WO1986001691A1 - Method for killing cells, and cell-killing agent - Google Patents
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Description
明 細 書
殺細胞方法及び殺細胞剤 技術分野
本発明は光半導体に生起する電圧を利用した各種細胞の殺 細胞方法に閩する。 背景技術
一般に、 細菌類、 微細藻類、 血球、 動植物細胞等の各種細 胞を死滅させるために、 殺菌剤の適用、 加熱等が行われてい た。
しかし、 食品、 医薬品、 各種動植物等の処理においては、 これらの方法は材料の変性や副作用等の不都合な効果を生じ させる場合が多々.あった。 特に飲料水等の殺菌や農作物の成 長を阻害する藻類の殺藻及び腫瘍細胞の殺細胞等においては 有効な方法が無く 、 簡易で著効を有する殺細胞方法が強く要 求されている。 本発明者は特願昭 58— 221388号において、 細 胞に所定電圧を印加することにより選択的に細胞活性を制御 する方法を提案した。 この方法においては、 サイ ク リ ックボ ルタメ ト リ、 微分ボ一ラログラフ、 位相弁別交流ボーラログ ラフ等々の手法に準じて細胞に走査電位を印加し、 生起電流 値を測定して得る。 細胞に固有の電流-電位曲線の極値又は 微分電流値の極値を与える電位値 （ピーク電位値） の近傍の 電位を外から印加することにより呼吸活性等の細胞活性が選 択的且つ効果的に抑制制御され得、 且つ特に殺菌的又は制菌
的制御も又可能となる。 この原理を応用し、 T i 02等の光半導 体に P t 等の導体を担持し、 この粒子が発生する光起電力を 利用して前記ビーク電位を各種細胞に直接印加することによ り殺細胞する方法が提案されている。 これらの殺細胞法はい ずれも導体を担持した光半導体を使用している。 しかしなが ら、 このような導体担持光半導体を使用する殺細胞方法は十 分に満足できるものではない。 例えば、 導体として白金以外 の金属が使用されている場合、 これらの金属は使用中に殺菌 対象材料中に溶出しやすく、 従って飮用水の殺菌等のために は使用することができない。 他方、 導体として白金が使用さ れる場合、 これが非常に高価な金属であるため、 殺細胞のコ ス トが高いものとなる。 従って、 殺細胞処理される材料に金 属を与えず、 柢廉 実^し得る殺細胞方法が希求されている , 発明の開示
従ってこの発明は、 生細胞を有する材料と導体非担持光半 導体材又はこれを含有する殺細胞剤とを接触せしめ、 該導体 非担持光半導体に光を照射することによつて該生細胞を殺す ことを特徵とする殺細胞方法を提供する。 導体非担持光半導 体材に光が照射された場合、 該半導体に電圧が生じ、 これが 細胞に印加されて細胞の殺滅が行われる。
この発明はさ.らに、 導体非担持光半導体材を含んで成る殺 細胞剤に関する。 この殺細胞剤は、 導体非担持光半導体を舍 有する粉末型、 軟育のごとき湿潤型、 不溶性担体に該光半導 体が固定化されている固形物型等の形態をとることができる
図面の簡単な説明
第 1図は、 例 2 においてパン酵母 （ . cerevisiae) の細 胞を用いて得られた、 生細胞数と照射時間との関係を示すグ ラフである。
第 2図は、 例 4において使用したこの発明の固形物型殺細 胞剤を用いる滅菌装置の模式断面図である。
第 3図は、 例 4において大腸菌 （J_. coll) の細胞を用い て得られた生細胞数と光照射時間との関係を示すグラフであ る。
第 4図は、 第 3図と同様の生細胞数と光照射時間との関係 を示すグラフである。 第 3図と第 4図では、 固形物型殺細胞 剤の量及び処理される液体の流速が異る。 . . 発明を実施するための好ま しい形態
(殺される細胞の種類）
本発明の方法及び殺細胞剤によれば、 細菌類， 放線菌類， カビ類， 微細藻類， 酵母類等の各種微生物， 赤血球， 白血球: 腫瘍細胞， 培養細胞等の動物細胞 ； 植物細胞等の各種の細胞 を殺すことができる。
(導体非担持光半導体材）
半導体材は、 全てデンバー効果を有するが、 光起電力は、 電子-正孔移動度比の対数に比例し、 これが 1 のときには光 起電力は "零 " となる。 したがって実際の使用においては電 子一正孔移勣度比の比較的大きな Ti02 , Ru02 , Cs3Sb, InAs, InSb及び GaAs等が適応半導体材として挙げられる。
(殺細胞法の態様）
処理される材料が飲料水、 海水等のごとき比較的光を透過 しゃすい液体である場合には、 これに上記の半導体材を直接 導入し、 これに光を照射することにより、 その材料中に含ま れる細胞、 例えば微生物を殺菌することができる。 光照射は 液体の外から行う こともでき、 又は光原を液体に投入して行 う こともできる。 野外において殺藻等のために使用する場合 は太陽光線が利用されるため人工光源を用いる必要はない。 殺細胞処理の後、 濾過、 遠心分離等の常法に従って半導体材 を除去することにより処理された生成物を得ることができる また、 こう して回収された半導体材は反復して使用すること ができる。
' 皮虜等の表面上に存在する微生物を殺菌するためには、 こ -れらの被処理物にこの発明の殺細胞剤を付着し、 これを照射 することにより殺菌を行う ことができる。 この場合、 前記の 殺細胞剤としては、 粉末剤、 ゲル剤、 ゾル剤、 軟青剤等の種 々の製剤を用いることができる。 粉末剤は、 導体非担持光半 導体材粒子を例えばタルク、 ステアリ ン酸亜鉛、 毅粉等と配 合することによって製造することができる。 軟資剤は、 導体 非担持光半導体材粒子と軟青基剤、 例えばヮセ リ ン、 バラフ ィ ン、 植物油、 殺粉糊等とを常法に従って混合することによ り製造するこ とができる。 また、 特に T i O zの超微粒子は透明 のためゾル钛殺細胞剤として好適に使用され得る。
さ らに、 この発明の殺細胞方法においては導体非担持光半 導体材が固定化されている固形物型の殺細胞剤を使用するこ
ともできる。 この方法の好ましい態様においては第 2図に示 すように固形物型殺細胞剤をカ ラムに充塡し、 これに処理す べき液体を連続的に流す。 これにより光半導体材を舍有しな い殺菌された液体を連続的に得ることができ、 この方法はき わめて実用的な方法である。 第 2図中、 ガラス管 1 内には、 光半導体微粒子を'担持した固形物型殺細胞剤 2が配置され、 同部分には外部からガラス眚壁を介して光照射される。 ガラ ス管 (1)の両端は貯液槽 )に連なり、 装置全体として循環系を なす。 被処理水はポ ンプ (4)によ って管内を循環し、 固形物殺 細胞剤 (2)を通過する際光半導体微粒子により滅菌処理される , 図示例は装置本体部分に透明ガラス材を用いた例であるが 同部分に光非透過性材料、 例えば、 プラ スチ ッ ク材、 セメ ン ト材、 金属材等々を使用する場合には装置内に光源を内装す' る。 光源と しては キセノ ンラ ンプ、 メ タルハラ イ ドラ ンプ 蛍光灯等が好適に使用され得るが、 光ファイバ一を用いて、 太 I 光等の外部光源より光線を装置内に導入するこ とも可能 である。 この固形物型殺細胞剤の固体担体としては、 例えば ニ ト ロセルロ ース， ガラ ス， ポリ塩化ビュル， プラスチ ッ ク： ナイ ロ ン， メタク リ ル樹脂， ポ リ プロ ピレ ン等を使用するこ とができ、 この担体の大きさ及び形状は使用する装置、 処理 される材料の種類、 物性等により適宜選択するこ とができ る その形状としては、 例えばフ ィ ルム状、 ビーズ状、 ボー f 状 繊維状等が考えられる。
(照射光源）
殺細胞のための光源としては自然光 （太陽光） を使用する
こともでき、 又人工光源を使用することもできる。 人工光源 としては、 例えば白熱灯， 蛍光灯， 陽光ランプ， キセノ ンラ ンブ， メ タルハライ ドラ ンプ等を使用するこ とができ る。 次に、 例により この発明の殺細胞方法及び殺細胞剤の殺細 胞効果及び実際的な使用例を具体的に説明する。
M L
導体非担持光半導体微粒子として Ti02粉末 （日本ァェロジ ル社 P-25) を用いた。 1 2時間培養した大腸菌 （ . coH.) の培養液を 2. 5 1 0 5 細胞ノ ιη £ まで希釈して、 この菌体 懸濁液 4 m£ に導体非担持光半導体微粒子 3. 2 m gを加え、 400W陽光ラ ンプまたは 300Wキセノ ンラ ンプ （光強度 1000 Ε/m2 · sec)で光照射した.。 生菌数はコ ロニー計数法で測定 した さらに、 比較のため、 上記と同様にして調製した菌体 懸濁液に導体非担持光半導体微粒子を加えずに光照射したと き、 及び導体非担持光半導体微粒子を加え光照射を行わなか つたときの生菌数を測定した。 さらに透折膜を用いて導体非 担持光半導体微粒子と菌体が直接接触できない状態にしたと " きの殺菌効果を調べた。
その結果、 導体非担持光半導体微粒子存在下で光照射する と、 大腸菌細胞は 4 0分で 5 0 9 0分で 100%殺菌され た。 一方、 その他の場合には殺菌効果は認められなかった。 透折膜を用いて導体非担持光半導体と菌体とを隔離した場合 殺菌効果が得られなかったので、 殺菌効果は光触媒反応によ り発生した物質の影響によるものではないことがわかった。 また、 導体非担持光半導体の存在下で 9 0分間光照射した後
菌体を顕微鏡観察したところ、 菌体の凝集や細胞膜の破壌は 観察されず、 菌体内の CoAの減少が認められたので、 導体非 担持光半導体微粒子と菌体の電子移動反応により殺菌が行わ れたことが示唆された。 以上のように導体非担持光半導体微 粒子を用いると電極系と同じ機構で殺菌が行われることが示 された。
M 2,
導体非担持光半導体としてアナターゼ型 Ti02粉末 （日本ァ エ ロ ジル P — 25) を用いた。 パン酵母 （_§_, cerevisiae) を 1 2時間好気的に培養し集菌後、 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 （pH
7. 0 ) に懸濁させ、 へマサイ トメ ーターを用いて菌潘度を一 定に調製.した。 こ の細胞懸濁液に、 Ti02粉末を 1 04 細胞/ nig濃度で加; ίて光照射し、 3 0分間隔で' 120分間生菌数を測 定した。 また、 . Ti()2粉末を 1 0 4 細胞/ nig濃度及び 1 03 細 胞 /mg濃度で加えて 9 0分間光照射して生菌数を測定した。 光照射は 400W陽光ラ ンプ （光強度 1400 E/m2sec)または
300Wキセノ ンラ ンプ （光強度 1000 E/m2sec)を用いた。 生 菌数はコ ロニー計数法を用いて測定した。 その結果、 Ti02粉 末の濃度 1 0 4 細胞/ mgにおいて、 第 1図に示すように、 6 0分で約 5 0 %、 9 0分で約 9 0 %の細胞が死滅した。 ま た、 光照射時間 9 0分で、 Ti02粉未の濃度が 1 03 細胞 Zmg のとき約 5 0 %、 1 0 4 細胞 /mgのとき約 9 0 %の細胞が死 滅した。
さらに、 細胞の呼吸活性を酸素電極の電流'减少値から測定 し、 また、 細胞内 CoAをホスホ ト ランスァセチラーゼによる
酵素分折法を用いて測定した。 その結果、 光照射時間の増加 につれて呼吸活性の阻害が見られ、 また細胞内 CoAも呼吸活 性と同様に減少していた。
また、 光照射後の細胞について電子顕微鏡を用いて形態を 観察したところ細胞壁構造の変化が見られ、 また菌濃度が高 いときは細胞が凝集することが明らかになつた。
つぎに Ti02粉末を透折膜で覆い Ti02粉末と細胞が直接接触 できない状態にしたときの生細胞数を測定した結果、 生細胞 数の減少は見られなかった。
他方 CoA溶液 （O.lmM) 4 0 m £ に T i 02粉末を 0.01 g懸濁 させ、 この懸濁液に陽光ラ ンプ （1400 E/m2sec)を用いて 9 0分間光照射したところ CoA量は O.iUmMに減少した。 .ま た、 光照射後の溶液について薄層クロマ トグラフィ一を用.い て生成物について検討したところ、 CoAの酸化生成物は CoA のダイ マーであることが示唆された。
以上の結果より、 導体非担持光半導体による酵母の殺菌機 構は、 電極による酵母の殺菌機構と同様に細胞内 CoA が Ti02 粉末表面上で酸化され、 この酸化生成物による阻害と CoAの 反応に伴う細胞壁構造の変化によると推察される。
m ^
導体非担持光半導体微粒子として Ti02粉末 （日本エア ロ ジ ル社 P-25) を用いた。 殺細胞対象としては緑藻クロ レラ . ブ ルガリス (Chlorella vulgaris) , 及び藍藻シネココ ッカス属 (Synechococcus sp. ) を用いた。 ク ロ レラ ' ブスレガ リ スの培 養液 5 m ( 1 07 細胞 ) に Π02粉末 5 mgを加えて、
400W陽光ラ ンプまたは 300Wキセノ ンラ ンプ （光強度 1000 E/m2sec)で光照射した後、 これをメ ンブラ ンフ ィ ルター上 に吸着固定化し、 酸素電極に装着し、 その光合成能を光照射 下の酸素発生により測定した。 そして、 呼吸活性を暗条件下 でグルコースを加えたときの酸素吸収により測定した。 2時 間光照射した後、 藻体の光合成活性、 呼吸活性のいずれも低 下が観察された。
—方、 導体非担持光半導体微粒子を加えない場合や光照射 を行わない場合は光合成活性、 呼吸活性の低下は見られなか つた。
次に、 各種濃度のク コ レラ . ブルガリスの懸濁液に Ti02粉 末を加えて 2時間光照射した後、 藻体を顕微鏡観察した。 藻 体濃度が 1 07 細胞/ のときは Ti02粉末の周囲にクロレラ . ブルガリ スの細胞が付着し塊状となつていることが観察され た。 藻体濃度が 1 0 5 細胞/ m 、 1 03 細胞 /m のときは凝 集は認められなかった。 また、 いずれの場合も細胞壁の破壊 は観察されなかった。
さらに、 ク ロ レラ . ブルガ リ スの培養液を種々の濃度に希 釈して藻体懸濁液を調製し、 Ti02粉末を加えて光照射した後. コ ロニー計数法により生菌数を測定した。 すなわち、 1 0 3 細胞/ 〜 1 0 5 細胞 /n^ の藻体濃度で藻体数に対する Ti02 粉末の量を変えて 2時間光照射した後の生菌数の測定をした ところ、 コ ロニー数減少率は 2. 1 1 0 4 細胞 Zmg半導体で は 3 3 %、 2. 1 1 03 細胞 Zing半導体では 4 0 %であった このよ う に、 殺藻効果は藻体濃度や導体非担持光半導体微粒
子当りの藻体数に依存した。 シネココ ，ンカス属についても同 様の結果が得られた。
以上の結果から、 導体非担持光半導体微粒子の光触媒反応 により殺藻が可能であることが示唆された。 なお導体非担持 光半導体微粒子のク ロ レラ . ブルガリ スに対する殺藻効果が 細菌や酵母に対するそれに比べて低いのは、 細胞壁が厚く、 これに藻,体が保護されているためと考えられる。
M L
0. 1 gのニ ト ロセルロースを 3 m のアセ ト ンに溶解し、 表面積 1 4 erf の半乾燥膜を調製し、 これに 4 0 mgの Ti02微粒 子 （日本エア口ジル社 P-25) を付着させ、 これを乾燥して Π02固定膜を調製した。 この固定膜をスパイ ラル状に巻き、 第 2図に示す殺菌装置の力'ラムに挿入した。
大腸菌 (E.coli) の培養液を菌濃度 1. 0 1 0 3 細胞 £ とした菌体懸濁液 5 0 & を、 Ti02固定膜 4枚（Ti0z160 mg) を揷入した上記装置を用い滅菌した。 流速は
/hと し、 光源としてキセノ ンラ ンプ （光強度 1. 2 x 1 0 4 β E/m2 sec)を用いた。 その結果 180分で 1 0 %、 300分で 3 0 %の 殺菌が観察された。 結果は第 3図に要約して示す。 図中、 縦 軸は 1 m 当りの生菌数、 横軸は光照射時間である。
次に、 Ti02 固定膜を 8枚（Ti02320mg) に増量し、 流速を 150πι£ /1ιとし、 その他同一条件で実験を行なった。 その結 果殺菌率は 6 0分で 7 0 %、 180分で 9 0 %に向上した。 さ らに TiOz固定膜を 1 2枚（Ti02480mg) に増量すると、 6 0分 で 9 5 %、 300分で 100%の殺菌が可能であった。 結果は第
4図に要約して示す。 図中、 縦軸は l ini 当りの生菌数、 横 軸は光照射時間である。 上記いずれの場合も、 Ti02固定膜を 使用しない対照実験では、 生菌数の減少は認められなかった, 以上明らかな通り、 この発明によれば、 処理された生成物 に不所望の影響を残すことなく安価に殺細胞を行う ことがで きる。
Claims
1. 生細胞を有する材料と導体非担持光半導体材又はこれ を舍有する殺細胞剤とを接触せしめ、 該導体非担持光半導体 材に光を照射することによって該生細胞を殺すことを特徴と する殺細胞方法。
2. 前記生細胞を有する材料が生細胞を舍有する水性液で あり、 そして前記導体非担持光半導体材と該水性液との接触 を、 該水性液中に該導体非担持光半導体材を懸濁せしめるこ とにより行う請求の範囲第 1項に記載の方法。
3. 殺細胞処理の後、 前記導体非担持光半導体材を前記水 性液から除去する段階をさらに舍む請求の範囲第 2項に記載 の方法。
4. 前記生細胞を有する材料が生細胞を含有する水性液で あり、 前記殺細胞剤が導体非担持光半導体をその上に固定し た固形物型殺細胞剤であり、 そして該固形物型殺細胞剤と該
'水性液との接触を該固形物型殺細胞剤を充填したカ ラムに該 水性液を流過せしめることによつて行う請求の範囲第 1項に 記載の方法。
5. 前記導体非担持光半導体材が Ti02、 Ru02. Cs3Sb 、 InAs、 InSb及び GAAsから成る群から選ばれる請求の範囲第 1 項記載の方法。
6. 導体非担持光半導体材を含んで成る殺細胞剤。
' 7. 前記導体非担持光半導体材を固体担体に固定して成る 請求の範囲第 6項記載の殺細胞剤。
8. 前記導体非担持光半導体材が Ti02、 RuOz. Cs2Sb 、
InAs、 InSb及び GAAsから成る群から選ばれる請求の範囲第 6 項記載の殺細胞剤。
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