WO1988008307A1 - Kidney growth accelerator and process for its preparation - Google Patents

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WO1988008307A1
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renal growth
kidney
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Kaoru Nomura
Kazutaka Ohmura
Yuri Shirakura
Yasunori Nakamura
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The Calpis Food Industry Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a renal growth promoter and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a renal growth promoting agent containing a luteinizing hormone isoform having a renal growth promoting activity as an active ingredient, and a method for producing the same.
  • the luteinizing hormone isoform has a renal growth-promoting effect.
  • renal cells in which renal cells are reduced It can be expected to activate the lowered kidney, increase the number of wise cells, and enhance the kidney function.
  • the present inventors have previously shown that in the mouse from which the pituitary gland had been removed, the renal weight was remarkably reduced, so that there may be some factors controlling kidney growth in the pituitary gland. Based on the idea, a intensive study was conducted to determine the renal growth factor present in the pituitary gland. We separated the z component and named it RGF (also known as Lenotropin). (Japanese Rinkan Vol. 44 No. 1 (January 1986), separate volume, pages 84-88).
  • FIG. 1 is a diagram showing the content of each protein obtained by subjecting a crudely purified renal growth factor to isoelectric focusing electrophoresis in Example 1.
  • the RGF obtained here was a crude product with inconstant activity and contained various contaminants that acted on the antagonism.
  • the present inventors have further studied to obtain RGF as a single substance, and surprisingly that the RGF previously obtained as a purified product was separated and purified by a difference in isoelectric point. In addition, they found that the active ingredient became a single band.
  • luteinizing hormone is known to be a glycoprotein consisting of a plurality of isoforms instead of a single one.
  • the phenomenon is attributable to microstructural polymorphisms' c
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a renal growth promoter containing a luteinizing hormone isoform as an active ingredient. Its to, luteinizing hormone Lee Seo body subunit door ⁇ 3 and subunit
  • the present invention is a method for producing a luteinized formon isoform having renal growth promoting activity, which comprises subjecting a crudely purified renal growth factor to a separation and purification treatment according to a difference in isotropic point.
  • the treatment of separation and purification based on the difference in isoelectric point refers to a treatment in which ampholytes such as proteins are separated and separated from each other according to their own isoelectric points.
  • chromatofocusing and electrofocusing are used.
  • the purified purified kidney growth factor-a is a luteinizing hormone extract obtained from urine, blood or organs of mammals such as mice, sheep, and pigs.
  • a crude product obtained from an artificially produced culture system is used.
  • it can be applied to products obtained from synthetic chemical reaction systems.
  • the starting material is a mixture of an isoform that has a kidney growth action and an isoform that has no action.
  • the obtained crude purified renal growth factor (RGF) is subjected to a process of separation and purification according to the difference in isoelectric point to convert the substance having renal growth promoting activity into a single band. I can get it-.
  • the single-banded substance having renal growth-promoting activity obtained here can be separated into
  • the obtained lyophilized powder was dissolved in a 0.01 M phosphate solution of sodium phosphate, and then applied to an SP-Sephadex (Pharmacia) column equilibrated with the same buffer solution, with 0.1 M phosphoric acid. The eluted fractions of Ninatrium were collected. The relevant fraction was lyophilized.
  • This lyophilized powder was dissolved in a small amount of a 0.05M ammonium bicarbonate solution, and fractionated by molecular sieve using a Sephadex G-lOO (Pharmacia) column using the same buffer system. After about 40,000 fractions were collected, they were freeze-dried.
  • the dried powder was dissolved in a small amount of 10 mM tris-hydrochloric acid (PH7.5) and 0.3 M sodium chloride solution, and the same buffer system was used to remove oncanavalin A'-Sepharose (Pharmacia) column. The fractions eluted with 0.2 methyl mannose were collected. The relevant fraction was sufficiently dialyzed under cooling and then freeze-dried to obtain about 25 mg of a crude purified renal growth factor (RGF).
  • PH7.5 tris-hydrochloric acid
  • REF renal growth factor
  • the purified product was fractionated and purified by isoelectric point.
  • a KB isoelectric focusing column (KB Fetter AB, Bromnia, Sweden) (11 ⁇ capacity) was used.
  • Ampholine pH 3.5 to 10 (LKB), Ampholine pH 9 to 11 (LKB), and Ampholine pH 7 to 9 (LKB) were used as carrier airlights.
  • LLB Ampholine pH 3.5 to 10
  • LLB Ampholine pH 9 to 11
  • LLB Ampholine pH 7 to 9
  • As the electrode solution a 1M sodium hydroxide solution and a 0.01M acetic acid solution were used.
  • the electricity was supplied for 24 hours under the conditions of 4 ° C and 800V. After the power was turned off, the sample was collected in 1.5-m units using a preparative fraction collector. The PH (4 ° C) of each fraction was measured immediately (COM-11, manufactured by Denki Kagaku Kogyo Co., Ltd., electrode type CE105C, standard buffer solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). At the same time, the protein in each fraction was quantified. An embodiment of electrophoresis is shown in FIG.
  • CD rats (average weight 100 g, birth day of the same day) (China Luss, Riva I Co., Ltd.) were pituitary-excised and castrated and bred for 9 days. After confirming the rats on which the surgery was performed properly, each experimental group was set up with at least 5 rats including the control group.
  • DMA quantification was performed using bovine thymus DNA (type I, Sigma Chemical Co.) as standard DMA.
  • radioactivity in 0.5 mJ2 of the extracted DNA was measured according to a conventional method.
  • the ability of the kidney cells to promote DNA synthesis was calculated based on the total amount of radioactivity-1Z DNA, and was calculated as a percentage of the experimental group with the control group being 100%.
  • the same batch which was a crudely purified renal growth factor, was simultaneously measured for its ability to promote the synthesis of DN : A. As a result, the activity was 112%.
  • mice After confirming the number of mice, the control group and the experimental group were divided into groups of 10 mice each. Dissolve each of the 110.32 to 10.15 planes, separated by isoelectric focusing, in a volume of 150 £ of 50111 borate buffer% 7.5; 0.1% BSA solution. Subcutaneous injections were given for 5 days. Immediately after decapitation and blood removal on the 6th day, the left and right kidneys were immediately removed, the capsule was peeled off, and the kidneys were freeze-dried. The renal dry weight per rat's final weight was calculated, and the difference in renal weight between the control group and the experimental group was tested. As a result, an increase of 116% was observed in the experimental plot compared to the control plot, indicating that the fraction had a kidney growth effect.
  • the Pll0.32 to 10.15 fractions fractionated by isometric electrophoresis were separated and separated by high-performance liquid chromatography. After dissolving 0.1% preparative Li Furuo B acid (TFA) small amount of aqueous solution, reverse phase column (Baker Bond wide pore butyl C 4 : Baker Rasearch Pro.duct s) using, Ri enter 0.1% TFA 2- Purono ⁇ 0 Nord acetate Toni preparative Rinore (7: 3) were separated were separated by a linear gradient from 10% to 50% and solvent.
  • TFA preparative Li Furuo B acid
  • Human pituitary gland oil (KabiVitrun AB) 750 mJ2 was collected by centrifugation. The suspension was suspended in a 70mJS 0.2M phosphoric acid aqueous solution of water, heated to 60 ° C for 3 minutes, and then dialyzed for 2 days under cooling. Remove the contents, add 0.13M ammonium sulfate, adjust the pH to 4.0, adjust the pH to 3.0 with a 0.5M methanolic acid solution, leave the mixture under cooling, and centrifuge. And the supernatant was collected. After cooling through, the product was freeze-dried.
  • the purified product was fractionated by isoelectric focusing.
  • the bioassay performed in the same manner as in Example 1 was performed on each of the obtained fractions.
  • the fractions Pl9.12 to 9.90 contained a renal growth promoting component.

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Description

明 細 書
発明の名称 ― 腎成長促進剤及びその製造法
産業上の利用分野
本発明は腎成長促進剤及びその製造法に関するもので ある。
更に詳細には、 本発明は、 腎成長促進活性を有する黄 体化ホルモンイ ソ体を有効成分とする腎成長促進剤と そ の製造法に関するものである。
本発明においては、 黄体化ホルモンイ ソ体に腎成長促 進作用のある こ と を確認したもので、 本発明の腎成長促 進剤を投与すれば、 腎細胞が減少した腎臓ゃ腎機能の低 下 した腎臓を活性化し、 賢細胞の増加、 腎機能の増強を 期待できるものであ り、 医薬界に實献する と ころ大なる ものがある。
従来の技術
従来、 黄体化ホルモン又は黄体化ホルモンィ ソ体に腎 成長促進作用がある こ とは知られていない。
本発明者らは、 先に、 下垂体を摘出 したマ ウスにおい て、 腎重量の減少が顕著である と こ ろから、 下垂体に腎 成長を司る何ら かの因子が存在するのではないかとの発. 想から、 下垂体に存在する腎成長因子を求めて鋭意研究 したと こ ろ、 下垂体から腎成長を促進するホルモ ン様成 z 分を分離し、 これに RGF (又ゅレ ノ トロ ピン）と名づけた のである。 (日本臨牀第 44卷第 1号（昭和 61年 1月号）別 冊 84〜88頁） .
図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 1 において、 腎生長因子粗精製物を 等電点鼋気泳動処理した各蛋白含量を示す図である。
発明が解決しょう と.する問題点
しかしながら、 ここに得られた RGFは活性が一定しな い粗精製物で、 種々のアンタゴニステッ ク に働く狭雑物 を含むこ とが明らかとなったのである。
本発明者 ら は、 R G Fを単一物質と して収得するため に更に研究を行い、 先に耝精製物と して得た R GFを等電 点の差異によって分離精製処理じたと ころ、 意外にも有 効成分が単一バン ドになる こ と を見出したのである。
ここに単一バン ド成分の分析を行い、 一次構造を決定 したと ころ、 全く意外なこ と には、 黄体化ホルモンのィ ソ体の内の 1種である こ とが判明したのである。
従来黄体化ホルモンは単一でなく複数のイソ体よ り な る糖蛋白質である こ とが知られている。 その現象は微小 構造上の多型性に帰因する' c
羊黄体化ホルモンについては、 構成するサブユニッ ト ctのア ミ ノ酸鎖のア ミ ノ基末端、 及びサブユニッ ト の ア ミ ノ酸鐄のカルボキシル基末端が幾通り かの切靳を受 けている こと が報告されている。 （D . N . WA RD ； Int . J . P ep tide Protein Res.27 , 1986 70 -78) X , 人黄体ィ匕ホノレモ ンが、 カ ラムエ レ ク ト ロ フォーカ シングによ り 7 つの ピ ーク に分かれる こ とも報告されている。 （矢野ま り子 ； 日本産科婦人科学会誌 Vol.37， Να 5 703〜 712 ( 1985 ) )。
勿論、 従来は、 黄体化ホルモン及び黄体化ホルモンの 各イ ソ体に腎成長促進作用のある こ とは全く知られてい な かっ たのである。
更に研究を進め、 本発明においては、 黄体化ホルモン イ ソ体がサブュニッ ト ct 3とサブュニッ ト （3 3が結合 した ものである場合に最も強い腎成長促進活性を有する こ と も明らかと したのである。
本発明は、 これら知見から完成されたものである。 本発明は、 黄体化ホルモンイ ソ体を有効成分とする腎成 長促進剤に関するものである。 そ して、 黄体化ホルモ ン イ ソ体がサブユニ ッ ト α 3とサブユニッ ト |3 3 と結合し たものである こ と が好ま しい。
また、 本発明は、 腎成長因子粗精製物を等鼋点の差異 によっ て分離精製処理する こ と を特徴とする腎成長促進 活性を有する黄体化ホルモ ンイ ソ体の製造法である。
こ こでいぅ等電点の差異によって分離精製する処理と は、 蛋白質等の両性電解質を、 個有の等電点に従って相 互分離し、 分取する処理の こ と をいう 。 たとえばク ロマ ト フ オーカ シ ングゃエ レ ク ト ロ フォ一カ シング等が用い られる。 本発明において、 原料となる腎成長因子 a精製物は、 マウス、 ヒッジ、 ブタ など哺乳動物の尿、 血液あるいは 臓器よ り得られる耝黄体化ホルモン抽出物が使用される あるいは、 遺伝子操作技術を利用 して人工的に製造せし めた培養系よ り得られる粗精製物が用いられる。 あるい は合成化学反応系よ り得られる物にも適用できる.。 いず れに しろ腎成長作用のあるイ ソ体と作用のないイソ体の 混合物を原料とするものである。
たとえば、 臓器よ り得る場合には下垂体に硫安水溶液 を加えて、 ホモゲナイズし、 遠心分離し、 上清液を精製 し、 .凍結乾燥し、 凍結乾燥物を溶解して、 S Pセ フ アデッ ク スク ロマ ト、 セフ アデッ ク ス G 1 00ク ロマ ト、 C Mセル口 —スク ロマ 卜、 C0 n . Aク ロマ 卜、 セ フ アデッ ク ス G 100ク ロマ ト等の精製処理を重ねて腎成長因子（R GF )粗精製物 が得られる。
' 得られた腎成長因子（RG F ) 粗精製物は等電点の差異に よって分離精製する処¾を行う こと によっ て、 腎成長促 進活性を有する物質を単一バン ドと して収得する こ とが できる-。
こ こ に得られた単一バン ドの腎成長促進活性を有する 物質は、 構成成分である と |5 のサブュニ ッ 卜に分離す る こ と ができ る。 勿論各々のサブュニッ 卜へと分離する こ とで腎成長促進活性は失なおれて し まう 。
分離を行なう方法と して とえば逆相系液体ク ロマ ト グラ フィ 一がある。 分離パタ ーンは、 ア ミ ノ酸の長さ に 応 じて α， ί9 サブユニ ッ ト共にそれぞれ複数の ピーク を 得る こ と ができ る 。 これ等の ピーク は、 既に報告されて い る ， |3 サブュニ ッ 卜のア ミ ノ酸が幾通 り かに切断さ れて短く なつ ているものに相当する こ と が確認さ れた。
サブュニ ッ ト α 3 とサブュニ ッ ト j33の結合体は、 黄体 化ホルモ ン活性をわずかに残している が、 著じ る し い腎 成長促進活性を有する点で他の黄体化ホルモ ンイ ソ体と 異なるものである。
サブュ ±1 ジ ト α 3， |33 と は、 最も切断を受ていないも の を い う 。 サブユニ ッ ト を再結合 した場合、 最も強い腎 成長促進活性は、 各種の組合わせの中で ct 3， j33の組 合わせに見い出された。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 1
豚脳下垂体約 350 g と 0.15M硫安水溶液 1 に フ エ ニル メ チルスル フ ォ二ル フノレオ ライ ド 1 OmM加えたのち、 冷却 しながら ワー リ ング · ブレ.ンダ一にて 2 分間ホモゲナイ ズ した。 PHを 4.0に調節 したのち、 冷却下に充分放置し たのち遠心分離を行い、 上澄液を集め、 更に、 0.5Mメ タ リ ン酸水溶液にて PHを 3.0に調節 したのち遠心分離を行 い、 上澄液を集めた。 上澄液の PHを 6.5〜7.0に調節 した のち、 0.5飽和になる まで硫安を添加 し、 再び冷却下に 充分放置 した。 遠心分離を行い、 沈^を集め、 50〜： LOOra βの 0.2Mリ ン酸ニ力 リ ゥム溶液に懸濁させた。 透析チュ ーブへ移し、 冷却下で充分透祈を行っ たのち、 内容液を 採り出し、 ΡΗを再度 8.5に調節し、 凍結乾燥した。
得 ら れた凍結乾燥粉末を、 0.01Mリ ン酸ニナト リ ゥ ム溶液で溶解したのち、 同緩衝液で平衝化した SP-Sepha dex (Pharmacia)カラムに力、 、 0 · 1Mリ ン酸ニナ 卜 リ ウ厶 溶出画分を集めた。 該当画分を凍結乾燥した。
この凍結乾燥粉末を少量の 0.05M炭酸水素アンモニゥ ム溶液に溶解したのち、 同緩衝液系を用いた Sephadex G -lOO(Pharmacia)カラムを用いて分子篩による分画を行 つ た。 約 4万前後の画分を集めたのち、 凍結乾燥を行つ た。
乾燥粉末を少量の 10mMト リ ス-塩酸（PH7.5)、 0.3M塩 化ナ ト リ ウム溶液で溶解したのち、 同緩衝液系を用いた し oncanavalin A'-Sepharose (Pharmacia) カ ラムを用 ヽて 分画し、 0.2 メチルマン ノ シ ドにて溶出される画分を集 めた。 該当画分を冷却下に Τ充分に透析を行っ たのち凍 結乾燥を行い、 腎生長因子（RGF)粗精製物約 25mgを得た。
つづいて、 該耝精製物を等電点による分画精製を行つ た。 し KB等電点鼋気泳動用カラム（ KB Produkter AB, Br omnia, Sweden) ( 11 Οπιβ容量）を用レヽた。 —キャ リ ア一アン ホライ 卜 と して Ampholine pH3.5〜 10 (LKB )、 Ampholin e pH 9 〜 11 (LKB)、 Ampholine pH 7~ 9(LKB)を用レヽた。 5 〜 50%の ソルビトール密度勾配を作成し、 該粗精製物を 2 m£の dense solutionに溶解 したのち力 ラ ム中央咅 βに重 層 した。 電極液と して 1M水酸化ナ ト リ ウム溶液及び 0.0 1M酢酸溶液を用いた。 4 °C 、 800Vの条件下で 24時間の通 電を行っ た。 通電終了後分取用 フ ラ ク シ ョ ン コ レ ク タ 一 を用 いて 1.5m£づっ分取した。 直ちに各画分の PH(4°C ) を測定 した（電気化学工業㈱製 COM- 11、 電極タ イ プ CE 1 05C, 和光純薬工業㈱製 標準緩衝液）。 同時に各画分の 蛋白質の定量を行っ た。 電気泳動の態様は第 1 図に示さ れ'る。
その結果、 腎生長因子粗精製物約 1.5mg よ り 、 ρΙ〉10· 32、 pi 10.32-10.15. pi 10.15-9.89, piく 9.89 の各 画分を それぞれおよ そ 104 g'、 281 g、 415 ^ g, 103 μ g 得た。
それぞれの画分を冷却下にて充分に透析を行い、 Amph oline 及びソルビ トールを除去 したの.ち、 凍結乾燥を行 つ て粉末化 した。
全く 同一条件で数回の等電点電気泳動法に よ リ 腎成長 因子粗精製物の精製を く り返 し、 各々 の各画分を合一 し た。 尚、 標準蛋白質と して用いたゥマ心臓 ミ オ グロ ビン
(Type ffl、 Sigma Chemical CO ·，）の P I値は 7 , 97であつ た。
(腎成長促進活性の測定）
上述のいずれの画分が腎成長促進を有する か判定 した。 なお、 レ ノ ト ロ ピンの作用 に よ る腎成長促進効果は、 腎細胞の DNA合成能の促進を指標と した。
平均体重 100g、 同日出生日 の CDラ ッ ト （日本チヤ 一ル ス · 'リバ一株式会社） ォスを下垂体摘出手術及び去勢手 術を施し、 9 日間飼育した。 手術が適切に行なわれたラ ッ トを確認したのち、 対照区も含めて 5 匹以上のラ ッ ト を一群と してそれぞれの実験区を設けた。
等電点電気泳動にょ リ分面したそれぞれの分面 物各 5 0 gを 150 β(5ΌιηΜホウ酸緩衝液 PH7.5、 0.1 % BSA) に 溶蘇し、 ラ ッ トに皮下注射した。 8時間後、 靳頭し、 脱 血したのち直ちに左及ぴ右腎を摘出し、 被膜を剥離した のち
corticomedullary axisに f口、つ てスラィ スを各.々 枚 作成した。 2枚のスライ スは 2 mjSの Krebs-Ringer bicar bonate緩衝液（pH7.5) 中にて 37 °C 2時間のィ ンキュベ一 シヨ ンを行っ た。 同緩衝液は、 予じめ 95 %酸'素、 5 %炭 酸ガス混合ガスにて通気を行い、 且つ 1， 2-メチル 3 H -サ イ ミ ジン
(New England Nuclear Corps. ) ¾ 2 Ci/mfi 添カロした。 イ ンキュベーショ ン終了後、 4 mMサイジミ ン溶液にてス ライスを リ ンスしたのち一 20 °Cにて保存した。
保存されたスライ スに蒸留水 4 πιβを加え、 ウル トラデ ィ スパーザ（ャマ ト科学》を用いホモゲナイズしたのち、 Fleck A and unro HN(1962, ' Biochim. Biophys. Acta 55、 571) の方法に従って DXA 7
の抽出を行レヽ、 Wannemacher JRV and BanksJWL . Wunner WH(1965、 Anal Biochem 11 : 320)の 方法に従っ て DMA の力 [1水分解を行い、 Burton K (1956、 Biochem J . 62 ：
315)の方法に従って牛胸腺 DNA (type I 、 Sigma Chemical Co.)を標準 DMAと して DMA定量を行っ た。 又、 同時に、 抽出 DNA 0.5mJ2中のラジオァクティ ビティ 一を常法に従 い測定した。
腎細胞の DNA合成促進能は、 ラジオアクティ ビティ 一 Z総 DNA量で計算し、 対照区を 100% と と し た実験区の 百分率で算出した。 その結果、 pl〉 10.32画分に 109%、 Pi 10.32〜； 10.15画分に 130% (第 1 図の太い矢印） 、 最 も蛋白質含量が高い PIIO.15〜9.89画分には DI 合成促進 能は無く （98°/。）、 piく 9.89画分に 115% (第 1 図の細い矢 印） の活性があっ た。 従っ て Pi 10.32〜10.15画分及ぴ PI O . 89 ( 9.89〜9.32 ) 画分が腎生長促進成分であっ た t 尚、 pl〉10.32 画分も弱いながらも腎生長促進成分が混 入 しているものと考えられた。
尚、 同 じバッチである腎成長因子粗精製物についても 同時に DN: A合成促進能を測定した結果、 112 %の活性があ- つ た。
(腎生長促進成分の in vivoにおける腎成長効果） 平均体重 17g、 同 日 出生 日 の CD-Iマ ウ ス ォ ス（日本 チヤ 一ルス， リバ一株式会社） を下垂体摘出手術及び去 勢手術を施し、 9 日間飼育した。 手術が適切に行なわれ ί 0
ていたマウスを確認したのち、 対照区及ぴ実験区それぞ れ 10匹づつの群にわけた。 等電点電気泳動によ リ分画 した 110.32〜10.15面分40 £づっ各々 を150 ^の50111 ホウ酸緩衝液 ΡΗ 7.5； 0.1 % BSA溶液に溶解し、 一匹当 リ 150 /X ΰΖ日づっ 5 日間連繞皮下注射した。 6 日 目 に断 頭 し脱血したのち、 直ちに左及び右腎を摘出し、 被膜 を剥離したのち、 腎を凍結乾燥した。 ラ ッ トの最終体重 当 り の腎乾燥重量を算出し、 对照区と実験区における腎 重量の差を検定した。 その結果、 実験区は対照区に比べ 116%の増加が見られ、 当該画分が腎成長効果を有する ことが判っ た。
(腎生長促進成分-のサブュニツ ト α と Ρへの分離と再会 合）
等鼋点電気泳動によ り分画した Pll0.32〜10.15画分を 高速液体ク ロマ トグラ フィーによ りサブュ ニッ ト分離 分取した。 0.1% ト リ フルォ ロ酢酸 （TFA) 水溶液の少 量に溶解したのち、 逆相カ ラム（Baker Bond wide pore butyl C4 ： Baker Rasearch Pro.duct s)を使用し、 0.1% TFA入 り 2-プロノヽ0ノール アセ トニ ト リノレ（ 7 ： 3 )を溶 媒と し 10 %から 50 %の直線勾配にて分離し分取した。
サブュニ ッ トの α及び β はそれぞれ主たる 3本づっ のピーク と して得られ、 溶出展に a i ， α 2 ， α 3 , i3 X , β 2 , p 3と名付けた。 試料 3 mg を分離した場合、 収量はそれ ぞれ 230 A g， 450 g， 350 ε , 10 μ g , 570 g, 60 μ g であっ た。 ア ミ ノ酸組成分析等の分析の結果、 a 3， β 3 が共に最も分解の少ない黄体化ホルモ ンである こ と が判 つ た。
" 丄と 丄 ， ct 2と j32 ， α 3と jS 3 をそれぞれ等モルづっ 混合し、 少量の 1 %炭酸アンモニゥム水溶液中にて 37°C 48時間保温し両サブユニッ トの再会 合を行っ た。 つづ いて TSK ge& G 3000SWカラム （東洋曹達製）を用いて脱 塩を行っ たのち凍結乾燥を行っ た。 それぞれのサンプル について前述した DNA合成促進能によ り活性の強さ を比 較した。 その結果 α 3 — /53の組合わせが最も強く 、 対 照区と の差に おいて ct i — の組合わせの約 2.5倍の 活性がある こ と が判っ た。
実施例 2
羊脳下垂体粉末 ( W a i t a k i NZ Refrigerating LTD) を 400πιβ冷水に懸濁させたのち、 1 · 5βの 0.15M硫安溶液を 力 []え、 1 Om,Mフ エ ニノレ メ チノレスノレ フ ォ ニノレ フ ゾレオ ラ イ ド 10 mM加えたのち、 冷却しながらポリ ト ロ ン f にて 2分間ホ モゲナイ ズした。 pHを 4.0に調節したのち、 冷却下に充 分放置したのち遠心分離を行い、 上澄液を集めた。 以下 実施例 1 と同様に して処理したのち、 sp-Sephadex力ラ ム 、 bephadex G- 100力 フ ム、 Concanavalm A-Sepharose カ ラ ム にかけ腎生長因子粗精製物を得た。
更に、 実施例 1 と 同様に腎生長因子粗精製物 5 mgを等 電点電気泳動法によ る分画を行っ た。 その結果、 Pl > 9. ί z
85、 ρΙ〉9·85〜9·60、 ρΙ9·60〜9· 10、 ΡΙ9· 10〜8·60、 ΡΙ 8.60〜 7.30、 ρΙ〉 7.30の画分に分けた。 実施例 1 と同様 のバイオアツセィ の結果 Pl> 9.85の画分に腎生長促進成 分が存在するのが確認された。
実施树 3
人脳下垂体油出物 （KabiVitrun AB) 750mJ2を遠心分離 して沈鏢物を集めた。 70mJS 0· 2Mリ ン酸ニ力 リ ゥム水溶 液に懸濁したのち 60 °Cに 3分間加熱し、 つづいて冷却下 に透析を 2 日行っ た。 内容物をと リ出し、 0.13M硫安を 加えたのち PHを 4.0に調節したのち、 0.5Mメ タ リ ン酸溶 液にて PH 3.0に調節し、 冷却下に放置したのち、 遠心分 離を行い、 上澄液を集めた.。 冷却 ¥にて充分に透祈を行 つたのち、 凍結乾燥を行った。
以下実施 ί ΐ と 同様に sp-Sephadexカ ラ ム、 Sephad ex G- 100カラムにかけて耝黄体化ホルモン抽出物を得た 粗黄体ィ匕ホノレモン抽出物を concanavalin A-Sepharose カラムにかけ腎生長因子租精製物を得た。
得られた該耝精製物を等電点電気泳動法による分画を 行った。 得られた各分画につき実施例 1 と同様のバイオ アツセィ を行った結果、 Pl9.12〜 9.90の画分に腎生長促 進成分が存在する のが確認された。

Claims

307
3
m 求 の 囲
黄体化ホルモ ンイ ソ体を有効成分とする腎成長促 進剤
2 . 腎成長因子粗精製物を等鼋点の差異によって分離 精製処理する こ と を特徴とする腎成長促進活性を有する 黄体化ホルモンィ ソ体の製造法。
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