UA61391A - Method for detecting causative agent of anthrax - Google Patents

Description

Опис винаходу

Для діагностики збудника сибірської виразки (сибірки) застосовують велику кількість методів досліджень. 2 У відповідності з найбільш поширеною схемою (А.С. Лабинская. Микробиология с о техникой микробиологических исследований.- М.: медицина. - 1978.- 394 с.), діагностика сибірки іп мімо, проводиться таким чином: у перший день досліджень відбирають пробу крові, мокроти або вміст сибіркового карбункула хворої тварини і готують мікроскопічні мазки. Один мазок фарбують за Грамом, другий - з метою виявлення капсульних форм бацил за Романовським-Гімаа. Підставою для постановки попереднього діагнозу на сибірку є 70 виявлення в пробах грампозитивних, оточених капсулою поодиноких палочок або їх ланцюжків та опор.

Основний недолік способу - часта відсутність капсульних форм, в зв'язку з чим збудника сибірки можна сплутати з сапрофітними бацилами-антракоїдами: Вас. сегейз, Вас. тезепіегісив. Вас. тедаїПегішт, Вас. тусоідез, Вас. апіпгасоіїдез, Вас. рзеидоапійгасіз. В зв'язку з цим для точного діагнозу необхідно виділити чисту культуру збудника і поставити біопробу на чутливих лабораторних тваринах, а потім, після їх захворювання, клінічного 72 огляду і загибелі, знову виділити чисту культуру та діагностувати збудник хвороби. Таким чином, загальний час, необхідний для отримання вірогідного результату становить 8-10 діб, що не відповідає основній вимозі: встановлення діагнозу в найкоротший термін для налагодження своєчасних профілактичних і лікувальних заходів.

Ідентифікацію збудника сибірки проводять за допомогою проби сибірковим бактеріофагом (Н.Г. Ипатенко.

Лабораторнье методьй исследования при сибирской язве // Ветеринария. - 1983, Мо7; Н.Г. Ипатенко.

Дифференциации Вас. апіпйгасіз от спорообразующих и почвенньїх бациллу / Ветеринария. - 1995. - Мо7).

Реакція досить специфічна і дозволяє віддиференціювати його від псевдосибіркових бацил. Незважаючи на високу чутливість цього способа діагностики і його різних модифікацій, проба бактеріофагом вимагає попереднього виділення чистої культури сибірки із патологічного матеріалу або навколишнього середовища, на 29 що йде до 48 годин. Крім того, необхідний час для постановки біопроби, на що витрачається ще декілька діб. «

Іншим недоліком методу є те, що він діагностує не тільки патогенні, але й авірулентні штами. Слід врахувати також той факт, що у природі існують патогенні штами збудника сибірської виразки не чутливі до бактеріофага та сапрофітні бацили, які лізуються під впливом сибіркового бактеріофагу (Н.Г. Ипатенко, В.А. Гаврилов, В.С.

Зелепукин и др. Сибирская язва. - М: Колос, 1996. - 3356с.). --

З метою прискореної діагностики збудника сибірки застосовують тест "бурштинового намиста". При цьому на од агаризоване середовище з пеніциліном, яке попередньо розливають у чашки Петрі, наносять бактеріологічною петлею трьохгодинну бульйонну культуру досліджуваного мікроорганізма. Із колоній, що виростають на о згаданому середовищі, готують мазки для мікроскопії. На контрольному середовищі (без додавання пеніциліну) «-- виростають колонії звичайних бацил, а на дослідному - колонії, утворені клітинами кулястої форми, з'єднаними 3о у ланцюжки - "бурштинове намисто". В останньому випадку ставлять діагноз - сибірка. Однак, як і в ее, попередньому аналозі, спосіб "намиста" не дозволяє відрізняти патогенні штами сибірки від авірулентних і, вимагає додаткових доказів. Крім відзначеного, в природі існують вірулентні бацили сибірки не чутливі до пеніциліну, а також бацили цереуса, здатні набувати кулястої форми під дією цього антибіотика. «

Фармаконцерн Роше у кооперації з фірмою Сепіеві (США) та деякі інші дослідники для швидкої діагностики З 50 збудника сибірки, в тому числі, в складі біологічної зброї, пропонують застосовувати широковідомий метод ПЛР с (полімеразна ланцюгова реакція) (Егедегікв О.М., КеІтап О.А. Арріїсайоп ої роїйтегазе спаіїп геасіоп о Ше

Із» діадповів ої Іпїесбйопе дізвеазев. // Сп. Іпйїесї Оів.- 001999,.- м.29. - р. 457-458;

НЕру/ЛМмлам. папаеїізБіай сотт/прімлумапуероїТп/гепібі/5тп/рийапрі/оп/оАгі. Лпдех. піт. 09.12.01). Оптимізм авторів щодо ефективності цього способу розділити важко, через такі причини: по-перше, для проведення

ПЛеР-тесту із підозрюваного матеріалу спочатку необхідно виділити чисту культуру сибірки, потім виділити і

Ме очистити ДНК, на що піде досить багато часу; по-друге, існує висока ймовірність отримання псевдопозитивного - результату, внаслідок присутності ДНК антракоїдів, або навпаки, псевдонегативного результату (інгібування реакції, внаслідок біологічного забруднення); по-третє, багатоетапність методики очищення і концентрування о бактеріальної ДНК, як і самий аналіз, вельми трудомісткі і дорогі та вимагають створення складних (Те) 20 стаціонарних молекулярно-біологічних лабораторій.

Найближчими до запропонованого нами способу діагностики збудника сибірки відносяться такі. та Реакція преципітації за Асколі. Її суть полягає в тому, що матеріал, підозрюваний на наявність збудника сибірки, екстрагують гарячим або холодним способом. Отриманий при цьому екстракт в кількості 0,2-0,3 см 3 наслоюють на такий же об'єм прозорої преципітуючої протисибіркової сироватки в уленгутовській пробірці. В 29 разі позитивної реакції (наявність антигену бацил сибірки) протягом 2 хвилин після сполучення згаданих в. компонентів з'являється характерне молочно-білого кольору кільце преципітації. Проте, цей спосіб має слабкі місця, а саме: а) реакція може бути позитивною навіть при відсутності життєздатних бацил і спор сибірки, що призводить до економічних втрат (знищення всієї партії тваринної сировини): б) за умови отримання негативного результату реакції преципітації з екстрактом, отриманим за допомогою гарячого способу, вимагається повторний 60 аналіз з холодним екстрактом і навпаки; в) при розтиранні шматочків патологічного матеріалу, кормів або інших щільних субстратів у ступці з піском існує небезпека забруднення повітря чи оточуючих предметів, а також людей спорами сибірки; г) для постановки реакції Асколі потрібний стандартний антиген, що також ускладнює проведення біотеста.

Відомий люмінесцентно-серологічний метод виявлення бацил сибірки з використанням високоспецифічних бо імунних капсульних протисибіркових сироваток, кон'югованих з люмінесцентним фарбником. Наявність збудника сибірки констатується під люмінесцентним мікроскопом у вигляді палочок і/або їх ланцюжків, які дають зелено-жовте свічення. Капсули світяться яскравіше. Основним недоліком цього методу є те, що свічення можуть давати антракоїдні бацили. Отже, постає необхідність підтвердження діагнозу біопробою на лабораторних тваринах.

Задачею винаходу є розробка надійного способу діагностики збудника сибірки в будь-якому матеріалі: тваринницькій сировині, грунті, воді, повітрі в тому числі у біологічній зброї, який би відрізнявся найкоротшим терміном постановки остаточного діагнозу, високою чутливістю і простотою застосування з врахуванням польових умов. 70 Поставлена задача досягається наступним чином.

Наважку досліджуваного на можливість контамінації збудником сибірки матеріалу (порошок, корми, шкірсировина, грунт тощо) в кількості 0,5-1,0 г заливають розчином фарбника у відношенні 1:2 - 1:55 такого складу: акридиновий оранжовий 1,0-1,5, спирт-ректифікат 967 і димексид - по 20,0: 195 водний розчин їдкого калію - 1,0; 10956-ний відвар цибулиння (цибуля ріпчаста) - 30,0, вода дистильована до 100,0. Пробірку з 7/5 бумішшю нагрівають ЗО хв. при 80-90" С, охолоджують, центрифугують, надосадочну рідину вилучають. Осадок промивають 2-3 рази в 5-10 об'ємах дистильованої води. Після кожного додавання води пробу центрифугують при З000 об/хв. 5-10 хв. Після промивання осаду надосадочну рідину виливають, а з осадку готують мазки "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Спори мають яскраво оранжевий колір.

Для постановки остаточного діагнозу ставлять дослід з тест-системою. Її готують наступним чином. На дно чистої бактеріологічної пробірки вносять 0,5-1,0 ом З комерційної антитоксичної сибіркової сироватки або сироватки "Антракол". На сироватку нашаровують підігрітий до 42-43" 195-ний прозорий гель агар-агару, приготовлений на фізіологічному розчині (0,8595 водний розчин натрію хлористого). Пробірку ставлять вертикально до застигання агару. Після цього на поверхню агару вносять 1-2 см З рідкого живильного середовища, наприклад, м'ясо-пептонний бульйон з додаванням сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) і глюкози, в яке вносять 0,2-0,Зсм З суспензії забарвленого осаду. Після цього пробірки ставлять в термостат при « 37"С на 12-15 годин.

Пробірки переглядають в проникаючому світлі на чорному фоні, як при обліку реакції Асколі. За наявності в досліджуваному матеріалі збудника сибірської виразки в агаровому гелі формується кільце преципітації. В процесі росту на живильному середовищі тільки бацили сибірки продукують і виділяють назовні (за межі -- клітинної стінки) токсин, який, дифундуює в агарові гель і зв'язується антитілами преципітуючої сироватки. Фо

Антракоїдні бацили диску преципітації не утворюють.

Таким чином, в результаті запропонованих нами лабораторних досліджень попередній діагноз ставлять со через 30 - 60 хв., остаточний - через 12 - 15 годин. «-

Приклади реалізації способу

Приклад 1. Порошок, підозрюваний на вміст спор сибірської виразки поміщають в пробірку в кількості 0,3 г. (О і заливають у пропорції 1:5 розчином фарбника такого окладу; акридин оранжевий 1,0-1,5, спирт-ректифікат 96"- 20,0, димексид - 20,0, 1956-ний водний розчин калію їдкого 1,0, 1095-ний відвар цибулиння - 30,0, вода дистильована - до 100 см3. Пробірку із сумішшю нагрівають при 807С протягом 20 хв., охолоджують, « центрифугують, надосадочну рідину виливають. Осадок промивають З рази в 5 см" дистильованої води. Після - кожного додавання води проводять центрифугування при 3000 об/хв., 7 хв. Паралельно проводять аналогічну с процедуру з порошком сухого молока коров'ячого (контроль), виготовленого за ГОСТ 13264 - 70 на Яготинському з» молокозаводі (Київська область).

З осадків дослідної і контрольної пробірок готують мікроскопічні препарати типу "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. В дослідній пробірці виявлені яскраво оранжеві спори, в контрольній - ні. б З метою підтвердження діагнозу ставлять спеціальний біотест з комерційною антитоксичною сибірковою - сироваткою. В пробірки з дослідним і контрольним осадами додають по їсм? стерильного фізіологічного о розчину, перемішують і засівають по 0,2см? суспензії на тест-системи, виготовлені як зазначено в описі винаходу. Склад живильного середовища тест-системи такий: 1см3 м'ясопептонного бульйону, їсм З і, інактивованої сироватки крові ВРХ та 195 глюкози. Пробірки з тест-системою ставлять в термостат при 377С на як 12 - 15 годин. При обліку результатів імунодифузної реакції через 12 годин в дослідній пробірці виявлено характерне кільце преципітації. В контролі диск преципітації відсутній.

Приклад 2. Вода поверхневого джерела, підозрювана на зараження спорами сибірки.

В стерильні пляшки відбирають по О,5дм? води для дослідження на предмет контамінації її опорами сибірки.

Воду фільтрують через бактеріологічні мембранні фільтри Моз (діаметр пор - 0,3 мкм) за допомогою фільтра » Зейтца. Після цього мембранні фільтри перевертають і промивають їх 100 см? фільтрату. Отриману суспензію прогрівають на водяній бані 20 хв. при 75"С, охолоджують. Потім роблять серію кратних розбавлень у стерильній водопровідній воді і їсм" суспензії засівають на чашки Петрі з застиглим агаризованим середовищем (склад 60 середовища як в прикладі 1). Чашки Петрі ставлять в термостат при 37"С. Через 3-6 годин інкубації чашки Петрі оглядають з метою виявлення колоній, характерних для бацил сибірки. Це плоскі матово-сірі шорсткі (К-форма) колонії з бахромчатими краями або кучероподібними відростками. Підраховують загальну кількість колоній спороутворюючих мікроорганізмів та число колоній, схожих за морфологічними ознаками на колонії збудника сибірки. За допомогою бактеріологічної петлі з колоній відбирають матеріал для посіву в пробірку з біотестом, 65 що містить антитоксичну сибіркову сироватку (як в прикладі 1). Огляд пробірок через 12 і 15 год. інкубації не виявив кільця преципітації. Отже, досліджувана вода не контамінована спорами сибірки, а містила спори сапрофітних бацил.

Приклад 3. Дослідження ділянки грунту, що підозрюється на забруднення спорами сибірської виразки.

Методом випадкових вибірок відбирають проби грунту масою до 100,0г. в стерильні банки з кришками. В лабораторії з проби грунту вилучають крупні частинки рослин, коренів тощо, грунт перемішують, зважують Зог і заливають його ЗОсм? 0,595-ного розчину піросульфату натрію. Суміш шуттелюють 20Охв. і відотоють 5 хв.

Надосадкову рідину зливають і фільтрують через стерилізуючу мембрану фільтра Зейтца. Після цього фільтр промивають 10 см? стерильної водопровідної води, центрифугують 10 хв. при 3000 об/хв. Надосадкову рідину зливають. Отриманий осадок ресуспендують в розчині люмінесцентного фарбника і фарбують як відзначено в 70 прикладі 1. Аналогічно готують пробу контрольного (завідомо чистого) грунту. Із дослідного і контрольного осадів готують препарати "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. В дослідному і контрольному зразках грунту виявлено спори, забарвлені в оранжевий колір. Після цього ставлять біотеста з антитоксичною сибірковою сироваткою "Антракол". Дослідну і контрольну пробірки з біосистемами інокулюють відповідно по 0,5см? дослідного і контрольного матеріалу і ставлять їх в термостат при 37"С. Через 12 годин інкубації виявлено чітке кільце преципітації в агаровому диску дослідної проби. Контрольньій зразок грунту кільця преципітації не дав.

Приклад 4. В герметичній камері КПГ-1 розпилюють суспензію опор штаму Вас. апіпгасіз. Після цього в допомогою волюнометричного відбирача зразків з атмосфери (фірма "Буркхард", Великобританія) з камери відкачують повітря впродовж 6 хв., яке пропускається через спеціальну барботажну камеру з 0,596-ним водним розчином препарату бактеріального екзополісахариду "Бактозоль" (свідоцтво на знак для товарів і послуг Мо 7946 від 12.07.2001р.).

Розчин прогрівають при 80"7С 20 хв. і центрифугують, надосадочну рідину зливають, осад тричі промивають, потім його змішують з розчином фарбника, фарбують, як в прикладі 1. З осаду готують препарати "роздавлена крапля" і проводять мікроскопію під люмінесцентним мікроскопом. В результаті виявлено яскраво оранжеві спори. «

З метою підтвердження попереднього діагнозу з допомогою бактеріологічної петлі з осаду відбирають посівний матеріал, яким засівають пробірку з підготовленою тест-системою і ставлять в термостат при 377С.

Шляхом візуального обліку результату реакції через 13 год. інкубації виявлено чіткий диск преципітації. Отже, в пробі досліджуваного повітря містяться опори сибірської виразки. --

Переваги запропонованого способу Фо

Практично всі відомі методи діагностики сибірки вимагають обов'язкового виділення чистої культури збудника, дослідження його морфологічних і культурально-біохімічних властивостей, постановки біопроби з со наступною ізоляцією із організмів загиблих лабораторних тварин збудника та його ідентифікації. На ці «- процедури витрачається від 7 до 10 діб, що не дозволяє своєчасно організувати відповідні лікувально-профілактичні заходи та призводить до великих втрат. (Се)

В порівнянні з відомими аналогами, запропонований спосіб діагностики має низку переваг: 1. Час постановки попереднього діагнозу становить 30 - 60 хв., остаточного - до 12 - 15 год., що дозволяє оперативно вжити всі необхідні лікувально-профілактичні заходи, особливо, у випадку застосування опор « сибірської виразки в якості біологічної зброї. 2. Для постановки остаточного діагнозу (проведення біотесту з антитоксичною сибірковою сироваткою) не т с обов'язково виділяти чисту культуру збудника сибірки, його можна проводити з накопичувальною культурою. ч З. Запропонований спосіб експрес-діагностики збудника сибірки є простим, надійним і економічним. ни Наприклад, порівняно з ПЛР - методом, який до того ж часто дає псевдопозитивний або псевдонегативний результати, він дешевший в сотні разів і його можна втілювати в польових умовах. 4. Запропонований спосіб експрес-діагностики дозволяє максимально скоротити втрати живої сили військ і (2) населення від зараження сибіркою при застосуванні відповідної біозброї шляхом масової імунізації людей - токсин-вакциною "Антракол", яку можна вводити за допомогою безгодкового ін'єктора. (95) со 20

Claims (2)

1. Формула винаходу

   -. й 1. Спосіб діагностики збудника сибірки у повітрі, воді і твердих субстратах, що включає мікроскопію забарвлених за Грамом мікроскопічних мазків, висів контамінованого матеріалу на штучні живильні середовища і зараження ним чутливих лабораторних тварин, який відрізняється тим, що суспензію досліджуваного матеріалу (порошок, змиви з об'єктів навколишнього середовища, стерилізуючих фільтрів тощо) змішують з з» люмінесцентною сумішшю спеціального складу: акридиновий оранжевий 1,0-1,5; спирт етиловий ректифікований 967 -20 і димексид - 20,0; 1 бб-ний водний розчин їдкого калію - 1,0; 10 95о-ний відвар лушпиння цибулі ріпчастої 20,0-30,0; вода дистильована до 100 см, нагрівають до 80-90" і забарвлюють 20-30 хвилин, центрифугують 3-6 хв. при 3000 об/хв., надосадкову рідину зливають, осад промивають 2-3 рази в 5-10 об'ємах 60 фізіологічного розчину, з осаду готують мазки "роздавлена крапля" і досліджують в люмінесцентному мікроскопі - спори сибірки яскраво оранжеві, осад висівають в живильне середовище спеціальної імунодифузійної тест-системи з застосуванням відомих комерційних антитоксичних сибіркових сироваток в метою виявлення екзотоксину збудника сибірки.
2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що реакцію імунодифузії проводять з токсин-вакциною "Антракол". б5 Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2003, М 11, 15.11.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України.

   « «- Фо со «- (Се) ші с ;»

   (22) - (95) о 50 -

   60 б5