WO1986004419A1 - Nouveau support pour tests biologiques in vitro et applications de ce support - Google Patents

Nouveau support pour tests biologiques in vitro et applications de ce support Download PDF

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WO1986004419A1
WO1986004419A1 PCT/FR1986/000011 FR8600011W WO8604419A1 WO 1986004419 A1 WO1986004419 A1 WO 1986004419A1 FR 8600011 W FR8600011 W FR 8600011W WO 8604419 A1 WO8604419 A1 WO 8604419A1
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WO
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support
drop
tests
hydrophilic
coating
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PCT/FR1986/000011
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Inventor
Pierre Marie Ambroise Ambroise-Thomas
Jacques Thelu
Original Assignee
Ambroise Thomas Pierre Marie A
Jacques Thelu
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Definitions

  • the present invention relates to a new support for in vitro biological tests, in particular immunofluorescence tests, ELISA tests, radioimmunoassays, etc., as well as to the applications of this support.
  • immunofluorescence techniques has greatly improved serology for the detection of antigens or antibodies with increased sensitivity.
  • glass slides covered on one side by a thin hydrophobic coating, such as in particular silicone, revealing circular hydrophilic uncoated areas intended to be sensitized, that is to say say to fix a certain amount of antigens, in the case of tests for the detection of antibodies, or, conversely, fix antibodies in the case of detection of antigens. Due to the increasing number of samples to be tested, it would be desirable to develop the automation of the various test stages.
  • the glass supports currently used do not lend themselves to automation due in particular to handling difficulties, long drying time and difficulties in locating.
  • the European patent application 0 018 435 describes a micro-analysis device comprising a rigid lower plate of large thickness made of plastic material which receives a test substance, as well as an upper plate with complex means for holding the two plates at constant distance from each other. This device is complicated and does not lend itself to serial tests.
  • European patent application 0 063 810 describes devices for tests and analyzes comprising sheets of a porous material such as porous nitrocellulose or other porous plastics.
  • the test substance is absorbed in the porous mass and the whole of the porous mass is impregnated with a neutral protein with respect to the substance to be tested, such as albumin / so as to saturate the possibilities of absorption. .
  • a neutral protein with respect to the substance to be tested, such as albumin / so as to saturate the possibilities of absorption.
  • the production of such supports is particularly complex and costly and the technologies using these supports are of a completely different nature from that which concerns the present invention.
  • the present invention proposes to remedy these drawbacks and to provide a new support for in vitro biological tests which has, compared to known supports, the following advantages: - possibility of automatic use continuously or discontinuously,
  • the present invention relates to a new plastic support for biological tests in vitro and in particular munological, characterized in that it comprises a sheet of substantially transparent plastic material carrying on one of its faces, a hydrophobic coating. leaving one or preferably several tracks hydrophilic uncoated, preferably circular.
  • plastic material in the sense of the present invention, is meant a synthetic material capable of being produced easily in the form of sheets, ribbons or sheets and having either spontaneously or after treatment, a hydrophilic character allowing the sensitization operations.
  • ⁇ sation that is to say, placing, on the surface of the sheet, complex molecules or particles, such as antigens or antibodies, as well as the collection and distribution of liquid media such as by example of sera or blood, and this without absorption.
  • the plastics according to the invention are produced in sheets or films of polyvinyl acetate or of polyester such as for example the films sold under the name 63610 DT2 by the company STAEDTLER, NURNBERG, R.F.A.
  • the sheets according to the invention can be more or less flexible depending on their nature and the thickness chosen. They must be relatively flexible while tending to be maintained substantially without collapsing when they are held by an edge. Preferably, the thickness is between 0.05 mm and 0.5 mm.
  • the films used may have undergone an anti-thermal and / or anti-static treatment such as, for example, the films sold under the name 63610 DT2 by the company STA ⁇ DTLER.
  • the hydrophobic coating may for example be a silicone coating. This can be done for example by placing drops of glycerol on the sheet placed horizontally at the locations of future hydrophilic zones and by spraying a silicone aerosol on the entire sheet, the location of the drop remaining hydrophilic while its periphery becomes hydrophobic. This process can be automated using, for depositing drops, an automatic reagent dispenser.
  • the coating can be obtained by a simple photocopying process using, for example, xerography or similar techniques. It then suffices to make a model printed on plain paper and to make photocopies of it on the plastic sheets mentioned above, allowing the formation of a hydrophobic carbon coating.
  • This improvement of the invention also makes it possible to obtain quickly and at particularly low costs, a large number of supports with all the desired spatial arrangements, these supports being able, moreover, to present directly on the one hand all the inscriptions necessary for locating different hydrophilic zones, on the other hand all the useful information, such as dates, nature of the deposited antigen (s), etc.
  • the diameter of the hydrophilic pads is between 2 and 20 mm.
  • the sheet support according to the present inven ⁇ tion can be presented in extremely diverse dimensions. Thus, it can be in the form of small blades, comparable to glass slides, or large sheets susceptible, if necessary, to be cut into subassemblies used separately or even under form of continuous windable ribbon which is particularly suitable for continuous automatic treatment.
  • Other plastics can also be used, including polyvinyl chloride, polyvinyl, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, Cellophane (registered trademark) and derivatives of these polymers.
  • the invention also relates to the application of these supports to immunofluorescence tests, characteristic 1 6 sée in that one sensitizes one or more hydrophilic areas of a support using an antigen or antibody contained in a liquid drop, that the support is washed with a reduced amount of a buffer usual (for example phosphate buffer), that the support is dried, preferably by letting it float in a flow of hot air while maintaining it at one end, that a drop is applied to the said pad (s) of serum or substance to be tested and a drop of fluorescent conjugate with repetition of the above-mentioned washing and drying operations and that the reading or readings are carried out under a UV microscope after having deposited a drop of oil covered with a transparent plastic sheet, which may in particular consist of the same material as the support.
  • a buffer usual for example phosphate buffer
  • a carrier com ⁇ taking a plurality of pads in rows and columns to not drop dispensing devices already known providing means progress On Automatic * e of the supports according to the invention. Automation can also be practically total by providing, between different drop dispensing stations, automatic washing and drying means.
  • the subject of the invention is also the application of these supports to ELISA tests, characterized in that one or more hydrophilic areas of a support are sensitized using an antigen or antibody contained in a liquid drop, that the support is washed with a reduced quantity of a usual buffer (for example phosphate buffer), that the support is dried, preferably by letting it float in a flow of hot air while maintaining it at one end , that a drop of serum or substance to be tested and a drop of a chromogen, preferably of a type which polymerizes while it is colored, is applied to said area, with repeated washing operations and drying above mentioned, after which a colorimetric measurement is made of the said area or areas.
  • a usual buffer for example phosphate buffer
  • the chromogen used is diaminobenzidine when the enzyme used for the conjugate is peroxidase.
  • the entire test can be automated, including reading and colorimetric measurement.
  • the invention also relates to the application of these supports to radioimmununological tests, characterized in that one sensitizes one or more hydrophilic areas using an antigen or antibody contained in a liquid drop, that l '' the support is washed with a reduced quantity of a usual buffer (for example tempon pH 7.2), that the support is dried, that a drop of the antigen to be titrated to which is applied to said area adds a known amount of the same antigen labeled with a radioactive isotope.
  • a measurement of the radioactivity of the said area or areas is carried out. This last operation can be carried out in two different ways: 1) either by perfect contact between the support and a sensitive film (autoradiography), 2) or by cutting each of the tracks and by carrying out a coupling of radioactivity in suitable vials.
  • This antigen titration method is said to be by competition.
  • Figure 1 shows a view of a support according to a first embodiment of the invention.
  • FIG. 2 represents a view of a support according to a second embodiment of the invention.
  • FIG. 3 shows a view of a support according to a third embodiment of the invention.
  • Figure 4 shows a view of a support according to a fourth embodiment of the invention.
  • FIG. 5 shows a view of a continuous support in the form of a ribbon.
  • FIG. 6 represents a view of a set of supports when the test is ready for reading the results under a UV microscope (supports covered with mounting liquid and coverslip).
  • FIG. 7 represents a view of a support adapted to the use of the micrometric displacement of the stage of a microscope.
  • a support according to the invention comprising a sheet of .plastic material 20. tick 1, more specifically made of polyester, having a thickness of 0.1 mm and dimensions of 100 x 150 mm.
  • tick 1 more specifically made of polyester, having a thickness of 0.1 mm and dimensions of 100 x 150 mm.
  • six coated areas, of rectangular shape, have been materialized, numbered 1 to 5 and each provided with ten uncoated circular areas 25 forming the hydrophilic areas, referenced 102 and having a diameter of 6 mm. These ranges are distributed in the form of two columns of five ranges 102.
  • the support also has an inscription 30 ("P. Falciparum") which designates the antigen with which, in the example described, the areas 102 are sensitized once the support produced.
  • the manufacture of the support according to the invention is carried out by preparing a matrix or original made of paper having an appearance identical to that shown and by scrolling the plastic sheets in a machine. to photocopy the usual type of a xerography machine so as to apply the coating appearing in black, coating consisting of the dried ink of the xerographic process.
  • zone 108 has been applied to the sheet 107, leaving areas 109.
  • other indications can be set up for example by xerography.
  • zone 108 first of all, for example using a drop dispenser of the "autodrop" type sold by the company FLOW LABORATORIES, a plurality of drops of glycerol diluted 1/4 in distilled water having a volume of 13 ⁇ l at the step of the desired ranges. Then sprayed on the sheet an aerosol of silicone sulfur. Then the sheet is washed to remove mine the glycerol and, if necessary, apply inscriptions, for example by xerography or by any other process, for example by printing.
  • a film of polyvinyl acetate having a thickness of 0.1 mm enabling a winding of the ribbon to be carried out.
  • the various supports according to the invention can be packaged in sterile form in sachets or other packaging made of paper or plastic. They are suitable for transport by post and can therefore be used for field sampling and sending to the center or laboratory carrying out the tests.
  • An example of the use of these supports will now be described:
  • Plasmodium falciparum antigen A liquid suspension of Plasmodium falciparum antigen is prepared as follows:
  • a support such as that shown in FIG. 3 is used. This support is placed under a dispenser automatic drop of the "autodrop” type which distributes, in the middle of each of the circular hydrophilic areas, a drop of antigen. The sensitization lasts 16 hours at room temperature. Washing is then carried out in phosphate buffer at pH 7.2 for a period of 10 min.
  • drying is carried out, for example by maintaining the support by one of the edges of the sheet inside a current of hot air, for example coming from a fan, the sheet floating freely in the air stream. In less than two minutes, the leaf is dried.
  • Reading can be visual or, if necessary, made automatic by optical analysis means sensitive to the variation in light intensity as a function of the agglutinations carried out.
  • a standard mounting liquid is spread over the different areas, for example using a drop dispenser, or directly over the whole of the area or areas comprising the areas of the support. (glycerin buffered at pH 7.2 for example) and the support is then immediately covered with its mounting liquid with a second transparent sheet of non-carrying polyester. no coating.
  • a strip of mounting liquid is thus formed between the two sheets polyester acetate for easy reading under a microscope.
  • a support 114 represented in FIG. 6 a support 114 provided with eight zones, 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, two rows of five hydrophilic pads 115, each zone having been covered with mounting liquid and then a strip 116 of slightly larger size. These strips are bonded by the mounting liquid which gradually dries.
  • the supports can be fixed on the stage of the microscope to be adapted to the micrometric displacement of the stage, for example as shown in FIG. 7 on which we see a rectangular tangent sheet of small width of material plastic 117 provided with two holes for the passage of the plate screws
  • the invention lends itself to tests by immunofluorescence of practically all antigens, antibodies or other elements capable of being checked by this kind of tests, and in particular indirect indirect fluorescence.
  • the following conditions may be mentioned in particular: toxoplasmosis, rubella, syphilis, trypanosomiasis, amebiasis, malaria, viral diseases, hydatidosis, bilharziasis and other parasitic diseases, aspergillosis and other fungal diseases.
  • the invention is however not limited to immunofluorescence techniques but can also be extended to other testing techniques.
  • the invention can be used for radioimmunoassay tests by replacing the immunoassay marker. fluorescence by a usual radioactive marker.
  • an enzyme-labeled conjugate such as peroxidase, phosphatase, p -galactosidase
  • a single dilution of the serum is sufficient, the reading being carried out by determination with the concentration of reacting antibodies.
  • the invention also applies to indirect or reverse tests with initial sensitization of antibodies on the hydrophilic areas of the support.

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Abstract

Le support se caractérise en ce qu'il comporte une feuille de matière plastique transparente telle que du polyester ou du polyvinyle (101) et un revêtement hydrophobe laissant subsister une pluralité de plages hydrophiles non revêtues (102) destinées à être sensibilisées. Le support est applicable notamment aux tests d'immunofluorescence, aux tests immuno-enzymatiques et aux tests radio-immunologiques.

Description

Nouveau support pour tests biologiques in vitro et applications de ce support.
La présente invention a trait à un nouveau support pour des tests biologiques in vitro, notamment tests d'immuno- fluorescence, tests ELISA, radio-immunodosages, etc... ainsi qu'aux applications de ce support. Le développement des techniques d'immunofluorescen¬ ce a fait largement progresser la sérologie pour la détection d'antigènes ou d'anticorps avec une sensibilité accrue. On utilise actuellement, pour sa mise en oeuvre, des lames de verre recouvertes sur une face par un mince revêtement hydro- phobe, tel que notamment du silicone, laissant apparaître des plages circulaires hydrophiles non revêtues destinées à être sensibilisées, c'est-à-dire à fixer une certaine quanti¬ té d'antigènes, dans le cas de tests pour la détection d'anti¬ corps ou, inversement, fixer des anticorps dans le cas de détection d'antigènes. En raison du nombre croissant de prélèvements à tester, il serait souhaitable de développer l'automatisa¬ tion des différentes étapes de tests. Cependant, les supports en verre actuellement utilisés ne se prêtent pas à l'automati- sation en raison notamment des difficultés de manutention, du long temps de séchage et des difficultés de repérage.
Il en est de même pour les tests immunoenzymati- ques, dits tests ELISA, lesquels utilisent des ensembles de cupules en matière synthétique difficiles à manier, longs à laver et d'un prix de revient très élevé.
La demande de brevet européen 0 018 435 décrit un dispositif de micro-analyse comprenant une plaquette infé¬ rieure rigide de grande épaisseur en matière plastique qui reçoit une substance de test, ainsi qu'une plaque supérieure avec des moyens complexes pour maintenir les deux plaques à distance constante l'une de l'autre. Ce dispositif est com¬ pliqué et ne se prête pas à des tests en série.
La demande de brevet allemand publiée 2 541 031 décrit des plaques en matière plastique de grande épaisseur revêtues d'une couche perforée d'une substance hydrophobè, à savoir du polyfluoréthylène. Un tel dispositif est peu prati¬ que et constitue un simple équivalent des plaques de verre déjà utilisées.
La demande de brevet européen 0 063 810 décrit des dispositifs pour tests et analyses comprenant des feuilles d'une matière poreuse telle que la nitrocellulose poreuse ou d'autres matières plastiques poreuses. La substance de test est absorbée dans la masse poreuse et l'ensemble de la masse poreuse est imprégné d'une protéine neutre par rapport à la substance à tester, telle que l'albumine/ de façon à satu¬ rer les possibilités d'absorption. La réalisation de tels supports est particulièrement complexe et coûteuse et les technologies mettant en oeuvre ces supports sont d'une nature tout à fait différente de celle qui intéresse la présente invention. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un nouveau support pour tests biologiques in vitro qui présente, par rapport aux supports connus, les avantages suivants : - possibilité d'utilisation automatique en con¬ tinu ou en discontinu,
- suppression des opérations de nettoyage et re¬ cyclage des supports,
- gain de temps important, notamment au niveau du montage, du séchage, de la lecture et de la disponibilité immédiate,
- gain de réactifs,
- innocuité,
- transmission à la lumière U,V. supérieure à celle du veçre,
- gain de poids très important,
- diminution du risque d'erreur de repérage,
- stockage et conservation facilités,
- possibilité d'adaptation di ensionnelle, - possibilité de fabrication simple,
- manutention facilitée pour la mise en place des réactifs et produits à tester, comme le lavage, le sé¬ chage, la lecture etc,
- facilité de transport pour l'utilisation sur le terrain.
La présente invention a pour objet un nouveau suppor en matière plastique pour tests biologiques in vitro et notam¬ ment i munologiques, caractérisé en ce qu'il comporte une feuille de matière plastique sensiblement transparente portant sur l'une de ses faces, un revêtement hydrophobe laissant subsister une ou de préférence plusieurs plages hydrophiles non revêtues, de préférence de forme circulaire.
Par matière plastique, dans le sens de la présente invention, on entend une matière synthétique susceptible d'être produite facilement sous forme de feuilles, de rubans ou de nappes et présentant soit spontanément, soit après traitement, un caractère hydrophile permettant les opérations de sensibili¬ sation, c'est-à-dire de mise en place, sur la surface de la feuille, de molécules complexes ou particules, telles qu'an¬ tigènes ou anticorps, ainsi que le recueil et la répartition de milieux liquides tels que par exemple de sérums ou de sang, et ceci sans absorption.
De préférence, les matières plastiques selon l'inven¬ tion sont réalisées en feuilles ou films d'acétate de polyviny- le ou de polyester tels que par exemple les films vendus sous la dénomination 63610 DT2 par la société STAEDTLER, NURNBERG, R.F.A.
Les feuilles selon l'invention peuvent être plus ou moins souples en fonction de leur nature et de l'épaisseur choisie. Elles doivent être relat-ivement souples tout en ayant tendance sensiblement à se maintenir sans s'effondrer lors¬ qu'elles sont tenues par un bord. De préférence, l'épaisseur est comprise entre 0,05 mm et 0,5 mm. Selon l'invention, les films utilisés peuvent avoir subi un traitement anti-thermique et/ou anti-statique tels que, par exemple, les films commercia- lises sous la dénomination 63610 DT2 par la société STAΞDTLER.
Le revêtement hydrophobe peut être par exem¬ ple un revêtement siliconé. Ceci peut être effectué par exemple en disposant des gouttes de glycérol sur la feuille disposée horizontalement aux emplacements des futures zones hydrophiles et en vaporisant un aérosol de siliconé sur l'ensemble de la feuille, l'emplace¬ ment de la goutte restant hydrophile alors que son pourtour devient hydrophobe. Ce procédé peut être automatisé en utilisant, pour le dépôt des gouttes, un distributeur automatique de réactif.
Cependant, conformément à un perfectionnement particulièrement avantageux de l'invention, le revêtement peut être obtenu par un simple procédé de photocopie uti¬ lisant par exemple la xérographie ou des techniques simi¬ laires. Il suffit alors de réaliser un modèle imprimé sur papier ordinaire et d'en faire des photocopies sur les feuilles plastiques sus-mentionnées, permettant la forma- tion d'un revêtement carboné hydrophobe.
Ce perfectionnement de l'invention permet en outre d'obtenir rapidement et à coûts particulièrement bas, un grand nombre de supports avec toutes les disposi¬ tions spatiales souhaitées, ces supports pouvant présenter en outre directement d'une part toutes les inscriptions nécessaires au repérage des différentes zoneshydrophiles, d'autre part toutes les mentions utiles, telles que dates, nature du ou des antigènes déposés, etc.
Le diamètre des plages hydrophiles est, confor- mément' à l'invention, compris en-tre 2 et 20 mm.
Le support en feuilles selon la présente inven¬ tion peut se présenter selon des dimensions extrêmement diverses. Ainsi, il peut se présenter sous forme de lames de petites dimensions, comparables aux lames de verre porte-objets, ou de feuilles de grandes dimensions suscep¬ tibles, le cas échéant, d'être découpées en sous-ensembles utilisés séparément ou encore sous forme de ruban continu enroulable se prêtant particulièrement à un traitement au¬ tomatique en continu. D'autres matières plastiques peuvent également être utilisées parmi lesquelles polychlorure de vinyle, polyvinyle, polystyrène, polyéthylène, polycarbonate, Cellophane (marque déposée) et dérivés de ces polymères.
L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests d' immunofluorescence, caractéri- 1 6 sée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tam- pon phosphate), que l'on sèche le support, de préférence en le laissant flotter dans un flux d'air chaud en le maintenant à une extrémité, que l'on applique sur ladite ou lesdites plages une goutte de sérum ou substance à tester et une goutte de conjugué fluorescent avec répétition des opéra- tions de lavage et séchage susmentionnées et qu'on effec¬ tue la ou les lectures au microscope à U.V. après avoir déposé sur la ou les plages une goutte d'huile recouverte d'une feuille de matière plastique transparente, pouvant être notamment constituée du même matériau que le support. De préférence, on utilisera un support com¬ prenant une pluralité de plages en rangées et colonnes au pas des appareils de distribution de gouttes déjà connus prévoyant des moyens d'avancement automatiqu*e des supports selon l'invention. L'automatisation peut d'ailleurs être pratiquement totale en prévoyant, entre différents postes de distribution de gouttes, des moyens de lavage et de séchage automatiques.
L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests ELISA, caractérisée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tampon phosphate) , que l'on sèche le support, de préférence en le laissant flotter dans un flux d'air chaud en le maintenant à une extrémité, que l'on applique sur ladite plage une goutte de sérum ou substance à tester et une goutte d'un chro¬ mogène, de préférence d'un type se polymérisant pendant qu'il se colore, avec répétition des opérations de lavage et de séchage susmentionnées, après quoi l'on effectue une mesure colorimétrique de la ou desdites plages.
De préférence, le chromogène utilisé est la diami- nobenzidine lorsque l'enzyme utilisée pour le conjugué est la peroxydase.
Dans cette application, on peut automatiser la totalité du test, y compris la lecture et la mesure colo¬ rimétrique.
L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests radioimifiunologiques, caractérisée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophi¬ les à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tempon pH 7,2), que l'on sèche le support, que l'on applique sur ladite plage une goutte de l'antigène à titrer auquel on ajoute une quantité connue du même antigène marqué par un isotope radioactif. Après répétition des opérations de lavage et séchage susmentionnées, on effectue une mesure de radio- activité de la ou desdites plages. Cette dernière opération peut être effectuée de deux manières différentes : 1) soit par contact parfait entre le support et un film sensible (autoradiographie) , 2) soit en découpant chacune des plages et en effectuant un couplage de radioactivité dans des fioles appropriées.
Cette méthode de titrage d'antigène est dite par compétition.
L'application du support aux tests radio-immuno- logiques peut être également étendue aux titrages suivant un procédé analogue à celui de 1'ELISA sus-mentionné. D'autres avantages et caractéristiques de l'inven¬ tion apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif et se référant au des¬ sin annexé dans lequel : La figure 1 représente une vue d'un support selon une première forme de réalisation de l'invention.
La figure 2 représente une vue d'un support selon une deuxième forme de réalisation de l'invention. 5 La figure 3 représente une vue d'un support selon une troisième forme de réalisation de l'invention.
La figure 4 représente une vue d'un support selon une quatrième forme de réalisation de l'invention.
La figure 5 représente une vue d'un support con- 10 tinu sous forme de ruban.
La figure 6 représente une vue d'un ensemble de supports lorsque le test est prêt pour la lecture des ré¬ sultats au microscope U.V. (supports recouverts de liquide de montage et de lamelle couvre-objet). 15 La figure 7 représente une vue d'un support adapté à l'utilisation du déplacement micrométrique de la platine d'un microscope.
En se référant -à la figure 1 , on voit un support selon l'invention comportant une feuille de matière .plas- 20. tique 1, plus précisément en polyester, ayant une épais¬ seur de 0,1 mm et des dimensions de 100 x 150 mm. Sur cette feuille transparente 1 , on a matérialisé six zones revêtues, de forme rectangulaire,, numérotées 1 à 5 et pourvues chacune de dix plages circulaires non revêtues 25 formant les plages hydrophiles, référencées 102 et ayant un diamètre 6 mm. Ces plages sont réparties sous forme de deux colonnes de cinq plages 102.
En dehors desdites zones de revêtement, de réfé¬ rences 1 à 6, le support présente encore une inscription 30 ("P. Falciparum") qui désigne l'antigène avec lequel, dans l'exemple décrit, on sensibilise les plages 102 une fois le support réalisé. La fabrication du support selon l'in¬ vention s'effectue en préparant une matrice ou original en papier ayant un aspect identique à celui représenté et en 35 faisant défiler les feuilles de plastique dans une machine à photocopier usuelle du type d'une machine de xérographie de façon à appliquer le revêtement apparaissant en noir, revêtement constitué par l'encre séchée du procédé xérographique. On comprend que l'on peut fabriquer à très bas prix de revient un grand nombre de supports et ceci sous toutes les formes voulues et à la demande.
En se référant à la figure 2, on voit un support présentant, sur une feuille rectangulaire 103 de même na- ture que la feuille 101, deux zones de chaque fois quaran¬ te plages 104 disposées en huit rangées de cinq plages référencées 1 à 8 et 9 à 1b. Le pas des plages 104 est adapté au pas d'un distributeur automatique de goutte¬ lettes. Sur la figure 3» on a représenté un autre sup¬ port comprenant une feuille 105 avec une zone unique de revêtement de quatre-vingt-seize plages 106 disposées sur une matrice rectangulaire de huit lignes et douze colonnes référencées a à h et 1 à 12. Un tel support est particulièrement intéressant pour effectuer un balayage en immuno luorescen'ce après un clonage de cellule productrice d'anticorps monoclonaux. On se référé maintenant à la figure 4. On voit un support présentant la même conforma- tion que le support de la figure 3 mais dans lequel on a appliqué sur la feuille 107 une zone 108 siliconée laissant des plages 109. Des repères ou d'autres ' indica¬ tions peuvent être mis en place par exemple par xérogra¬ phie. Pour réaliser la zone 108, on dispose tout d'abord, par exemple à l'aide d'un distributeur de gouttes du genre "autodrop" vendu par la société FLOW LABORATORIES, une pluralité de gouttes de glycerol diluées au 1/4 dans de l'eau distillée ayant un volume de 13 μl au pas des plages souhaitées. On pulvérise ensuite sur la feuille un aérosol de soufre siliconé. Ensuite on lave la feuille pour éli- miner le glycerol et, le cas échéant, on applique des ins¬ criptions, par exemple par xérographie ou par tout autre procédé, par exemple par impression.
Bien entendu, différentes autres techniques d'application de revêtements sont possibles. Ainsi, le revêtement par xérographie peut être remplacé par d'autres types de revêtement soit utilisant des principes simi¬ laires " mais avec des encres spéciales, soit encore par imprimerie ou sérigraphie. Une fois réalisés les supports tels que ceux qui ont été décrits, on sensibilise les plages hydrophiles telles que 102, 104, 106 et 109-
En se référant à la figure 5, on voit un support se présentant sous forme d'un ruban de polyester ou de polyvinyle ayant une épaisseur de 0,1 mm sur lequel on a appliqué, par sérigraphie ou de toute autre manière, un certain nombre de zones 111 laissant des plages hydrophi¬ les 112. Des lignes graphiques de séparation 113 peuvent être prévues éventuellement. Différentes inscriptions peuvent bien entendu être portées. Pour réaliser un tel support, on utilise de préférence un film d'acétate de po¬ lyvinyle ayant -une épaisseur de 0,1 mm permettant de réa¬ liser un enroulement du ruban.
Les différents supports selon l'invention peuvent être conditionnés sous forme stérile dans des sachets ou autres emballages en papier ou en matière plas¬ tique. Ils se prêtent au transport par la poste et peuvent donc être utilisés pour le prélèvement sur le terrain et l'envoi au centre ou laboratoire pratiquant les tests. Un exemple d'utilisation de ces supports va maintenant être décrit :
On prépare une suspension liquide d'antigène de Plasmodium falciparum de la façon suivante :
On utilise un support tel que celui représenté sur la figure 3. Ce support est placé sous un distributeur automatique de gouttes du type "autodrop" qui distribue, au milieu de chacune des plages hydrophiles circulaires, une goutte d'antigène. La sensibilisation dure 16 heures à température ambiante. On effectue ensuite un lavage dans du tampon phosphate à pH 7,2 pendant une durée de 10 mn.
Après ce lavage, on réalise le séchage, par exemple en maintenant le support par l'un des bords de la feuille à l'intérieur d'un courant d'air chaud, par exemple en provenance d'un ventilateur, la feuille flottant librement dans le courant d'air. En moins de deux minutes, la feuille est sécnée.
Un prélèvement sanguin d'une personne suspectée d'être parasitée est effectué et ce prélèvement subit les dilutions suivantes : 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320. On applique une goutte de chacune des dilutions sur les différentes plages. On laisse incuber pendant une durée de 30 mn à l'étuve à 37°C. On répète les opérations de lavage et de séchage sus-mentionnées. On applique une goutte de conjugué fluorescent an i-iramunoglobulines hu- • aines, préalablerient porté à sa dilution optimale d'emploi. On répète les opérations d'incubation, de lavage et de séchage sus-.mentionnées.
La lecture peut être visuelle ou, le cas échéant, rendue automatique par des moyens d'analyse op¬ tique sensibles à la variation d'intensité lumineuse en fonction des agglutinations réalisées.
Pour une lecture au microscope, on étend sur les différentes plages, par exemple à l'aide d'un distributeur de gouttes, ou bien directement sur l'ensemble -de la ou des zones comprenant les plages du support, un liquide de montage usuel (glycérine tamponnée à pH 7,2 par exemple) et on recouvre ensuite immédiatement le support avec son liquide de montage d'une seconde feuille transparente de polyester ne portant . aucun revêtement. Il se forme ainsi une lamelle de liquide de montage entre les deux feuilles d'acétate de polyester permettant la lecture aisée au microscope. On a. représenté sur la figure 6 un support 114 muni de huit zones, 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, de deux rangées de cinq plages hydrophiles 115, chaque zone ayant été recouverte de liquide de montage puis d'une lamelle 116 de taille légèrement supérieure. Ces lamelles se trouvent collées par le liquide de montage qui sèche progressivement. La lecture au microscope peut s'effectuer de façon usuelle. Le cas échéant, les supports peuvent être fixés sur la platine du microscope pour être adaptés au déplace¬ ment micrométrique de la platine, par exemple comme repré¬ senté sur la figure 7 sur laquelle on voit une feuille rec¬ tangulaire de faible largeur de matière plastique 117 munie de deux trous pour le passage des vis de la platine
118. Grâce à une feuille de matériau auto-adhésif usuel
119, on peut solidariser un support 120 selon l'invention (dont on ne voit qu'une partie dépourvue de revêtement), cette feuille pouvant ensuite être facilement séparée par enlèvement de la bande adhésive 119.
L'invention se prête aux tests par immunofluores- cence de pratiquement tous les antigènes, anticorps ou autres éléments susceptibles d'être contrôlés par ce genre de tests et notamment 1 ' im unofluorescence indirecte. Parmi ces applications, on peut citer notamment les affections suivantes : toxoplasmose, rubéole, syphilis, trypanosomoses, amibiase, paludisme, maladies virales, hydatidose, bilharzioses et autres maladies parasitaires, aspergilloses et autres maladies fongiques. L'invention n'est cependant pas limitée aux techniques d' immunofluorescence mais peut également s'é¬ tendre à d'autres techniques de tests. Ainsi, à titre d'exemple, l'invention peut être utilisée pour des tests de radio-immunodosage en remplaçant le marqueur d'immuno- fluorescence par un marqueur radio-actif usuel. Une fois que la substance à tester est placée, aux dilutions conve¬ nables, sur les plages hydrophiles, il suffit d'appliquer étroitement, contre la feuille constituant le support, un film sensible. Le film sensible étant ainsi mis en contact parfait avec le support, on obtient alors un film impressionné fournissant immédiatement le résultat du test sans être obligé d'utiliser le lourd appareillage de comptage de radio-activité actuel, du fait que, grâce au contact immédiat du film, on élimine la zone de flou latéral due à l'émission du rayonnement. .ans un dosage parfaitement quantitatif, on découpe chacune des plages hydrophiles et on effectue un couplage en les éluant dans un liquide de comptage approprié. Dans le cas d'une application aux tests du type
ELISA, on utilise un conjugué marqué par une enzyme (telle que peroxydase, phosphatase, p -galactosidase) et une seule dilution du sérum est suffisante, la lecture s'effectuant par détermination avec la concentration en anticorps réa- gissants.
On a constaté que l'on peut utiliser les suports selon l'invention en mettant en oeuvre un chromogène qui polymέrise sur la plage du support au fur et à mesure qu'il se colore par oxydation (par exemple diamino- benzidine en tampon Tris HC1 + eau oxygénée). Par exemple dans le cas d'un sérum réagissant avec un antigène Kyste hydatiq e, on obtient une coloration brune sur la plage hydrophile du support.
Bien entendu, l'invention s'applique également aux tests indirects ou inverses avec sensibilisation ini¬ tiale d'anticorps sur les plages hydrophiles du support.
Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien en¬ tendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications de forme ou de matériau sans pour cela s'éloigner ni de son cadre, ni de son esprit.

Claims

REVENDICATIONS 1. Nouveau support en matière plastique pour tests biologiques in vitro et notamment tests immunologiques, carac¬ térisé en ce qu'il comporte une feuille souple de matière plastique (101, 103, 105, 107, 110, 114), sensiblement transpa¬ rente, portant, sur l'une de ses faces, un revêtement hydro¬ phobe laissant subsister au moins une plage hydrophile non revêtue, notamment de forme circulaire (102, 104, 106, 109, 112). 2. Support selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est réalisé en polyester ou en acétate de polyviny¬ le.
3. Support selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit revêtement hydrophobe est un revêtement siliconé.
4. Support* selon la revendication 3. caractérisé en ce que le revêtement est obtenu en disposant sur la feuille des gouttes de glycerol et en vaporisant un aéro¬ sol de siliconé sur l'ensemble de la feuille, l'emplace- ment de la goutte restant hydrophile alors que son pour¬ tour devient hydrophobe.
5. Support selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le revêtement est obtenu par une technique de copie ou d'impression. δ. Support selon la revendication 5, caractérisé en ce que le revêtement est un revêtement obtenu par un procédé de xérographie.
7. Support selon l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des inscriptions et/ou repérages.
8. Support selon l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 7, caractérisé en ce que le diamètre des plages hydrophiles est compris entre 2 et 20 mm.
9. Support selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs ensembles séparés de plusieurs revêtementsdéli¬ mitant plusieurs ensembles de plages, éventuellement sus¬ ceptibles d'être découpées pour former des supports indi¬ viduels. 10. Support selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un ruban enroulable.
11. Application d'un support selon l'une quelcon¬ que des revendications 1 à 10 aux tests d'immunofluorescence, caractérisée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs pla- ges hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anti¬ corps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel, que l'on sèche le support, qu'on applique sur ladite ou les- dites plages une goutte de sérum ou substance à tester puis après lavage et séchage une goutte de conjugué fluorescent avec répétition des opérations de lavage et séchage sus-mentionnées et qu'on effectue la ou les lec¬ tures au microscope à U.V. après avoir déposé sur la ou les plages une goutte de liquide de montage recouverte d'une feuille de matière plastique transparente (116).
12. Application selon la revendication 11, carac¬ térisée en ce que, pour le déplacement sur le microscope, on relie le support (120) à une feuille de matière plastique (117) munie de trous pour le passage des vis de la platine de microscope par le moyen d'une feuille de matériau auto¬ adhésif (119) .
13. Application du support selon1 'une quelconque des revendications 1 à 10, aux tests ELISA, caractérisée en ce que l'on utilise une ou plusieurs plages hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel, que l'on sèche le support, que l'on applique sur ladite plage ou lesdites plages une goutte de sérum ou substance à tester, puis une !
17 goutte d'un chromogene avec répétition des opérations de lavage .et de séchage susmentionnées, après quoi on effec¬ tue une mesure colorimétrique de la ou desdites plages.
14. Application selon la revendication 13, ca- 5 ractérisée en ce que l'on utilise un chromogène d'un type se polymérisant pendant qu'il se colore.
15. Application selon la revendication 14, ca¬ ractérisée en ce qu'on utilise comme chromogène la diamino- benzidine.
10 16. Application du support selon l'une quelcon¬ que des revendications 1 à 10 aux tests radio-immuno- logiques, destinés au titrage d'anticorps ou d'antigènes, caractérisée* an ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophiles à l'aide d'un antigène ou d'un anti-
15 corps dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel, qu'après lavage et séchage, on fait agir le sérum à étudier ou un antigène préalablement dilué puis, après incubation,
* séchage et lavage, un conjugué radio-marqué et, que l'on
2o révèle la réaction en mettant en contact parfait le support et un film sensible.
17. Application selon l'une quelconque des re¬ vendications 11 à 16, caractérisée en ce que l'on procède aux opérations de séchage du support en le maintenant aux
25 extrémités pour le faire flotter dans un flux d'air chaud.
18. Application selon l'une quelconque des re¬ vendications 11 à 17, caractérisée en ce que l'on utilise des supports ayan -des plages au pas de dispositifs de distribution automatique de gouttes.
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