WO1987003891A1 - Polypeptide synthetique biodegradable et son utilisation en therapeutique - Google Patents

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WO1987003891A1
WO1987003891A1 PCT/CH1986/000177 CH8600177W WO8703891A1 WO 1987003891 A1 WO1987003891 A1 WO 1987003891A1 CH 8600177 W CH8600177 W CH 8600177W WO 8703891 A1 WO8703891 A1 WO 8703891A1
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Daniel Bichon
Bernard Lamy
William Borloz
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Battelle Memorial Institute
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Definitions

  • the subject of the present invention is a non-toxic, water-soluble biodegradable polypeptide which can be used in biology and for various therapeutic applications, in particular to serve as a support for medicaments, the latter being then gradually released in the organism as the biochemical degradation of the polymer.
  • polyamino acids polyamino acids
  • SIDMAN ET AL J. MEMBR. SCI (1980), 7 (3), 277-91
  • a copolymer of glutamic acid and ethyl ⁇ -glutamate the degradation rate of which is a function of the composition of the copolymer (molar proportions of the esterified segments relative to the non-esterified segments) and which makes it possible to store numerous products, for example anti-malaria, anticancer and other drugs.
  • Such polymers can be used in the form of rods containing, in a mixture, the desired medicament or in the form of capsules containing the medicament if the latter is not miscible with the polymer.
  • the polyglutamates and polyaspartates of alkyl are degradable in good time (of an order of magnitude compatible with their pharmaceutical use) only in partially hydrolyzed form (see for example ASANO et al, J. Macromol. Sci. Chem. A21 (5) (1984), 561-582).
  • these polyglutamates or polyaspartates must be subjected to a controlled hydrolysis reaction, the conditions of which are very difficult to reproduce.
  • very small differences in the degree of hydrolysis considerably influence the rate of subsequent biodegradability, which constitutes an additional problem in the use of such polymers for the aforementioned purposes.
  • thermoplastics 1. Excellent solubility in most common harmless solvents suitable for medicines and even in water (indeed, known polyamino acid derivatives are generally only soluble in certain special solvents (DMF, pyridine, F 3 CCOOH) whose use is inconvenient for pharmaceutical preparations). thermoplastics.
  • R is any amino acid residue, but preferably hydrogen (glycine), methyl (alanine), benzyl (phenylalanine), etc.
  • R can also denote amino acid residues containing OH functions , SH, NH 2 (corresponding to other amino acids), as well as - COOH (corresponding to glutamic and aspartic acids), this carboxylic group possibly being free, partially esterified by a lower alkyl or completely esterified.
  • n is 1 or 2
  • m is 0 or one integer from 1 to 4
  • p is zero
  • x is such that the molecular weight of the polymer is at least 5000D.
  • the amide bond connecting the lateral carbon of the polyacid and the rest of the side chain is called an "isopeptide" bond.
  • the polymer in the case where m equals zero, the polymer is a derivative of polyglutamine and, in particular when p is zero, poly- ⁇ -malonylglutamine.
  • p 1, we have poly- ⁇ -succinylglutamine and when p is 2, asymmetric poly- ⁇ -glutarylglutamine.
  • the molecule When m is other than zero, the molecule has a mono or oligopeptide link inserted between the CO group of the polyglutamine and the terminal amino-substituted group.
  • the existence of one or more peptide groups in the side chain of the present polymer corresponds to the presence of one or more sites of enzymatic hydrolytic attack leading to the degradation of the polymer into resorbable fragments by the organism in which the polymer is incorporated. It is therefore possible, by varying the number and type of amino acids constituting said link, to exercise precise control over the rate of degradation of the polymer in a given application.
  • amino acids which are preferred for constituting these links, mention may be made of glycine, alanine, phenylalanine, esterified or non-esterified aspartic and glutamic acids, leucine, tyrosine, methionine and others.
  • the polymer of the invention can also be in the form of a copolymer with other polyamino acids. In this case, there will be a copolymer of formula:
  • the definition of R 'can therefore correspond to that of R.
  • R' it is preferred for R' to have groups such as, for example methyl (alanine), isopropyl ( valine), isobutyl (leucine and isoleucine), benzyl (phenylalanine), etc.
  • R ′ can also denote a residue of glutamic or aspartic acid which is not esterified, or partially esterified by any alcohol, for example MeOH or EtOH, that is to say, for example, -CH 2 ) n -COOH or - (CH 2 ) n -COOMe, n being 1 or 2.
  • R 'de a residue of free glutamic or aspartic acid
  • amino acids of the L or D series we can also have, indifferently, amino acids of the L or D series.
  • the amino acids of the L series (or natural) are the most interesting because the polypeptides containing them are degradable by enzymes (proteases) of the human body, so that polypeptides made up of D units are not.
  • the molar proportion, in copolymer II, of the other free or partially esterified polyamino acid also makes it possible, to a considerable extent, to regulate the rate of biodegradation of the copolymer as a function of the agents present in the organism at the site of destination of the mixture of copolymer and of the drug to be administered, (that is to say in the organ where the drug must act).
  • the copolymer is a copolymer of polyglutamine I and of leucine
  • the relative molar proportion of the two constituents will be chosen as a function of the relative rate of degradation, at the place considered, of the polyglutamine and of the polyleucine.
  • the z / y ratio can vary from 1 to 30, but these limits can be exceeded if necessary.
  • the polymers of the invention can comprise elements of configuration L or D or racemic mixtures or, again, polymers where one of the configurations dominates.
  • the biochemical properties of these various assemblies are, of course, not identical, the polymers dominated by the natural forms L being more accessible to enzymatic degradation. It is therefore possible, as already mentioned above, to control its degradability by proportioning, in the copolymer, the relative proportions of one and the other form.
  • Polymers I and copolymers II are soluble in water (even at acidic pH, unlike polyglutamic acid) (unless the COOH groups are esterified) and generally soluble in one or more solvents such as dimethylformamide, trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoroethanol
  • the biodegradation of polymer I can be diagrammed as follows:
  • reaction (2) is consecutive to the reaction (1) and, therefore, the biodegradation of the polymer will be all the faster the faster the hydrolysis rate of the side chain.
  • Polymer I and its copolymer II can be prepared by various routes.
  • the desired polyamino acid IV or co-polyamino acid is reacted with an aminomalonate, aspartate or glutamate of alkyl III (of tert-butyl, for example) in the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) which provides the corresponding ester of polyacid I or II, the latter being then hydrolyzed by the usual means.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • polyamino acid IV or co-polyamino acid V used as starting material for the preparation of polymer I or of copolymer II is easily obtained by the usual means comprising the esterification by a lower alcohol of the lateral carboxylate of an acid of formula
  • N-carboxyanhydride N-carboxyanhydride
  • the starting product (V) that will be used will be a copolymer of H 2 NCHE acid (CH 2 ) n -COOH] -COOH and of ester HN 2 -CHC (CH 2 ) n -COOAlk] -COOH.
  • polymers I and II Due to the presence, along the chain, of two carboxylic groups, polymers I and II can fix certain metal ions, such as Ca +2 , more firmly than monocarboxylic acids.
  • Such a property is encountered with certain natural polypeptides present in the organism, such as prothrombin, factor Xa of the blood, osteocalcin of bones and cartilages; these compounds have ⁇ -carboxyglutamic residues (Gla) capable of binding Ca +2 (see JP
  • osteocalcin has a great affinity for hydroxyapatite and, although its physiological role is still poorly understood, it probably plays an important role in the control of bone growth.
  • prothrombin As far as prothrombin is concerned, it has, in its molecule, ten Gla residues allowing prothrombin to bind, in the presence of calcium, to the phospholipids constituting cell membranes. In under such conditions, prothrombin has the property of converting, in the presence of factor Xa, into thrombin which causes the blood to clot by catalyzing the transformation of fibrimogen into fibrin. In the absence of Gla remains the prothrombin loses all activity.
  • prostheses can be used for the manufacture of bone prostheses and fully biocompatible and biodegradable cartilage without the formation of toxic residues.
  • Such prostheses are mechanically very rigid, but are gradually absorbed as the regeneration of the consolidated bone. Thus, the usual final intervention to remove the prosthesis after healing can be avoided.
  • the present carboxylic polypeptides can be used to provide cyclic anhydrides, when p is equal to 1 or 2, for example by treatment of polyacids I or II with a carbodiimide such as DCC, as indicated below:
  • This transformation has the effect of providing polymers which are insoluble in water, but soluble in the numerous usual organic solvents, such as acetone, methyl ethyl ketone, THF, dioxane, ethyl acetate, monoglyme and others, which allows their easy transformation into beads. , rods, fibers, filaments, microcapsules etc ... by the processes of extrusion, casting, evaporation etc.
  • polymers IA, as well as their HA homolics obtained identically from II, restore polyacids I and II.
  • the polymers and copolymers IA and HA are biodegradable and biocompatible when used for the slow and controlled release of drugs, for example from thin films prepared by pouring a solution of polymer and drug onto a support followed by drying. by evaporation of the solvents from the solution.
  • Such techniques are described in "Controlled Release of Macromolecules from Polymers by R. LANGER et al., Biomedical Polymers, Ed. GOLDBERG and NAKAJIMA, Académie Press, 1980). After the film has dried, the drug may be in the state dissolved or as a suspension of particles.
  • the polymer IA and the copolymer IIA can be used as a drug reservoir in various ways.
  • the present polymers IA and copolymers IIA can be used to make microcapsules containing a drug.
  • microcapsules comprise a polymeric membrane and contain an aqueous or oily solution in which the medicament is in suspension, or in solution.
  • Microspheres can also be made, that is to say solid particles or beads containing the drug in the dispersed state or in the form of a solid solution in the polymer matrix.
  • micro sponges microporous products
  • solubility of the present polymers in numerous solvents, miscible or not with water is an advantage for their application according to the techniques described in these references. It is also possible to prepare yarns made of these polymers by extruding a solution of these in a die and precipitating the yarn, either by evaporation, or by a non-solvent bath, according to the usual spinning techniques. Filaments prepared in this way can be knitted, knotted or woven to form sutures, ligatures or tubular structures that can serve as artificial arteries, veins, conduits or internal organs with temporary functioning.
  • the polymers of the invention can also be used, either directly or as a mixture with a plasticizer, for the manufacture of films or surgical prostheses used, for example, in the consolidation of fractured bones, such as staples, needles, screws, reinforcement plates, buffers etc ..., these materials can be produced by casting or molding a solution, thermoforming or by machining solid polymer blocks. As such prostheses are absorbable, they are gradually eliminated in the body and it is then no longer necessary to provide, as is currently done, a new operation to remove the reinforcement and consolidation material.
  • the polymers and copolymers of the invention can also be used for the preparation of biodegradable surgical dressings.
  • Such dressings consist of one or more layers successively obtained from solutions of these polymers in a solvent deposited on a support and solidified by evaporation or drying.
  • Such dressings consist of one or more layers of suc stops obtained from solutions of these polymers in a hydrocompatible solvent deposited on a support and solidified by extraction with water of the solvent in question. Such extraction can be done by contacting with water, for example by washing or immersion.
  • Such dressings can be formed by pouring solutions onto a support (these solutions containing or not containing one or more drugs, for example a disinfectant) under sterile conditions, by treating the whole with water and then detaching the film. insolubilized from the support and possibly drying it before use (or by packaging it in a sterile manner if its immediate use is not foreseen).
  • the intrinsic advantage of the IA and IIA polypeptides over the polyalkyglutamates or aspartates of the prior art lies in the unstable character of the anhydride functions, which makes it possible to ensure the dissolution / biodegradation of the polymer in its hydrophobic anhydride form.
  • the anhydride compounds IA and IIA are also useful as a "drug vector" for covalently fixing drugs exhibiting a reactive function with this cycle (that of an enzyme, a protein or d 'a polypeptide), for example an amino function, as indicated below where M denotes the molecule of a medicament to be fixed on the present polymer:
  • the polymer thus modified by binding to the drug M can in general be handled as described above and administered likewise, so that it acts at its destination in the body. Such a pharmacological action may, in some cases be due to the polymer thus modified itself, but, most often the drug will only be active after having been separated, for example by hydrolysis, from its support.
  • the arrows indicate the bonds likely to split by hydrolysis.
  • Polyamino acids have also been used as drug carriers, especially in cancer therapy.
  • poly L-lysine has been used as a carrier for anticancer drugs (SHEN and RYSER, Molecul. Pharmacol. 16, (1979), 614-622) .
  • Polyaspartic acid has also been used (ZUNINO et al, Int. J. Cancer 30, (1982) 465-470) to fix daunorubicin.
  • polyglutamic acid has been reported as a support for norethindrone (contraceptive product) (ZUPON et al, J. Pharmac.
  • Adriamycin an anticancer drug was also attached to polyglutamic acid (Van Heeswijk et al., Journal of Controlled Release 1, 301 (1985)).
  • copolymers of maleic anhydride and another vinyl monomer have often been used for medical applications.
  • these polymers have an intrinsic pharmacological activity after hydrolysis (this is particularly the case for the divinylether-maleic anhydride DIVEMA which acts as an activator of macrophages).
  • DIVEMA divinylether-maleic anhydride which acts as an activator of macrophages.
  • they are capable of serving as drug carriers, in particular by reaction of the anhydride function with an R-OH or R-NH 2 group of an active principle like anhydrides derived from the polyacids of the invention; HIRANO et al, Makromol. Chem. 180 1125 (1979).
  • polymers of the invention as well as the corresponding anhydrides can be used to form soluble macromolecules carrying an active ingredient and allowing a slow release of this active ingredient. It will be noted that, compared with the known examples of the technique described above, they have the following advantages:
  • dicarboxylic groups -CH- (COOH) 2 capable of chelating calcium, are part of the ⁇ -carboxyglutamic acid found in certain human proteins
  • This property of fixing calcium makes the compounds of the invention particularly useful for the manufacture of bone prostheses and cartilages entirely biocompatible and resorbable.
  • a prosthesis can for example be produced by molding a mixture of hydroxyapatite Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 in powder form and a binder consisting of the polymer or copolymer of the invention in which p is, preferably zero.
  • p is, preferably zero.
  • the accompanying drawing is a graph illustrating the complexing power of calcium in the polymers according to the invention.
  • polymers and copolymers of the invention are synthesized as follows: firstly, poly-L-glutamic acid or poly-L-aspartic acid is prepared, in a conventional manner, by the method of M -carboxyanhydrides. (See for example patent application CH-5021/84).
  • polyglutamic acid of the N-carboxyanhydride of alkyl ⁇ -benzylglutamate ( ⁇ -benzylglutamate NCA) which makes it possible to obtain polymers of high molecular weights.
  • ⁇ -benzylglutamate NCA alkyl ⁇ -benzylglutamate
  • the poly- ⁇ -benzylglutamate thus obtained is then debenzylated by HBr in benzene to give poly-L-glutamic acid.
  • Polyaspartic acid will be prepared in the same way, by polymerization of the ⁇ -benzylaspartate NCA and then debenzylation of the esterified polyacid.
  • the molecular weights of the polymers obtained are generally lower in the case of polyaspartate than in that of polyglutamate.
  • This copolymer is prepared by incomplete hydrolysis of poly [Glu (OMe)] in aqueous trifluoroacetic acid (this polymer therefore comprises in its backbone 20% of methyl glutamate unit).
  • the pellet (dicyclohexylurea) is washed with CHCl 3 (50 ml) and the extract is added to the supernatant. Another 100 ml of CHCl 3 is added thereto and this phase is washed successively with H 2 O (3 times 100 ml), 1N NaHCO 3 (2 times 100 ml), H 2 O (100 ml), 1% HCl (3x100 ml) and H 2 O (2x100 ml). The organic phase is dried over Ma 2 SO 4 and concentrated to 40 ml.
  • a polymer sample is hydrolyzed for 12 h in 6N HCl at 120 ° C.
  • the NMR spectrum of the polymer in TFA solution corresponds well to the proposed structure.
  • the product thus obtained is very hygroscopic and must be stored in a desiccator. 0.927 g of the above poly [Glu (OMe) Glu (OH) Glu (Asp)] are dissolved in 10 ml of DMF and 3 mmol of DCC are added.
  • the precipitate is redissolved in chloroform (50 ml) and washed successively with 0.1 N NaHCO 3 , H 2 O, 1% HCl and H 2 O saturated with salt (100 ml). It is centrifuged with each washing to separate the organic and aqueous phases. The organic phase is finally dried over MgSO 4 , filtered and the solution is precipitated by adding an excess of ether.
  • the polymer is redissolved in MeOH (20 ml), acetic acid (30 ml) and 5 ml of H 2 O are added; 2 g of palladium on activated carbon are added and hydrogen is bubbled through this solution for 15 hours. After filtration of the activated carbon, the solution is dialyzed for 3 days in distilled water, then lyophilization is carried out, which provides 3.5 g of poly ( ⁇ -L-glutamyl-glutamine].
  • the polymer can be stored in its dicarboxylic acid form or it can be cyclized as follows:
  • poly [ ⁇ -L-aspartyl-L-aspartamine] is obtained. This can be cyclized to the corresponding anhydride by the above-mentioned means.
  • reaction medium a solvent where mixture of solvent such that the reaction of the group -NH 2 of the substance to be fixed is favored compared to that of the hydrolysis of the anhydride cycle.
  • the polymer (3 g) is added to 30 ml of KOH N / 10 in MeOH. 25 ml of H 2 O are then added. The polymer gradually dissolves. After 17 hours, the pH is brought back to 7 and the solution is dialyzed for 1 day in H 2 O then HCl at 1%.
  • the whole is lyophilized and thus 2.45 g of the polymer of formula is obtained:
  • the proportion of amino acids in a sample is measured after complete hydrolysis of the latter in a 6N HCl solution (24 h) from which it is deduced that the rate of fixation of the malonylamido radical is 85%.
  • the analysis consists in assaying the glycine which forms, during hydrolysis, by decarboxylation of the aminomalonic residue.
  • the purpose of this example is to demonstrate the complexing power of various polymers according to the invention vis-à-vis calcium ions.
  • a series of 1 ml aqueous solution containing radioactive Ca +2 100, ⁇ l of 45 Ca 10 -3 M and variable amounts of various polymers according to the invention were introduced into a series of dialysis envelopes (casings) as well as a control).
  • the polymers studied were: polyglutamic acid (control A); poly- (malonyl-glutamine) B; poly- (aspartylglutamine) C; poly- (glutaryl-glutamine) D.
  • This example is intended to show that the poly ( ⁇ -malonylglutamine) derivative binds in the presence of Ca +2 , to lipid surfaces as does prothrombin - (see for example SP BAJAJ et al., Journal of Biol.
  • a liposome suspension was first prepared by dissolving 250 mg of lecithin in 36 ml of CHCl 3 , adding 10 ml of buffer (20 mM Tris, HCl + 40 mMol NaCl, pH 7.5) and subjecting this mixture to ultrasound at 50 ° C. After evaporation of CHCl 3 , 30 ml of buffer were added, the total volume was adjusted to 40 ml and centrifuged for 1/2 hour at 60,000 rpm. The pellet was taken up in 41.6 ml of buffer which provided a liposome suspension at 6 mg / ml.
  • a 10 mM aqueous solution of Ca ions was then introduced into a series of test tubes, each containing 2 mg / ml of liposomes and increasing amounts (from 0.025 to 1 mg / ml) of poly ( ⁇ -malonylglutamine) labeled with 14 C.
  • poly ( ⁇ -malonylglutamine) labeled with 14 C.
  • EEDQ radioactive methyl glycinate 14 C in the presence of EEDQ, (2-ethoxy-1-ethoxy-carbonyl-1,2, dihydroquinoline) so as to replace approximately 1% of the malonic residues with the glycinate and thus obtain a specific activity of 37,000 dpm / mg (disintegrate / min) of polymer.
  • the liposomes were centrifuged and the radioactivity present in the supernatant was then measured, this quantity characterizing the percentage of poly ( ⁇ -malonylglutamine) not fixed by the liposomes.
  • polymers -poly ( ⁇ -glutamylglutamine); -poly ( ⁇ -aspartylglutamine); - poly ( ⁇ -malonylglutamine) were dissolved in an isotonic NaCl solution at pH 7.4 (0.01 M phosphate) at a concentration of 100 mg / ml.
  • the solutions were injected i.p. to white mice (25-30 g) up to a dose of 2000 mg / kg (5 tests per dose). After a 4-week observation period, no lethal effect was observed on the experimental animals, up to the dose of 2000 mg / kg.

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Abstract

Dérivés des acides polyaspartique et/ou polyglutamique dont les chaînons latéraux comportant des groupes COOH susceptibles de former des anhydrides cycliques. Ces polyacides et anhydrides sont utilisables pour la fabrication de médicaments.

Description

POLYPEPTIDE SYNTHETIQUE BIODEGRADABLE ET SON UTILISATION EN THERAPEUTIQUE
La présente invention a pour objet un polypeptide biodégradable hydrosoluble non toxique utilisable en biologie et pour diverses applications thérapeutiques, notamment pour servir de support à des médicaments, ceux-ci étant, ensuite, libérés progressivement dans l'organisme au fur et à mesure de la dégradation biochimique du polymère.
Depuis plusieurs années, on connaît des polymères biodégradables non-toxiques pouvant servir de réservoir de médicaments et permettant la libération progressive contrôlée de ceux-ci dans l'organisme lors de la dégradation du polymère porteur. On trouve des informations générales sur de tels produits dans l'ouvrage: "Fundamental Aspects of Biocompatibility" par D.F. WILLIAMS, CRC Press (1981). Voir aussi brevet USP 4,093,709.
Parmi ces polymères, on cite plus particulièrement les polypeptides synthétiques (polyaminoacides) dont la structure est voisine de celle des protéines. Ces polypeptides sont biocompatibles et leurs produits de dégradation (acides aminés) sont résorbabies par l'organisme. Ainsi SIDMAN ET AL (J. MEMBR. SCI (1980), 7 (3), 277-91) ont divulgué un copolymère d'acide glutamique et de γ-glutamate d'éthyle dont la vitesse de dégradation est fonction de la composition du copolymère (proportions molaires des segments estérifiés par rapport aux segments non estérifiés) et qui permet d'emmagasiner de nombreux produits, par exemple médicaments anti-malaria, anticancer et autres. De tels polymères peuvent être utilisés sous forme de baguettes contenant, en mélange, le médicament désiré ou sous forme de capsules renfermant le médicament si celui-ci n'est pas miscible avec le polymère. Cependant, les polyglutamates et polyaspartates d'alcoyle (esters simples de ces polyacides) ne sont dégradables en temps utile (d'un ordre de grandeur compatible avec leur utilisation pharmaceutique) que sous forme partiellement hydrolysée (voir par exemple ASANO et al, J. Macromol. Sci. Chem. A21 (5) (1984), 561-582). Pour obtenir de tels polymères partiellement estérifiés, il faut soumettre ces polyglutamates ou polyaspartates à une réaction d'hydrolyse ménagée dont les conditions sont très difficilement reproductibles. Par ailleurs, de très faibles différences dans le degré d'hydrolyse influent considérablement sur la vitesse de biodégradabilité ultérieure ce qui constitue un problème additionnel dans l'emploi de tels polymères pour les buts précités.
Aussi, malgré l'intérêt que présentent les produits ci-dessus, on a continué à chercher un produit de qualités améliorées et présentant notamment les propriétés suivantes:
1. Excellente solubilité dans la plupart des solvants inoffensifs courants convenant aux médicaments et même dans l'eau (en effet, les dérivés connus de polyaminoacides ne sont, en général, solubles que dans certains solvants spéciaux (DMF, pyridine, F3CCOOH) dont l'emploi est incommode pour les préparations pharmaceutiques). thermoplastiques.
2. Contrôle amélioré du processus de dégradation. En effet, la vitesse de dégradation des polypeptides synthétiques connus est liée de façon stricte à leur structure chimique et notamment au taux d'estérification. Ainsi, dans un cas donné (voir, SIDMAN K.R., et al., PB 81-132136 NTIS (1980), p. 42) une variation du taux d'estérification de l'ordre de 10% fait passer la vitesse de dégradation de 1 au centuple (voir également la référence :SIDMAN citée plus haut), ce qui pose des problèmes pour la préparation d'échantillons reproductibles.
DEFINITION DE L'INVENTION
Le polymère de l'invention (et ses copolymères avec d'autres acides aminés) a permis de réaliser ces objectifs et d'autres encore, non moins importants, comme on le verra par la suite. Il s'agit d'un polypeptide estérifié de formule:
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dans laquelle R est un reste d'amino-acide quelconque mais, de préférence, un hydrogène (glycine), méthyle (alanine), benzyle (phenylalanine), etc.. Cependant R peut également désigner des restes d'aminoacides comportant des fonctions OH, SH, NH2 (correspondant à d'autres amino-acides), ainsi que - COOH (correspondant aux acides glutamiques et aspartiques), ce groupe carboxylique pouvant être libre, partiellement estérifié par un alcoyle inférieur ou totalement estérifié.
Dans la formule I qui précède, n vaut 1 ou 2, m est égal à 0 ou un entier de 1 à 4, p vaut zéro, 1 ou 2 et x est tel que la masse moléculaire du polymère soit d'au moins 5000D. La liaison amide reliant le carbone latéral du polyacide et le reste de la chaîne latérale est dénommée liaison "isopeptide".
On voit, de par la formule I qui précède que, dans le cas où m égale zéro, le polymère est un dérivé de la polyglutamine et, notamment lorsque p vaut zéro, la poly- γ -malonylglutamine. Lorsque p vaut 1, on a la poly-γ -succinylglutamine et lorsque p vaut 2, la poly- γ-glutarylglutamine asymétrique.
Lorsque m est différent de zéro, la molécule comporte un chaînon mono-ou oligopeptidique intercalé entre le groupe CO de la polyglutamine et le groupe amino-substitué terminal. L'existence d'un ou plusieurs groupes peptidiques dans la chaîne latérale du présent polymère correspond à la présence d'un ou plusieurs sites d'attaque hydrolytique enzymatique conduisant à la dégradation du polymère en fragments résorbabies par l'organisme dans lequel le polymère est incorporé. On peut donc, en jouant sur le nombre et le type des aminoacides constituant ledit chaînon, exercer un contrôle précis sur la vitesse de dégradation du polymère dans une application donnée. Parmi les aminoacides qu'on préfère pour constituer ces chaînons, on peut citer la glycine, l'alanine, la phénylalanine, les acides aspartiques et glutamiques estérifiés ou non estérifiés, la leucine, la tyrosine, la méthionine et autres.
Le polymère de l'invention peut également se présenter sous la forme de copolymère avec d'autres polyaminoacides. Dans ce cas, on aura un copolymère de formule:
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où R' est un reste d'acide amihé quelconque, non carboxylé ou carboxylé; dans ce dernier cas, les groupes COOH peuvent être libres, partiellement estérifiés ou totalement estérifiés, les groupes R' des unités -(NH-CHR'- CO) pouvant être identiques ou différents dans la chaîne du copolymère, avec y + z = x, la valeur de x étant toujours choisie pour que le copoly mère ait une masse moléculaire moyenne d'au moins 5000 D. La définition de R' peut donc correspondre à celle de R. En règle générale, on préfère pour R' avoir des groupements tels que, par exemple méthyle (alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine et isoleucine), benzyle (phénylalanine), etc.. En principe, tous les autres acides aminés sont également possibles, quoique, pour des raisons évidentes, on n'ait pu les essayer tous. R' peut également désigner un reste d'acide glutamique ou aspartique non estérifié, ou estérifié partiellement par un alcool quelconque, par exemple MeOH ou EtOH, c'est-à-dire, par exemple, -CH2)n-COOH ou -(CH2)n-COOMe, n valant 1 ou 2. Il est à remarquer que si R' désigne un reste d'acide glutamique ou aspartique libre, on peut représenter le polymère par la formule I, mais en admettant que le degré de substitution (amidation du carboxylé) est inférieur à 100%; bien entendu, ce cas est également représentable par la formule II avec R' = (CH2)n-COOH et y/(z+y) étant égal au degré de substitution.
On pourra également avoir, indifféremment, des acides aminés de la série L ou D. Les acides aminés de la série L (ou naturels) sont les plus intéressants car les polypeptides les contenant sont dégradables par les enzymes (protéases) du corps humain, alors que les polypeptides constitués d'unités D ne le sont pas. On peut mettre à profit cette différence grâce à des copolymères comprenant des aminoacides D et L, ceci afin de disposer de polymères dont la vitesse de dégradation est modifiée suivant un schéma préétabli.
Revenant à des considérations plus générales, il faut noter que la proportion molaire, dans le copolymère II, de l'autre polyaminoacide libre ou partiellement estérifié permet également dans une notable mesure de régler la vitesse de biodégradation du copolymère en fonction des agents présents dans l'organisme au site de destination du mélange de copolymère et du médicament à administrer, (c'est-à-dire dans l'organe où le médicament doit agir). Ainsi, par exemple, si le copolymère est un copolymère de polyglutamine I et de leucine, on choisira la proportion molaire relative des deux constituants en fonction de la vitesse relative de dégradation, au lieu considéré, de la polyglutamine et de la polyleucine. En règle générale, le rapport z/y peut varier de 1 à 30, mais ces limites peuvent être dépassées si besoin est.
Bien entendu, dans le cas où le groupe R' ne désigne pas un groupe de nature unique dans la chaîne du copolymère, c'est-à-dire, par exemple lorsque l'un des R' désigne un reste d'acide aminé libre et qu'un autre R' désigne un reste d'amino-acide estérifié, on pourra, pour plus de commodité désigner les variantes de R' par les signes R", R''' etc.. La formule générale d'un tel copolymère peut alors être schématisée comme suit:
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où la somme des y, z, u, v, ..., etc est égale à x; u, v, etc. peuvent être bien entendu nuls si le reste désigné par R' est de nature unique. Un cas typique où le copolymère présente des R' et R" distincts est celui où ces groupes désignent des restes d'acide glutamique et/ou aspartique estérifiés et non estérifiés, la formule schématique d'un tel polymère (dans le cas d'espèce, partiellement méthylé) se présentant comme suit:
Figure imgf000007_0002
Il est bien entendu que, du point de vue isomérie optique, les polymères de l'invention peuvent comprendre des éléments de configuration L ou D ou des mélanges racémiques ou, encore, des polymères où une des configurations domine. Les propriétés biochimiques de ces divers assemblages ne sont, bien évidemment, par identiques, les polymères où dominent les formes naturelles L étant plus accessibles à la dégradation enzymatique. On peut donc, comme déjà mentionné ci-dessus, en contrôler la dégradabilité en dosant, dans le copolymère les proportions relatives de l'une et l'autre forme.
Les polymères I et copolymères II sont solubles dans l'eau (même à PH acide, contrairement à l'acide polyglutamique) (à moins que les groupes COOH ne soient estérifiés) et généralement solubles dans un ou plusieurs des solvants tels que le diméthylformamide, l'acide trifluoroacétique, l'acide dichloroacétique, le trifluoroéthanol
La biodégradation du polymère I peut être schématisée comme suit:
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La réaction (2) est consécutive à la réaction (1) et, de ce fait, la biodégradation du polymère sera d'autant plus rapide que la vitesse d'hydrolyse de la chaîne latérale est plus grande.
Dans le schéma réactionnel ci-dessus, on a indiqué par des petites flèches les liaisons où se produisent les scissions par hydrolyse enzymatique (par exemple par la γ-glutamyltranspeptidase présente dans l'organisme); aussi, par une sélection appropriée des aminoacides constituant cette chaîne latérale, on peut, en fonction des conditions d'hydrolyse au lieu d'administration au polymère, régler sa vitesse de dégradation et, partant, celle de libération des médicaments qui lui sont associés. On pourra trouver une bonne illustration des propriétés d'hydrolyse enzymatique des peptides greffés dans la référence suivante: J. KOPECEK et al., Enzamatically Degradable Bonds in Synthetic Polymers dans Controlled Drug Delivery, Vol. I, basic concepts, CRC Press, page 81, (1983).
On peut préparer le polymère I et son copolymère II par diverses voies. Ainsi, par exemple dans le cas où m = 0 (absence de chaînons de pontage entre le carbonyle du polyacide et le groupe azote substitué de la glutamine) on fait réagir le polyaminoacide IV ou co-polyaminoacide correspondant désiré avec un aminomalonate, aspartate ou glutamate d'alcoyle III (de tertbutyle, par exemple) en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ce qui fournit l'ester correspondant du polyacide I ou II, ce dernier étant ensuite hydrolyse par les moyens habituels.
Le schéma réactionnel de cette voie de préparation figure ci-dessous. Dans ce schéma, le signe Y désigne un groupe ester, par exemple, méthyle, butyle, benzyle, etc..
Figure imgf000009_0001
Dans le cas où on intercale un chaînon intermédiaire de pontage dans la chaîne latérale (m ≠ 0), on peut, suivant une forme d'exécution, constituer d'abord cette chaîne latérale à partir du diester III, en y fixant, progressivement un ou plusieurs amino acides suivant les moyens habituels, puis relier cette chaîne au polyaminoacide comme dans le schéma ci-dessus.
On donne ci-dessous un exemple schématique d'un tel processus dans lequel le diester III dérive de l'acide amino-malonique et les chaînons intermédiaires dérivent, successivement, de la phénylalamine et de la glycine. On notera que pour ajouter ces chaînons intermédiaires, on protège la fonction amino de ces aminoacides par un groupe benzoxycarbonyl (Z) et on utilise, conjointement à la dicyclohexylcarbodiimide (DCC), de l'hydroxybenzotriazole (HOBt), un réactif permettant d'éviter les racémisations
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Suivant une seconde forme d'exécution, on peut procéder dans un sens inverse, c'est-à-dire, dans le cas d'exemple ci-dessus, faire réagir le polyacide de départ en présence de DCC avec la glycine (celle-ci ayant été préalablement estérifiée), éliminer le groupe ester protecteur, faire réagir le polymère ainsi obtenu avec un ester de phénylalanine, et ainsi de suite, jusqu'à obtention de la chaîné finale. Les étapes d'une telle forme d'exécution étant évidentes en soi pour l'homme de métier, notamment le spécialiste des synthèses peptidiques , il n ' est pas nécessaire de les détailler plus avant ici.
Bien entendu, les techniques utilisées pour la préparation du polymère I conviennent identiquement dans le cas des copolymères II, la différence concernant simplement le choix du polyacide de départ, c'est-à-dire le remplacement du polyacide IV par un copolyacide correspondant, par exemple
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Le polyaminoacide IV ou co-polyaminoacide V utilisé comme produit de départ pour la préparation du polymère I ou du copolymère II s'obtient facilement par les moyens habituels comprenant l'estérification par un alcool inférieur du carboxylé latéral d'un acide de formule
Figure imgf000011_0002
la transformation de l'ester en N-carboxyanhydride correspondant (NCA) par lé phosgène en milieu dioxanne ou THF, la polymérisation du NCA en polyaminoacide estérifié et l'hydrolyse du groupe ester protecteur en milieu alcalin ou par l'acide trifluoroacétique. De telles méthodes sont connues en soi (voir par exemple Encyclopedia of Polymer Science and Technology; N-carboxyanhydride, vol II, page 837). Lorsqu'on désire parvenir à un copolymère ou R' désigne un carboxylé latéral partiellement estérifié (R' = - (CH2)n-COOH et R'' = -(CH2)n-COOAlk) on prendra soin que l'hydrolyse du groupe ester protecteur ne soit que partielle. Ainsi, par exemple, le produit de départ (V) qu'on mettra en jeu sera un copolymère d'acide H2NCHE(CH2)n-COOH]-COOH et d'ester HN2-CHC(CH2)n-COOAlk]-COOH.
En raison de la présence, le long de la chaîne, de deux groupes carboxyliques, les polymères I et II peuvent fixer certains ions métalliques, tels le Ca +2, plus fermement que les acides monocarboxyliques.
Une telle propriété se rencontre auprès de certains polypeptides naturels présents dans l'organisme, tels la prothrombine, le facteur Xa du sang, l'ostéocalcine des os et des cartilages; ces composés présentent des restes γ-carboxyglutamiques (Gla) susceptibles de lier le Ca +2 (voir J.P.
BURNIER et al., Molecular and Cellular Biology 39 (1981), 191-199). En particulier, l'ostéocalcine présente une grande affinité pour l'hydroxyapatite et, quoique son rôle physiologique soit encore mal connu, elle joue probablement un rôle important dans le contrôle de la croissance osseuse.
En ce qui concerne la prothrombine, celle-ci présente, dans sa molécule, dix restes Gla permettant à la prothrombine de se fixer, en présence de calcium, aux phospholipides constituants des membranes cellulaires. Dans de telles conditions, la prothrombine présente la propriété de se convertir, en présence du facteur Xa, en thrombine laquelle provoque la coagulation du sang en catalysant la transformation de fibrimogène en fibrine. En l'absence des restes Gla la prothrombine perd toute activité.
Or, certains composés de l'invention, et notamment l'acide poly-( γ- malonylglutamique)
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présentent une structure très similaire à celle des restes Gla
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et des propriétés analogues.
Ainsi, ils sont utilisables pour la fabrication de prothèses d'os et de cartilages intégralement biocompatibles et biodégradables sans formation de résidus toxiques. On peut réaliser de telles prothèses par moulage de mélanges d'hydroxyapatite en poudre avec, comme liants, les polymères de l'invention, en tout ou en mélanges avec d'autres polymères biodégradables. On préfère utiliser, pour un tel but, des polymères I ou II dans lesquels p = 0. De telles prothèses sont mécaniquement très rigides, mais se résorbent progressivement au fur et à mesure de la régénération de l'os consolidé. Ainsi, l'intervention finale habituelle destinée à éliminer la prothèse après la guérison peut-elle être évitée.
Les présents polypeptides carboxyliques sont utilisables pour fournir des anhydrides cycliques, lorsque p est égal à 1 ou 2, par exemple par traitement des polyacides I ou II avec un carbodiimide tel que le DCC, comme indiqué ci-dessous:
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Cette transformation a pour effet de fournir des polymères insolubles dans l'eau, mais solubles dans le nombreux solvents organiques usuels, tels que acétone, méthyléthyl cétone, THF, dioxanne, éthyl acétate, monoglyme et autres, ce qui permet leur transformation aisée en billes, bâtonnets, fibres, filaments, microcapsules etc... par les procédés d'extrusion, de coulage, d'évaporation etc. Par hydrolyse, les polymères IA, ainsi que leurs homoloques HA obtenus identiquement à partir de II, redonnent les polyacides I et II.
Les polymères et copolymères IA et HA sont biodégradables et biocompatibles lors de leur utilisation pour le relargage lent et contrôlé de médicaments par exemple à partir de films minces préparés par coulée d'une solution de polymère et de médicament sur un support suivie d'un séchage par évaporation des solvants de la solution. De telles techniques sont décrites dans "Controlled Release of Macromolecules from Polymers par R. LANGER et al., Biomédical Polymers, Ed. GOLDBERG et NAKAJIMA, Académie Press, 1980). Après séchage du film, le médicament peut se trouver à l'état dissous ou sous forme de suspension de particules.
Le polymère IA et le copolymère IIA sont utilisables comme réservoir de médicaments de diverses manières. Ainsi, par exemple, on peut employer les présents polymers IA et copolymères IIA pour fabriquer des microcapsules contenant un médicament. De telles microcapsules comprennent une membrane polymérique et contiennent une solution aqueuse ou huileuse dans laquelle le médicament est en suspension, ou en solution. On peut également fabriquer des microsphères, c'est-à-dire des particules solides ou billes contenant le médicament à l'état dispersé ou à l'état de solution solide dans la matrice de polymère. On peut également fabriquer des produits microporeux dénommés microéponges. En général, on pourra mettre en oeuvre, au moyen des présents polymères, toutes les techniques de fabrication de médicaments retard, c'est-à-dire ayant la propriété de relâcher (relarguer) le médicament de manière prolongée au fur et à mesure de la dégradation du support. On trouvera un description de ces techniques dans les ouvrages suivants: "Biodégradables and Delivery Systems for Contraception", E.S.E. HAFEZ, MTP Press limited (1980); "Controlled Release Technologies = Methods, Theory and Applications" Vol. 1 et 11, A.F. KYDONIEUS, CRC Press (1980) et "Microencapsulation - New Techniques and Applications" par Tamotsu KONDO, Techno Inc. (1979) Japan. La solubilité des présents polymères dans de nombreux solvants, miscibles ou non à l'eau, est un avantage pour leur application selon les techniques décrites dans ces références. Il est également possible de préparer des fils constitués de ces polymères en extrudant une solution de ceux-ci dans une filière et en précipitan le fil, soit par évaporation, soit par un bain de non-solvant, selon les techniques habitueles de filage. Des filaments préparés ainsi peuvent être tricotés, noués ou tissés pour former des sutures, des ligatures ou des structures tubulaires pouvant servir d'artères artificielles, de veines, de conduits ou d'organes internes à fonctionnement temporaire. Les polymères de l'invention peuvent également servir, soit directement, soit en mélange avec un plastifiant, à la fabrication de films ou de prothèses chirurgicales servant, par exemple, à la consolidation d'os fracturés, comme des agrafes, des aiguilles, des vis, des plaques de renforcement, des tampons etc..., ces matériaux pouvant être réalisés par coulage ou moulage de solution, thermoformage ou par usinage de blocs de polymère solides. De telles prothèses étant résorbabies, elles sont progressivement éliminées dans l'organisme et il n'est alors plus nécessaire de prévoir, comme on le fait actuellement, une nouvelle opération pour enlever le matériau de renforcement et de consolidation.
Les polymères et copolymères de l'invention sont également utilisables pour la préparation de pansements chirurgicaux biodégradables. De tels pansements sont constitués par une ou plusieurs couches successivement obtenues à partir de solutions de ces polymères dans un solvant déposées sur un support et solidifiés par évaporation ou séchage.
On peut par exemple constituer de tels pansements par coulées des solutions sur un support (ces solutions contenant, ou non, un ou plusieurs médicaments, par exemple un désinfectant) dans des conditions stériles, en éliminant le solvant, par exemle par la chaleur ou sous vide, puis en détachant ensuite le film insolubilisé du support et le séchant encore éventuellement avant emploi (ou en l'emballant de manière stérile si son utilisation immédiate n'est pas prévue).
De tels pansements sont constitués par une ou plusieurs couches suc cessives obtenues à partir de solutions de ces polymères dans un solvant hydrocompatible déposées sur un support et solidifiés par extraction à l'eau du solvant en question. Une telle extraction peut se faire par mise en contact avec de l'eau, par exemple par lavage ou immersion.
On peut constituer de tels pansements par coulées des solutions sur un support (ces solutions contenant, ou non, un ou plusieurs médicaments, par exemple un désinfectant) dans des conditions stériles, en traitant le tout à l'eau puis en détachant ensuite le film insolubilisé du support et le séchant éventuellement avant emploi (ou en l'emballant de manière stérile si son utilisation immédiate n'est pas prévue). L'avantage intrinsèque des polypeptides IA et IIA sur les polyalkyglutamates ou aspartates de l'art antérieur réside dans le caractère instable des fonctions anhydrides, ce qui permet d'assurer la dissolution/biodégradation du polymère sous sa forme hydrophobe d'anhydride.
Les composés anhydrides IA et IIA sont également utiles en tant que "vecteur de médicament" (drug vector) pour fixer, de manière covalente, des médicaments présentant une fonction réactive avec ce cycle (celle d'une enzyme, d'une protéine ou d'un polypeptide), par exemple une fonction amino, comme indiqué ci-dessous où M désigne la molécule d'un médicament à fixer sur le présent polymère:
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Le polymère ainsi modifié par liaison avec le médicament M peut être en général manipulé comme décrit précédemment et administré de même, de façon qu'il agisse à son lieu de destination dans l'organisme. Une telle action pharmacologique pourra, dans certains cas être due au polymère ainsi modifié lui-même, mais, le plus souvent le médicament ne sera actif qu'après avoir été séparé, par exemple par hydrolyse, de son support. Dans le schéma ci-dessus, les flèches indiquent les liaisons suseptibles de se scinder par hydrolyse.
En ce qui concerne l'état de la technique dans ce domaine, on notera que le greffage de molécules pharmacologiquement actives sur des supports macromoléculaires solubles est connu; on trouve en particulier de nombreuses références sur les techniques de greffage mises en oeuvre et les avantages des produits qu'on en obtient, ceux-ci étant généralement appelés "polymères pharmacologiquement actifs". On peut citer, par exemple, les ouvrages suivants traitant de tels sujets:
- Polymers in medicine Advances Polym. Science, No 57, Springer Ed. 1984,
- Polymeric Drugs, Ed. DONARUMA et VOGI, Académie Press, 1978).
Ainsi, ont été décrits des polymères pharmacologiquement actifs de type vinylique (acrylique) qui présentent le défaut majeur de ne pas être biodégradables. Par contre, on a greffé des substances pharmacologiquement actives sur des polysaccharides dégradables (Dextrane, par exemple) (voir, par exemple, HASHIDA et al; Drug Metab. Dispos.12 (1984), 492-499).
On a également utilisé des polyaminoacides comme supports de médicaments, notamment en cancerothérapie, Ainsi, la poly L-lysine, a été utilisée comme support de médicaments anticancéreux (SHEN and RYSER, Molecul. Pharmacol. 16, (1979), 614-622). L'acide polyaspartique a également été employé (ZUNINO et al, Int. J. Cancer 30, (1982) 465-470) pour fixer de la daunorubicine. Par ailleurs, on a signalé l'utilisation de l'acide polyglutamique comme support de la noréthindrone (produit anticonceptionnel) (ZUPON et al, J. Pharmac. Science 72, (1983), 1323-1326) de même que comme base d'un médicament-cible antitumoral par sa conjugaison avec un anticorps (ROWLAND et al, Nature (Lond), 255 (1975), 487-488;WILCHEK, Makromol. Chem. Suppl 2 (1979), 207-214). Plus récemment, on a synthétisé de nouveau polymères antitumoraux à base de mitomycine C. ROOS et al., Int. J. of Pharmaceutics 22 (1984), 75-87) en partant d'acide polyglutamique ou aspartique et de polylysine. De plus, KATO et al ont divulgué une méthode de couplage entre la daunomycine et un anticorps et leur fixation sur l'acide polyglutamique (J. Med. Chem. 27, (1984), 1602-1607).
On a également fixé l'adriamycine (médicament anticancéreux) sur l'acide polyglutamique (Van Heeswijk et al., Journal of Controlled Release 1, 301 (1985)).
On a, par ailleurs, souvent utilisé des copolymères d'anhydride maléique et d'un autre monomère vinylique pour des applications médicales. Ces polymères ont d'une part une activité pharmacologique intrinsèque après hydrolyse (c'est notamment le cas pour l'anhydride divinylether-maléique DIVEMA qui agit comme activateur de macrophages). D'autre part, sous la forme d'anhydride, ils sont capables de servir de supports de médicaments, notamment par réaction de la fonction anhydride avec un groupe R-OH ou R-NH2 d'un principe actif à l'instar des anhydrides dérivés des polyacides de l'invention; HIRANO et al, Makromol. Chem. 180 1125 (1979). Ces polymères de l'état de la technique ont toutefois l'inconvénient de n'être pas biodégradables et de s'accumuler dans les lysosomes, ce qui provoque à la longue une affection dénommée "Syndrome macromoléculaire" ou thesaurosis (W.C. HUEPER Arch. Path. 28, 510,1939).
Les polymères de l'invention ainsi que les anhydrides correspondants peuvent être employés pour former des macromolécules solubles portant un principe actif et permettant un relargage lent de ce principe actif. On notera que, par rapport aux exemples connus de la technique décrits cidessus, ils présentent les avantages suivants:
- simplicité d'emploi (les agents intermédiaires de couplage sont inutiles)
- bonne solubilité dans l'eau même avec des taux de fixation élevés, en raison de la formation, lors de la réaction de fixation du médicament (couplage), d'un groupe -COOH (hydrophile).
Comme on l'a vu plus haut, les polymères I et II présentent un intérêt considérable en raison de leur pouvoir complexant (chélatant) vis-à-vis de certains ions métalliques, notamment le Ca+2 cette propriété étant due à la présence des groupements latéraux dicarboxyliques. Des groupes dicarboxyliques -CH-(COOH)2, susceptibles de chélater le calcium, font partie de l'acide γ-carboxyglutamique qu'on trouve dans certaines protéines humaines
(voir J.P. BURNIER et al., Gamma carboxyglutamic acid, Molecular and Cellular Biology 39, 191-199, (1981), notamment dans les os et les cartilages.
Cette propriété de fixer le calcium, particulièrement développée dans le cas du dérivé aspartique (I, p = 1), rend les composés de l'invention particulièrement utiles pour la fabrication de prothèses d'os et de cartilages entièrement biocompatibles et résorbabies. Une telle prothèse peut par exemple être réalisée par moulage d'un mélange d'hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2 en poudre et d'un liant constitué par le polymère ou copolymère de l'invention dans lequel p est, de préférence, zéro. Une telle prothèse, quoique de grande rigidité mécanique à l'application, se résorbe lentement au fur et à mesure de la régénération naturelle du membre consolidé et permet d'éviter l'intervention habituelle destinée à son élimination après consolidation définitive.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention en détail.
Le dessin annexé est un graphique illustrant le pouvoir complexant du calcium des polymères suivant l'invention. Méthodes générales de synthèse
On synthétise les polymères et copolymères de l'invention de la manière suivante: on prépare tout d'abord de l'acide poly-L-glutamique ou de l'acide poly-L-aspartique, de manière classique, par la méthode des M-carboxyanhydrides. (Voir par exemple la demande de brevet CH-5021/84).
D'une manière générale, on préfère partir, pour préparer l'acide polyglutamique de la N-carboxyanhydride du γ-benzylglutamate d'alcoyle ( γ -benzylglutamate NCA) qui permet d'obtenir des polymères de hauts poids moléculaires. Le poly-γ-benzylglutamate ainsi obtenu est ensuite débenzylé par HBr dans le benzène pour donner l'acide poly-L-glutamique.
On préparera l'acide polyaspartique de la même manière, par polymérisation du β-benzylaspartate NCA et ensuite débenzylation du polyacide estérifié. Les poids moléculaires des polymères obtenus sont généralement plus bas dans le cas du polyaspartate que dans celui du polyglutamate.
Exemple 1
Synthèse de poly-[ γ-L-aspartyl-L-glutamine] et de son anhydride.
On utilise comme polymère de départ du poly[Glu(OMe)20Glu(OH)80], c'est-à-dire un polyacide représentable par la formule (V) dans laquelle R' = (CH2)-COOMe, y = 0,8 et z = 0,2 (x étant bien entendu rapporté à l'unité). Ce copolymère est préparé par hydrolyse incomplète de poly[Glu(OMe)] dans l'acide trifluoroacétique aqueux (ce polymère comporte donc dans son squelette 20% d'unité glutamate de méthyle).
On dissout 3,8 g de poly[Glu(OMe)20 Glu(OH)80] dans 30 ml de dimethylformamide (DMF) ce qui correspond à 23,04 mmole de groupes -COOH. On ajoute 25 mmole d'hydroxybenzotriazole (HOBt) à 8% d'H2O, soit 3,67 g, puis 25 mmoles de di-t-butyl-L-aspartate.HCL, soit 7,04 g, ainsi que 6 ml de tributylamine (TBA) et 5,16 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). On laisse sous agitation 20 heures à température ambiante puis on centrifuge le mélange. On lave le culot (dicyclohexylurée) avec du CHCl3 (50 ml) et on ajoute l'extrait au surnageant. On ajoute encore à celui-ci 100 ml de CHCl3 et on lave successivement cette phase avec H2O (3 fois 100 ml), NaHCO3 1N (2 fois 100 ml), H2O (100 ml), HCl 1% (3x100 ml) et H2O (2x100 ml). On sèche le phase organique sur Ma2SO4 et on la concentre à 40 ml. On rajoute 100 ml d'éther et d'hexane jusqu'à apparition d'un trouble et on verse le tout dans 550 ml d'un mélange d'hexane-éther de pétrole (35-45°) ce qui provoque une précipitaion. Le précipité est redissous dans 20 ml de CHCl3, on ajoute 100 ml d'éther, on filtre sur celite, on rajoute de l'hexane dans le filtrat, on précipite et on sèche le produit sous vide. On obtient 5,72 g de polymère dont la majeure partie, correspond à la formule:
Figure imgf000019_0001
On dissout les 5,72 g de polymère dans 20 ml d'acide trifluoracétique (TFA) et on rajoute 40 ml de CHCl3, puis quelques ml d'acétone jusqu'à apparition d'un trouble. On verse cette solution dans 400 ml d'acétone sous violente agitation. On reprend le précipité fin obtenu dans 200 ml d'acétone + 200 ml d'éther, on filtre et on sèche. On obtient 3,68 g de polymère (IIA) (rendement = 90%), correspondant à la formule suivante (théorique):
Figure imgf000019_0002
Un échantillon de polymère est hydrolyse 12 h dans HCl 6N à 120 °C. Par analyse de la composition en acides aminés de la solution, on constate la présence de 3 moles d'acide aspartique pour 4 moles d'acide glutamique, ce qui permet d'attribuer les valeurs suivantes aux indices moléculaires: y = 0,75, z = 0,2, u = 0,05. Par ailleurs, le spectre RMN du polymère en solution TFA correspond bien à la structure proposée. Le produit ainsi obtenu est très hygroscopique et doit être conservé au dessicateur. On dissout 0, 927 g du poly[Glu(OMe)Glu(OH)Glu(Asp)] ci-dessus dans 10 ml de DMF et on ajoute 3 mmole de DCC. Après 20 heures sous agitation, on filtre et on ajoute au filtrat 30 ml d'éther. On verse ensuite ce liquide dans 350 ml d'éther et on ajoute au mélange 200 ml d'éther de pétrole ce qui occasionne la séparation d'un solide. On centrifuge et on sèche le culot ainsi obtenu ce qui fournit 0,73 g d'un polymère insoluble dans l'eau mais soluble dans le CHCl3. Le spectre IR de ce polymère confirme la présence de fonctions anhydrides (δ = 1800 cm-1) et sa formule est donc
Figure imgf000020_0001
Exemple 2
Synthèse de la poly[ γ-L-glutamyl-glutamine] et de son anhydride.
On dissout 2,5 g d'acide poly-L-glutamique (0,0192 moles COOH) dans 50 ml de DMF et on ajoute dans l'ordre 2,85 g d'hydroxybenzo-triazole 3,63 g de tributylamine 0,7 g de chlorhydrate de dibenzyl glutamate et 3,95 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). On laisse 24 heures sous agitation à température ambiante. On filtre la dicyclohexylurée formée et on évapore le filtrat (40°C/l Torr). Le précipité est redissous dans du chloroforme (50 ml) et lavé successivement avec NaHCO30,1 N, H2O, HCl 1% et H2O saturée de sel (100 ml). On centrifuge à chaque lavage pour séparer les phases organiques et aqueuses. On sèche finalement la phase organique sur MgSO4, on filtre et on fait précipiter la solution par adjonction d'un excès d'éther. Le polymère est redissous dans du MeOH (20 ml), on ajoute de l'acide acétique (30 ml) et 5 ml d'H2O; on ajoute 2 g de palladium sur charbon actif et on fait barboter de l'hydrogène 15 heures dans cette solution. Après filtration du charbon actif, on dialyse la solution 3 jours dans l'eau, distillée, puis on effectue une lyophilisation ce qui fournit 3,5 g de poly( γ -L-glutamyl-glutamine].
Le polymère peut être stocké sous sa forme diacide carboxylique ou on peut le cycliser de la manière suivante:
On dissout 1,44 g de ce polymère dans 200 ml de DMF et on ajoute 2,3 g de DCC. On laisse le tout 24 h en agitation; à 70°C on filtre la dicyclohexylurée (DCU) et on ajoute de l'éther ce qui fait précipiter le polymère. Le spectre IR d'un film mince de ce polymère, obtenu par dépôt d'une couche de sa solution dans le CHCl3 sur une plaque de verre, montre la présence de la fonction anhydride (1 pic à 1830 cm-1).
En procédant comme dans l'exemple 1 qui précède, mais en remplaçant l'acide polyglutamique par l'acide polyaspartique correspondant, on obtient la poly[γ-L-aspartyl-L-aspartamine]. Celle-ci peut être cyclisée en anhydride correspondant par les moyens sus-indiqués.
Figure imgf000021_0002
De même, en utilisant comme polyacide de départ un copolymère 50/50 d'acide glutamique et de leucine, on obtient tout d'abord un copolymère de formule
Figure imgf000021_0001
où y = z = 0,5 avec x = 1, puis l'anhydride corredpondant par les moyens sus-indiqués.
Exemple 3
Fixation de composés aminés sur les polyglutamine-anhydrides.
Les réactions suivantes ont été effectuées avec des polyacides de l'invention sous la forme d'anhydrides et certains acides aminés: On a ajouté goutte à goutte à des solutions des polypeptides dans le DMF des solutions aqueuses (ou DMF) des acides aminés. On a laissé sous agitation pendant 14 heures, après quoi on a salifié le polymère obtenu par NaHCO3 N/10 et on a procédé à 24 h de dialyse dans H2O suivie d'une lyophilisation. On a analysé des échantillons des produits obtenus (après hydrolyse dans HCl 6 N) pour déterminer le taux de fixation des acides aminés. Les résultats figurent au tableau ci-dessous. On peut remarquer d'après ces résultats que le taux de fixation dépend en partie de la solubilité des produits de départ dans le milieu ractionnel
Polypeptide Composé milieu réactionel taux de fixation anhydride aminé
poly(Glu-glutamine)glycine methylEMF (bonne 75% anhydride ester solubilité
Alanine DMF + H2O 20%
poly(Asp(anh)gluGlycine DMF + H2O (solu50% tamine bilité moyenne) En général, il faut choisir comme milieu réactionnel un solvant où mélange de solvant tel que la réaction du groupe -NH2 de la substance à fixer soit favorisée par rapport à celle du l'hydrolyse du cycle anhydride.
Exemple 4
Poly[γ-2-(dicarboxy-1,3-propyl)glutamine]
Il s'agit du polyglutamide de l'acide 2-aminomalonique dont le nom, suivant la nomemclature IUPAC est poly[imino[1-oxo-2(1',3'-dicarboxy-2'-iminocarbonyléthylène)-éthylène]].
On dissout 5 g d'acide polyglutamique (PGA) dans 100 ml de DMF; on ajoute ensuite 7,16 g de tributylamine, 7,10 g de chlorhydrate d'aminomalonate diméthylique (0,0387 moles) et, 5,23 g d'HOBt. On refroidit vers 0°C et on ajoute 7,97 g de DCC dissous dans 20 ml de DMF. Après 24 heures on filtre et on précipite le polymère par adjonction d'H2O. On redissout le solide dans de l'acétone et on reprécipite par l'eau. On redissout dans CHCl3 et on sèche la solution sur MgSO4. On filtre sur gooch en verre fritte et on précipite par l'éther. On obtient 5,8 g de polymère estérifié ayant la formule suivante:
Figure imgf000022_0001
Le spectre RMN du polymère en solution dans l'acide trifluoracétique correspond à la formule ci-dessus, (δ = 3,15 ppm, OCH3). On ajoute le polymère (3 g) à 30 ml de KOH N/10 dans le MeOH. On ajoute ensuite 25 ml d'H2O. Le polymère se dissout peu à peu. Après 17 heures, le pH est ramené à 7 et la solution est dialysée 1 jour dans H2O puis HCl à 1%. On lyophilise le tout et on obtient ainsi 2,45 g du polymère de formule:
Figure imgf000023_0001
On mesure la proportion des amino-acides d'un échantillon après hydrolyse totale de celui-ci dans une solution HCl 6N (24 h) d'où on déduit que le taux de fixation du radical malonylamido est de 85% . L'analyse consiste à doser la glycine qui se forme, lors de l'hydrolyse, par décarboxylation du reste aminomalonique.
Exemple 5
poly-( γ-aspartyl-anhydride-glycine-glutamine) On prépare tout d 'abord le dipeptide de formule
Figure imgf000023_0002
par couplage classique à la dicyclohexylcarbodiimide de Z-Gly(OH) et de H2N-Asp(OtBu)2. Ce dipeptide est ensuite soumis à une débenzylation catalytique pari hydrogène/palladium pour donner H-Gly-Asp(OtBu)2. Ce peptide est cristallisé sous forme de sel de dibenzylsulfimide (HN(SO2-Bz)2 dans l'éther. On le couple ensuite à l'acide polyglutamique comme décrit dans les exemples précédents. On filtre la DCU formée, on précipite le polymère dans NAHCO-, 0,1N, on le lave avec H„0 et on le dissout dans du dioxanne saturé d'HCl (4 N). Après 20 minutes, le polymère précipite. On évapore à sec et on dissout le produit dans un tampon carbonate pH 7. On filtre pour éliminer les parties insolubles et on dialyse le polymère contre H2O pendant 24 heures, puis contre HCl 1% 24 heures. On lyophylise la solution et on obtient un polymère ayant la formule suivante:
-HN-CH(CO-) ( CH2) 2-CONH-CH2CONHCH(COOH) -OH2COOH
Ce polymère est repris dans le DMF et, à la solution, on ajoute 1,5 équivalent de DCC. Après 24 heures de réaction, on filtre la DCU, on évapore le DMF et on redissout le polymère dans un minimum de choroforme. On filtre à nouveau pour éliminer les traces restantes de DCU, on précipite le polymère dans un mélange 50/50 éther/éther de pétrole et on sèche sous vide. Le spectre IR d'un film de ce polymère obtenu à partir d'une solution dans l'acide trifluoroacétique montre la présence de groupements anhydride ( λ = 1830 cm.)
L'analyse des acides aminés résultant de l'hydrolyse totale du polymère montre que le taux de greffage est de 78% .
Exemple 6
Le but de cet exemple est de mettre en évidence le pouvoir complexant de divers polymères suivant l'invention vis-à-vis des ions calcium.
On a introduit dans une série d'enveloppes de dialyse (boyaux) des portions de 1 ml de solution aqueuse contenant du Ca +2 radioactif 100, μl de 45Ca 10-3M et des quantités variables de divers polymères suivant l'invention (ainsi qu'un contrôle). Les polymères étudiés étaient: acide polyglutamique (contrôle A); poly-(malonyl-glutamine) B; poly-(aspartylglutamine)C; poly-(glutaryl-glutamine) D.
On a placé ces enveloppes dans 7 ml de tampon phosphate à pH 7,5 et on a laissé la dialyse s'effectuer jusqu'à l'équilibre (24 h); on a mesuré au moyen d'un compteur à scintillation les concentrations de calcium dans le tampon de dialyse, à l'extérieur de la membrane, et dans la solution dialysée à l'intérieur de la membrane. On a ensuite déterminé le rapport (%) entre le calcium lié au polymère par rapport au calcium total. Les résultats sont rassemblés au graphique annexé en fonction (abcisse) de la quantité de polymère exprimée en mMoles/1 de restes porteurs de groupes carboxyliques. et montrent que l'acide polyglutamique n'a qu'un pouvoir de fixation du calcium très limité par rapport aux polypeptides dicarboxyliques de l'invention.
Exemple 7
Cet exemple est destiné à montrer que le dérivé poly( γ-malonylglutamine) se lie en présence de Ca+2, aux surfaces lipidiques comme le fait la prothrombine - (voir par exemple S. P. BAJAJ et al., Journal of Biol.
Chemistry, 250(6), 2150-2156 (1975)).
On a opéré de la manière suivante:
On a préparé tout d'abord une suspension de liposomes en dissolvant 250 mg de lécithine dans 36 ml de CHCl3, en ajoutant 10 ml de tampon (20 mM Tris, HCl + 40 mMol NaCl, pH 7,5) et en soumettant ce mélange aux ultrasons à 50°C. Après évaporation du CHCl3, on a rajouté 30 ml de tampon, on a ajusté le volume total à 40 ml et on a centrifugé 1/2 heure à 60000 rpm. On a repris le culot dans 41,6 ml de tampon ce qui a fourni une suspension de liposomes à 6 mg/ml.
On a introduit ensuite dans une série de tubes à essai des solutions aqueuses 10 mM en ions Ca contenant chacune 2 mg/ml de liposomes et des quantités croissantes (de 0,025 à 1 mg/ml) de poly( γ-malonylglutamine) marquée au 14C. (Pour marquer la poly(γ-malonylglutamine), on a fait réagir celle-ci avec du glycinate de méthyle radioactif 14C en présence de EEDQ, (2-éthoxy-1-éthoxy-carbonyl-1,2, dihydroquinoléine) de manière à substituer environ 1% des restes maloniques par le glycinate et obtenir ainsi une activité spécifique de 37000 dpm/mg (désintégrat/min) de polymère.
Après 30 minutes, on a centrifugé les liposomes et on a mesuré ensuite la radioactivité présente dans le surnageant, cette quantité caractérisant le pourcentage de poly( γ-malonylglutamine) non fixé par les liposomes.
Le tableau suivant rassemble les résultats obtenus:
No tube polymère Ca++ liposomes % polymère non
(mg/ml) (mM) (mg/ml) fixé
1 1 10 0 95,7
2 0,025 0 2 92,0
3 0,025 10 2 5,0
4 0,05 10 2 21,8
5 0,1 10 2 48,2
6 0,25 10 2 76,3
7 0,5 10 2 84,4
8 0,75 10 2 90,0
9 1 10 2 92, 2
Ces résultats montrent que 1 mg de liposomes fixe 0,5 mg de poly( γ-malonyl glutamine) en présence de calcium. On voit aussi (essai No 2, qu ' en l ' ab sence de Ca+2, il n'y a pas de fixation du polymère sur les liposomes. Le comportement de ce polymère, dans les conditions susmentionnées, est donc analogue à celui, naturel, d'une protéine du sang.
Exemple 8
Les polymères suivants: -poly( γ-glutamylglutamine); -poly(γ-aspartylglutamine);-poly( γ-malonylglutamine) ont été dissous dans une solution NaCl isotonique à pH 7,4 (0,01 M phosphate) à une concentration de 100 mg/ml.
Les solutions ont été injectées i.p. à des souris blanches (25-30 g) jusqu'à une dose de 2000 mg/kg (5 tests par dose). Après une période d'observation de 4 semaines, on n'a constaté aucun effet létal sur les animaux d'expérience, et ceci jusqu'à la dose de 2000 mg/kg.

Claims

RE VE N D I CA T I O N S
1. Polypeptide carboxylé hydrosoluble biodégradable dérivé des acides polyaspartique et/ou polyglutamique de formule
Figure imgf000027_0001
et ses copolymères, avec d'autres acides aminés, de formule
Figure imgf000027_0002
où les groupes R et R', identiques ou différents, sont des restes d'aminoacide, ceux d'entre-eux comportant un groupe COOH pouvant être libres ou partiellement ou totalement estérifiés; m est un nombre entier de 0 à 5, p est égal à 0, 1 ou 2, n vaut 1 ou 2 et x qui est égal à y + z est choisi pour que la masse moléculaire du polypeptide ne soit pas inférieure à 5000 D.
2. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que R est choisi parmi les restes méthyle, éthyle, isobutyle, phényle et benzyle.
3. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que, les chaînons intermédiaires d'indice m sont choisis parmi les amino acides suivants: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phénylalanine, tyrosine, serine, cystéine, méthionine, lysine, arginine.
4. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ossature du composé I est choisie parmi les acides polyglutamiques et aspartiques et que l'ossature du composé II est choisie parmi les copolymères des acides glutamique et /ou aspartique avec un ou plusieurs autres acides aminés choisis parmi l'alanine, la leucine, la valine et la phénylalanine.
5. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le copolymère II est choisi parmi les copolymères des polyglutamines ou aspartamines I avec, comme co-monomères, respectivement, l'acide glutamique et/ou les glutamates d'alcoyles inférieurs et l'acide aspartique et/ou les aspartates d'alcoyles inférieurs.
6. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les groupes carboxyliques sont salifiés par des cations métalliques alcalins ou alcalino-terreux, par des aminés primaires, secondaires ou tertiaires ou qu'ils sont sous forme d'anhydrides cycliques.
7. Utilisation du polypeptide I et ses colopymères II suivant les revendications 1 à 6 comme réservoir de médicament à effet retard dans l'organisme, ce dernier étant progressivement libéré à son lieu de destination consécutivement à la biodégradation du polymère porteur.
8. Utilisation suivant la revendication 7, caractérisée par le fait qu'on mélange ledit médicament et ledit polymère de façon homogène et qu'on façonne ce mélange sous une forme pharmaceutiquement acceptable.
9. Utilisation suivant la revendication 8, caractérisée par le fait qu'on plasfifie le polymère par un plastifiant, notamment un polyalcoylène glycol, qu'on y ajoute un médicament, puis qu'on moule par la chaleur le produit thermoplastique ainsi obtenu sous forme de granulés, bâtonnets, capsules ou autres particules aptes à être administrées par toutes voies habituelles.
10. Utilisation des polymères I et copolymères II, suivant la revendication 1, pour fabriquer des implants et prothèses biodégradables utilisables en chirurgie.
11. Utilisation suivant la revendication 7, caractérisée par le fait qu'on fait réagir les polymères et copolymères I et II sous leur forme d'anhydride cyclique avec une substance susceptible de réagir avec les anhydrides et, partant, de se fixer par une liaison covalente sur lesdits polymères.
12. Utilisation suivant la revendication 11, caractérisée par le fait que ladite liaison covalente est biodégradalbe au lieu d'administration du polymère dans l'organisme.
13. Utilisation suivant la revendication 11, caractérisée par le fait que ladite substance réagit avec l'anhydride par l'intermédiaire d'une fonction amino, amido, hydroxy ou thiohydroxy.
14. Utilisation suivant la revendication 10, pour la préparation d'implants ou prothèses d'os biodégradables, caractérisée par le fait qu'on constitue de telles prothèses d'hydroxyapatite liée par lesdits polymères I ou copolymères II.
15. Utilisation des polymères I et copolymères II en tant que médicaments antiviraux et antitumoraux.
16. Procédé de préparation des polymères I et copolymères II suivant la revendication 1 où m = o, caractérisé par le fait qu'on fait réagir un polyacide de formule -(NH-CHC(CH2)n-COOHU-CO-)xIV, ou le copolyacide correspondant de formule -(NH-CHC(CH)n-COOH]-CO)-y(NH-CHR'-CO-)z V où n, x, y, z et R' ont le sens précité, avec un ester d'aminoacide de formule H2N-CH [(CH2)P-COOO]-COOY III où p a le sens précité et Y désigne un alcoyle d'estérification en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC), de manière à obtenir les polymères I ou copolymères II sous forme estérifiée, puis qu'on soumet ces polymères-ester à une désalcoylation par hydrolyse ou hydrogénolyse catalysée de façon à les convertir en acides carboxyliques libres.
17. Procédé suivant la revendication 16 applicable au cas ou m ≠ 0, caractérisé par le fait qu'on utilise en place de l'ester III un diester de formule H2N-CHR-CO-(NH-CHR-CO)m-NH-CH[(CH2)p-COOY]-COOY VI où les R, identiques ou différents, ainsi que m, p, et Y ont le sens précité.
18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé par le fait que le diester de formule (VI) est obtenu par couplages successifs sur le diester III, en présence de DCC, d 'aminoacides dont le NH, est temporairement désactivé par un groupe protecteur, par exemple benzyloxycarbonyl, ce groupe protecteur étant éliminé par déshydrogénation après chacun desdits couplages.
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