UA82583C2 - Біосумісний гідрогель медичного призначення та спосіб його одержання - Google Patents

Abstract

Об'єктом винаходу є біосумісний гідрогель медичного призначення та спосіб його отримання. Гідрогель являє собою зшитий співполімер на основі гідрофільного мономеру, гідрофобного мономеру і ненасиченої кислоти, який також містить лікарський препарат і культуральне середовище з біологічними мікрооб’єктами, насамперед стовбуровими клітинами. Призначений гідрогель для створення покриттів для загоєння опіків та інших уражень шкіри.

Description

якості ефективного тимчасового штучного замін- Таким чином, розробленому нами гідрогелю, ника шкіри при лікуванні опіків, особливо великих отриманому заявленим способом, надаються такі за площею (понад 7095) та глибоких, що зачіпають корисні для загоєння уражень шкіри експлуатаційні підшкірні тканини, а також інших уражень шкіри. властивості, як механічна міцність, еластичність,

Як відомо, раневі покриття у вигляді гелів во- прозорість, висока поглинаюча здатність стосовно лодіють рядом переваг: прозорість, щільний кон- раневого ексудату. Завдяки застосуванню техно- такт із раною, висока поглинаюча здатність стосо- логії культивування на поверхні гідрогелю мезен- вно раневого ексудату, можливість аерації й хімальних стовбурових клітин та/або диференці- переміщення продуктів метаболізму, безболісність йованих клітин шкіри гідрогель набуває видалення. Однак, наявні гідрогелеві покриття властивостей "еквіваленту шкіри". часто малоефективні через низьку механічну міц- Відоме застосування широкого кола полімерів ність, схильність до пересихання, недостатню сор- для культивування мікроорганізмів і клітин ссавців бційну здатність (Парамонов БА., Порембский (як іп міїо, так і іп мімо). При цьому використову-

Я.О. Яблонский В.Г. Опіки.-Санкт-Петербург, ються природні й синтетичні полімери, як гідрофо-

Спецлиг, 2000.-488 с.|. бні, так і гідрофільні. Застосування кожного з пе-

Винахід відноситься до способу одержання рерахованих класів полімерів володіє рядом зшитого кополімерного гідрогелю на основі акри- переваг та недоліків. Однак, дотепер не створено лових мономерів, що володіє комплексом власти- універсального матеріалу, придатного для викори- востей, які створюють оптимальні умови для куль- стання на всіх фазах загоєння ран опіків різної тивування на його поверхні та в об'ємі клітин, у глибини. тому числі мезенхімальних стовбурових, і призна- Так, у (патенті О5 3949073| описане застосу- ченого для використання в медицині, насамперед, вання природного біодеградуємого полімеру - роз- для одержання противоопікових покрить. По фун- чинного колагену, що зараз досить широко вико- кціональному призначенню зазначений гідрогель ристовується в якості природного покриття при відноситься до захисних покрить, по стійкості - до лікуванні опікових ран. У зазначеній роботі спочат- біоінертних або недеградуючих синтетичних мате- ку в організм за допомогою ін'єкції вводився сам ріалів, по механізму дії - до сорбуючих покрить, що полімер, а потім його заселяли клітинною популя- запобігають випаровуванню ексудату. Завдяки цією. розробці способу одержання зазначеного гідроге- Відомі випадки використання культур клітин, лю будуть поліпшені захисні, сорбційні, лікувальні, розміщених у матриці, що утворена при взаємодії транспортні й технологічні властивості синтетич- колагену й зшиваючого агенту, біфункніонального них раневих покрить. поліетиленгліколю (МО 95267611. У даному патенті

Відповідно до запропонованого винаходу здій- висвітлено розробку комбінованого матриксу, що снюється насичення зазначеного гідрогелю куль- може використовуватись для ендопротезування туральним середовищем, в якому містяться біоло- (заміщення внутрішніх тканин організму), але не- гічні мікрооб'єкти, що забезпечує оптимальні придатного для зовнішнього застосування. умови для їх іммобілізації, життєдіяльності, росту й Як правило, саме колаген застосовують у біо- розмноження т міїго та іп мімо. Використання мезе- технології для одержання гелю з метою форму- нхімальних стовбурових клітин як клітинного ком- вання "дермального еквівалента" і "живого еквіва- поненту гідрогелевої мембрани є перспективним, лента шкіри" |(Парамонов Б.А., Порембский Я.О., тому що у відповідному мікрооточенні вони здатні Яблонский В.Г. Опіки.-Санкт-Петербург, Спецлит, диференціюватися в різні типи клітин, у тому числі 2000.-488 з|). При цьому готують складні клітинні епітеліальні, м'язеві та клітини сполучної тканини й композиції з розчином колагену й культуральним інші (Чапу М. еї аї. Рішгіроїепсу ої тезепспутаї середовищем. Отримані суміші при низьких тем- віет сеї дегімей тот адиїк татом // Майштге.-2002.- пературах залишаються рідкими, а при нанесенні 418.-Р.41-49). на рану при температурі тіла полимеризуются в

Даний спосіб веде до збільшення здатності гель. Незважаючи на безліч цінних властивостей даного гідрогелю до поглинання й тривалого утри- колагену як природного покриття, що піддягає біо- мування достатньої кількості різних лікарських деградації йому властиві й недоліки, що виявля- препаратів, культуральних середовищ, ростових ються у цілому ряді робіт. факторів і спеціальних добавок, що використову- Так, існують труднощі ідентифікації цього при- ються у процесі культивування як мікроорганізмів, родного полімеру: структура колагену, а також так і клітин ссавців з різним рівнем диференцію- відповідно і його властивості, змінюються залежно вання. від конкретного джерела його одержання (див.,

У результаті здійснення запропонованого спо- наприклад, ЕР 0681846|. Серед інших недоліків собу зазначеному гідрогелю надаються не лише покрить на основі колагену слід зазначити його властивості до ефективної сорбції, але й до насту- високу вартість, складність виділення й обробки, пного пролонгованого вивільнення різних медика- схильність до заселення хвороботворними мікроо- ментозних препаратів (зокрема, знеболювальних, рганізмами й неможливість парової стерилізації противогрибкових, бактерицидних, гормональних, внаслідок денатурації при підвищених температу- гемостатичних, вітамінних, ферментативних та ін.). рах. Крім того, плівки колагену не посідають до-

При використанні складних клітинних композицій з статньої міцності на розрив. Тому використання гелю виділяються численні ростові фактори й інші колагену для загоєння ран і опіків обмежується речовини клітинного походження, які сприяють внаслідок збільшення ризику додаткового інфіку- загоєнню рани. вання ран, а також можливості імунних реакцій.

Слід зазначити, що наведені недоліки колаге- лення противоопікових покрить, які, крім забезпе- нових покрить нівілюються при використанні про- чення необхідних умов для культивування клітин, понованого нами синтетичного гідрогелевого пок- повинні надійно захищати уражену поверхню від риття. інфікування ззовні. Крім того, у випадку недостат-

Ддя виготовлення синтетичних покрить мо- ньої механічної міцності покриття існує висока жуть використовуватись гідрофобні полімери, на- ймовірність того, що його дрібні фрагменти із гній- приклад, полістирол (Иммобилизованнье клетки и но-некротичкими виділеннями залишатимуться на ферменть!. Методьії. Под ред. Дж-Вудворда. Моск- поверхні рани. ва. "Мир". 1988. 215 с.| або кополімер етилену з Варто також підкреслити, що відсутність іоно- вінілацетатом (ЕР 0681846). Є дані про те, що такі генних функціональних груп у поліакриламідному гідрофобні полімерні покриття не пригнічують ріст гелі обмежує можливість його збагачення елемен- клітин різного походження та не володіють цитото- тами культурального середовища та їх тривалого ксичністю. Зазначеним покриттям притаманний закріплення, що не сприяє якісній іммобілізації низький рівноважний водовміст (близько 5-7905), клітин на поверхні (ттобіїїзей сеїї5 апа епзхутев. внаслідок чого вони мають підвищену твердість і А ргасіїса! арргоаспі. УМ/ооаймага 9., ей ІВ Ргевв. жорсткість. Проте саме це перешкоджає викорис- Охоюога. У/азпідюп. 1985). танню їх у якості противооігікових покрить, для Крім того, як відомо з літературних даних, зда- яких вкрай важливі протилежні властивості: елас- тність поліакриламідного гелю до іммобілізації й тичність, м'якість, здатність відтворювати рельєф пролонгованого вивільнення лікарських речовин рани, а також атравматичність при застосуванні й украй низьька |ІК.АА. Макаров, С.А. Кибардин. біосумісність, що збільшується по мірі росту рівно- Иммобилизованнье биопрепаратьії в медицине. важного водовмісту. Москва. Медицина. 1980). Задовільна ефектив-

Інший гідрофобний двошаровий матеріал на ність іммобілізації досягалася лише у випадку фе- основі поліуретану застосовують для виготовлен- рментів з високою молекулярною масою, що до- ня тимчасового штучного раневого покриття (УР лають стеричні перешкоди при дифузії крізь часто 6104116). Матеріал являє собою синтетичний по- зшиту макромолекулярну сітку гідрогелю. Однак, лімерний шар насичений культуральним середо- високий ступінь зшивки в поліакриламідному гелі вищем і шар з клітинами. Недоліком вказаного негативно позначається на культивуванні клітин матеріалу внаслідок його гідрофобності є низька (ІИммобилизованньсе клетки и ферменть!. Методьі. поглинаюча здатність стосовно раневого ексудату. Под ред. Дж.Вудворда. Москва. "Мир". 1988.

Крім того, внаслідок низької термостабільності, 215с.|. матеріал не витримує термостерилізації, що ство- З огляду на викладене, використання вказаних рює загрозу його заселення мікроорганізмами. гідрогелевих покрить з адресним пролонгованим

Відомо також застосування гідрофільних син- вивільнення комплексу лікарських препаратів по- тетичних покрить для культивування клітин. Най- ряд із клітинною терапією не є ефективним. більше широко описане застосування гідрогелів на У результаті проведених нами досліджень бу- основі поліакриламіду. Відоме застосування поліа- ло продемонстровано, що кополімеризація гідро- криламідного гелю в якості субстрату для культи- фобних й гідрофільних мономерів дозволяє досяг- вування клітин, причому спочатку гель вводиться в ти того гідрофільно-гідрофобного балансу, при організм ссавця, а потім його ін'єкційним методом якому створюються оптимальні умови для культи- заселяють клітинами (КО 2151800). Однак, зазна- вування клітин (адгезія, розпластування, розмно- чений спосіб придатний лише для вакцинації всьо- ження, утворення моношару) та забезпечується го організму ссавця й не дозволяє здійснювати комплекс необхідних фізико-хімічних властивостей адресну клітинну терапію конкретних зовнішніх покриття (сорбційна здатність стосовно раневого уражень шкіри, зокрема, опіків. ексудату, паро- та киснепроникшисть, міцність, ела-

Найбільш близьким за технічним рішенням є стичність, атравматичність при застосування). метод одержання поліакриламідного гелю для Мікробіологічні дослідження показали, що на медико-біологічних цілей, у тому числі й для куль- гідрофільних поверхнях (наприклад, на поверхні тивування клітин (ЗО 977466), який був обраний гомополіакриламідного гедю) не спостерігається нами в якості прототипу. Спосіб передбачає про- пригнічення росту клітин, однак ні розпластування ведення гелеутворення акриламіду у фізіологічно- клітин, ні утворення моношару при цьому не вияв- му розчині, у присутності зшиваючого агента та лено. У випадку надмірної гідрофобності кополі- ініціаторів полімеризації з наступним відмиванням мерного покриття клітини погано прикріплюються від непрореагованих низькомолекулярних домішок до поверхні, а внаслідок непрозорості матеріалу та інкубацією клітинних культур. Отриманий сітча- спостереження за ростом клітин та за процесом стий полімер не токсичний (за умов якісно викона- загоєння рани ускладнюється. Крім того, надмірна ного відмивання від залишків мономерів), має ви- твердість такого матеріалу не дозволяє виготов- соку еластичність та прозорість. Взагалі, ляти з нього атравматичні противоопікові покрит- поліакриламідний гель володіє високим рівноваж- тя. ним водовмістом (може досягати значень порядку Таким чином, оптимальні експлуатаційні па- 95-97905) і, як наслідок, унікальною біосумісністю, раметри гідрогелевих покрить у поєднанні з най- однак, його механічна міцність дуже низька (Копао кращими умовами для культивування клітин дося-

Т., Мигатаїзи М. Іп: Місгоепсарзшіаїйоп (Міхоп У.МК., гаються саме у випадку застосування помірно ей), р.67, Магзеї! Оеккег, Іпс., Мем МогК, 1976Ї, що гідрофільних і одночасно помірно гідрофобних не дозволяє використовувати його для виготов- гідрогелів, що одержуються в процесі кополімери-

зації гідрофільних і гідрофобних мономерів. Дода- ні скляних флаконів або чашок Петрі обробляли ткове введення в зазначений кополімерний гідро- розчином трипсину й версену (Бужиевская Т.ИЙ., гель мономерів з іоногенними групами (наприклад, Лукаш Л.Л., Подольская С.В. Зкспериментальнье ненасичених кислот) сприяє кращому насиченню модели для изучения мугагенеза и трансформа- покриття культурайьним середовищем й закріп- ции, индуцированньїх вирусами и нуклеийновьми ленню з наступною пролонгацією вивільнення лі- кислотами // Методьі молекуляр. биологии.-Киев: карських засобів, що використовуються при ліку- Наук. Думка, 1986. -С. 147-158. ванні опіків та інших уражень шкіри. В якості контролю клітини висівали на поверх-

Основним завданням, на рішення якого спря- ню стандартних чашок Петрі. Інкубацію клітинних мовано даний винахід, е вдосконалення способу культур проводили при температурі 37"С. Спосте- одержання багатофункціонального гідрогелю ме- реження за клітинами проводили під інвертованим дичного призначення й покращення його характе- мікроскопом щодня протягом тижня. При цьому ристик. досліджувалися здатність клітин до іммобілізації

Поставлене завдання вирішується тим, що за- на гідрогелевих зразках, агрегація, адгезивні влас- пропоновано біосумісний недеградуючий гідрогель тивості, ріст й розмноження, а також морфологічні медичн призначеннз,що містить у масою властивості. зшитого кополімеру на ос- Через добу після посіву клітин на більшості із нові гідрофільного мономе- досліджуваних гідрогелевих зразків спостерігалося ру, гідрофобного мономеру, прикріплення клітин до поверхні, часткове розпла- ненасиченої кислоти та бі- стування; а також утворення агрегатів різної вели- функціонального мономеру 2,0-70,0 чини (Рис.1). Лише при використанні помірно гід- лікарського препарату 0,001-5 рофобних і одночасно помірно гідрофільних культурального середовища покрить спостерігалося прикріплення, ефективне з мікрооб'єктами залишок до 100 розпластування, розмноження й ріст клітин з утво-

Одержують його за допомогою кополімеризації ренням моношару (Рибс.2). гідрофільного мономеру (наприклад, М- Надалі суть винаходу ілюструється приклада- вінілігіролідону, 2-гідрооксиетилметакрилату, ак- ми конкретного виконання. Отримані гідрогелеві риламіду, метакриламіду), гідрофобного мономеру зразки покрить аналізувалися за такими показни- (наприклад, метилакрилату, етилакрилату, метил- ками, як міцність на розрив, тривалість вивільнен- метакрилату, акрилонітрилу, метакрилонітрилу), ня введених хіміотерапевтичних засобів та харак- ненасиченої кислоти (наприклад, акрилової кисло- тер взаємодії клітин та гідрогелевого зразку. ти, метакрилової кислоти, кротонової кислоти, 2- Для оцінки швидкості вивільнення лікарських акриламідо-2-метилпропансульфонової кислоти) засобів гідрогелеві зразки покрить поміщали в ди- та біфункціонального мономеру (наприклад, ети- стильовану воду при температурі 2572 й спостері- ленглікольдиметакрилату, М,М'-метилен-біс- гали за змінОюЮ ІінтенсивніСсті смуги поглинання в акриламіду, 1,4-диакрилоілпиперазину). Уф-області, що визначалась з використанням спе-

Зазначений зшитий кополімер одержують при ктрофотометра "ЗРЕСОКО-М40". наступних концентраціях комономерів, мас.9о: Міцність на розрив синтезованих гідрогелів ви- гідрофільний мономер 3,5-60 значали з використанням розривної машини "ЕР гідрофобний мономер 0,5-30 10017 (Німеччина). шо ненасичена кислота 0,05-5 втаб гідрогелів різного складу наведені бідункпіональний мономер 0,001-1 Приклад 1 з наступним відмиванням гелю в апірогенній В л100мл апірогенної води з температурою воді, висушуванням, стерилізацією, насиченням 25"Сб розчиняють 45,0г М-вініл-піролідону (всі ви- культуральним середовищем й нанесенням на користані реактиви - виробництва фірми "Бідта", його поверхню клітинної суспензії, що містить для біомедичних цілей), 2,5г метилакрилату, 0,5г в 1 мл не менш ніж 105 клітин. метакрилової кислоти, 0,2г етиленглікольдимета-

Тестування гідрогелевих матриць як покрить крилату, 0,15г персульфату амонію й 0,15г тетра- для культивування клітин здійснювали в такий метилетилендіаміну. Отриманий розчин відфільт- спосіб. Сухі гідрогелеві зразки покрить поміщали в ровують крізь бактерицидний фільтр із розміром чашки Петрі (фірма "Апитбга", діаметр 35 мм) й пор 0,45мкм, продувають газоподібним азотом й заливали їх культуральним середовищем на 12 розливають для проведення полімеризації в плос- годин для набухання. Потім надлишок рідини ви- ко-паралельні прес-форми для одержання пластин даляли й наносили клітинну суспензію (105 клітин в з товщиною 0,7мм. Прес-форми витримують при 1 мл культурального середовища). Для приготу- температурі 252С протягом 2-х годин. Потім мате- вання клітинних суспензій використовували мезе- ріал виймають із прес-форм і піддають відмиван- нхімальні стовбурові клітини лінії 4ВІ 2, отримані з ню в апірогенній воді при температурі 752С (спів- периферійної донорської крові. Клітини 4ВІ 2 куль- відношення гідрогелю й води 1:3) протягом 7діб з тивували іп мйго у стандартному середовищі щоденною заміною води. Гідрогелеві покриття

ДМЕМ (фірма "Зідта") з додаванням 595 сироват- після хроматографічного контролю залишкового ки новонароджених особин великої рогатої худоби вмісту мономерів висушують при температурі (фірма "Зідта"), а також антибіотиків пеніциліну й 40гС, пакують в полімерну плівку, стерилізують, стрептоміцину по 100 ОД/мл. Для одержання клі- насичують культуральним середовищем, що міс- тинних суспензій моношарову культуру на поверх- тить 595 бактерицидного препарату хлоргексидину біглюконату й наносять клітинну суспензію, що Приклад 7 (порівняльний) містить 109 клітин в їмл культурального середо- Одержують поліакриламідний гель, що містить вища (процес інкубації клітин описаний вище). 11,095 поліакриламіду й 89,095 0,595-ного водного

Визначали міцність на розрив гідрогелевих покріп- розчину хлористого натрію (відповідно до прикла- тів, тривалість вивільнення введеного лікарського ду 1 та прототипу - БО 9774661). Надалі обробку препарату й спостерігали за характером пово- отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно при- дження клітин на поверхні. Результати зведені в кладу 1. Використовують культуральне середови-

Таблицю 1. ще, що містить 595 бактерицидного препарату

Приклад 2 хлоргексидину біглюконату. Визначали параметри,

В 100г апірогенної води з температурою 2570 що перераховані в прикладі 1. Результати зведені розчиняють 90,0г акриламіду, 10г акрилонітрилу, 1 в Таблицю 1. г акрилової кислоти, 0,2г М,К-метилен-біс- акриламіду, 0,1г персульфату калію й 0,125г мета- Таблиця 1 бісульфіту натрію. Надалі обробку отриманого гідрогелю здійснюють аналогічно прикладу 1. Ви- 2, Тривалість | Характер взає- користовують культуральне середовище, що міс- Гідрогелевий Міцність вивільнення! модії клітин з тить 595 анестетику лідокаїну гідрохлориду. Ви- зразок згідно | "2 РОЗ- | лікарських | поверхнею гід- значали параметри, що перераховані в прикладі 1. прикладу й препаратів, | рогелевого зра-

Результати зведені в Таблицю 1. кла години Зк

Приклад З Клітини розпла-

В 100г апірогенної води з температурою 2570 стуються, прик- розчиняють 70г акриламіду, З0г акрилонітрилу, 2г 1 180 85 ріплюються до акрилові кислоти, 1 г М,М'-метилен-біс-акриламіду, поверхні 0,05г персульфату амонію й 0,1г метабісульфіту Клітини розпла- натрію- Надалі обробку отриманого гідрогелю стуються, прик- здійснювали аналогічно прикладу 1. Використову- 2 245 120 ріплюються до ють культуральне середовище, що містить 595 поверхні анестетику лідокаїну гідрохлориду. Визначали па- Клітини розпла- раметри, що перераховані в прикладі 1. Результа- стуються прик- ти зведені в Таблицю 1. З 420 134 ріплюються до

Приклад 4 поверхні, утво-

В 100г апірогенної води з температурою 2570 оюють моношар розчиняють З35г акриламіду, 55 г акрилонітрилу, Клітини розпла- 10г метакрилової кислоти, 2г М,М'-метилен-біс- стуються прик- акриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3- 4 570 145 ріплюються до диметиламінопропіонітрил. Надалі обробку отри- поверхні, утво- маного гідрогелю здійснювали аналогічно прикла- рюють моношар ду 1. Використовують культурадьне середовище, 5 (порівняль- що містить 595 антибіотику лінкоміцину гідрохло- риду. Визначали параметри, що перераховані в я я

Приклад 5 (порівняльний) зація -

В 100г апірогенної води з температурою 2570 й Клітини не роз- розчиняють 2,0г акриламіду, 0,1г акрилонітрилу, 1 - (порівняль- 125 12 пластуються, 0,15г метакрилової кислоти, 0,05г М,М'-метилен- ний) моношар не біс-акриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г творюється

З-метабісульфіту натрію. Внаслідок низької конце- , , нтрації комономерів гідрогель не утворювався. Таким чином, наведені приклади підтверджу-

Приклад 6 (порівняльний) ють, що запропонований біосумісний гідрогель

В 100г апірогенної води з температурою 252С медичного призначення може бути отриманий. У розчиняють 205г акриламіду, 20г акрилонітрилу, 5г порівнянні із прототипом досягається значне зміц- акрилової кислоти, 25г М,М'-метилен-біс- нення матеріалу, пролонгація вивільнення введе- акриламіду, 0,125г персульфату калію й 0,125г 3- них у його сполуку лікарських засобів, поліпшення диметиламінопропіонітрил. Внаслідок високої кон- біосумісності із клітинами, що вперше показано на центрації мономерів спостерігалася бурхлива спо- прикладі мезенхімальних стовбурових клітин лю- нтанна вибухоподібна реакція гелеутворення зі дини. вспінюваниям суміші й різким погіршенням фізико- механічних властивостей полімеру.

ооо ВЕК е о ен оо с с с 5. 5. ве т зріг. Фіг;

СО КомпютернаверсткаВ.Клюкін (00000000 Підписне (00000000 Тиражобоприм, ////000С0С

Державний департамент телекуальної власності вул. Уришнкого, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601