquences oncogenes et susceptibles de transporter d'autres gènes, dans une configuration permettant une expression la plus efficace possible de ces derniers.
Ainsi, dans EP 178 996, les principaux vecteurs décrits comportaient encore l'oncogène erbA. Selon la présente invention, cet oncogène a été délété à son tour.
Selon la présente invention, on a recherché l'optimisation de vecteurs rétroviraux, objet des brevets précédents cités ci-dessus.
L'optimisation des vecteurs a été recherchée en travaillant respectivement sur l'activité des promoteurs et sur l'efficacité du système de maturation et de traduction des ARN.
La présente invention a en effet pour objet un vecteur viral d'intégration et d'expression d'au moins un gène hétérologue dans des cellules aviaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par tout ou partie du génome proviral de l'érythroblastose aviaire ou d'un virus apparenté dans lequel le(s) dit(s) gène(s) hétérologue(s) remplace(nt) le gène v-erbA et/ou le gène v-erbB et en ce que ie(s) dit(s) gène(s) se trouve(nt), soit sous
le contrôle d'un promoteur de LTR du même virus auquel cas le(s) gène(s) hétérologue(s) mime(nt) le(s) gène(s) qu'il(s) remplace(nt) soit sous le contrôle d'un promoteur hétérologue, auquel cas une séquence att additionnelle est positionnée en amont dudit promoteur hétérologue. Par gène hétérologue, on entend désigner un gène qui n'est pas normalement présent dans le génome du virus de l'érythroblastose aviaire. Il peut s'agir d'un gène dit "utile" codant pour une protéine d'intérêt industriel destinée à être obtenue par culture cellulaire ou bien d'un gène pouvant présenter un intérêt particulier dans le traitement ou l'élevage des oiseaux notamment les poulets, gène assurant la vaccination ou un meilleur développement par exemple, ou encore il peut s'agir d'un gène marqueur en particulier de résistance à un antibiotique.
Par promoteur hétérologue, on entend désigner un promoteur efficace qui n'est pas normalement présent dans le génome du virus, il peut s'agir notamment d 'un promoteur eukaryote. On peut citer en particulier le promoteur du virus simien SV40.
Les vecteurs viraux évoqués dans le cadre de la présente invention peuvent être aussi bien des vecteurs plasmidiques ou éventuellement des fragments d'ADN que des vecteurs viraux vrais à ARN comme cela a été déjà mentionné dans les brevets précédents de la demanderesse.
Les virus plus particulièrement concernés par la présente invention sont l'AEV et les virus apparentés du type ALSV, ainsi que les virus non défectifs du type RAV.
Différents promoteurs ont été testes et ont été placés dans des vecteurs dans différentes configurations.
L'activité de ces vecteurs, après insertion stable, a été examinée sur CEF et sur QT6.
L'étude de l'activité des promoteurs montre que, dans le cas des cellules de poulet normales, l'emploi d'un promoteur de LTR aviaire est préférable. Les promoteurs du gène TK n'y exercent quasiment aucune activité. Le promoteur de SV40 exerce une activité, quoique plus faible que celle d'une LTR aviaire. Dans les cellules QT6, on peut utiliser un promoteur de LTR, aussi bien qu'un promoteur hétérologue.
En second lieu, une difficulté majeure, dans l'expression des gènes portés par des vecteurs dérivés de l'AEV, résulte du mécanisme de traduction particulier des oncogenes erb-A et erb-B chez l'AEV sauvage : la traduction n'est pas initiée à des codons AUG respectifs de ces gènes (v-erbA n'a pas d'AUG ; l'AUG de v-erbB est un codon interne). L'initiation se fait au codon initiateur du résidu du gène gag situé en 5 ' du gène erb-A. II en résulte la production de deux protéines fusion dites gag-erbA et gag-erbB.
Plusieurs vecteurs véhiculant un ou des gènes hétéroiogues ont été construits. Par exemple, le gène neo a été inséré soit à la place de l'oncogène erb-A, soit à la place de i'oncogène erb-B et, pour chacune des deux positions, il a été inséré soit dans ia même phase de lecture que i'oncogène qu'il remplace, soit dans une phase de lecture différente. Dans une construction, on a déiété la panie 3' terminale du résidu du gène gag en vue de réduire la longueur de la protéine fusion gag-neo. Dans d'autres, cette région a été simplement déplacée, de façon à conserver les fonctions d'encapsidation et de stimulation de transcription qu'elle est susceptible d'exercer. On a cherché à déterminer, en particulier :
- quelles configurations conduisent à une production maximale de néomycine phospho-transférase ;
- s'il est possible d'obtenir une protéine néomycine phosphotransférase ne comportant pas les acides aminés NH2 terminaux codés par le gène gag et dont la traduction serait initiée au niveau de l'AUG propre du gène neoR. L'expression d'un gène hétérologue est maximale lorsque son mécanisme de traduction mime celui des oncogenes erb-A ou erb-B qu'il remplace. Il s'instaure alors une compétition entre l'AUG du gène gag et celui du gène hétérologue pour l'initiation de ia traduction ; cette compétition s'avère totalement à l'avantage de l'AUG viral. Dans certaines structures, on peut observer le fonctionnement de l'AUG spécifique du gène hétérologue. Mais le niveau d'expression reste alors très bas. Une amélioration consiste à introduire un signal d'arrêt de traduction dans le
gène gag. Ce signai permet une réinitiation de ia traduction à l'AUG du gène hétérologue et donc la production d'une protéine non fusionnée à la protéine virale gag. En effet, il s'avère nécessaire pour certaines applications, d'obtenir une expression spécifique de ia séquence exogène, afin de conserver toutes les caractéristiques de la protéine codée.
Dans un premier mode de réalisation utile notamment pour l'intégration dans des cellules de poulets, le(s) gène(s) hétérologue(s) se trouve(nt) donc sous la dépendance d'un promoteur de LTR aviaire et il(s) mime(nt) le(s) gène(s) qu'il(s) remplace(nt). De façon appropriée, le vecteur comporte un premier gène hétérologue marqueur en position v-erbA et un second gène hétérologue utile en position v-erbB.
L'intérêt essentiel des vecteurs en cause est en effet de pouvoir remplacer, entre les deux LTR, les deux oncogenes par un gène marqueur et un gène utilitaire. Lors des essais qui ont été effectués, on a constaté que, dans certains cas, les souches résistantes ne produisaient plus la protéine intéressante, bien qu'elles gardent l'expression du gène marqueur. Ceci intervient avec une fréquence notable quand le gène ' de résistance est placé en 3'. Au contraire, lorsque le dernier gène est placé en 5', ia conservation du gène utilitaire est bien meilleure. L'une des explications pourrait être que ceci provient d'un épissage au niveau du processus de transcription. L'extrémité 5' est épissé et ferait disparaître dans certaines traductions le gène qui se trouve à l'extrémité 5'. Par contre, le second gène de l'extrémité 3' est bien exprimé et lorsqu'il s'agit du gène marqueur, celui-ci confère la résistance aux cellules, qui sont donc sélectionnées. Afin d'éviter cet inconvénient, il convient de placer le gène utilitaire en position 3', à savoir v-erbB. Dans ces conditions, toutes les cellules qui seront sélectionnées pour une résistance seront également des cellules productrices. Avantageusement, selon une autre caractéristique de l'invention dans ce mode de réalisation, le(s) dit(s) gènes hétérologue(s) se
trouve(nt) traduit(s) à partir de l'AUG du gène gag ou à partir de son (ou leurs) propre(s) AUG mais toujours dans le même cadre de lecture que celui du gène gag.
Ainsi, le cas échéant, le premier gène hétérologue marqueur est traduit a partir de l'AUG du gène gag et le second gène hétérologue utile est traduit à partir de l'AUG du gène gag ou son propre AUG.
Avantageusement, un codon stop est introduit entre le gène gag et le gène hétérologue utile ou l'AUG propre dudit gène utile.
De préférence, le codon stop est situé à une distance optimale de 65 nuciéotides du codon AUG dudit gène utile.
Un autre but de l'invention est de produire des vecteurs capables de prolonger la durée de vie en cultures de cellules.
On a donc aussi réalisé des vecteurs conformes à ce premier mode de réalisation dans lesquels sont insérés un gène marqueur en position v-erbB et un gènede fusion composé de la séquence Δ gag et de la séquence de I'oncogène v-myc issu du génome du rétrovirus aviaire MC29 en position v-erbA ou encore des vecteurs qui possèdent le gène de p53 en position v-erbA ou v-erbB et un gène marqueur en positon v-erbB ou v-erbA respectivement. Ces derniers vecteurs confèrent des propriétés de pérennisation aux cellules aviaires qu'ils infectent.
Dans EP 178 996, les vecteurs décrits capables de prolonger la durée de culture in vitro de fibroblastes de poulet avaient une action qui s'avérait due à I'oncogène erbA. L'utilisation d'autres oncogenes que erbA montrent que le gène myc est nettement plus efficace. L'infection d'une cellule par un rétrovirus entraîne la production d'un ADN proviral circuiarise, comportant soit une LTR, soit deux LTR en tandem. Les données récentes ont montré que cette dernière forme remplit une fonction décisive dans le processus d'intégration de l'ADN provirai au sein de l'ADN cellulaire. En effet, la disposition de deux LTR en tandem crée une structure appelée att qui comporte 30 nuciéotides :
20 sont portés par le segment U5 de la partie 3' terminale de la LTR 3' et
10 sont portés par le segment U3 de la partie 5' terminale de la LTR 5'. Le fonctionnement de cette structure exige l'intervention d'une activité nucléasique portée par le gène Pol. Selon la présente invention, on a exploité les propriété de la séquence att pour obtenir l'intégration d'ADN plasmidiens sans autre relations avec une séquence rétrovirale.
Un segment de 88 pb portant la séquence att a été extrait d'un clone pJS21 portant un doublet de LTR. Ce segment a été inséré dans différents plasmides.
Dans un second mode de réalisation de l'invention, un premier gène hétérologue marqueur est en position v-erbA sous la dépendance d'un promoteur LTR 5' aviaire et un second gène hétérologue utile est en position v-erbB sous la dépendance d'un promoteur hétérologue, le vecteur comportant une séquence att supplémentaire positionnée en amont du promoteur hétérologue. En effet, l'utilisation d'une séquence att supplémentaire dans les constructions virales, permet de mettre un gène sous l'influence d'un promoteur qui ne soit pas le promoteur se trouvant dans le LTR. Dans les vecteurs de type AEV, il n'est en effet pas possible d'assurer la promotion d'un gène en dehors de l'utilisation du promoteur de LTR 5'. Lors de la réplication du virus, les extrémités 5' et 3' c'est-à-dire les deux LTR sont amenées à fusionner la partie centrale de cette fusion est appelée séquence att. Si l'on construit un vecteur dans lequel entre les deux séquences LTR, a été introduit une séquence att supplémentaire, cette séquence att supplémentaire étant suivie par exemple d'un promoteur de SV40 ou d'un promoteur hétérologue quelconque assurant la promotion d'un gène, on constate que certaines des cellules transformées expriment le gène placé sous la promotion dudit promoteur hétérologue. Ceci correspond à des constructions dans lesquelles les structures LTR 5' et 3' demeurent fusionnées c'est-à-dire que la séquence att supplémentaire a servi à l'intégration. Ce phénomène a été démontré en particulier dans une construction mixte comportant dans le sens de lecture 5'-3', le gène neo sous la dépendance du promoteur LTR 5 ' et dans le sens de lecture 3'-5', le gène hygro sous la dépendance du promoteur de SV40 précédé par une séquence att supplémentaire.
Lorsque l'on infecte ou transfecte ces cellules avec ce type de vecteur, on observe sur certaines d'entre elles, la résistance au gène neo ce qui prouve que le promoteur de LTR 5' est alors fonctionnel mais par contre dans certaines d'entre elles, la résistance à l'hygromycine démontre que c'est le promoteur de SV40 qui est actif et dans ces constructions le produit de fusion LTR 5'-3' est resté indemne et ses deux extrémités s'annulent en quelque sorte dans leur pouvoir de promotion.
L'intérêt d'utiliser un promoteur eukaryote non retrovirai différent du promoteur de LTR est que l'on peut mettre un promoteur qui soit inductible ce qui n'est pas possible dans le cas du promoteur de LTR, ou encore un promoteur spécifique du tissu cible.
Dans les vecteurs qui ont une séquence att supplémentaire, on peut déléter une partie de ia séquence U5 de la LTR 5' de telle sorte qu'après, un cycle retrovirai, ne reste fonctionnelle que la séquence att supplémentaire qui assure l'intégration. De préférence, on effectue une délétion de 23 pb dans la région 3' terminale de la séquence U5 de la
LTR 5'. La séquence att supplémentaire permet une intégration exclusive, ia séquence att naturelle générée par la foncion des 2 LTR, lors du premier cycle retrovirai est inactive du fait de la délétion dans la séquence U5. Avantageusement, le vecteur est caractérisé en ce que le second gène hétérologue est en positon v-erbB encadré par le promoteur hétérologue et la séquence de poiyadényiation hétérologue et en ce que l'ensemble (promoteur - gène utile - séquence de poiyadényiation) est en orientation opposée au sens transcriptionnel retrovirai. On peut citer comme promoteur hétérologue le promoteur du virus simien SV40.
La production des virions s'effectue le plus commodément sur des lignées cellulaires immortalisées. Deux lignées qui présentent ces propriétés sont employées : - la lignée QT6 de cellules de caille, issue de traitement de ces cellules par des cancérogènes chimiques. Malheureusement, les cellules de caille ne multiplient que les virus appartenant à certains sous groupes ; - une lignée iymphoblastoïde de cellules de poulet (lignée RPL) dérivée de cellules traitées par le virus de la maladie de Marek. L'emploi de cette lignée débute seulement.
Les lignées précédentes ne sont pas viroproductrices.
Pour obtenir des préparations de vecteurs viraux défectifs, sans adjonction de virus helper, on a cherché à réaliser des lignées cellulaires helper (assistant) capables de fournir à un génome défectif les protéines gag, pol et env, nécessaires pour lui permettre de former des virions.
Les résultats observés montrent que la production de cellules helper aviaires peut effectivement être réalisée. Les lignées obtenues jusqu'à présent sont dotées d'une productivité virale pour créer, par infection à partir des virus obtenus, des lignées cellulaires résistantes au
G418 et non viroproductrices.
Un autre but de la présente invention est donc de construire une lignée permanente de cellules helper capable de produire des préparations virales helper free. Dans EP 178 996, on utilisait pour construire des vecteurs capables de transformer une cellule normale en cellules helper, un promoteur TK ou un promoteur SV40, les points de départ des constructions étant les helper classiques du virus AEV, RAV-1 en particulier.
Selon la présente invention, on utilise un promoteur LTR auquel des déiétions ont été apportées pour supprimer l'aptitude à l'encapsidation de i'ARN codé par ce vecteur.
La présente invention a en effet également pour objet un vecteur capable de transformer une cellule aviaire normale en cellule helper caractérisé en ce qu'il comporte les trois gènes gag-poi-env du virus RAV-1 placés sous le contrôle transcriptionnel d'un LTR du même virus auquel diverses déiétions ont été apportées afin de supprimer l'aptitude à l'encapsidation de l'ARN codé par ce vecteur.
De préférence, le vecteur comporte un gène marqueur placé en 3' du gène env et un second site accepteur d'épissage en amont du gène marqueur.
Dans un mode de réalisation, le gène env a été délété.
Dans un autre mode de réalisation, le gène gag et poi ont été déiétés et remplacés par un gène marqueur, le gène env qui subsiste étant précédé par un site accepteur d'épissage.
La présente invention a donc également pour objet un plasmide d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence composite d'ADN transcrit reverse d'un vecteur retrovirai.
En particulier, la présente invention a pour objet un plasmide d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules compétentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide à ADN comportant au moins une séquence att d'un rétrovirus assurant l'intégration dans l'ADN cellulaire.
Les virions obtenus par transfection d'un tel plasmide et d'un virus assistant doivent alors comporter les produits codés par le gène pol, à savoir les conjugués reverse transcriptase et l'integrase, introduits au cours des processus d'encapsidation sans que le gène correspondant fasse partie du génome encapsidé. Il en résulte que le génome pourra être intégré tout en restant capable de déterminer la formation de virions fonctionnels.
La présente invention a donc également pour objet des cellules infectées par un vecteur viral ou transfectées par un plasmide selon l'invention.
Selon une autre caractéristique, la cellule est capable de compiémenter le vecteur viral.
Enfin, la présente invention a pour objet un procédé de production d'une protéine codée par un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules infectées ou transfectées, selon l'invention.
De même, la présente invention a pour objet un procédé de modification génétique d'animaux, caractérisé en ce qu'on infecte les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral, selon la présente invention.
On peut infecter les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral non producteur de virus, selon l'invention.
La présente invention a enfin pour objet un procédé de production de cellules helper aviaires ou d'immortalisation de cellules aviaires, caractérisé en ce qu'on transfecte ou co-transfecte avec certains des vecteurs selon l'invention citée précédemment des cellules aviaires normales.
Les exemples ci-après décrivent les constructions de divers vecteurs réalisés :
A - A partir du virus de l'érythroblastose aviaire
(AEV) :
Ce rétrovirus défectif comporte deux oncogenes v-erb A et v-erb B exprimés indépendamment à partir de deux ARN distincts (voir figure 1). On a délété ces deux oncogenes afin d'utiliser le génome de l'AEV dans des constructions capables de véhiculer deux gènes insérés respectivement aux positions v-erb A et v-erb B.
Dans un premier ensemble de constructions, un seul gène (le gène codant pour la néomycine phosphotransférase, le gène NéoR, conférant la résistance à l'antibiotique G418) a été inséré soit en position v-erb A soit en position v-erb B. Selon les constructions réalisées, le codon initiateur de traduction AUG du gène inséré se trouve placé ou non en phase avec l'AUG de la fraction résiduelle du gène rétroviral gag (Δ gag).
Dans un second ensemble de constructions deux gènes ont été insérés, l'un utilisé pour la sélection des cellules après transfection, l'autre servant de gène modèle pour l'étude de l'expression génique dans un vecteur retrovirai. En outre, on a construit des vecteurs dans lesquels des séquences retrovirales décrites comme étant nécessaires à l'intégration du provirus dans le génome des cellules cibles (séquence
att), ont été placées en 5' des gènes insérés dans ces vecteurs.
B - A partir du génome helper RAV-1 (figure 30 A)
Ces constructions visent à placer les gènes rétroviraux gag-pol-env, nécessaires au cycle rétroviral, sous le contrôle transcriptionnel de divers séquences virales. Elles ont été réalisées afin de produire des cellules trans-complémentantes exprimant les gènes gag-pol-env, de manière constitutive en inhibant l'encapsidation des génomes portant ces gènes dans les virions synthétisés. L'expression de ces gènes dans de telles cellules peut alors conduire à l'obtention de lignées cellulaires helper autorisant la production des seuls virus vecteurs dέfectifs dérivés de l'AEV, en stock viraux "helper free".
Les exemples comportent deux principaux volets :
- le premier dans lequel sont décrites les constructions dérivées de l'AEV (exemples 1 à 3), - le second qui concerne les constructions impliquant le génome du virus helper RAV-1 (exemples 4 et 5).
Ces exemples sont fait en référence à des dessins sur lesquels :
- La figure 1 représente la structure du génome de l'AEV sauvage (obtenu du Dr J.M. Bishop, US San Francisco), associé aux ARN transcrits et matures (traits pleins) ainsi qu'aux polypeptides traduits (tirets épais). Les gènes v-erb A et v-erb B sont traduits à partir de l'AUG du gène gag pour former les protéines fusions p75 gag-erb A et p61 erb B. ds = site donneur d'épissage as = site accepteur d'épissage.
- La figure 2 représente la construction des vecteurs pTSN et pTXN3'. Ces vecteurs sont directement dérivés des vecteurs p3Rgag-J-env2LTR (ou pTS) pour le pTSN, pTSN et pXJ12 pour le pTXN3', selon la démarche indiquée ci-après . Il s'agit pour le pTSN de la mise en place du gène Néor en position 5' au site XbaI, derrière la séquence gag du vecteur. Le pTXN3' quant à lui correspond au vecteur pXJ12 pour ce qui concerne la position du gène Néor. La différence résidant dans la disparition de toute séquence oncogène. séquence du vecteur, doublet de LTR, gène Néor, pBR 322.
A:ApaI , B:BamHI , Bg:BglII , E:EcoRI , N:Ndel , P:PvuII , X:XhoI , Xb:XbaI .
- La figure 3 représente la construction des vecteurs pTXN3 ' gag- et pTXhoN. Ces vecteurs sont directement dérivés du vecteur pTXII3 ' selon la démarche indiquée ci- après . Le pTXN3 ' gag- dérive du DTXN3 ' après délétion de la séquence gag comprise entre les sites xhoI et XbaI. La construction du pTXhoN représente la mise en place du gène Néor en position 5 ' au site Xhol sans tenir compte de la phase de lecture du gène gag. séquence du vecteur, doublet de LTR, gène Néor ,
pBR 322. A:ApaI , B:BamHI , Bg :BglII , b.e:blunt end, N:NdeI , P:PvuII , X :XhoI , Xb :Xba I .
- La figure 4 représente la construction du vecteur pTXN5'. Ce vecteur est indirectement dérivé du pTXN3'. Cette construction a pour but la mise en place du gène Néor en position 5', au site Xhol, en phase de lecture avec l'AUG du gène gag du vecteur. Les séquences indiquées sur la figure et représentées en triplet correspondent aux sites enzymatiques présents ou créés par l'insertion de linkers. Chaque triplet représente un codon indiquant ainsi la trame de lecture ouverte avec l'AUG du gène gag et du vecteur. séquence du vecteur,
doublet de LTR,
gène Néor , pBR322.
A;ApaI, BtBamHI, Bg:BglII, EtEcoRI, N:NdeI, P:PvuII, X:XhoI, Xb:XbaI.
- Les séquences représentées dans la figure 5 correspondent aux portions codantes (représentation en triplet de bases) séparant l'AUG du gène gag (*) de l'AUG du gène Néor dans les différents vecteurs. Un AUG supplémentaire est présent dans les séquences des vecteurs TSN et XJI. Il appartient en fait à une séquence du transposon Tn5 duquel est issu le gène Néor. L'AUG entre parenthèses dans la séquence de XJI représente un AUG du gène v-erb B encore présent dans ce vecteur (voir brevet EP 8540019999).
Lorsque le gène Néor est situé en position 3', et par conséquent exprimé sur I'ARN sous génomique, les séquences représentent I'ARN après épissage (le signe / indique la fusion entre le site donneur d'épissage et le site accepteur).
- La figure 6 représente la construction du vecteur pNL 35P.
Le plasmide pMC 1871, commercialisé par Pharmacia, a été digéré par l'enzyme SalI, et le fragment de 3,1 kb portant le gène LacZ a été purifié sur un gel d'agarose. Ce fragment a été inséré dans le site unique Xhol (les sites Xhol et SalI sont compatibles) situé dans la région gag du vecteur.
Il en résulte le vecteur pNL 35P ;; le gène LacZ dans ce vecteur ne possède pas son propre AUG, il est traduit à partir de l'AUG du gène retroviral delta-gag, et s'exprime sous forme de protéine fusion delta-gag-Lacz. Le cadre de lecture du gène LacZ est en phase avec l'AUG de delta-gag.
- La figure 7 représente la construction du vecteur pNL 53gpt.
Le plasmide pMMuLVSV-LacZ a été doublement digéré par les enzymes HindIII et BamHI, et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow. Le fragment de 3,5 kb portant le gène Lacz et le fragment de 280 pb du gène gpt a été purifié sur un gel d'agarose puis intégré dans le vacteur pTXN5' préalablement linéarisé par l'enzyme EcoRI et les extrémités réparées par la polymérase de Klenow. II en résulte le vecteur pNL 53 gpt.
. Le fragment de 280 pb du gène gpt est représenté par :
. La partie hachurée
dans le pMMuLVSV-LacZ correspond à de l'ADN cellulaire murin. . Les flèches portées par les gènes correspondent à leur sens de transcription. . B.E. : bout franc.
- La figure 8A représente la construction du vecteur pNL 35 AUG (exemple 2).
- La figure 8B représente ia carte de restriction du PUC 19.
- La figure 9 représente la construction vecteur pNL 35 nis (exemple 2).
- La figure 10 représente ia construction du vecteur pNL 35 P (exemple 2).
- La figure 1 1 représente la construction du vecteur pNc GH (exemple 2).
- La figure 12 représente la construction du vecteur pMN 53
(exemple 2).
- La figure 13 représente le clonage du gène p 53 murin dans TXN 5' (exemple 2).
- La figure 14 représente le clonage du gène p53 de poulet dans TXN 5'.
- La figure 15 représente la récupération de la séquence "att" à partir du doublet de LTR de l'AEV.
A partir du plasmide pJS21 comportant un doublet de LTR issu de la fusion du génome de l'AEV, bordé de par et d'autre par les résidus des gènes gag et env, et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pBR322, a été relâché par la double digestion à l'aide de ces enzymes, le fragment de 1751 pb purifie ensuite sur gel d'agarose. A partir de ce fragment, est relaché en digestion simple HinfI, un sous fragment de 340 pb qui est purifié sur gel d'agarose à 2,5 %. La digestion MaelII, ainsi que la purification sur gel de polyacrylamide permet d'obtenir un fragment de 88 pb contenant la séquence "att" dont nous donnons la séquence (B : BamHI. E : EcoRI, Hf : HinfI, M: MaeIII, Ps : Pst I).
- La figure 16 représente le sous-clonage de la séquence "att" munie du polylinker dans le plasmide PX343.
Les fragments de 420 pb (ou 508 pour celui issu du Matt55) sont relâchés, par digestion PvuII à partir des clones Matt3, Matt5 et Matt55, et purifié sur gel d'agarose. Ce fragment est recoupé par EcoRI et l'on récupère le fragment de 266 pb (ou 354 pb) que l'on purifie sur gel d'agarose. Les extrémités 5' sortantes générées par cette enzyme sont remplies par la polymérase de KLENOW,- et les fragments sous-clonés en amont du promoteur de SV40 du plasmide PX343 préalablement linéarisé par l'enzyme PvuII et déphosphorylé. Il en résulte 3 clone portant la séquence "att", soit dans un sens (PXatt3), soit dans l'autre (PXatt5), soit en doublet de même sens que ce dernier (PXatt55). Ces vecteurs sont représentés
en prenant les mêmes conventions d'orientation que pour les vecteurs Matt.
(B: BamHI, E: EcoRI, F: FspI, Hd: HindIII, K: KpnI, P: PvuII, Ss: SstI, oci-SV: origine de réplication du SV40, polyA-IVS-t-SV : séquence de polyadénylation et intron du gène codant pour l'antigène t de SV40).
- La figure 17 représente la construction des vecteurs rétroviraux pAFY.
Les plasmides PXatt ont été linéarisés par l'endonucléase Fspl, et sur les extrémités franches générées par cette enzyme, ont été ligués des linker HindIII. Les fragments de 4 kb portant la séquence "att" -gène Hygro avec le promoteur de SV40 sont isolés sur gel d'agarose après digestion HindlII, puis insérés dans le site HindlII du pCNH. L'insertion dans ce vecteur peut se faire dans les deux sens. Deux types de vecteurs pAFY sont obtenus, et identifiés par cartographie de restriction. On définie les pAFY53, pAFY55, pAFY555 comme les vecteurs portant l'ensemble att-hygro dans le même sens que celui de transcription retrovirai, et les vecteurs pAFY33, pAFY35, pAFY355 comme les vecteurs portant cet ensemble inséré en sens inverse. (B: BamHI, E: EcoRI, : Hd: HindIII, K: KpnI).
- La figure 18 représente les vecteurs rétroviraux pAFY.
Ces vecteurs sont représentés sans la partie plasmidienne qui sert à leur amplification. Les lignes représentent les séquences non codantes d'origines rétrovirales, les petites boîtes représentent les résidus des gènes rétroviraux gag et env, et les grandes boîtes représentent les LTR ainsi que les séquences qui ne sont pas d'origines retrovirales. (B: BgLII, E: EcoRI, H. HindIII, K: KpnI, Xb: XbaI, Xh: XhoI)
- La figure 19 représente la construction du plasmide BSK + LTR.
- La figure 20 est une représentation schématique du coliphage recombinant M13mp18ΔU5. le cercle en trait simple représente le génome du coliphage M13mp18. - la partie en trait double représente la LTR mutée et ses séquences flanquantes. - la première ligne de séquence correspond à celle de l'extrémité 3' de la séquence U5 mutée de la LTR, la seconde à la partie délétée (23 pb).
- la figure 21 représente l'insertion du gène de résistance à la néomycine dans le coliphage recombinant M13mp18ΔU5.
Cette figure illustre l'étape de construction du coliphage recombiπant M13mp18 U5Néo à partir du M13mp18 U5.
- la figure 22 représente la construction du plasmide PSVph (exemple 3).
- la figure 23 représente la construction du plasmide BSK+ att LTR (exemple 3).
- la figure 24 représente la construction du plasmide pPCYS64 (exemple 3).
- la figure 25 représente la construction du plasmide pCYS84.
- La figure 26 représente la construction du clone pDIPO 123 véhiculant le promoteur du vecteur défectif pHF 13. Lés fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution.
séquence codante des gènes rétroviraux,
séquence rétrovirale non codante,
pBR 322.
- La figure 27 représente la construction du clone pGAS-Cla véhiculant le signal de polyadénylation du helper défectif pHF 13. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution. origine de réplication du virus SV40, contenant le
promoteur et l'enhancer des gènes précoces,
signal de poiyadényiation des gènes précoces de SV40, pro
moteur du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I,
signal de polyadényiation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I.
- La figure 28 représente la construction du clone pHP2 véhiculant les gènes gag-pol-env sous le contrôle transcriptionnel du promoteur des gènes précoces de SV40. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution.
ϋ5, R, U3, séquence codante
des gènes rétroviraux,
séquence rétrovirale non codante,
pBR 322,
origine de réplication du virus SV40, contenant le promoteur et l'enhancer des gènes précoces, signal de poiyadényiation des gènes
précoces de SV40.
- La figure 29 représente la délétion de la séquence d'encapsidation et assemblage du clone pHF 13. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution.
séquence codante des gènes rétroviraux,
séquence rétrovirale non codante,
pBR 322 ou coliphage M13 mp11,
origine de réplication du virus SV40, contenant le promoteur et l'enhancer des gènes précoces,
signal de poiyadényiation des gènes précoces de SV40,
signal de poiyadényiation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I, Δ indique la délétion de la séquence d'encapsidation.
- La figure 30 représente la structure comparée du génome de RAV-1 avec celui du pHF 13. A - Carte des gènes et principales structures impliquées dans le fonctionnement du helper. B - Carte détaillée de la région promoteur de pHF 13. c - Description de la délétion de la séquence d'encapsidation dans le génome de pHF 13. Caractères gras : séquence délétée, caractères gras italiques : séquence d'encapsidation.
séquence codante des gènes rétroviraux,
séquence rétrovirale non codante.
- La figure 31 représente la structure et le fonctionnement des divers vecteurs helper construits.
Les boîtes représentent la structure des différents génomes. Ceux-ci sont associés aux ARN transcrits et matures (traits pleins), ainsi qu'aux polypeptides traduits (tirets épais). ds et as sont les sites donneurs et accepteurs d'épissages.
∇ et ▼ représentent les codons initiateurs et terminateurs de traduction.
- La figure 32 représente la construction du plasmide Sa-H.
Dans cette figure, et dans les suivantes, on utilise les abréviations suivantes :
. ds et sa sont les sites donneurs et accepeurs d'épissage. . Kb et pb : kilopaires de bases et paires de base. . A : AccI, Bs : BstEII, B : BamHI, C : ClaI, E : EcoR I, k : kpnI, H : HindIII,
Hp : Hpal, N : Notl, P : PVUII, Si : SalI, Sp : SphI, Sm : SmaI, Ss : SstI, St : StvI, Xb : XbaI, Xh : XhoI, Nr : NARI.
- La figure 33 représente la construction du vecteur helper pGPEM.
- La figure 34 représente la construction du retour helper pGPH.
- La figure 35 représente la construction des plasmides pUC
Env A et pue Env B.
- La figure 36 représente la construction des vecteurs helper pEA.pA et pUC.Env B pA.
- La figure 38 représente la construction du plasmide pLTR-pHléo.
La figure 39 représente la construction des vecteurs helpers p.Ph.EA et pPh.EB.
- La figure 40 représente la construction des vecteurs rétroviraux pNE A et pNEB.
EXEMPLE 1 - Elaboration de vecteurs véhiculant un seul gène
1) Préparation du clone pTSN (figire 2)
Le clone pTSN est préparé à partir du clone pBRgag-J-env2LTR (pTS) qui contient le génome. de l'AEV débarrassé de ses séquences oncogenes (voir brevet n° 85 4019999). Le gène codant pour la néomycine phosphotransférase II (Néo), issu du transposon Tn5, est pourvu de linkers XbaI à ses extrémités. Il est inséré par ligation dans le vecteur pTS préalablement linéarisé après digestion par lienzyme XbaI.
Le gène Néo est inséré dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo est situé à 803 nuciéotides de l'AUG du gène gag et ne se trouve pas dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5).
2) Préparation du clone pTXN3' (figure 2)
Le clone pTXN3' dérive à la fois des clones pTS et pXJ12 (voir brevet n° 85 4019999).
Les clones pTS et pXJ12 sont successivement digérés par les enzymes Apal et EcoRI. Le fragment de 1,2 kb, issu du clone pXJ12 après digestion et renfermant le gène Néo, est purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose. Ce fragment est alors clone dans le vecteur pTS préalablement digéré pour former le clone pTXN3'.
Le clone pTXN3' présente les caractéristiques des deux clones dont il est issu :
- il est, comme le clone pTS, dépourvu de séquences oncogenes et possède en 3' de la séquence gag un site de clonage unique XbaI.
- il contient, comme le clone pXJ12, le gène Néo en position 3' (à la place du gène v-erb-B). L'AUG de ce gène se situe, après épissage de I'ARN génomique, à 33 nuciéotides de l'AUG du gène gag et se trouve dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5). 3) Préparation du clone pTXN3' gag- (figure 3)
Le clone pTXN3' gag- est directement issu du clone pTXN3' (paragraphe 2, figure 2).
Le clone pTXN3' est digéré successivement par les enzymes Xhol et Xbal. Les extrémités ainsi obtenues sont réparées par la DNA polymérase I fragment dit de Klenow (polymérase de Klenow). Le vecteur est ensuite purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose, et religué. Le clone pTXN3' gag- obtenu est ainsi délété d'environ 600 nuciéotides de la partie 3' terminale du gène gag.
4) Prégaration du clone pTXhoN (figure 3)
Le clone pTXN3' (paragraphe 2, figure 2) est successivement digéré par les enzymes Ndel et EcoRI. Les extrémités obtenues sont réparées par la polymérase de Klenow. Les fragments sont ensuite purifiés par électroélution après séparation sur gel d'agarose.
Le fragment correspondant au vecteur est religué sur lui-même pour former le clone pTX. Ce clone pTX est digéré par l'enzyme Xhol, ses extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow.
Le fragment correspondant au gène Néor est clone dans le clone pTX pour former le clone pTXhoN.
Dans le clone pTXhoN, le gène Néo se trouve orienté dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo se situe à 255 nuciéotides de l'AUG du gène gag et n'est pas dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 3).
5) Préparation du clone pTXN5' (figure 4)
Le clone pTXN3' (paragraphe 2 , figure 2) est linéarisé après digestion par l'enzyme BglII. Après réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, le clone est ligué en présence de linkers XbaI pour former le clone pTXN3'Xba.
Le clone pTXN3'Xba est successivement digéré par l'enzyme Ndel et partiellement digéré par l'enzyme Xbal. Le fragment correspondant au gène Néo est purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose.
Le clone pTXN3' est digéré successivement par les enzymes Ndel et BglII. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow et religuées pour former le clone pTX. On peut noter que cette opération reconstitue le site BglII, le site NdeI étant détruit.
Le clone pTX est ensuite linéarisé après digestion par l'enzyme Xhol. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Le clone est alors religué en présence de linkers BglII (dont la séquence exacte est indiquée sur la figure 4) pour former le clone pTXBglII. Ce clone est soumis a une surdigestion par l'enzyme BglII pour éliminer l'excès de linker, et religué. On peut noter que l'adjonction d'un linker
BglII sur le site XhoI préalablement réparé, recrée le
site Xhol .
Le clone pTXBglII est a son tour linéarisé après digestion par l'enzyme BglII. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Le clone est religué en présence de linkers NdeI (dont la séquence exacte est indiquée dans la figure 4) pour former le clone pTXNde. Cette opération détruit le site BglII. L'excès de linkers Ndel est éliminé par surdigestion.
Le clone pTXNde est successivement digéré par les enzymes XbaI et Ndel. Il est ensuite mis en ligation avec le fragment NdeI-XbaI, correspondant au gène Néo précédemment isolé du clone pTXN3'Xba, pour former le clone pTXN5'.
Le clone pTXN5' contient ainsi :
- le gène Néo en position 5' (à la place du gène v-erb-A).
- deux sites uniques de clonage EcoRI et BglII en position 3' (à la place du gène v-erb-B).
Le gène Néor se trouve positionné dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo se situe à 267 nuciéotides de l'AUG du gène gag et est dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5).
Les différentes constructions réalisées ont été transfectées sur des CEF en culture. Les cellules exprimant le gène neoR sont sélectionnées en présence de G148. Un apport initiai de virus helper permet d'obtenir des particules virales vecteurs dans le surnageant des cultures. Ces particules ont servi à infecter d'autres fibroblastes qui, à leur tour, deviennent résistants à l'antibiotique de sélection. Les protéines cellulaires sont alors extraites et l'activité néomycine phosphotransferase dosée. Les premiers résultats peuvent être énoncés comme suit :
1. l'activité maximale est obtenue lorsque le gène NéoR est inséré dans la même phase de lecture que celle de i'oncogène qu'il remplace (production de protéines fusion gag-neo ; vecteurs TXN5', XJ12, TXN3 ' et TXN3 'gag-) ;
2. pour obtenir la production d'une protéine néomycine phosphotransferase dont la traduction soit initiée à l'AUG propre du gène néoR, on a inséré ce dernier dans une phase de lecture différente de celle de I'oncogène qu'il remplace. Dans ces conditions, l'activité néomycine phosphotransferase détectée est relativement faible lorsque le gène se trouve en position erbB (XJ1 ) ; cette activité est en dessous du seuil de sensibilité de la méthode lorsque le gène est placé en position erb-A (TXhoN et TSN). Bien que très faible, cette activité suffit pour conférer à ces cellules la résistance au G418 ;
3. la délétion de la partie 3' terminale du résidu du gène gag réduit l'activité néomycine phosphotransferase d'un facteur 2 (comparer TXN3' avec TXN3'gag-). Chez le RSV, cette région contient une séquence de type enhancer. L'effet observé pourrait donc s'exercer par un mécanisme transcriptionnel. La présence du gène erb-A dans le vecteur entraîne un doublement de la quantité d'enzymes produite. Cet effet se relie peut-être à l'action stimulatrice de ce gène sur la multiplication cellulaire.
EXEMPLE 2 : Vecteur véhiculant deux gènes respectivement en position v-erbA et v-erbB
Le gène bactérien NéoR codant pour la néomycine phosphotransferase est présent dans tous ces vecteurs à deux gènes ; il est placé soit en posiion de I'oncogène v-erbA soit en position de I'oncogène v-erbB. Dans la position non occupée nous avons placé :
- le gène bactérien Lac7 codant pour la bêta galactosidase d'E.coli (utilisé comme gène modèle d'expression) ; c'est le cas des vecteurs pNL35 - pNL35AUG - pNLnls35 - pNL53gpt et pNL53P,
- le gène CGH codant pour l'hormone de croissance aviaire (cas du vecteur ' pNcGH),
- le gène fusion ∆ gag-Vmyc (cas du vecteur pMN53),
- les gènes codant pour la protéine p53 d'origine murine ou aviaire (p5355 , p5396, p53P4 et p53P2),
- ie gène env codant pour la protéine de l'enveloppe virale (pNEA et pNE B).
1 ) - Le vecteur pNL35 (figure 6 )
Il dérive du pTXN3' décrit dans la figure 2. L'ADN du clone pTXN3' a été linéarisé par l'endonucléase XhoI dans le site unique situé dans la séquence delta-gag du vecteur (figure 6).
Le gène lacZ est isolé à partir du plasmide pMC 1871 (figure 6), par digestion avec l'enzyme Sali. Le fragment de 3,1 kb est purifié sur gel d'agarose, puis inséré dans le site Xhol du pTXN3' ; les extrémités Xhol et SalI sont compatibles et conduisent à la recréation des sites SalI.
Il en résulte le vecteur pNL 35 (figure 6). - Propriété du vecteur pNL 35.
En plus des propriétés du vecteur pTXN3' rapportées dans le paragraphe 1-A-2, ce vecteur porte :
. le gène Lac Z en 5' de la séquence J ; ce gène s'exprime sous forme de protéine fusion à partir de l'AUG du gène gag retroviral. . la protéine fusion delta-Gag-LacZ est fonctionnelle dans les cellules de poulet (CEF), puisque l'activité enzymatique qui se traduit par une coloration bleue en présence de X-Gal (5-bromo,4-chloro,3- indolyl,B-D galactopyranoside) a été révélée dans les cellules qui ont reçu ce vecteur.
. ce vecteur permet de mettre en évidence et d'étudier le fonctionnement de 2 gènes simultanément, le gène codant pour la résistance à la néomycine (les cellules cultivées sur un milieu contenant du G 418 continuent à croître), et le gène codant pour la bêta-galactosidase dont l'activité est mise en évidence par la coloration bleue des cellules en
présence de X-Gal.
2) - Vecteur pNL 53 (figure 7)
. Il dérive du vecteur pTXN5' décrit dans la figure 4. . Le vecteur pTXN5' a été linéarisé par l'enzyme EcoRI et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extrémités franches. . Le plasmide pMMuLVSV LacZ (obtenu de chez J.F. Nicholas (Sanes J.S. et al 1986, EMBO J.5 ; 3133- 3142)) porte le gène bactérien LacZ de 3,5 kb limité par les sites HindIII et BamHI dans le génome du rétrovirus murin MMuLV. Ce gène LacZ comprend dans sa partie 5' environ 280 pb du gène gpt. . Ce plasmide est doublement digéré par BamHI et HindIII, le fragment de 3,5 kb LacZ est purifié sur un gel d'agarose et, les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Ce fragment est inséré dans le vecteur pTXN 5' préparé comme indiqué cidessus. Il en résulte le vecteur pNL 53.
- Propriétés du vecteur pNL 53. . En plus des propriétés du vecteur pTXN 5' ce vecteur comme le vecteur pNL 35 à la potentialité d'exprimer 2 gènes : Néo et LacZ. . Le gène LacZ peut s'exprimer à partir de l'AUG porté par la séquence du gène gpt en position -15 (figure 7). Cet AUG est dans le même cadre de lecture que la séquence du gène LacZ. . La protéine fonctionnelle codée par le gène LacZ n'est pas une protéine fusion dans ce cas car la traduction initiée à l'AUG de delta-gag doit être stoppée par l'un des 4 codons de terminaison (TAG, TGA, TGA et TGA) situés dans la séquence du gène gpt, placée en amont du gène LacZ (figure 7).
3) - En plus des vecteurs déjà mentionnés dans cet exemple, c'est-à-dire les vecteurs pNL 35 et pNL 53, nous avons construit d'autres vecteurs qui peuvent sms être rassemblés en 3 groupes, le 3 groupe constituant un cas particulier de vecteurs à 2 gènes. a) 1 groupe :
Ce sont des vecteurs qui véhiculent les mêmes gènes que les vecteurs pNL 35 et pNL 53, c'est-à-dire les gènes bactériens Néo et LacZ. Ces vecteurs sont :
- pNL 35 AUG, dont la caractéristique est : le gène LacZ a son propre AUG (ce qui n'était pas le cas dans le vecteur pNL 35) dans une trame de lecture différente de celle de la séquence delta-gag.
- pNL 35 AUG P possède comme le précédent le gène LacZ avec son propre AUG, ce dernier étant dans la même trame de lecture que l'AUG de la séquence delta-gag.
- pNL 53 P : la séquence du gène gpt présente dans le vecteur pNL 53 gpt a été délétée. La séquence codante du gène LacZ est placée dans le même cadre de lecture que celle de ia séquence delta-gag.
- pNL 53 AUG : identique au précédent vecteur (pNL 53 P) et possède un codon initiateur AUG pour le gène LacZ, dans une trame de lecture différente de celle de la séquence delta-gag.
- pNL 53 AUG P : identique au précédent vecteur (pNL 53 AUG) mais le codon initiateur AUG du gène LacZ est dans la même trame de lecture que celui de la séquence delta-gag.
- pNL nls 35 : identique au vecteur pNL 35 mais avec insertion d'une séquence supplémentaire dite nls (nuciear localisation- séquence) en amont du gène LacZ. Cette séquence confère une localisation péri-nucléaire à l'enzyme produite par le gène LacZ (β-galactosidase), soit une coloration bleue péri-nucléaire en présence du substrat X-Gal.
b) 2ème groupe : Ce sont des vecteurs qui véhiculent 2 gènes, dont l'un, est le gène Néor. b.l) - pNcGH : ce vecteur possède un gène Néor en position de I'oncogène v-erbA, et un gène codant pour la G. H. aviaire (Hormone de croissance aviaire) en position de I'oncogène v-erbB ; ce gène cGH aviaire est représenté par l'ADN complémentaire synthétisé à partir des ARN messager produisant la GH aviaire. Ce gène a été produit par SANOFI-Toulouse.
b.2)- pMN53 : ce vecteur possède un gène
Néor en position v-erbB et un gène fusion composé de la séquence delta-gag et de la séquence de I'oncogène v-mye issu du génome du rétrovirus aviaire MC29 en position v-erbA. Ce vecteur confère aux cellules qui l'hébergent, des caractéristiques de pérennisation et transformation cellulaires.
b.3) - Vecteurs véhiculant les gènes de p53 : 4 vecteurs ont été construits. Tous possèdent le gène Néor en position v-erbA et un gène codant pour la protéine P53 en position v-erbB. Ces gènes de P53 sont représentés par des ADN complémentaires (ADNc). * 2 vecteurs véhiculant un ADNc de P53 d'origine murin. Ils diffèrent par l'orientation de ce
gène placé dans le sens retrovirai (p53S5) ou en sens inverse (p53S6).
* 2 vecteurs véhiculant un ADNc de P53 d'origine aviaire. Ils diffèrent par l'orientation de ce gène placé dans le sens retroviral (p53P4) ou en sens inverse (p53P2).
Ces constructions peuvent être utilisées, comme le vecteur pMN53, à des fins de pérennisation cellulaire. Le vecteur p53P4 paraît avoir un effet similaire aux vecteurs véhiculant I'oncogène v-erbA, c'est-à-dire une influence positive sur la multiplication cellulaire.
b.4) - pN.E : deux vecteurs ont été construits contenant l'un et l'autre le gène Néor en position de I'oncogène v-erbA. (voir exemple 4-5) B))
En outre, ces vecteurs véhiculent un gène en v (codant pour l'enveloppe rétrovirale) ; l'un étant le gène env de sous-groupe A (pN.EA), l'autre étant le gène env de sous-groupe B (pN.EB), le site accepteur d'épissage, précédant le gène env, a été rapporté lors de la construction avec le gène env.
Ce site provient du virus RAV fournissant le gène env, soit RAVI pour pN.E A, soit RAV2 pour pN.EB. les cellules hébergeant ce vecteur exprime: constitutivement le gène env. Cette expression conduit la cellule en question à une résistance rétrovirale vis-à-vis des virus de même sous-groupe. En outre, ces cellules sont résistantes à la Néomycine.
c) 3ème groupe :
Cas particulier de vecteurs à 2 gènes : . pE.Ph : Deux vecteurs ont été construits, l'un contenant le gène env de sous-groupe A (pEAPh),
l'autre le gène env de sous-groupe B (pEB.Ph).
Ils contiennent l'un et l'autre, en plus du gène env, le gène de résistance à la phléomycine (PhleoR) en aval du gène env. Dans les deux cas, le site accepteur d'épissage est absent. Les gènes env et Phléo R sont placés sous le contrôle transcriptionnel de la LTR du rétrovirus
RSV et de la séquence de fin de transcription et de poiyadényiation du virus SV40.
a.1) Vecteur pNL 35 AUG (figure 8) Il dérive du vecteur pTXN3' décrit dans la figure 2.
* Le vecteur pTXN3' a été linéarisé par l'enzyme xhol et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extrémités franches.
Le vecteur linéarisé a été digéré par l'enzyme xbal qui génère des extrémités cohésives. Le vecteur doublement digéré, résultant, de 7857 paires de bases, a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution.
* Le vecteur pMC 1871 de 7460 paires de bases, décrit dans la figure 8 a été linéarisé par l'enzyme Sali et le fragment de 3000 paires de bases, portant le gène LacZ, a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution.
* Le vecteur pUC 19 de 2868 paires de bases, décrit dans la figure 8 a été linéarisé par l'enzyme Sali. Le fragment LacZ de 3000 paires de bases a été inséré dans le pUC 19. Le vecteur résultant est le pUC 19-LacZ de 5690 paires de bases.
* Le vecteur pUC 19 LacZ a été linéarisé par l'enzyme HindIII et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extré
mités franches.
Ce vecteur linéarisé a été digéré par l'enzyme XbaI. Le fragment résultant, de 3097 paires de bases a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution. Ce fragment de 3097 paires de bases, portant le gène LacZ, a été inséré dans le vecteur pTXN3' de 7857 paires de bases.
Il en résulte le vecteur pNL 35 AUG (figure 8).
En plus des propriétés du vecteur pNL 35, ce vecteur a la potentialité d'exprimer le gène LacZ à partir d'un AUG propre.
a. 2) Vecteur pNL 35 nls (figure 9) * Ce vecteur dérive du pTXN3' décrit dans la figure 2. Ce vecteur pTXN3' a été linéarisé par l'enzyme Xbal et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extrémités franches. Ce vecteur linéarisé a été digéré par l'enzyme Xhol qui génère des extrémités cohesives. Le vecteur doublement digéré, résultant, de 7857 paires de bases a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution.
* Le vecteur pGEM nls LACZ décrit dans la figure 9, porte le gène LacZ en aval d'une séquence nls (nuclear localisation séquence). Ce vecteur a été doublement digéré par les enzymes SalI, qui génère des extrémités cohésives et Smal qui génère des extrémités franches. Le fragment de 3,8 kb résultant a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution. Ce fragment de 3,8 kb a ensuite été inséré dans le vecteur pTXN3' de 7857 paires de bases.
Il en résulte le vecteur pNL 35 nls. Ce vecteur, en plus des propriétés du vecteur
NL 35, possède la séquence nls en amont du gène LacZ. Cette séquence permet la localisation périnucléaire de la protéine LacZ vers la membrane nucléaire Les cellules qui expriment ce vecteur NL 35 nls, présentent une coloration bleue périnucléaire, après traitement au Xgal, alors que les cellules qui expriment le vecteur NL 35 présentent une coloration bleue cytoplasmique, après le même traitement au Xgal.
a. 3) Le vecteur pNL 53 P (figure 10)
Ce vecteur dérive du pNL 53gpt décrit dans la figure 7.
* Le vecteur pNL 53 gpt a été linéarisé par l'enzyme HindlII, et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extrémités franches. Le vecteur résultant a ensuite été digéré par l'enzyme Clal qui génère des extrémités cohesives. Le fragment d'ADN résultant, de 11 kb a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution. * Le plasmide pMC 1871 décrit dans la figure 8 a été linéarisé par l'enzyme SalI et les extrémités ont été réparées par la polymérase d e Klenow pour obtenir des extrémités franches.L'ADN ainsi traité a ensuite été digéré par l'enzyme Clal qui génère des extrémités cohesives. Le fragment de 1 kb, résultant, portant la partie 5' du gène LacZ, a été isolé sur gel d'agarose et purifié par électroélution.
Le fragment de 1 kb a ensuite été inséré dans le vecteur pNL 53. Il en résulte le vecteur pNL 53 P.
En plus des propriétés du vecteur pNL 53 gpt, le vecteur pNL 53 P a la particularité de ne plus posséder la séquence gpt, et d'exprimer le gène LacZ à partir de l'AUG du résidu Δ Gag qui est dans le même cadre de lecture que la séquence du gène LacZ.
La protéine fonctionnelle codée, est une protéine fusion Gag-LacZ.
b. 1) Construction du vecteur pNcGH (figure 1) A partir du plasmide pCGHl portant l'ADN complémentaire du gène de l'hormone de croissance aviaire, le fragment de 750pb HindIII-NcoI a été isolé et l'extrémité Ncol rendue franche par traitement à la polymérase de Klenow. Ce fragment portant le gène d'hormone de croissance aviaire a été inséré entre les sites HindIII et EcoRI en remplacement du gène LacZ dans le vecteur pNL 53. Le plasmide résultant a été appelé pNcGH. Ce vecteur porte le gène de résistance à la néomycine en position v-erbA et le gène d'hormone de croissance aviaire cGH en position v-erbB.Ce dernier porte dans sa partie 5' un codon stop et un codon initiateur distants de 19pb l'un de l'autre. Ces deux codons sont dans le même cadre de lecture que l'AUG de la séquence Δ-gag. Les cellules infectées par un stock viral de ce vecteur deviennent résistantes à la néomycine et devraient exprimer le gène cGH, produisant donc l'hormone de croissance aviaire.
b. 2) Construction du vecteur pMN53 (figure 12)
Le plasmide recombinant pMC38 portant le génome retrovirai aviaire du virus MC29 dans le plasmide pBR313 a été utilisé.
A partir de ce plasmide, un fragment de 3,5 kb BamHI portant I'oncogène V-myc et une partie de la séquence Δ-gag a été isolé puis inséré dans le site BamHI du plasmide Blue scribe. Le plasmide recombinant résultant a été appelé BS-myc.
Le fragment de 3,5 kb délimité par les sites XhoI et XbaI et portant la totalité de I'oncogène
v-myc et une partie de la séquence Δ-gag a été isolé puis inséré dans le vecteur TXN3' (figure 12). Le vecteur résultant a été appelé pMN53.
Ce vecteur comportant I'oncogène v-myc et le gène de résistance à la néomycine est capable d'une part de transférer la résistance à la néomycine et, d'autre part, d'induire des capacités de transformation aux cellules infectées ou transfectées.
b. 3) Construction de vecteurs portant le gène p53 murin et aviaire
a) Gène p53 murin.
Le cDNA du gène p53 murin nous a été fourni sous la forme du plasmide pSV53c (figure 13) par le Marie Curie foundation research institute, England. Nous avons remplacé, en 3' de ce gène, le site BglII par un site EcoRI. Puis le fragment EcoRI-EcoRI correspondant au cDNA du gène p53 murin a été purifié et clone dans le vecteur retroviral TXN 5 ' préalablement digéré par EcoRI. Deux vecteurs ont ainsi été obtenus : le vecteur p53S5(+) qui porte le cDNA du gène p53 murin, cloné en position 3' dans le sens de la transcription provirale, le vecteur p53S6(-) qui porte le cDNA du gène p53 murin, cloné dans le sens inverse de la transcription provirale.
b) Gène p53 aviaire.
Le cDNA du gène p53 aviaire nous a été fourni sous la forme du plasmide p53 poulet cDNA (figure 14) par l'IRSC, unité d'oncologie moléculaire , Villejuif.
Le gène p53 aviaire, déjà délimité par les sites EcoRI, a été directement clone dans le vecteur TXN5'. Deux vecteurs ont ainsi été obtenus : le vecteur p53P4 (+) qui porte le cDNA du gène p53 de poulet, clone dans le sens de la transcription provirale, le vecteur p53P2 (-) qui porte le cDNA du gène p53 de poulet, clone dans le sens inverse de la transcription provirale. b.4) Construction des vecteurs portant un gène env
Construction des vecteurs pNEA et pNEB
Nous avons construit deux vecteurs rétroviraux capables de véhiculer un gène env de RAV dans des cellules en culture, ou chez l'animal. Ces vecteurs sont dérivé de la construction pTXN5' qui est décrite dans ce brevet. Il porte donc le gène néo conférant la résistance à l'antibiotique néomycine ; et le gène env de sous-groupes A ou B. Il ont été construits en deux temps :
- préparation d'une cassette env, étape commune avec celle de la construction 3 (figure 35),
- assemblage de cette cassette dans le plasmide pTXN5'. Assemblage des plasmides pNEA et pNEB (figure 40)
A partir des vecteurs pUC envA et pUC envB, on génère un fragment de 4,4 kb soit par digestion partielle du plasmide pUC envA par l'enzyme HindIII ; soit par digestion totale HindlII du plasmide pUC envB.
Les extrémités cohésives de ces fragments sont remplies par la DNA polymérase de Klenow. Ces fragments sont ensuite digérés partiellement par l'enzyme EcoRI. On purifie alors un fragment de 1,9 kb.
Le vecteur retroviral pTXN5' de 7,7 kb est doublement digéré par les enzymes EcoRI et Xbal. On remplit les extrémités cohesives ainsi générées, par la DNA polymérase de Klénow, et on les religue ensuite sur elle-même. Il en résulte un plasmide de 7,3 kb appelé pTXNΔJ qui est dérivé du pTXN5', et qui a subi une délétion de la séquence J contenant un signal accepteur d'épissage.
Le plasmide pTXNΔJ est digéré partiellement par l'enzyme StuI, puis totalement par l'enzyme EcoRI. On purifie sur gel un fragment de
7 kb dans lequel on insère le fragment de 1,9 kb contenant le gène env. Les vecteurs rétroviraux résultants, de 8,9 kb sont appelés pNEA ou pNEB selon la nature du sous-groupe du gène env qu'il porte.
Le gène néo qu'ils véhiculent est exprimé à partir d'un ARN genomique, tandis que le gène env est exprimé à partir d'un ARN sous-génomique produit par epissage du premier. Le codon initiateur de ces gènes est celui du résidu Δ gag du vecteur, et est en phase avec la trame de lecture du gène env et du gène néo.
Applications.
Ces quatre vecteurs ont été transfectés, soit à des CEF en présence de rétrovirus assistant RAV-1, soit sur les cellules de la lignée transcomplémentante HF-g. Les cellules ont été sélectionnées par addition de G418 dans le milieu de culture. Les stocks viraux ont été récupérés à partir de ces cellules : stocks "virémiques" à partir des CEF transfectées et stocks "helper free" à partir des cellules HF-g transfectées.
Ces stocks viraux ont été utilisés pour infecter des CEF qui ont à leur tour été sélectionnées par addition de G418 dans le milieu de culture. Puis, ces cellules ont été étudiées pour leur capacité de croissance en culture in vitro. Seules les CEF infectées par le vecteur p53P4(+) (cDNA du gène p53 de poulet clone dans le sens de la transcription provirale) ont montré une capacité à se multiplier, analogue à celle qui avait été observée pour I'oncogène v-erbA, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu appauvri en sérum (0,5% au lieu de 6% dans le milieu régulier).
EXEMPLE 3 - Vecteurs de type pAFY
- Tous les vecteurs pAFY véhiculent deux gènes de sélection : * Le gène conférant la résistance à la néomycine (Néo) situé dans la partie 5' en position du gène v-erbA est inséré dans le même sens que le sens de transcription retroviral. * Le gène conférant la résistance à l'hygromycine situé dans la partie 3' du vecteur en position v-erbB porte dans sa partie 5' le promoteur-enhancer du virus simien SV40 et la séquence "att" rétrovirale. Ainsi, ces vecteurs possédent deux sites potentiels d'intégration spécifiquement rétrovirale ; l'un est constitué par le site "att" naturel localisé dans les LTR, l'autre correspond au site "att" surnuméraire inséré à l'intérieur du vecteur en 5' du gène conférant la résistance à l'hygromycine B.
Ces constructions ont comportées trois étapes principales :
. la préparation des séquences "att". . l'insertion de ces séquences dans le plasmide pX343 véhiculant le gène bactérien conférant la résistance à l'hygromycine B. . l'insertion de l'ensemble (séquence "att" - promoteur de SV40 - gène conférant la résistance à l'hygromycine B - signaux de poiyadényiation de SV40) dans un vecteur retroviral.
. Plasmide pJS21 : Entre les sites EcoRI et BamHI du
plasmide pBR 322 est clone un fragment EcoRI-BamHI de 1751 nuciéotides portant une partie du gène env, un doublet de LTR issu de fusion naturelle, et une partie du gène gag de l'A.E.V. (figure 15). . La séquence "att" de 88; nuciéotides est isolée à partir de ce plasmide à la suite de 3 séries de digestion et purification sur gel ;
- Double digestion EcoRI/BamHI et récupération du fragment de 1751 pb. - Digestion HinfI et récupération d'un fragment de 340 pb.
- Enfin digestion MaeIII et récupération d'un fragment de 88 pb.
. Après réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, ce fragment de 88 pb a été sous clone dans le site Smal du vecteur M13 mp19 pour bénéficier des sites du polylinker porté par le coliphage M13 mp19. Trois clones, Matt3, Matt5 et Matt55 ont été retenus (figure 16).
2) Insertion de la séguence "att" dans le plasmide pX343 (figure 16).
Le plasmide pX343 comporte le fragment EcoRI- PvuII (2295 pb) du plasmide pBR 322, un fragment de 340 pb portant l'origine de réplication du virus SV40, un fragment de 1,2 kb portant le gène bactérien conférant la résistance à l'hygromycine, l'intron du gène codant pour l'antigène t et un fragment portant le site de poiyadényiation du virus SV 40 (figure 16). Ce plasmide a été linéarisé par l'enzyme PvuII qui possède un site de clivage unique juste en amont de l'origine de réplication de SV40. Après double digestion EcoRI/
PvuII et réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, la séquence "att" est récupérée d'une part à partir du Matt3 et du Matt5 dans un fragment de 266 pb et d'autre part à partir du Matt55 dans un fragment de 354 pb. Ces trois fragments ont été intégrés séparément dans le site PvuII du plasmide pX343.
3 clones ont été isolés (figure 16) :
- Le pXatt3 porte la séquence "att" orientée dans le même sens de transcription que celui du gène codant pour 1 'hygromycine.
- Le pXatt5 porte la séquence "att" orientée en sens inverse par rapport au pXatt3.
- Le pXatt55 porte un doublet de séquence "att" placé dans le même sens que le pXatt5.
Les deux vecteurs (pXatt3, pXatt5) portent respectivement une séquence att en orientation directe ou en orientation inverse par rapport à celle du gène Hygro. Les plasmides précédents ont été transfectés sur des cellules QT6, soit non infectées, soit préalablement infectées par un virus RAV-1 destiné à apporter l'activité Pol. Les cellules ainsi traitées ont été sélectionnées par l'hygromycine B à la concentration de 40 μg/ml.
L'intervention du virus RAV-1 produit systématiquement une réduction de la viabilité en culture et donc un amoindrissement du nombre de clones résistants obtenus. Compte tenα de l'ensemble des facteurs en cause, il ne semble pas que l'insertion d'une séquence att donne lieu à une intégration intrinsèquement plus fréquente que les intégrations observées en son absence.
13 clones cellulaires, transformés par pXatt5 (7 en présence de RAV-1 ; 6 en absence de RAV-1 ) ont été amplifiés et leurs ADN ont été examinés après digestion par des enzymes qui ne coupent qu'une seule fois dans les plasmides employés. L'hybridation est faite à l'aide du plasmide pX343. On observe dans tous les cas une bande de 6kb, d'intensité variable selon les clones. Dans la plupart de ceux-ci, on observe, en plus, deux bandes supplémentaires de dimensions variables selon les clones. Dans certains clones, on observe plus de deux bandes supplémentaires.
Ces résultats montrent que lesu intégrations se sont faites sous forme de concatémères. Ceux-ci sont coupés par l'enzyme en fragments d'une longueur égale à celle du monomère initial d'ADN transformant. Les bandes variables représentent les bandes de jonction avec l'ADN cellulaire. La présence de plus de deux bandes dans certains clones peut résulter, soit de plusieurs intégrations réalisées dans la cellule initiale du clone, soit du caractère impur de certains de ces clones qui pourraient représenter, en fait, un mélange de deux ou plusieurs clones.
7 clones transformés par pX343 ont été examinés de la même façon. La principale différence par rapport aux clones transformés par pXatt5 paraît résider dans l'intensité moindre de la bande à 6kb, semblant indiquer que les intégrations portent sur des concatémères plus courts. Ces conclusions ont été confirmées par une analyse des .ADN en dot blots : l'intensité de l'hybridation peut être comparée à celle d'une gamme de témoins
contenant des quantités connues de pX343. On estime ainsi le nombre de copies par clone avec les résultats suivants : transfection par pXatt5 seul ...... 2 à 7 copies par cellule transfection par pXatt5 + RAV1 .... 2 à 30 copies par cellule transfection par pX343 + RAV1 ..... 2 copies par cellule.
Le caractère unique de la bande majeure observée montre que les concatémerisations s'effectuent entre des segments d'ADN identiques coupés en un même point et assemblés en tandem. Les observations effectuées ne prouvent pas que cette coupure se produit au niveau de la séquence att. Cependant, compte tenu de l'effet de l'infection par RAV1 et des propriétés endonucléasiques connues de l'enzyme Pol, cette supposition paraît vraisemblable. On imagine que, en présence de cette enzyme dans la cellule, les plasmides peuvent subir une coupure uniforme dans des conditions particulièrement favorables à la réalisation d'enchaînements. Un clonage des fragments de jonction serait nécessaire pour savoir si l'intégration dans l'ADN cellulaire s'effectue également au niveau des séquences att.
Les clones portant un nombre élevé de copies s'avèrent plus résistants, à l'hygromycine que ceux portant des copies en nombre plus faible. De sorte que la fréquence plus élevée de clones transformés observée après transfection par pXatt en présence de RAV1 peut être due, pour une part, à une résistance plus élevée de ceux-ci vis-àvis des toxiques.
3) Réalisation des vesteurs pAFY ( figure 17 )
A partir du vecteur retrovirai (pTXhoN) rapporté dans la figure 3 le site EcoRI juxtaposé au site Xbal a été transformé en HindlII par intégration d'un linker HindIII, le vecteur résultant est appelé pCNH (figure 17).
Sur l'ADN des clones pXatt (figure 16) un site unique Fspl (F) porté par le fragment du plasmide pBR322 a été transformé en un site HindIII Iar intégration d'un linker HindIII.
Les fragments HindIII de 3,8 kb issus de chacun de ces plasmides ont été isolés et intégrés séparémen dans le site unique HindIII du vecteur pCNH (figure 1 et figure 18).
Six types de clones ont été obtenus ; ils peuvent être distingués en deux grandes catégories : - soit le fragment de 3,8 kb est inséré de façon telle que le sens de transcription du gène codant pour la résistance à l'hygromycine correspond à celui du rétrovirus et du gène codant pour la néomycine phosphotransferase II, c'est le cas des vecteurs pAFY53, pAFY55 et PAFY525 (figure 18) ; - soit l'orientation de transcription du fragment de 3,8 kb HindIII est opposée à celle du rétrovirus ; c'est le cas des vecteurs pAFY35, pAFY33 et pAFY325 (figure 18).
Le vecteur pAFY35 a été étudié sur culture de cellules aviaires : a - La cotransfection de cellules aviaires (CEF, QT6) par l'ADN de ce vecteur et l'ADN correspondant au
génome du virus helper RAVI suivie de culture sur un milieu sélectif contenant du G418 conduit à la production d'un stock viral (stock AFY35). b - Des cellules infectées par ce stock viral et cultivées sur un milieu contenant du G418 continuent à croître et, produisent des virions qui transmettent la résistance au G418. Ce résultat permet de conclure que le génome proviral est inséré au niveau du site "att" situé entre les LTR, conduisant ainsi à une production virale normale. Cependant, les cellules résistantes au G418 sont sensibles à l'hygromycine. Cette observation peut recevoir deux types d'interprétations : * soit le gène conférant la résistance à l'hygromycine n'est pas exprimé quand il est placé dans le sens opposé au sens de transcription rétroviral. * soit le niveau d'expression de ce gène est trop faible pour permettre la résistance à la drogue (hygromycine). c - Des cellules infectées par ce stock viral (stock
AFY35) et cultivées sur un milieu contenant de l'hygromycine continuent à croître mais s'avèrent incapablés de produire des virions transmettant la résistance à l'hygromycine ou au G418 ; l'analyse immunologique (ELISA) du surnageant de ces cellules démontre cependant la présence de virions correspondant au helper. Ce résultat permet de conclure que le génome proviral peut être intégré au niveau du site "att" surnuméraire situé à l'intérieur de la séquence virale, entraînant ainsi une désorganisation totale de la structure rétrovirale ; dans ce cas, la production du virus vecteur (AFY) est abolie.
4) En plus des vecteurs déjà mentionnés dans cet exemple, nous avons construit d'autres vecteurs qui possèdent une structure générale comparable au pAFY35 (figure 18). Ces vecteurs possèdent tous, le gène NéoR en position de I'oncogène v-erbA et le gène PhlécR (conférant la résistance à la phléomycine) encadré par le promoteurenhancer et la séquence de poiyadényiation du virus simien SV40, en position v-erbB. Cet ensemble (promoteur-enhancer/ gène Phléor/séquence de poiyadényiation) est en orientation opposée au sens transcriptionnel retrovirai.
- pCYS74 : ce vecteur n'a pas d'autres caractéristiques particulières que celles rapportées ci-dessus.
- pCYS84 : ce vecteur retrovirai possède, en plus des éléments porté par le vecteur pCYS74, une séquence "att" supplémentaire positionnée en amont du promoteur-enhancer de SV-40.
- pCYS54 : ce vecteur est identique au vecteur pCYS74, mais présente une délétion de 23pb dans la région
3' terminale de la séquence U5 de la LTR5'.
- pCYS64 : ce vecteur est identique au vecteur PCYS54 mais possède une séquence "att" supplémentaire comme le vecteur pCYS84.
Le vecteur pCYS64 permet une intégration exclusive par la séquence "att" supplémentaire, la séquence "att" naturelle générée par la jonction des 2 LTR, lors du premier cycle retrovirai. est inactive du fait de la délétion créée dans la séquence U5. Le gène ainsi transféré s'exprime sous la dépendance du promoteur transcriptionnel non retrovirai, dans ce cas le promoteur SV40. La structure rétrovirale intégrée par le site "att" supplémentaire possède
un doublet de LTR. Ce doublet n'est plus capable d'assurer les fonctions de promotion de la transcription.
Les vecteurs pCYS54, pCYS74 et 84 constituent des systèmes contrôles de fonctionnement d'une part de la séquence "att" supplémentaire et, d'autre part, de l'effet de la délétion pratiquée dans la région U5 de la LTR5'.
Construction du vecteur pCYS64.
La construction du vecteur pCYS64 a comporté plusieurs étapes : . 1) Mutagénèse de la séquence U5 de la LTR5'.
A partir du plasmide recombinant pJS21 (figure 15, les fragments EcoRI-HgiAI (1180pb) et HgiAISstI (290pb), portant respectivement la partie 5' et la partie 3' d'une LTR, ont été isolés et insérés entre les sites EcoRI et SstI du plasmide BSK+. Le plasmide recombinant qui en résulte est appelé BSK+LTR (figure 19). Ce plasmide (BSK+LTR) a été linéarisé au site unique BstEII situé à la fin de la séquence U5, et soumis à une dégradation séquencielle par l'exonuciéase Bal31. Le clone retenu après examen par séquençage nucléotidique présente une délétion de 23pb localisée exclusivement dans la partie 3' terminale de la séquence U5. Le clone recombinant constitué du coliphage M13mp18 portant entre ses sites EcoRI et PstI un fragment de 1,5 kb composé d'une LTR délété de 23pb dans la séquence U5, et de la séquence PBS et leader, a été appelé mp18ΔU5 (figure 19 et 20).
. 2) Construction du vecteur intermédiaire mp18ΔU5-Néo. Le gène NéoR été isolé à partir du vecteur pNL53 (décrit dans l'exemple 2 et figure 7) dans un fragment SstI-HindIII de 1,8 kb. Ce fragment a
été inséré entre les sites SstI et HindlII du vecteur recombinant mp18ΔU5 (figure 21). Le clone recombinant retenu a été appelé; mp18Δ U5-Néo (figure 21). Construction d'un plasmide recombinant intermédiaire portant le gène de résistance à la phléomycine contrôlé par des séquences du virus simien SV40.
L'obtention de ce plasmide recombinant a nécessité plusieurs étapes intermédiaires : a) Isolement et sous-clonage du gène HygroR et des séquences régulatrices du virus SV40.
A partir du vecteur pAFY35 (décrit dans l'exemple 3 et figure 18), le fragment HindlII de 3,8 kb a été isolé puis inséré dans le site HindlII du plasmide pBR322, le clone recombinant retenu a été appelé pSVHy322 (figure 22). b) Remplacement du gène HygroR et de l'Intron de l'antigène t par le gène de résistance à la phléomycine = PhléoR.
A partir du plasmide recombinant pSVHy322, le gène HygroR et l'intron de l'antigène t ont été délétés par élimination du fragment HpaI-SmaI de 1,8 kb. A partir du plasmide recombinant pUT507 contenant le gène de résistance à la phléomycine PhléoR sous le contrôle d'un promoteur LTR du rétrovirus RSV et de la séquence portant les signaux de fin de transcription et de polyanédylation du virus SV40, le gène PhléoR a été isolé dans un fragment BstEII-HpaI de 700 pb.
Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par traitement à l'aide de l'enzyme composé du grand fragment de la polymérase de Klenow, puis le fragment de 0,7 kb ainsi traité a été inséré
entre les sites à bouts francs Hpal et Smal du plasmide pSVHy322 délété du gène HygroR et de l'intron de l'antigène t de SV40.
Le plasmide recombinant pSVPh correspond au clone qui a été retenu (figure 22).
4) Insertion d'une séquence att et d'une LTR dans le plasmide recombinant pSVPh : construction du vecteur intermédiaire pSVPhattLTR. a) Isolement et sous-clonage de la séquence att.
A partir du plasmide Matt5 a été isolé un fragment de 200pb Kpnl - BamHI. L'extrémité BamHI a été rendue franche par réparation à l'aide du grand fragment de la polymérase de Klenow.
Ce fragment a été inséré entre les sites HindIII (rendu extrémité franche, par traitement au grand fragment de polymérase de Klenow) et KpnI. Le plasmide recombinant BSK att LTR correspond au clone retenu (figure 23). b) Insertion de la séquence att et de la LTR dans le plasmide recombinant pSVPh. A partir du plasmide recombinant BSK+att LTR, le fragment KpnI-BstEII de 1520 pb portant la séquence att et une LTR a été isolé. Le site BstEII a été rendu bout franc par traitement à l'aide du grand fragment de la polymérase de Klenow.
Le plasmide pSVPh a été linéarisé par digestion partielle à l'aide de HindlII. Les- extrémités ont été rendues franches par traitement à l'aide du grand fragment de la polymérase de Klenow. Les molécules linéaires ont été digérées à nouveau par l'enzyme KpnI, et le fragment de 6,5 kb a été isolé.
Entre le site Kpnl et l'extrémité franche de ce fragment, a été inséré le fragment portant la séquence att et la LTR pour générer le plasmide recombinant pSVPh att LTR (figure 23). . 5) Construction du vecteur final pCYS64.
A partir du plasmide recombinant. mp18Δ U5Néo a été isolé le fragment EcoRI-HindIII de 3,1 kb portant la LTR5' muté dans la séquence U5, la séquence leader et le gène de résistance à la néomycine. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches, puis ce fragment a été inséré dans le site HindIII rendu bout franc par traitement au grand fragment de la polymérase de Klenow, du plasmide recombinant pSVPh att LTR.
Le plasmide recombinant ainsi obtenu a été appelé pCYS64 (figure 24).
Construction du vecteur pCYS54.
Ce vecteur constitue un système contrôle de fonctionnement du vecteur pCYS64. Sa structure est identique à celle du vecteur pCYS64 mais ne possède pas la séquence att supplémentaire.
La procédure expérimentale de construction de ce vecteur est exactement identique à celle décrite pour le vecteur pCYS64 à une seule exception.
Cette exception concerne l'étape 4 (Insertion d'une séquence att et d'une LTR dans le plasmide pSVPh) dans la construction du vecteur pCYS64.
Le plasmide recombinan.t BSK+LTR a été doublement digéré par les endonucléases EcoRV et Xhol. Le fragment de 4,kb a été isolé, les extrémités ont été rendues bouts francs par traitement au grand fragment de la polymérase de Klenow, puis ligué sur lui-même. Le clone recombinantBSK+-ΔLTR est le clone qui a été retenu.
Le fragment KpnI-BstEII de 1350 pb portant une LTR a été isolé et l'extrémité BstEII rendue franche par traitement au grand fragment de la polymérase de Klenow, puis inséré entre les sites Kpnl et HindlII rendu bout franc du plasmide recombinant pSVPh.
Le plasmide recombinant pSVPhLTR correspond au clone retenu (figure 23).
La cinquième étape est identique à celle de la construction du plasmide recombinant pCYS64. Le plasmide recombinant qui en résulte a été appelé pCYS54 (figure 24).
Construction des vecteurs DCYS74 et DCYS84.
Les vecteurs pCYS74 et pCYS84 dérivent respectivement des vecteurs pCYS54 et pCYS64 ci-dessus décrirs Par rapport à ces deux vecteurs, les vecteurs pCYS74 et pCYS84 ne possèdent pas de modification dans la séquence U5 de la LTR5'.
Les plasmides recombinant pCYS54 et pCYS64 ont été partiellement digérés par SstI, puis totalement digérés par Clal et les fragments de 9 kb purifiés sur gel d'agarose.
A partir du plasmide BSK+LTR. le fragment de 1,1 kb Sstl-Clal portant une LTR d'AEV, a été isolé, puis inséré dans chacun des fragments de 9 kb ci-dessus préparés.
Le plasmide recombinant obtenu à partir du fragment de 9 kb issu du pCYS54 a été appelé pCYS74 (figure 25). Le plasmide recombinant obtenu à partir du fragment de 9 kb issu du pCYS64 a été appelé pCYS84. (figure 25).
EXEMPLE 4 - Construction du génome helper défectif
Plusieurs constructions ont été réalisées dans ce but. a/ Une construction PIIF 13.Celle-ci comporte une LTR de RAV-1,délétée d'une cinquantaine de nuciéotides dans la région qui porte le signal d'encapsidation. Elle porte les gènes gag, pol, env de RAV1. A son extrémité 3', la LTR 3' a été remplacée par la séquence de poiyadényiation du gène TK du virus HSV. Une construction similaire pHF 405 a subi une délétion qui s'étend jusqu'au segment PBS du virus, portant en tout sur 150 nuciéotides. b/ Une construction pHF13-Hygro a été réalisée à partir de pHF13. Celle-ci comporte un gène Hygro, appor tant la résistance à l'hygromycine, inséré après la séquence de terminaison portée par pHF13. Le fonctionneme éventuel de ce gène Hygro est conditionné par une réinitiation de la traduction dans la partie 3' d'un transcrit total. 1. Des cellules QT6 ont été cotransfectées par les constructions pHF13 ou pHF405 associées respectivement au plasmide pXJ12. Après sélection sur G418, 39 clones ont été isolés parmi lesquels 25 ont reçu le plasmide pHF13 et 14 le plasmide pHF405. Sur l'ensemble de ces clones, 22 montrent un signal positif en Elisa pour la détection de la protéine P27 intracellulaire. Parmi ces clones positifs, 7 seulement relâchent la protéine dans le milieu de culture. Ces 7 clones ont été testés pour la production de virions capables de transférer la résistance au G418. Deux clones (AIII2 et AII6) se sont révélés positifs dans le test. Ils renferment tous deux la construction pHF13. Alors que les
surnageants de ces clones transmettent la résistance au G418 à des CEF, ils ne transmettent pas la production virale, ce qui démontre que ces deux clones se comportent comme des clones de cellules helper. Le titrage de l'activité de ces surnageants montre que la concentration des virions renfermant un gène Neo fonctionnel est faible (environ 50 par ml de surnageant, soit 1000 à 1000 fois moins qu'une culture infectée par RAV1).
L'analyse des protéines virales synthétisées dans les clones AIII2 et AU6 montre que les protéines gag (Pr76 et P27) et pol (Pr180) sont produites à des taux 10 à 20 fois plus faibles que dans les cellules QT6 infectées par un virus helper non déficient ; les ARN viraux s'y trouvent à des taux 5 à 10 fois plus faibles que dans une culture infectée. La discordance entre les déficits observés respectivement au niveau des protéines ou des ARN et à celui de la production virale suggèrent que l'explication pourrait se trouver soit dans une production réduite de la protéine env, soit dans une difficulté dans l'assemblage des particules virales.
2. 2x106 cellules QT6 ont été transfectées par les constructions pHF 13 ou pHF 405, en même temps que par une construction indépendante pX343 portant un gène Hygro fonctionnel. Après sélection par l'hygromycine, 90 clones cellulaires ont été isolés. Sur chacun de ces clones, on a dosé par Elisa la protéine p27, caractéristique du fonctionnement du gène gag, à la fois dans un lysat cellulaire et dans le surnageant de culture 44 clones produisent la protéine p27 en intracellulaire. On constate l'existence d'une corrélation entre les concentrations intracellulaire et extracellulaire de cette protéine. Tout semble se passer comme si les caractères
étudiés dépendaient de deux facteurs aléatoires indépendants : - l'un d'eux gouvernant la production intracellulaire de la protéine p27 ; - l'autre gouvernant l'aptitude à voir cette protéine déversée dans le milieu de culture, dans la mesure où elle est produite par la cellule.
Parmi ces 44 clones produisant la protéine p27 en intracellulaire, 22 seulement la déversent en quantité notable dans le milieu de culture. Parmi ces 22 clones, 7 se sont avérés non producteurs des virus HELPER. On note que certaines cultures non viroproductrices produisent presque autant de protéine p27 que des cultures de cellules infectées par RAV-1. 4 clones ont été sélectionnés pour leur production de protéine p27 la plus élevée. Ils renferment tous les 4 la construction pHF13. Ces clones ont été transfectés séparément par le vecteur pTXN3'. Après sélection sur G418, les cellules résistantes sont amplifiées en masse. Leur surnageant de culture est capable de transmettre la résistance au G418 à des CEF, mais ne transmet pas la production virale. Les cellules se comportent donc comme des cellules Helper. Le titrage de l'activité de leurs surnageants peut être estimé, selon les clones, à des valeurs comprises entre 3 × 10 et 2 × 104 particules TXN3' par ml de surnageant. La valeur de 2 × 104 obtenue avec le clone MBG est seulement
50 fois plus faible que celle obtenue avec une culture co-infectée par TXN3'/RAV-1.
3. Des cellules QT6 ont été transfectées par la construction pHF13-Hygro. Huit lignées résistantes à l'hygromycine ont été obtenues. Celles qui ont été analysées s'avèrent très fortement productrices de la protéine p27 et non viroproductrices.
La construction helper réalisée comporte les trois gènes viraux gag-pol-env du virus assistant RAV-1 placés sous le contrôle transcriptionnel d'une LTR du même virus. La LTR 3' est remplacée par une séquence de 600 nuciéotides contenant les signaux de fin de transcription et de poiyadényiation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I. La LTR 3' intervient :
- dans la poiyadényiation des ARN viraux,
- dans la circularisation de I'ARN genomique au cours de l'encapsidation,
- dans l'intégration et la transcription du génome viral lors de l'infection secondaire.
Son absence constitue donc un premier niveau de blocage de la virémie.
La construction du génome helper défectif (pHF 13) comporte également une délétion de 52 nuciéotides de la séquence leader 5' non traduite. Cette délétion englobe une région d'environ 30 nuciéotides intervenant en cis dans l'encapsidation de I'ARN viral. Cette délétion constitue un second niveau de blocage de la virémie.
Trois cassettes ont été construites séparément puis assemblées selon le protocole de la figure 29 : - le promoteur (figure 26)
- le signal de poiyadényiation (figure 27)
- des gènes viraux gag-pol-env (figure 28) 1) Le promoteur (clone pDIPO-123, figures 26 et 27) a) Remarques générales
Le promoteur est constitué de deux LTR en tande l'une située en 3' provient du virus assistant RAV-1 (obtenu du Dr J.M. Bishop, U.C. San Francisco) l'autre, située en 5' est un hybride entre les LTR de RAV-2 et de RAV-1, dans lequel une partie de la séquence U3 (entre les sites Sph I et Tag I) a été délétée. Il en résulte vraisemblablement une LTR
infonctionnelle. La structure de l'ensemble de cette région promoteur est schématisée sur la figure 30B. b) Réalisation - le clone pRAV-1 est digéré par l'endonucléase
EcoRI. Le fragment véhiculant les séquences plasmidienne est recircularisé pour générer le clone pDIPO 1. Le fragment EcoRI de 0,6 kb est purifié puis recloné au site EcoRI de pBR 322 pour générer pDIPO 3 (figure 26).
- le clone pRAV-2 (obtenu du Dr Skalka, Roche Institut Nutley) est digéré par l'endonucléase Sph I. Le fragment véhiculant les séquences plasmidiennes est traité par la T4-DNA polymérase pour générer des extrémités franches. Il est recircularisé en présence de linkers Cla I pour générer le clone pDIPO 4 (figure 26).
- le clone pDIPO 1 est digéré par les endonucléases EcoRI et Sacl. Le clone pDIPO 3 est digéré par les endonucléases EcoRI et TaqI. Le clone pDIPO 4 est digéré par les endonucléases SalI et ClaI. Les trois fragments sont purifiés puis religués entre les sites SacI et SalI de pBR 322 pour générer le clone pDIPO 123 (figure 26). Cette construction est rendue possible grâce à la compatibilité des sites Clal et TaqI.
2) La structure de polyadénγlation (clone pGAS-Cla, fi- gure 27) a) Remarques générales
Deux signaux de poiyadényiation sont généralement utilisés dans les vecteurs d'expression eucaryotes.
- celui des gènes précoces du virus SV40
- celui du gène de la thymidine kinase (TK) du virus Herpès Simplex I.
Nous avons choisi celui du gène TK car celui de SV40 comporte un signal d'épissage susceptible d'interférer avec ceux du rétrovirus.
b) Réalisation
- le clone pSV2 gpt (Mulligan et coll.) est digéré par les endonucléases HindIII et ApaI. Le fragment véhiculant l'origine de réplication de SV40 et le signal de poiyadényiation est traité par la
T4-DNA polymérase pour générer des extrémités franches. Il est recircularisé en présence de linkers SacI pour générer le clone pSV-Sac.
- le clone pAG 60 (obtenu du Dr A.G. Garapin, Institut Pasteur Paris) est digéré par les endonucléases BgIII et Sma I. Le fragment véhiculant le promoteur et le signal de poiyadényiation du gène TK est traité par la DNA polymérase I (fragment de Klenow) pour générer des extrémités franches. Il est recircularisé en présence de linkers SacI pour générer le clone pAG-Sac.
- le clone pSV-Sac est linéarisé par l'endonucléase EcoRI. Il est traité par la DNA polymérase I de Klenow pour générer des extrémités franches, puis il est redigéré par l'endonucléase SacI. Le fragment SacI-EcoRI contenant le signal de poiyadényiation de SV40 est éliminé et remplacé par le fragment SacI-PvuII du clone pAG-Sac qui contient le signal de poiyadényiation du gène TK. L'échange génère le clone pGAS dans lequel le signal de poiyadényiation du gène TK est associé au promoteur de SV40. L'association des sites EcoRI, rendus francs par la DNA polymérase, et PvuII génère le site PvuII.
- le clone pGAS est finalement linéarisé par l'endonucléase PvuII, puis recircularisé en présence des linkers ClaI pour générer le clone pGAS-Cla (figure 27).
3) Les gènes virauxgag-pol-env (clone pHP 2) a) Remarque générale
Ces gènes viraux dérivent du virus assistant RAV-I (sous groupe A).
b) Réalisation
- le clone pRAV-1 est digéré par l'endonucléase SalI. Le fragment contenant l'extrémité 3' de gène env et les LTR est recircularisé pour générer le clone pEnv. - le clone pEnv est digéré par les endonucléases
SalI et AccI. Le fragment contenant l'extrémité 3' du gène env est purifié puis traité par la DNA polymérase I de Klenow pour générer des extrémités franches. Il est ligué en présence de linkers SacI (on notera que l'addition des linkers
Sacl sur le site SalI préalablement réparé, recrée le site SalI). Le fragment est redigéré par les endonucléases Sacl et SalI, puis religué entre les sites SacI et SalI de pBR 322 pour générer le clone p. 800el (figure 28).
- le clone p. 800el est digéré par les endonucléases Sali et Sacl pour relâcher l'extrémité 3' du gène env. Parallèlement, le clone pRAV-1 est digéré par les endonucléases SacI et SalI pour relâcher les gènes gag-pol et l'extrémité 5' du gène env. Les deux fragments sont religués dans le site Sacl du clone pSV-Sac pour générer le clone pHP 2 (figure 28).
Dans cette construction, les gènes viraux
gag-pol-env sont placés sous le contrôle transcriptionnel du promoteur des gènes précoces de SV40 et sous le contrôle de fin de transcription du signal de poiyadényiation du gène.
4) Délétion de la séguence d'encapsidation et assemblage des trois cassettes (clonepHF 13, figure 29)
- Le clone pDIPO 123 est linéarisé au site Sacl situé dans la séquence 5' non traduite, immédiatement en 3' de la séquence d'encapsidation (figure 30 C). L'ADN linéarisé est soumis à une digestion ménagée par l'exonucléase Bal, puis digéré par l'endonucléase SalI. Les fragments comportant des délétions plus ou moins étendues sont reclonés dans la forme réplicative du coliphage M13 entre les sites SalI et Smal (extrémités franches). Les clones mp11-DIPO 123 ainsi générés sont analysés par séquençage pour contrôler l'étendue de la délétion. L'un d'eux, comportant une délétion de 52 nuciéotides en 5' du site SacI (figure 30 C) a été choisi pour élaborer le helper défectif pHF 13.
- le clone mp11-DIPO 123 préalablement sélectionné est digéré par les endonucléases Sacl et Clal. Le fragment contenant les LTR et la séquence leader mutée est purifié puis religué entre les sites Sacl et Clal du clone pGAS-Cla décrit au paragraphe 2. Cette construction génère le clone pGAS-LTR.
- le clone pHP 2 est digéré par l'endonucléase Sacl. Un fragment est relâché véhiculant les trois gènes viraux gag-pol-env. Il est inséré au site Sacl du clone pGAS-LTR pour générer le clone pHF 13. La structure du génome pHF 13 et celle du génome de RAV-1 sont représentées sur la figure 30 A.
5) En plus des vecteurs déja mentionnéés dans cet exemple , nous avon s co nstruit les vecteurs sui va nts :
- pGPEH : ce vecteur dérive du vecteur pHF13 (figure 29). Il comporte, en plus des structures décrites pour pHF13, le gène HygroR (conférant la résistance à l'hygromycine B) placé en 3' du gène env, et un second site accepteur d'épissage placé en amont du gène Hygro R. Ce vecteur confere aux cellules qui l'hébergent des capacités transcomplémentantes du même type que le vecteur pHF13. Cependant, cette construction permet d'apporter, sur le même ADN, les gènes viraux gag-pol-env qui assurent la fonction de transcomplémentation, et le gène de sélection HygroR .
- pGPH : ce vecteur est identique au précédent (pGPEH) à l'exception du gène env qui a été délété dans cette construction. Il ne possède qu'un seul site accepteur d'épissage placé en amont du gène HygroR.
- pPh.E : ce vecteur dérive du vecteur pHF13 ; les gènes gag et pol ont été délétés et remplacés par le gène de résistance à la phléomycine (PhléoR).
En outre, le gène env qui subsiste est précédé par le site accepteur d'épissage. Deux constructions du même type ont été réalisées et se distinguent par la nature du gène env, soit pPh.E contenant le gène env de sous-groupe A, soit pPh.E contenant le gène env de sous-groupe B.
- Ces deux vecteurs pGPH et pPh.E agissent en complémentation dans la cellule les hébergeant pour fournir les gènes gag et pol (vecteur pGPH) d'une part et env (vecteur pPh.E) d'autre part, pour conférer aux cellules des capacités transcomplémentantes. En outre, les cellules sont cosélectionnées sur leurs caractères de résistance
à l'hygromycine et à la phléomycine apportés par l'un et l'autre des deux vecteurs.
5.1. Construction impliquant le génome du virus helper RAV-1 5.1.1. Construction du vecteur pGPEH
La construction helper réalisée (figure 31 ) est dérivée de la construction helper pHF13. Outre les gènes viraux gag-pol-env, elle porte un gène hygro dont l'expression confère la résistance à l'hygromycine. Ce gène est inséré dans ia construction pHF13 juste en aval du gène env, et est muni de son propre site accepteur d'épissage.
Dans un premier temps, on construit un plasmide contenant le site accepteur d'épissage de RAV-1 et le gène HygroR placés dans le même sens transcriptionnel (plasmide Sa-H, figure 32).
Dans un deuxième temps, on réalise l'assemblage de ces deux séquences dans le pHF13, entre la fin du gène env et le début de la séquence de poiyadényiation (plasmide pGPEH, figure 33).
5.1.2. Construction du plasmide Sa-H (figure 32)
A partir du plasmide pHF 13, doublement digéré par les enzymes de restriction Kpnl et SalI, on purifie sur gel d'agarose, un fragment de 1,1 Kb contenant le début du gène env de RAV-1. Ce fragment est digéré par l'enzyme Xhol, et on purifie ensuite un fragment de 263 pb contenant le site accepteur d'épissage du gène env de RAV-1.
Le gène HygroR bordé par les extrémités cohesives SstI est inséré par ligation dans le plasmide blue script SK+ (3Kb), commercialisé par Stratagène, digéré par l'enzyme SstI. Le plasmide résultant, appelé
BS-H+ est digéré par les enzymes Kpnl et Xhol. On insère alors, dans ce vecteur, la séquence de 263 pb. Il en résulte un plasmide de 4,5 kb appelé BSH-Sa. Ce dernier est digéré par les enzymes AccI et NotI ; les extrémités cohesives ainsi générées sont remplies par l'enzyme DNA polymérase de Klenow et religuées sur elles-mêmes. On obtient alors un plasmide de 4,5 kb appelé Sa-H qui porte le site accepteur d'épissage du gène env de RAV-1, ainsi que le gène HygroR orienté dans le même sens transcriptionnel, et placé dans la même trame de lecture que celle du gène env.
5.1.3. Construction du plasmide pGPEH (figure 33)
Le plasmide Sa-H est doublement digéré par les enzymes Kpnl et pvull. On purifie alors sur gel un fragment de 1,7 kb contenant le site accepteur d'épissage de RAV-1 et le gène hygro. Cette séquence est insérée par ligation dans le vecteur Blue Scribe (34 b) préalablement digéré par les enzymes Kpnl et Smal. Il en résulte un plasmide de 4,7 kb appelé mp 18-SaH. Celui-ci est digéré partiellement par l'enzyme SstI. On purifie alors un fragment de 1,5 kb contenant le site accepteur d'épissage de RAV-1 et le gène hygro, et bordé par des extrémités cohesives SstI ; ce qui permet de l'insérer par ligation dans le pHF 13 préalablement linéarisé par digestion partielle SstI. La taille du plasmide PGPEH résultant est de 1 1 ,8 kb.
5.1.4. Construction du vecteur pGPH
Nous avons ensuite tenté de réaliser une série de constructions helper en suivant la stratégie suivante : transférer en deux temps le génome helper de RAV-1. Les deux types de construction permettent de transférer, soit le génome gag-poi, soit le gène env. Chacune de ces séries de construction véhicule, en outre, un gène de sélection différent.
La construction véhiculant les gènes gag-pol (figure 31 ) (appelée pGPH) porte, en plus, le gène de sélection HygroR. Celui-ci est inséré à la place du gène env dans le pHF 13. La réalisation de cette construction se fait en deux temps :
- préparation de la cassette site d'épissage du gène env de RAV-1 accolé au gène hygro. Cette étape, décrite dans la construction pGPEH, aboutit à l'obtention du plasmide Sa-H ;
- assemblage de cette cassette avec le génome gag-pol.
5.1.5. Construction du plasmide pGPH (figure 34)
A partir du pHF13 digéré partiellement par l'enzyme SstI, on purifie sur gel le fragment de 10,3 kb, qui est ensuite digéré par l'enzyme Kpnl. On purifie alors un fragment de 8,4 kb dans lequel on insère par ligation une séquence de 1,5 kb contenant le site accepteur d'épissage du gène env de RAV-1 et le gène HygroR. Cette séquence provient d'une digestion partielle SstI, suivie d'une digestion par l'enzyme Kpnl du plasmide Sa-H (figure 32). La taille du plasmide pGPH résultant est de 9,6 kb.
5.1.6 Réalisation des vecteurs pEAPh et pEBPh La construction d'une première série de vecteurs véhiculant un gène env et un gène de résistance à la phléomycine (gène phléo) a été réalisée en deux temps :
- isolement du gène env entire dans un plasmide pUC19, vecteur pUC-env ;
- Insertion de ce gène dans un plasmide véhiculant un gène hygro animé par une LTR de RSV (Rous Sarcoma Virus). La construction finale (plasmide pE-Ph) est réalisée en double : . l'une véhicule le gène env de RAV-1 (sous-groupe A),
. l'autre celui de RAV-2 (sous-groupe B).
5.1.7. Réalisation des plasmides pUC envA et pUC envB
(figure 35 )
A partir des plasmides pRAV-1 ou pRAV-2 véhiculant les génomes rétroviraux RAV-1 ou RAV-2, digérés par les enzymes SalI et
KpnI, on purifie sur gel un fragment de 1,1 kb contenant la moitié 5' du gène env. Cette séquence est liguée avec le plasmide pUC19 préalablement digéré par les enzymes KpnI et SalI. Il en résuite la formation des plasmides pUC-env5', dont la taille est de 3,6 kb. Les plasmides pRV-1 et pRAV-2 sont digérés par l'enzyme
Sali, puis par l'enzyme AccI. On purifie alors un fragment de 0,9 kb qui est ligué avec le plasmide pUC env5' préalablement linéarisé par l'enzyme SalI.
A partir de ce mélange réactionnel de ligation, on purifie sur gel un fragment de 4,4 kb qui possède deux extrémités non compatibles AccI et SalI. Celles-ci sont remplies à l'aide de la DNA polymérase de Klénow, et on religue l'ensemble sur lui-même. Il en résulte la formation d'un plasmide de 4,4 kb, appelé pUC envA ou pUC env selon la nature du sous-groupe du gène env qu'il porte.
5.1.8. Construction des vecteurs pE-Ph (figure 36) A partir du plasmide pUC envA digéré partiellement par l'enzyme HindIII, on purifie sur gel un fragment de 4,4 kb. On obtient également un fragment de taille homologue à partir du plasmide pUC envB digéré par l'enzyme HindIII. Les fragments de 4,4 kb sont remplis par les
DNA polymérase de Klenow, et sont ensuite digérés partiellement par l'enzyme EcoRI. On purifie sur gel un fragment de 1,9 kb dont on remplit les extrémités cohésives par la DNA polymérase de Klénow. Ce fragment est alors inséré par ligation dans le plasmide pUT507 préalablement digéré par l'enzyme Bst E2, et dont les extrémités cohesives ont été remplies par la polymérase de Klenow. Le plasmide pUT507 (4,1 kb) porte le gène bactérien phléo animé par un promoteur LTR de RSV. La ligation nous permet d'obtenir les vecteurs pEAph et pEBph (selon la nature du sous-groupe du gène env qu'il véhicule) dont la taille est de 5,9 kb. 5.1.9. Réalisation des vecteurs pPhEA et pPhEB
Nous avons construit une deuxième série de vecteurs portant le gène env (sous-groupe A ou B) et le gène Phléo. Ces vecteurs diffèrent des plasmides pE-Ph par les processus d'expressions des gènes véhiculés
(figure 31). Les vecteurs helper pPh E sont construits en trois temps :
- préparation d'une cassette pUC.env PA contenant un gène env et la séquence de polyédénylation du virus SV40 ;
- préparation d'une cassette pLTR-phléo contenant le promoteur du pHF13, la séquence leader du RAV-1 délétée de la séquence d'encapsidation, un résidu du gène gag du RAV-1 et ie gène phléo ;
- assemblage des deux cassettes précédentes et obtention des plasmides pPh.E.
5.1.10 Préparation des cassettes pUC envA pA et pUC envB pA
(figure 37) A partir du plasmide pX343, vecteur portant un gène de résistance à l'hygromycine, muni d 'un promoteur et d'une séquence de poiyadényiation du virus SV40, digéré par les enzymes Hpal et EcoRI, on
purifie sur gel un fragment de 0,9 kb dont on remplit l'extrémité cohésive par le DNA polymérase de Klenow.
Le fragment alors inséré par ligation soit dans le plasmide pUC envA, soit dans le pUC envB qui ont été préalablement linéarisés par l'enzyme SphI, et dont les extrémités cohesives ont été remplies par la T4
DNA polymérase. Il en résulte la formation des plasmides pUC envA pA et pUC envB pA, dont la taille est de 5,3 kb.
5.1.1 1. Préparation du plasmide pLTR-phléo (figure 38)
La partie promoteur de cette construction, de 0,9 kb est purifiée sur gel après digestion du pHF13 par les enzymes BamHI et ClaI.
Le gène phléo est préparé par purification d'un fragment de 0,6 kb, provenant d'une digestion par les enzymes BamHI et NotI du plasmide pUT56 portant la trame de lecture du gèen phléo.
Ces deux fragments sont insérés par double ligation dans le plasmide Sk+ (commercialisé par Stratagène) digéré par les enzymes ClaI et Notl.
Il en résulte la formation d'un plasmide de 4,5 kb appelé pLTR phléo
5.1.12. Assemblage des plasmides pPH EA et pPH EB (figure 39)
A partir des vecteur pUC envA pA et pUC envB pA digérés totalement par l'enzyme NarI, les extrémités cohesives sont séparées par la
DNA polymérase de Klénow.
A partir du plasmide pLTR-phléo, totalement digéré par les enzymes pVUII et StuI, on purifie sur gel d'agarose un fragment de 1,65 kb.
Ce dernier est alors ligué dans les vecteurs pUC env pA préparés comme décrit au paragraphe précédent.
Il en résulte la formation des plasmides pPh EA et pPh EB de
7,0 kb.
EXEMPLE 5 - Construction d'une cellule helper aviaire
1) Transfection des cellules par le plasmide pHF 13
5.105 cellules (lignée continue de caille : Q16) ont été transfectées par 500 ng du plasmide de sélection pX343 et 3 ug du plasmide pHF 13. Le plasmide pX343 véhicule le gène de résistance à l'hygromycine B et confère la résistance à cet antibiotique aux cellules qui l'expriment.
La transfection est réalisée par la technique décrite par Kawai (polybrène DMSO). Après 10 jours de sélection en présence de 50 ug d'hygromycine B par ml de milieu, les clones cellulaires résistants sont isolés et amplifiés. Ils sont alors analysés pour la production de la protéine virale p27 gag dans le surnageant des cultures, par une méthode immunoenzymatique (ELISA). L'un deux (MBg) a été sélectionné pour sa production de protéines p 27 gag la plus élevée.
2) Transfection du clone cellulaire MBg par le génome vecteur pTXN 3'
5.105 cellules du clone MBg ont été transfectées par 500 ng du plasmide pTXN 3'. Le pTXN 3' véhicule le gène de résistance à la néomycine et confère la résistance au G418 aux cellules qui l'expriment. Après 10 jours de sélection en présence de 200 ug de G418 par ml de milieu, les clones cellulaires résistants sont amplifiés en masse. La population cellulaire qui en
résulte (MBg-TXN 3') est analysé pour sa capacité à produire des particules virales infectieuses de type vecteur.
3) Mise en évidence d'une production de particules vi- rales "TXN 3' helper-free" par des cellules MBg-TXN 3' Trois lots de 106 cellules de la lignée QT6 ont été infectés par respectivement 1 ml, 100 ul et 10 ul du surnageant de culture des cellules MBg-TXN 3'. 24 heures après l'infection, les cellules infectées par les particules TXN 3', sont sélectionnées par addition de G418 (200 ug/ml). Après 10 jours de sélection, la numération des clones cellulaires résistant à l'antibiotique fournit une estimation du nombre de particules virales vecteur, présent dans le surnageant de culture des cellules MBg-TXN 3'. Le nombre est estimé à 104 particules TXN 3' par ml de surnageant de culture.
Les foyers cellulaires, résistant au G418, ainsi obtenus, sont amplifiés. L'analyse de leur surnageant de culture par une méthode immunoenzymatique révèle l'absence d'une production virale. Ce résultat est confirmé en infectant des fibroblastes d'embryons de poulet par ces surnageants. Aucun foyer de résistance au G418 ne s'y développe après 15 jours de sélection à la drogue (200 ug/ml). On en conclut que les particules produites par les cellules MBg-TXN 3' sont exclusivement de type vecteur en l'absence totale de particules helper.
Dépôt de souches :
Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganisme de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux - 75724 PARIS Cedex 15 sous les numéros suivants :
Souche E. Coli pAFY 53 nº I- 696
Souche E. Coli pNL 35 nº I- 697
Souche E. Coli pNL 53 n° I- 698
Souche E. Coli pAFY 525 n° I- 699
Souche E. Coli pAFY 325 nº I- 700 Souche E. Coli pAFY 55 nº I- 701 Souche E. Coli pAFY 35 nº I- 702 Souche E. Coli pAFY 33 nº I-703 Souche E. Coli pTXN3' nº I-704 Souche E. Coli pTXhoL nº I-705 Souche E. Coli pTXN 5' nº I-706 Souche E. Coli pTXN 3' gaz- n° I-707 Souche E. Coli pHF-13 n° I-708
le 16 octobre 1987.