FR2652504A1 - Composition immunisante et procede de preparation. - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une composition immunisante caractérisée en ce qu'elle est constituée par l'association d'une protéine immunogène et de fragments membranaires de cellules, ladite protéine étant produite par lesdites cellules présentée sous forme intégrée à leur membrane. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une telle composition à l'aide de vecteurs rétroviraux.
Description
La présente invention concerne une composition immunisante, ainsi qu'un procédé de préparation utilisant des vecteurs d'intégration et d'expression d'un gène étranger dans des cellules hôtes.
On a découvert selon l'invention qu'une protéine immunogène fabriquée sur cellules et présentée sur fragments membranaires desdites cellules est dotée de capacité immunogène considérablement améliorée par rapport à ladite protéine purifiée.
Plus précisément, la présente invention a pour objet une composition immunisante caractérisée en ce qu'elle est constituée de l'association d'une protéine immunogène et de fragments membranaires de cellules, ladite protéine étant produite par lesdites cellules en se présentant ensuite sous forme intégrée à leurs membranes.
Selon une autre caractéristique tout à fait avantageuse de la présente invention, la protéine immunogène est produite par l'expression dans des cellules hôtes appropriées d'un vecteur d'intégration et d'expression d'un gène codant pour ladite protéine dans lesdites cellules hôtes.
Plus particulièrement, ledit vecteur d'intégration et d"expression sera un vecteur rétroviral défectif comportant un gène de sélection et le gène de ladite protéine immunogène, ce vecteur étant construit de façon à optimiser la production de la protéine et de sorte qu'elle s'intègre à la membrane des cellules dans laquelle elle est produite.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition, caractérisé en ce que a) la protéine immunogène est produite par l'expression dans des cellules
hôtes appropriées d'un vecteur d'intégration et d'expression d'un gène
étranger codant pour ladite protéine dans lesdites cellules hôtes, le
vecteur étant construit de façon à optimiser la production de ladite
protéine et de sorte qu'elle s'intègre à la membrane des cellules dans
laquelle elle est produite, b) les cellules hôtes sont soumises à sélection notamment par l'antibio
tique correspondant au gène de sélection, et les cellules ainsi
sélectionnées sont multipliées, c) on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent, d) on récupère et purifie au besoin les constituants membranaires associés
à la protéine immunogène.
hôtes appropriées d'un vecteur d'intégration et d'expression d'un gène
étranger codant pour ladite protéine dans lesdites cellules hôtes, le
vecteur étant construit de façon à optimiser la production de ladite
protéine et de sorte qu'elle s'intègre à la membrane des cellules dans
laquelle elle est produite, b) les cellules hôtes sont soumises à sélection notamment par l'antibio
tique correspondant au gène de sélection, et les cellules ainsi
sélectionnées sont multipliées, c) on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent, d) on récupère et purifie au besoin les constituants membranaires associés
à la protéine immunogène.
Dans un mode particulier de réalisation d'un procédé de préparation de composition immunisante selon l'invention, le procédé comporte les étapes suivantes - production d'un vecteur rétroviral défectif présenté sous forme d'ADN
plasmidien comportant un gène de sélection et le g-ène d'une protéine
immunogène, le vecteur étant construit de façon à optimiser la
production de la protéine immunisante, la structure de cette protéine et
du vecteur d'intégration étant construits de telle sorte que la protéine
s'intègre à la membrane de la cellule dans laquelle cette protéine est
produite - transfection de ce vecteur sur une culture de cellules assistantes
("helper") d'où il résulte la production d'une préparation virale
("helper-free") de ce même vecteur sous forme de virus défectif doué de
capacité infectieuse;; - la préparation virale obtenue est employée pour infecter une culture de
cellules ordinaires de sorte qu'aucun virus transmissible ne peut se
former - les cellules sont ensuite soumises à sélection par l'antibiotique
correspondant au gène de sélection employé selon la procédure connue de
l'homme de l'art - les cellules ainsi sélectionnées sont multipliées selon une procédure classique - on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent notamment par irradiation UV
puis congélation-décongélation et on récupère les constituants membra
naires associant la protéine immunogène, constituants que l'on purifie au
besoin.
plasmidien comportant un gène de sélection et le g-ène d'une protéine
immunogène, le vecteur étant construit de façon à optimiser la
production de la protéine immunisante, la structure de cette protéine et
du vecteur d'intégration étant construits de telle sorte que la protéine
s'intègre à la membrane de la cellule dans laquelle cette protéine est
produite - transfection de ce vecteur sur une culture de cellules assistantes
("helper") d'où il résulte la production d'une préparation virale
("helper-free") de ce même vecteur sous forme de virus défectif doué de
capacité infectieuse;; - la préparation virale obtenue est employée pour infecter une culture de
cellules ordinaires de sorte qu'aucun virus transmissible ne peut se
former - les cellules sont ensuite soumises à sélection par l'antibiotique
correspondant au gène de sélection employé selon la procédure connue de
l'homme de l'art - les cellules ainsi sélectionnées sont multipliées selon une procédure classique - on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent notamment par irradiation UV
puis congélation-décongélation et on récupère les constituants membra
naires associant la protéine immunogène, constituants que l'on purifie au
besoin.
Ce mode de préparation s'est avéré particulièrement performant et n'a jusqutà présent jamais été employé dans la préparation d'un vaccin.
Dans un mode de réalisation particulier, on utilise des vecteurs aviaires que Iton cultive sur des cellules aviaires.
Une protéine immunogène fabriquée sur cellules aviaires et présentée sur fragments membranaires desdites cellules aviaires est doté de capacités immunogènes considérablement améliorées et ce même sur mammifères par rapport à ladite protéine purifiée.
L'emploi d'un vecteur rétroviral aviaire pour préparer une telle protéine permet de maîtriser de façon parfaite le processus d'intégration du gène de la protéine immunogène et le processus de production de ladite protéine dans des cellules aviaires. On peut ainsi optimiser tous les éléments tels que l'activité de transcription, la production de la protéine et la présentation de cette protéine sur des récepteurs capables de multiplier son activité immunogène. Tous ces résultats sont plus difficiles à obtenir par une transfection banale.
Bien sûr l'emploi d'un vecteur aviaire nécessite la culture de cellules aviaires. Toutefois, le même résultat peut être obtenu avec des vecteurs et cellules d'une autre origine par exemple un vecteur de mammifère cultivé sur des cellules hôtes de mammifère tel qu'un vecteur murin.
Des vecteurs viraux d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires ont été décrits dans les demandes de brevets européen et international EP 178 996 et PCT/FR 88 00487 (WO 89/03877). I1 conviendra de s'y reporter pour la meilleure intelligence de la présente demande de brevet et plus particulièrement pour la description détaillée de vecteurs viraux aviaires utiles selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention on utilisera comme vecteur d'intégration et d'expression du gène de la protéine immunogène dans des cellules aviaires, un vecteur constitué par tout ou partie du gènome proviral de l'érythroblastose aviaire ou d'un virus apparenté dans lequel le gène de la protéine immunogène et le gène de sélection remplacent les gènes v-erbA et v-erbB et en ce que lesdits gènes se trouvent soit sous le contrôle d'un promoteur de LTR du même virus, auquel cas lesdits gènes miment les gènes qu'ils remplacent, soit sous le contrôle d'un promoteur hétérologue auquel cas une séquence att additionnelle est positionnée en amont dudit gène promoteur hétérologue.
Les virus aviaires plus particulièrement concernés par la présente invention sont l'AEV et les virus apparentés du type ALSV, ainsi que les virus non défectifs du type RAV.
Dans un mode de réalisation utile notamment pour l'intégration dans des cellules de poulet, tel que des fibroblastes d'embryon de poulet, le gène de la protéine immunogène se trouve sous la dépendance de
LTR aviaire et leur mécanisme de traduction mime celui des gènes qu'ils remplacent.
LTR aviaire et leur mécanisme de traduction mime celui des gènes qu'ils remplacent.
De façon appropriée, le vecteur comporte le gène de sélection en position v-erbA, et le gène de la protéine immunogène en position v-erbB.
Avantageusement, selon une autre caractéristique de ces vecteurs, le gène de sélection et le gène de la protéine immunogène se trouvent traduits à partir de l'AUG du gène gag ou à partir de leur propre
AUG, mais toujours dans le même cadre de lecture que celui du gène gag.
AUG, mais toujours dans le même cadre de lecture que celui du gène gag.
Ainsi, le cas échéant, le gène de sélection est traduit à partir de 1'AUG du gène gag et le gène de la protéine immunogène est traduit à partir de l'AUG du gène gag ou son propre AUG.
Avantageusement, un codon stop est introduit entre le gène gag et le gène de la protéine immunogène ou 1'AUG propre dudit gène de la protéine immunogène.
De préférence, le codon stop est situé à une distance optimale de 65 nucléotides du codon AUG dudit gène de la protéine immunogène.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur d'intégration et d'expression est tel que le gène de sélection est en position v-erbA sous la dépendance d'un promoteur LTR5' aviaire et le gène de la protéine immunogène est en position v-erbB sous la dépendance d'un promoteur hétérologue, le vecteur comportant alors une séquence att supplémentaire positionné en amont du promoteur hétérologue.
Dans les vecteurs qui ont une séquence att supplémentaire, on peut déléter une partie de la séquence U5 de la LTR5' de telle sorte qu'après un cycle rétroviral ne reste fonctionnelle que la séquence att supplémentaire qui assure l'intégration.
De préférence, on effectue une délétion de 23 pb dans la région 3' terminal de la séquence U5 de la LTR5'.
Avantageusement, le vecteur est caractérisé en ce que le gène de la protéine immunogène est en position v-erbB encadré par le promoteur hétérologue et la séquence de polyadénylation hétérologue, et en ce que l'ensemble promoteur - gène de la protéine immunogène - séquence de polyadénylation est dans la même orientation ou en orientation opposée au sens transcriptionnel rétroviral.
On peut citer notamment comme promoteur hétérologue le promoteur du virus simien SV40.
La mise en oeuvre du procédé selon l'invention nécessite également l'utilisation de lignées permanentes de cellules assistantes ("helper") capables de produire des préparations virales "helper-free". Les lignées assistantes fournissent au génome défectif, les protéines gag-pol-env nécessaires pour lui permettent de former des virions et permettent donc d'utiliser des vecteurs viraux défectifs sans adjonction de virus assistants.
Selon la présente invention, on pourra utiliser notamment comme vecteur capable de transformer une cellule aviaire normale en cellule "helper" un vecteur comportant tout ou partie des trois gènes gag-pol-env du virus RAV-1 ou du virus RAV-2 placés sous le contrôle transcriptionnel d'une LTR du même virus à laquelle diverses délétions ont été apportées afin de supprimer l'aptitude à l'encapsidation de L'ART produit par ce vecteur.
Dans un mode de réalisation, on utilise comme cellules de départ pour préparer les cellules assistantes, des cellules de cailles QT6.
Dans un mode de réalisation, notamment lorsque le vecteur d'intégration et d'expression comprend comme gène de protéine immunisante le gène env, on a pu supprimer dans le vecteur visant à transformer les cellules normales en cellules "helper" le gène env.
Dans d'autres modes de réalisation, les gènes gag et pol peuvent être délétés et remplacés par un gène de sélection, le gène env subsistant étant précédé par son site accepteur d'épissage.
Un exemple de réalisation de l'invention est une composition d'immunisation contre le virus RSV, caractérisée en ce que ladite protéine est la protéine env associée à des fragments membranaires de cellules CEF.
Comme mentionné précédemment, on trouvera décrits d'autres caractéristiques des vecteurs aviaires utiles dans le procédé selon l'invention dans la demande de brevet international WO 89/03877.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée d'un mode de réalisation qui va suivre.
On a employé un vecteur contenant un gène env de rétrovirus aviaire RAV-1 appartenant au sous groupe A. Les animaux (des poulets) ont reçu ce gène ou les produits de son activité sous diverses formes détaillées ci-après. Sur les animaux ainsi traités, on a examiné d'une part la production d'anticorps anti-env (titrés par sero neutralisation d'une préparation virale), et d'autre part, la production de tumeurs après épreuve résultant de l'injection d'une préparation de virus RSV.A (Rous Sarcoma
Virus de sous groupe A) (3,6 103 PFU/animal), 35 jours après le premier traitement immunisant.
Virus de sous groupe A) (3,6 103 PFU/animal), 35 jours après le premier traitement immunisant.
1. Construction des vecteurs
Les gènes env de sous-groupes A et B, d'origines RAV-1 et
RAV-2 respectivement, ont été insérés dans le veceur de base pTXN5' (portant déjà le gène néo) préalablement délété de la séquence J (contenant le site accepteur d'épissage de l'AEV) et du résidu du gène env de l'AEV. Ces vecteurs rétroviraux appelés pNEA et pNEB ont été décrits dans le brevet WO 89/03877 à l'exemple 2-b.4).
Les gènes env de sous-groupes A et B, d'origines RAV-1 et
RAV-2 respectivement, ont été insérés dans le veceur de base pTXN5' (portant déjà le gène néo) préalablement délété de la séquence J (contenant le site accepteur d'épissage de l'AEV) et du résidu du gène env de l'AEV. Ces vecteurs rétroviraux appelés pNEA et pNEB ont été décrits dans le brevet WO 89/03877 à l'exemple 2-b.4).
Le vecteur non encapsidable pGPH servant à transformer des cellules aviaires normales en cellules assistantes, a été produit à partir de pHF13 dans lequel a été inséré le gène hygro conférant résistance à l'hygromycine B à la place du gène env (en aval du site accepteur d'épissage). Ce vecteur pGPH portant les gènes gag et pol du RAV-1 a été décrit dans le brevet WO 89/03877 exemple 4 : 5.1.4.
2. Obtention des lignées transcomplémentantes HAYDEE et ISOLDE
Des cellules de caille QT6 ont été transfectées par l'ADN du vecteur pGPH, et sélectionnées par l'hygromycine. 23 colonies hygro ont été isolées, et testées pour leur production de p27gag extra et intracellulaire. La moitié de ces clones produisaient une quantité de p27gag équivalente à celle produite par des cellules QT6 infectées par RAV-1.
Des cellules de caille QT6 ont été transfectées par l'ADN du vecteur pGPH, et sélectionnées par l'hygromycine. 23 colonies hygro ont été isolées, et testées pour leur production de p27gag extra et intracellulaire. La moitié de ces clones produisaient une quantité de p27gag équivalente à celle produite par des cellules QT6 infectées par RAV-1.
9 de ces lignées ont été transfectées par l'ADN du vecteur pNEA, et sélectionnées par la néomycine. Les surnageants de ces cultures ont été titrés pour la production de particules conférant la résistance à la néomycine (en RFU/ml). Parmi ces cultures, 2 produisaient des particules à un taux significatif dans des conditions "helper-free", dont un à très haut titre (plus de 105 RFU/ml). On a appelé HAYDEE le clone hydro qui peut produire cette dernière culture. Ce clone est donc transcomplémentant pour l'expression d'un vecteur défectif portant un gène env.
La lignée HAYDEE a été transfectée par l'ADN du vecteur non encapsidable pPhEA qui est décrit dans la demande de brevet WO 89/03877 à Itexemple 4 : 5.1.6. Ce vecteur porte le gène de résistance à la phléomycine (gène phléo), ainsi que le gène env de sous-groupe A. Après sélection par la phléomycine, des clones phléo+ ont été isolés. Sur 11 d'entre eux, la production du gène env a été testée par un test d'interférence, grâce à un stock viral superinfectant de sous-groupe A. En effet, la protéine codée par le gène env sature les récepteurs superficiels spécifiques de sous-groupe et empêche une nouvelle infection par un rétrovirus du même sous-groupe.Parmi ces clones, 2 se sont avérés être aussi interférant que des cellules de caille QT6 infectées par le virus
RAV-1. 4 de ces clones ont été transfectés par l'ADN du vecteur rétroviral défectif pNL53 décrit dans la demande de brevet WO 89/03877 à l'exemple 2-2). Les surnageants de ces cultures ont été titrés pour leur capacité à transmettre, à des cellules cibles, le vecteur pNL53 dans des conditions "helper-free". Le clone le plus producteur a été dénommé ISOLDE ; il peut produire des vecteurs rétroviraux entièrement défectifs, à un titre de l'ordre de 104 à 105 RFU/ml.
RAV-1. 4 de ces clones ont été transfectés par l'ADN du vecteur rétroviral défectif pNL53 décrit dans la demande de brevet WO 89/03877 à l'exemple 2-2). Les surnageants de ces cultures ont été titrés pour leur capacité à transmettre, à des cellules cibles, le vecteur pNL53 dans des conditions "helper-free". Le clone le plus producteur a été dénommé ISOLDE ; il peut produire des vecteurs rétroviraux entièrement défectifs, à un titre de l'ordre de 104 à 105 RFU/ml.
3. Propriétés du virus NEA
Des cellules de caille QT6 ont été infectées par le vecteur rétroviral pNEA produit par la lignée HAYDEE transfectée par le pNEA.
Des cellules de caille QT6 ont été infectées par le vecteur rétroviral pNEA produit par la lignée HAYDEE transfectée par le pNEA.
Des clones de QT6 résultant de cette infection ont été isolés (après sélection par la néomycine). Sur ces clones a été testée la production du gène env par test d'interférence avec un stock viral interférent pseudotypé en sous-groupe A.
Il s'est avéré que 80 % de ces clones exprimait le gène env, attestant la capacité du vecteur NEA à transférer l'expression du gène env à des cellules en cultures.
4. Préparation du matériel immunisant
4.1. Virus défectif NEA (modalité a) dans le tableau I)
Le virus NEA produit par la lignée transcomplémentante
HAYDEE transfectée par le vecteur pNEA, a été concentré 100 fois par ultracentrifugation (30000 RPM, 4"C, 20 min). Les stocks viraux sont conservés à - 80"C.
4.1. Virus défectif NEA (modalité a) dans le tableau I)
Le virus NEA produit par la lignée transcomplémentante
HAYDEE transfectée par le vecteur pNEA, a été concentré 100 fois par ultracentrifugation (30000 RPM, 4"C, 20 min). Les stocks viraux sont conservés à - 80"C.
4.2. Surnageant de la lignée ISOLDE (modalité b) dans le tableau I)
Ce surnageant, produisant les protéines rétrovirales à l'exclusion de matériel génétique rétroviral, a été concentré 100 fois (mêmes conditions que pourle virus NEA).
Ce surnageant, produisant les protéines rétrovirales à l'exclusion de matériel génétique rétroviral, a été concentré 100 fois (mêmes conditions que pourle virus NEA).
4.3. Préparations faites à partir de CEFs infectées par le vecteur
NEA (modalité c) dans le tableau I)
Des fibroblastes embryonnaires de poulet (CEF) sont infectés par la préparation virale "helper-free" du vecteur NEA, puis sélectionnés par le G418. Les cellules neo + sont alors amplifiées, et on teste dans leur surnageant l'absence de virus sauvage. Ces cellules sont irradiées par les
UV (à 254 nm) pendant 5 min, trypsinées puis resuspendues dans du PBS à la concentration de 3 x 106 cellules par ml. Les préparations sont alors congelées à - 20"C, et décongelées juste avant injection chez l'animal.
NEA (modalité c) dans le tableau I)
Des fibroblastes embryonnaires de poulet (CEF) sont infectés par la préparation virale "helper-free" du vecteur NEA, puis sélectionnés par le G418. Les cellules neo + sont alors amplifiées, et on teste dans leur surnageant l'absence de virus sauvage. Ces cellules sont irradiées par les
UV (à 254 nm) pendant 5 min, trypsinées puis resuspendues dans du PBS à la concentration de 3 x 106 cellules par ml. Les préparations sont alors congelées à - 20"C, et décongelées juste avant injection chez l'animal.
4.4. Préparations faites à partir de CEFs infectées par le virus
RAV-1 (modalité d) dans le tableau I)
Des CEF sont infectées par un surnageant du virus RAV-1, et amplifiées. Avant de les récolter selon les mêmes modalités que celles décrites plus haut (en 4.3.), on contôle la présence du virus RAV-1.
RAV-1 (modalité d) dans le tableau I)
Des CEF sont infectées par un surnageant du virus RAV-1, et amplifiées. Avant de les récolter selon les mêmes modalités que celles décrites plus haut (en 4.3.), on contôle la présence du virus RAV-1.
5. Injections des animaux
Les animaux qui à ce jour ont donné les résultats les plus complets étaient âgés de 3 mois au début du traitement, et répartis en lots de 9 à 11 animaux traités de façon homogène (voir tableau I)
5.1. Protocole d'immunisation
Les animaux ont reçu une injection par voie intraveineuse selon les modalités a) (environ 107 RFU/animal), b) (1 ml par animal), c) (3 x 106 cellules recombinantes par animal), d) (3 x 106 cellules virémiques par animal), e) (3 x 106 cellules témoins par animal).
Les animaux qui à ce jour ont donné les résultats les plus complets étaient âgés de 3 mois au début du traitement, et répartis en lots de 9 à 11 animaux traités de façon homogène (voir tableau I)
5.1. Protocole d'immunisation
Les animaux ont reçu une injection par voie intraveineuse selon les modalités a) (environ 107 RFU/animal), b) (1 ml par animal), c) (3 x 106 cellules recombinantes par animal), d) (3 x 106 cellules virémiques par animal), e) (3 x 106 cellules témoins par animal).
Un rappel d'injection est effectué 15 jours après la primoinjection, selon les mêmes modalités.
Un prélèvement de sang est effectué tous les 8 jours, et est destiné à la préparation de sérum pour tester la présence d'anticorps.
5 semaines après la primo-injection, tous les animaux (sauf ceux traités selon la modalité d) sont injectés par voie sous-cutanée par 3,6 x 103 PFU/animal d'une préparation virale de RSV de sous-groupe A.
5.2. Résultats
Bilan
TABLEAU I
Bilan
TABLEAU I
<tb> <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (3) <SEP> (4) <SEP> (5) <SEP> (6) <SEP> (7)
<tb> a)NEA <SEP> HF <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 9/9 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 0% <SEP>
<tb> b)ISOLDE <SEP> 0 <SEP> 2/9 <SEP> 7/9 <SEP> 22 <SEP> % <SEP> 78 <SEP> % <SEP> 33 <SEP> %
<tb> c)CEF <SEP> NEA <SEP> 9 <SEP> 9/9 <SEP> 0/9 <SEP> 100 <SEP> % <SEP> O <SEP> <SEP> % <SEP> ~ <SEP>
<tb> d)CEF <SEP> RAV1 <SEP> 9 <SEP> 9/9 <SEP> non <SEP> 100 <SEP> % <SEP> non <SEP> non
<tb> <SEP> testé <SEP> testé <SEP> testé
<tb> CEFtémoins <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 9/9 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> %
<tb> non <SEP> injecté <SEP> 11 <SEP> 0/11 <SEP> 11/11 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 9 <SEP> %
<tb> (I) modalité d'injection ; (2) effectif ; (3) anticorps neutralisants (4) nombre de tumeurs ; (5) % animaux producteurs d'anticorps (6) % de tumeurs ; (7) % de régression
Contrôle des anticorps neutralisants principe
Les anticorps neutralisants abolissent spécifiquement l'activité infectieuse du rétrovirus contre lequel ils sont dirigés. Pour contrôler les sérums des animaux traités, on a employé un stock viral NL/RAV-l composé de 104 particules NL par ml et de 106 particules RAV-I par ml.
<tb> a)NEA <SEP> HF <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 9/9 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 0% <SEP>
<tb> b)ISOLDE <SEP> 0 <SEP> 2/9 <SEP> 7/9 <SEP> 22 <SEP> % <SEP> 78 <SEP> % <SEP> 33 <SEP> %
<tb> c)CEF <SEP> NEA <SEP> 9 <SEP> 9/9 <SEP> 0/9 <SEP> 100 <SEP> % <SEP> O <SEP> <SEP> % <SEP> ~ <SEP>
<tb> d)CEF <SEP> RAV1 <SEP> 9 <SEP> 9/9 <SEP> non <SEP> 100 <SEP> % <SEP> non <SEP> non
<tb> <SEP> testé <SEP> testé <SEP> testé
<tb> CEFtémoins <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 9/9 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> %
<tb> non <SEP> injecté <SEP> 11 <SEP> 0/11 <SEP> 11/11 <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 9 <SEP> %
<tb> (I) modalité d'injection ; (2) effectif ; (3) anticorps neutralisants (4) nombre de tumeurs ; (5) % animaux producteurs d'anticorps (6) % de tumeurs ; (7) % de régression
Contrôle des anticorps neutralisants principe
Les anticorps neutralisants abolissent spécifiquement l'activité infectieuse du rétrovirus contre lequel ils sont dirigés. Pour contrôler les sérums des animaux traités, on a employé un stock viral NL/RAV-l composé de 104 particules NL par ml et de 106 particules RAV-I par ml.
La méthode employée consiste à incuber pendant une heure dans de la glace une aliquote comportant 3.102 particules NL et 3.104 particules RAV-1 avec diverses dilutions des-sérums à tester (1, 1/2, 1/4...
1/256).
Les mélanges ainsi obtenus sont employés pour infecter des cellules QT6, 48 heures après l'infection, les cellules sont soumises à la détection de l'activité bêta galactosidase apportée par le vecteur NL, par coloration au XGal.
Les résultats d'une expérience (exprimés en nombre de cellules bleues) sont rapportées dans le tableau Il
- les contrôles ont été effectués avec du sérum d'un animal
non immunisé,
l'animal 80868 donne un résultat qui permet de calculer un
ND 50 (dose neutralisant 50 % des particules virales)
d'environ 1/64ème,
- les autres antisérums donnent manifestement des activités
neutralisantes beaucoup plus élevées ne permettant par de
calculer une ND 50 dans la limite des dilutions effecti
vement employées. On peut à partir de ces résultats
sommaires estimer que cette ND 50 doit alors être
nettement plus élevée que 1/500.
- les contrôles ont été effectués avec du sérum d'un animal
non immunisé,
l'animal 80868 donne un résultat qui permet de calculer un
ND 50 (dose neutralisant 50 % des particules virales)
d'environ 1/64ème,
- les autres antisérums donnent manifestement des activités
neutralisantes beaucoup plus élevées ne permettant par de
calculer une ND 50 dans la limite des dilutions effecti
vement employées. On peut à partir de ces résultats
sommaires estimer que cette ND 50 doit alors être
nettement plus élevée que 1/500.
TABLEAU II
<tb> animaux <SEP> dilutions <SEP> des <SEP> sérums
<tb> <SEP> testés
<tb> <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/16 <SEP> 1/32 <SEP> 1/64 <SEP> 1/128 <SEP> 1/256
<tb> <SEP> 80851 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10
<tb> <SEP> 80853 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 20
<tb> <SEP> 80862 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 15 <SEP> 29
<tb> <SEP> 80868 <SEP> 28 <SEP> 30 <SEP> 47 <SEP> 83 <SEP> 155 <SEP> 216 <SEP> nd
<tb> <SEP> 80869 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4
<tb> <SEP> 80873 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> <SEP> 83204 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 20
<tb> <SEP> 83265 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> <SEP> 83271 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 14
<tb>
Les contrôles effectués avec les sérums non dilués issus d'animaux témoins (non immunisés) donnent les valeurs respectives de : 323, 271, 310 et 305.
<tb> <SEP> testés
<tb> <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/16 <SEP> 1/32 <SEP> 1/64 <SEP> 1/128 <SEP> 1/256
<tb> <SEP> 80851 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10
<tb> <SEP> 80853 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 20
<tb> <SEP> 80862 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 15 <SEP> 29
<tb> <SEP> 80868 <SEP> 28 <SEP> 30 <SEP> 47 <SEP> 83 <SEP> 155 <SEP> 216 <SEP> nd
<tb> <SEP> 80869 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4
<tb> <SEP> 80873 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> <SEP> 83204 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 20
<tb> <SEP> 83265 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> <SEP> 83271 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 14
<tb>
Les contrôles effectués avec les sérums non dilués issus d'animaux témoins (non immunisés) donnent les valeurs respectives de : 323, 271, 310 et 305.
Claims (16)
1. Composition immunisante caractérisée en ce qu'elle est constituée par l'association d'une protéine immunogène et de fragments membranaires de cellules, ladite protéine étant produite par lesdites cellules présentée sous forme intégrée à leurs membranes.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine immunogène est produite par l'expression dans des cellules hôtes appropriées d'un vecteur d'intégration et d'expression d'un gène étranger codant pour ladite protéine dans lesdites cellules hôtes.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit vecteur d'intégration est un vecteur rétroviral défectif comportant un gène de sélection et le gène de ladite protéine immunogène, le vecteur étant construit de façon à optimiser la production de ladite protéine et de sorte qu'elle s'intègre à la membrane des cellules dans laquelle elle est produite.
4. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que a) la protéine immunogène est produite par l'expression dans des cellules
hôtes appropriées d'un vecteur d'intégration et d'expression d'un gène
étranger codant pour ladite protéine dans lesdites cellules hôtes, le
vecteur étant construit de façon à optimiser la production de ladite
protéine et de sorte qu'elle s'intègre à la membrane des cellules dans
laquelle elle est produite, b) les cellules hôtes sont soumises à sélection notamment par l'antibio
tique correspondant au gène de sélection, et les cellules ainsi
sélectionnées sont multipliées, c) on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent, d) on récupère et purifie au besoin les constituants membranaires associés
à la protéine immunogène.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit vecteur d'intégration est un vecteur rétroviral défectif comportant un gène de sélection et le gène de ladite protéine immunogène.
6. Procédé de préparation d'une composition immunisante selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que a) on transfecte un vecteur rétroviral défectif comportant un gène de
sélection et le gène de la protéine immunogène sur une culture de
cellules assistantes ("helper") présenté sous forme d'ADN plasmidien.Il
en résulte la production de ce même vecteur sous forme de virus
défectif doué de capacités infectieuses, b) on infecte, avec la préparation virale helper-free ainsi obtenue, une
culture desdites cellules hôtes, puis c) les cellules hôtes sont soumises à sélection notamment par l'antibio
tique correspondant au gène de sélection, et les cellules ainsi
sélectionnées sont multipliées, d) on traite les cellules obtenues de façon à inactiver les acides nucléiques
cellulaires et viraux qu'elles contiennent, e) on récupère et purifie au besoin les constituants membranaires associés
s . . fi
a la protéine immunogène.
7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les vecteurs viraux, les cellules hôtes et les cellules assistantes le cas échéant sont d'origine aviaire.
8. Procédé selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur viral d'intégration et d'expression du gène de la protéine immunogène dans des cellules aviaires est constitué par tout ou partie du génome proviral de l'érythroblastose aviaire ou d'un virus apparenté dans lequel les gènes hétérologues à savoir le gène de sélection et le gène de la protéine immunogène remplacent les gènes v-erbA et v-erbB et en ce que lesdits gènes se trouvent soit sous le contrôle d'un promoteur de LTR du même virus auquel cas les gènes hétérologues miment les gènes qu'ils remplacent soit sous le contrôle dfun promoteur hétérologue auquel cas une séquence att additionnelle est positionnée en amont dudit promoteur hétérologue.
9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le vecteur viral est utilisé pour une intégration dans des cellules de poulet telles que des CEF et les gènes hétérologues se trouvent sous la dépendance dtun même promoteur de LTR aviaire et miment les gènes qu'ils remplacent.
10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que dans le vecteur viral d'intégration, le gène de sélection est situé en position v-erbA et le gène correspondant à la protéine immunogène est situé en position v-erbB.
Il. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les gènes hétérologues sont traduits à partir de l'AUG du gène gag ou à partir de leur propre AUG mais toujours dans le même cadre de lecture que celui du gène gag.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène de sélection est traduit à partir de l'AUG du gène gag et le gène de la protéine immunogène est traduit à partir de l'AUG du gène gag ou son propre AUG.
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'un codon stop est introduit entre le gène gag et le gène de la protéine immunogène ou l'AUG propre dudit gène de la protéine immunogène.
14. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le gène de sélection est en position v-erbA sous la dépendance d'un promoteur
LTR 5' aviaire et le gène de la protéine immunogène est en position v-erbB sous la dépendance d'un promoteur viral hétérologue et le vecteur comporte une séquence att supplémentaire positionnée en amont du promoteur hétérologue.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le gène de la protéine immunogène est en position v-erbB encadré par le promoteur viral hétérologue et la séquence de polyadénylation hétérologue et en ce que l'ensemble promoteur - gène de la protéine immunogène séquence de polyadénylation étant d'orientation identique ou opposée au sens transcriptionnel rétroviral.
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules helper sont des cellules de cailles QT6 obtenues à l'aide d'un vecteur capable de transformer une cellule QT6 normale en cellule assistante comportant tout ou partie des trois gènes gag-pol-env du virus RAV-1 ou RAV-2, placés sous le contrôle transcriptionel d'une LTR du même virus à laquelle diverses délétions ont été apportées afin de supprimer l'aptitude à l'encapsidation de L'ART produit par ce vecteur.
17. Procédé d'une composition immunisante contre le virus
RSV selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite protéine est la protéine env associée à des fragments membranaires de
CEF.
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Citations (2)
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| WO1989003877A1 (fr) * | 1987-10-21 | 1989-05-05 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inr | Vecteurs viraux d'integration et d'expression |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Title |
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 106, no. 5, 2 février 1987, page 245, résumé no. 29661j, Columbus, Ohio, US; A. CHARBIT et al.: "Probing the topology of a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope; expression at the cell surface", & EMBO J. 1986, 5(11), 3029-37 * |
| NATURE, vol. 332, no. 6166, 21 avril 1988, pages 728-731, Londres GB; D. ZAGURY et al.: "A group specific anamnestic immune reaction against HIV-1 induced by a candidate vaccine against AIDS" * |
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