UA56131C2 - Спосіб мікробіологічного знезараження тромбоцитів - Google Patents

Abstract

Даний винахід відноситься до способу інактивації мікробіологічних забруднювачів у препаратах кров'яних пластинок (тромбоцитів) крові людини. Спосіб включає, по-перше, отримання тромбоцитів, зокрема тромбоцитів людини, можливо забруднених мікроорганізмами. Тромбоцити обробляють фіксатором (переважно шляхом змішування з 1,8% розчином параформальдегіду) протягом часу, достатнього для фіксації тромбоцитів (переважно від 45 хвилин до 1 години). Після фіксації тромбоцити переважно промивають та висушують з метою отримання сухих фіксованих тромбоцитів. Час фіксації тромбоцитів підбирається таким чином, щоб його було досить також для знищення частини або всіх мікроорганізмів, які забруднюють препарат.

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до способу отримання та очищення від мікробних забруднювачів сухих фіксованих 2 кров'яних пластинок (тромбоцитів), придатних для використання у лікуванні людей.

Концентрати тромбоцитів успішно застосовуються у переливанні крові вже протягом тридцяти років. Проте, швидка втрата функціональної активності під час зберігання та ризик бактеріального забруднення дуже ускладнює ефективний облік та зберігання концентратів тромбоцитів у банках крові. У багатьох випадках обмежені терміни зберігання концентратів тромбоцитів значно зменшують рівень їх використання. 70 Е. Клейн (Е. Кієїп еї аїЇ., 9. Реаіайісв 49, 517-522, (1956)) описав приготування ліофілізованих препаратів тромбоцитів та їх застосування у лікуванні дітей з гострою лейкемією та апластичною анемією. При цьому введення супроводжувалося болем та спазмами судин у місці інфекції. Обмежену ефективність застосування таких препаратів продемонстровано в таблиці 2 згаданої роботи. Упродовж більше, ніж 30 років застосування, такі препарати тромбоцитів не показали задовільних терапевтичних результатів. 12 З метою зробити використання концентратів тромбоцитів у переливанні крові більш зручним для банків крові, виник значний інтерес у розробці засобів для усунення або принаймні зменшення втрати функціональної активності концентратами тромбоцитів під час зберігання. Один підхід полягав у створенні вільного від плазми середовища для зберігання (5. Ноіте, 05 Раїепі Мо4695460). Інший підхід полягав у розробці біохімічних технологій для стабілізації тромбоцитів (А. Воде еї аІ., 05 Раїепі Мо4994367). Хоча ці підходи забезпечують корисне продовження терміну зберігання, вони не дозволяють збільшити термін зберігання на значний період часу.

Врешті, було описано приготування мікровезикул з тромбоцитарних мембран, виходячи з, серед інших, прострочених препаратів тромбоцитів (Р. Спао, 05 Раїепі Мо5185160).

Описано використання висушених фіксованих тромбоцитів у діагностиці (Вгіпкпоиз еї аі,, 05 Раїепі с 29 Мо4287087). Такі сухі фіксовані препарати тромбоцитів можуть зберігатися протягом значного часу для Ге) діагностичних цілей, проте раніше вони не мали форми, придатної для фармацевтичного використання. Таким чином, все ще існує потреба у розробці нових засобів приготування кров'яних тромбоцитів, які мали б довгий термін зберігання та були придатними для використання у лікуванні людей.

Сухі фіксовані тромбоцити та спосіб їх приготування було описано раніше (М. Кеай еї аІ.,, РСТ Арріїсайоп -- 30 М/093/23997, опубліковано у грудні 1993 р.). со

Даний винахід відноситься до способу інактивації мікробіологічних забруднювачів у препаратах тромбоцитів крові людини. Спосіб включає, по-перше, отримання тромбоцитів, зокрема тромбоцитів людини, можливо -- забруднених мікроорганізмами (бактерії, віруси). Тромбоцити обробляють фіксатором протягом часу, Ге) достатнього для фіксації тромбоцитів. Після фіксації тромбоцити переважно промивають та висушують для 3о отримання сухих фіксованих тромбоцитів. Час фіксації тромбоцитів підбирається таким чином, щоб його було о досить також для знищення частини або всіх мікроорганізмів, які забруднюють препарат. Однак, час фіксації підбирається також таким чином, щоб він був недостатнім для втрати тромбоцитами після висушування та ресуспендування наступних властивостей: « 1) адгезія до тромбогенних поверхонь; З 40 2) відсутність адгезії до нетромбогенних поверхонь; с 3) зміна форми (округлення) під час адгезії до тромбогенних поверхонь; з» 4) агрегація та формування гемостатичного згустка під час контакту з тромбогенними поверхнями; 5) викид вмісту внутрішніх гранул.

Іншими словами, тромбоцити мають залишатися життєздатними після процедури фіксації. 45 Ці та інші аспекти даного винаходу детально пояснюються нижче. і-й Приготування біофармацевтичних препаратів на основі крові потребує усунення або знищення принаймні

Ге») кількох логарифмічних циклів мікробної інфекційності. У випадку часткового знищення (бактеріцидні та віроцидні методи) або повного знищення (процеси стерилізації) така інактивація дає гарантію, що кінцевий - продукт не містить побічних агетів, включаючи забруднювачі, які можуть надходити з вихідним матеріалом. со 20 Спосіб згідно даного винаходу можна здійснювати з використанням фіксатору, який обирають серед формальдегіду, параформальдегіду та глутарового альдегіду. Фіксація такими сполуками потребує ретельної - п : й . модифікації способу, описаного у ОЗ Раїепі Мо4287087, щоб запобігти втрати життєздатності тромбоцитів. В цілому, відмиті тромбоцити фіксують шляхом їх інкубації, звичайно при кімнатній температурі, до 60 хвилин (переважно від 30 до 45 хвилин, внаслідок того, що деякі віруси потребують для інактивації всього ЗО хвилин) у 1,895 розчині фіксатора (переважно від 1 до 295 фіксатора). Як детальніше обговоритиметься нижче, достатня

ГФ) фіксація також необхідна, щоб запобігти небажаного лізису під час подальшого етапу висушування.

Може бути застосована альтернативна техніка фіксації тромбоцитів шляхом їх інкубації у розчині о перманганату, (наприклад, перманганату натрію або перманганату калію). В цілому, згідно вказаної методики, відмиті тромбоцити інкубують у розчині КМпО); або МаМпО, з концентрацією від 0,01 до 1Ог/л протягом 5-20 60 хвилин, переважно у розчині КМпО; або МамМмпО) з концентрацією від 0,05 до Б5г/л протягом 5-15 хвилин, найкраще у розчині КМмМпО)Х або МампО), з концентрацією від 0,05 до 0,5г/л протягом 8-12 хвилин.

Для приготування фармацевтичних сполук препарати тромбоцитів обов'язково мають бути очищені від сторонньої речовини, зокрема від лізованих тромбоцитів, які можуть бути джерелом вільних тромбогенних факторів при введенні пацієнтові. Таким чином особливу увагу слід приділити достатній фіксації тромбоцитів бо (без порушення життєздатності за вищевказаними характеристиками) перед висушуванням. В іншому випадку процес висушування може супроводжуватися небажаним лізисом. Наприклад, препарати тромбоцитів, що придатні для приготування фармацевтичних сполук для людини, характеризуються такими показниками: при розведенні до концентрації 109 тромбоцитів на їмл розчину-не більше 10! мікрочастинок (фрагментованих залишків лізованих тромбоцитів) на мл та не більше 150 міжнародних одиниць (13) на літр лактатдегідрогенази у супернатанті при ресуспендуванні та осадженні (лактатдегідрогеназа у концентрації 22001О/л повністю лізує 109 клітин у 1мл).

Висушування тромбоцитів після фіксації може бути проведене одним з придатних способів, але переважно здійснюється шляхом ліофілізації. Слід приділити увагу стабілізації тромбоцитів перед висушуванням, щоб 70 запобігти небажаного лізису. Стабілізація здійснюється, наприклад, шляхом ресуспендування тромбоцитів у розчині, який містить молекули придатного замісника води ("стабілізатора"), такого як альбумін або трегалоза, та подальшого висушування розчину. На практиці застосовують розчин альбуміну у масовій концентрації від 0,1 до 2095, переважно розчин альбуміну у масовій концентрації від 1 до 1095, найкраще розчин альбуміну у масовій концентрації від 5 до 1095. Для застосування у лікуванні важливе значення має видоспецифічність альбуміну 75 (наприклад, для людини - людський альбумін). В іншому випадку, для стабілізації можна застосовувати альбумін іншого виду з подальшим його вилученням. Перед введенням суб'єкту у препарат додають видоспецифічний альбумін. Щоб запобігти антигенних реакцій у суб'єкта лікування, треба подбати про повне очищення препарату від видонеспецифічного альбуміну.

Фармацевтичні препарати згідно даного винаходу можуть складатися просто з сухих (переважно ліофілізованих) тромбоцитів, вільних від пірогенів, стерильних та у стерильній антисептичній упаковці.

Препарати можуть також містити альбумін, як було зазначено вище. Фармацевтичні суміші можуть також містити препарат тромбоцитів згідно даного винаходу, ресуспендований у фармацевтичне придатному носії. В ролі такого носія може бути використаний будь-який водний носій, здатний гідратувати тромбоцити таким чином, щоб вони мали вищезгадані характеристики та придатний для внутрішньовенної ін єкції (наприклад, стерильний, СМ вільний від пірогенів фізіологічний сольовий розчин). Суспендована суміш також може містити інші додаткові о агенти, такі як буферні розчини, консерванти та інші фармацевтично активні речовини (див. 05 Раїепі

Мо4994367, зміст якого приведено вище).

Для лікування хворих людей фармацевтичні суспензії згідно даного винаходу звичайно застосовують у вигляді внутрішньовенних ін'єкцій. Такого лікування потребують пацієнти, які страждають на тромбоцитопенію, -- геморагічну дисфункцію тромбоцитів, а також важкотравмовані пацієнти, які зазнали великої втрати крові. Доза со фармацевтичного препарату буде залежати від ваги та стану пацієнта, та звичайно складатиме від 20 до ЗБОмл за об'ємом у концентрації від 1х109 до З3х109 тромбоцитів на 1мл (найкраще від 2хХ109 до 3х109 тромбоцитів на (87

ТІмл) . Фармацевтичні препарати можуть бути розфасовані у стерильні, вільні від пірогенів контейнери У «ОО дозованих об'ємах.

Даний винахід детальніше описано у наступних прикладах. Ці приклади ілюструють винахід, але ніяким юю чином не обмежують його.

Приклад 1

Приготування сухих фіксованих тромбоцитів. «

А. Приготування ліофілізованих тромбоцитів людини (Протокол 1). Тромбоцити отримують, виходячи з суміші крові та розчину кислого цитрату декстрози (ЦД) в ролі антикоагулянту (0,085М цитрат натрію, 0,0702М но) с лимонної кислоти, 0,111М декстрози, рН-4,5) у співвідношенні атникоагулянт-кров 1:5,66. Тромбоцити виділяють "» шляхом диференційного центрифугування та відмивають кислим цитратним буфером (0,00544М цитрату натрію, " 0,154М масі, рН доводять до 6,5 за допомогою 0,1Н НС).

Після відмивання тромбоцити фіксують, інкубуючи тромбоцити, які отримано з 100мл крові, у 5,Омл 1,890 розчину параформальдегіду (приготований, виходячи з 9,Омл 495 розчину параформальдегіду, додаючи 1,0мл і-й ЦД та 10мл 0,135М Ман»оРО),) протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (час фіксації можна збільшити до

Ге») 60 хвилин). Альтернативний спосіб полягає в інкубації відмитих тромбоцитів, отриманих з 100мл крові в 195 розчині параформальдегіду протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (час фіксації можна збільшити до 60 - хвилин). г) 20 Для усунення параформальдегіду після інкубації у кожну пробірку додають рівну кількість імідазольного сольового буферу (0,084М імідазолу, 0,146М Масі, рН доводять до 6,8 за допомогою 1,0Н НОЇ). Після цього ть тромбоцити осаджують центрифугуванням при 15009 протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант зливають, а осад тромбоцитів промивають, ресуспендуючи його в 5-1О0мл імідазольного буферу, рн-7,35.

Промивання повторюють ще двічі для повного видалення параформальдегіду. Після третього промивання 22 тромбоцити ресуспендують у 595 розчині сироваткового альбуміну (5г альбуміну на 100мл цитратного буферу:

Ф! 0,0054М цитрату натрію, 0,154М Масі, рН 6,5). Тромбоцити підраховують, використовуючи фазовоконтрастний мікроскоп та гемоцитометр (Атегісап Оріїса! ВгідпЕ іпе Нетосуіотегег). Концентрацію тромбоцитів доводять до з 800000 на мм.

Аліквоти по 1Омл суспензії тромбоцитів доведеної концентрації у розчині сироваткового альбуміну вносять у 60 скляні пробірки та заморожують до -70"С. Потім тромбоцити ліофілізують протягом 12 годин до отримання розсипчастого білого порошку.

Препарати тромбоцитів також можуть бути заморожені у більших об'ємах (від 100 до 5О0Омл) та ліофілізовані протягом 4 годин при температурі -40"С, після чого на решту часу висушування температуру підвищують до -2570. Ліофілізовані продукти зберігають при температурі від -207С до -70"С до використання. бо Ліофілізовані тромбоцити регідратують у 0,084М імідазольному безсольовому буфері, рН якого доводять до

7,35 за допомогою 1,0М Маон. Після додавання імідазольного буферу суміш залишають на декілька хвилин, потім обережно перемішують, обертаючи пробірки, для отримання гомогенної суспензії регідратованих окремих тромбоцитів.

Б. Приготування ліофілізованих тромбоцитів людини (Протокол 2) . Цілісну кров отримують від здорових добровільних донорів у стандартні контейнери для збирання крові (Гепжша! 4К6402, Вахіег Неаїйй Саге), які містять стандартну кількість антикоагулянту (СРОА-1). Кінцевий об'єм кожного зразку отриманої крові після змішування з цитратом становить 500см 3. Кожний контейнер з цілісною кров'ю центрифугують для отримання збагаченої тромбоцитами плазми, яку вилучають з контейнерів та відмивають, проводячи три цикли 70 центрифугування/ресуспендування у фосфатному буферному розчині (такому, як описано у пункті А). Після цього відмиті тромбоцити осаджують центрифугуванням, та обробляють осад буферним розчином, що містить 1,896 параформальдегіду (описаного у пункті А), протягом 45 хвилин-1 години при кімнатній температурі. Вихід тромбоцитів після вилучення стабілізуючого агенту та подальшого промивання для видалення параформальдегіду складає 60-8095 від вихідної кількості, підрахованої перед стабілізацією. Якщо буферний 75 розчин, яким промивають тромбоцити після стабілізації, не містить альбуміну, відсоток виходу тромбоцитів зменшується.

Склад суспензії тромбоцитів перед заморожуванням та висушуванням є важливим для отримання необхідного кінцевого виходу тромбоцитів. В цілому, для забезпечення виходу 85-10095 після процедури ліофілізації та регідратації необхідно, щоб буферний розчин містив ефективну кількість стабілізатору, такого як альбумін або трегалоза. Альбумін вводять у концентрації від 1 до 500г/л, переважно у концентрації від 10 до 250г/л, найкраще у концентрації від 50 до 100г/л. Трегалозу вводять у концентрації від 0,1 до 1ОМ, переважно у концентрації від 0,2 до 5М, найкраще у концентрації від 0,5 до 1,0М. Можна застосувати декілька типів дегідратуючих розчинів без помітної різниці кінцевих параметрів: фосфатний сольовий буферний розчин, рнН-7,З; трис-сольовий буферний розчин, рН-7,4; імідазольний сольовий буферний розчин, або ОМІБОЇ тм с збалансований фізіологічний сольовий розчин. о

Приклад 2.

Очищення тромбоцитів від бактерій

Метою цього експерименту було дослідження кінетики інактивації бактерій 1,8956 розчином формальдегіду під час процесу консервації тромбоцитів. -

Дванадцять контейнерів тромбоцитів були отримані від Американського Червоного Хреста. Васійшв сегеиз були введені в кожний контейнер до отримання колонієутворюючих одиниць (КО) у кінцевій концентрації о

Б5ОКО/мл у всіх контейнерах. З вмісту шести контейнерів приготували ліофілізовані препарати тромбоцитів згідно че прикладу 1 (протокол 1) та повернули їх у нові контейнери для зберігання тромбоцитів. Шість інших зразків залишились у вихідних зберігальних контейнерах. Щоденно протягом семи днів у всіх контейнерах кількісно шо оцінювали рівень росту бактеріальних культур (розсівання О,їмл суспензії після серії розведень на чашки з юю агаром та інкубація протягом 48 годин при температурі 37"С, зразки продубльовано). В результаті спостерігали ріст Васіййз сегеиз на всіх шести зразках, що зберігались за нормальних умов, але не на оброблених тромбоцитах. «

У другому експерименті шість контейнерів з тромбоцитами були інокульовані біарпуіососсизв ерідегтів у кінцевій концентрації 5ОКО/мл. Вміст кожного контейнеру розділили на дві рівні частини. Одну частину з-д с кожного контейнеру обробили згідно прикладу 1 (протокол 1) та повернули після цього у нові контейнери для ц зберігання. Решту зразків зберігали за нормальних умов. В результаті на необроблених зразках усіх контейнерів ,» на третій день спостерігали ріст З. ерідептіз. У попередніх експериментах було показано, що ураження препаратів тромбоцитів, інокульованих 5. ерідегтів у кінцевій концентрації 5ОКО/мл, спостерігалося у 10095 випадків на 7 день (М. Вгеспег еї аї., Тгпеїивіоп 34, 750-755 (1994)). Фіксовані та відмиті згідно прикладу 1 1 тромбоцити залишились стерильними протягом всіх 7 днів спостереження.

Приклад 3. (22) о б нон чищення тромбоцитів від вірусів -й В цьому експерименті модельні віруси, що репрезентують широкий спектр вірусних характеристик, були випробувані на інактивацію через п'ять різних проміжків часу при інкубації у 1,895 розчині параформальдегіду

Мн згідно прикладу 1. - М Для досліду були обрані наступні віруси, які представляють спектр біофізичних та структурних рис, що можуть відображувати характеристики потенційних забруднювачів вихідного матеріалу: 1) Вірус діареї великої рогатої худоби (ВМО, штам КУ-22)-розмір 40-7Онм, має ліпідну оболонку,

РНК-вмісний вірус. Останні дослідження вірусного геному та фізичні характеристики вірусу гепатиту С (НСМ, відомий як гепатит ні-А ні-В) показали, що він належить до родини флавовірусів, роду пестівірусів. Зважаючи

ІФ) на те, що НСМ не може бути культивований іп міїго, та для нього не існує придатних модельних тварин, крім ко шимпанзе, ВМО був використаний як модель НСМ в даному експерименті . 2) Вірус енцефаломіокардиту (ЕМС, штам ЕМС)-розмір 28-ЗОнм, не має ліпідної оболонки, РНК-вмісний 60 пікорнавірус, дуже стійкий до багатьох стандартних методів інактивації вірусів. Цей вірус належить до тієї ж родини, що й вірус гепатиту А та є, відповідно, непоганою моделлю для нього.

З) Вірус імунодефіциту людини (НІМ, штам НТІМ-ПІВ)-розмір, 80-100нм, має оболонку, РНК-вмісний ретровірус, є потенційним забруднювачем крові людини. НІМ було титровано іп міго синцитіальним методом

СЕМ-А. Через 7-10 днів після інфікування НІМ клітини СЕМ-А утворюють багатоядерні клітини (синцитії), які 65 легко спостерігаються. Всі роботи з НІМ проведено на спеціалізованому обладнанні ВСІ -3 (Віогеспн).

Ї. Методика

А. Матеріали

Аліквотні проби стерильного вихідного продукту (тромбоцитів у цитратному сольовому буферному розчині) приготували за описаною вище методикою. Контрольний матеріал зберігали при температурі від 227С до 2876.

Аліквоти 495 параформальдегіду, 0,135М буферний розчин фосфату натрію, буферний розчин ЦД та імідазольний сольовий буферний розчин зберігали при кімнатній температурі.

Б. Дослідження токсичності

В попередньому дослідженні було перевірено токсичність контрольного матеріалу на індикаторних клітинах

ВТ-1, які використовували для титрування ВМО, індикаторних клітинах МЕКО, які використовували для 7/0 титрування ЕМС та індикаторних клітинах СЕМ-А, які використовували для титрування НІМ-1. Для кожного вірусу було перевірено на цитотоксичність такі дослідні зразки: 1) розчин тромбоцитів перед обробкою параформальдегідом; 2) розчин тромбоцитів після обробки 1,895 розчином параформальдегіду.

На початку аналізу 1,8мл дослідного зразку І (РМ-001) обробили 0,2мл суспензії вірусу в буфері, потім 7/5 додали 1,6мл 495 розчину параформальдегіду. Таким чином створено зразки РМ-004, РМ-006 та РМ-008. Другу аліквотну пробу приготували, обробивши 3,Змл вихідного розчину тромбоцитів (РМ-001) 0,7мл суспензії вірусу в буфері. Таким чином створено зразки РМ-003, РМ-005 та РМ-007. Усі зразки перевірено в двох екземплярах на цитотоксичність на відповідних індикаторних клітинах. Перевіряли нерозведені розчини, розведені у 10 разів та розведені у 100 разів (в мінімальному середовищі Ігла (ЕМЕМ)) відповідно стандартного протоколу титрування

Кожного вірусу (див. Розділ 4.60). Якщо внаслідок дії зразку, злиття моношару індикаторних клітин було меншим 5090, то такий зразок вважали цитотоксичним.

За результатами попереднього дослідження токсичності, проби, що містили параформальдегід, показали досить високий ступінь цитотоксичності. Тому взяли додаткові зразки, що містили тромбоцити, оброблені параформальдегідом, але параформальдегід було видалено шляхом центрифугування та промивання. Такі сч

Зразки аналізували безпосередньо, без зараження, за методикою, описаною вище. Таким чином створено зразки

РМ-032, РУ-03З3 та РУ-ОЗ4. і)

В. Дослідження інактиваційних властивостей.

Для кожного з вірусів, що аналізувалися, контроль проведено в таких точках: 1) То, ч: зо 2) То 5-30 хвилин;

З) 4-1 година; і 4) Т1 5-1 година ЗО хвилин; «- 5) Т2-2 години.

Вихідний продукт (3З,бмл тромбоцитів у цитратному сольовому буферному розчині), температура якого була ісе) 25537С, обробили 0,4мл вірусу з високим титром. Рівень рН зразку довели до 6,8-7,6, та зразок поділили на дві ю рівні аліквотні проби. Одну з проб одразу ж заморозили до температури -70"С або нижче для того, щоб використати її як дублікат. Паралельно зробили аналіз іншої аліквотної проби, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д. Таким чином створено зразок "То". 21,бмл вихідного продукту (тромбоцити у цитратному сольовому буферному розчині) центрифугували « протягом 8 хвилин при 8009 та при температурі 255437С для осадження тромбоцитів. Приготували свіжий 290 шщ с розчин параформальдегіду, змішавши 12,5мл 4956 розчину параформальдегіду з 11,5мл 0,135М фосфатного буферного розчину та 1,0мл буферного розчину ЦД. Після того, як видалили цитратний сольовий супернатант, ;» осаджені тромбоцити ресуспендували у 21,бмл свіжого 295 розчину параформальдегіду. Таку тромбоцитарну суспензію обробили 2,4мл вірусу з високим титром, довівши таким чином концентрацію параформальдегіду до 450 1,890. Вихідний продукт, що обробили 1,895 розчином параформальдегіду, поділили на чотири аліквоти, три с об'ємом по 4мл і одну об'ємом 10л. Після цього зразки інкубували на водяній бані з температурою 255370. За змінами температури спостерігали та реєстрували.

Ме. Для створення зразків Т ов, Т4 та Ті 5 (ж 1 хвилина) взяли аліквоти об'ємом по 4мл. До кожної аліквоти - об'ємом 4мл додали 4мл імідазольного сольового буферного розчину. Ці зразки тричі перемішали, 5р перевертаючи, і центрифугували протягом 8 хвилин при 8009 та при температурі 25537"С. Супернатант злили та о тромбоцити ресуспендували у 4мл імідазольного сольового буферного розчину. Зразки тричі перемішали, як перевертаючи, і центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25537"С. Цю процедуру повторили ще двічі. Після останнього центрифугування тромбоцити ресуспендували у 4мл імідазольного сольового буферного розчину. Зразок поділили на дві рівні частини. Одну з частин одразу ж заморозили до дв температури -707С або нижче для того, щоб використати її як дублікат. Паралельно зробили аналіз іншої аліквотної проби, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д. Для

Ф) аналізу на ВМО та ЕМС 0,5мл розведених та нерозведених зразків нанесли у кожну з трьох лунок до кінцевого ка об'єму 1,5мл. Для аналізу на НІМ, О,2мл розведених та нерозведених зразків нанесли у кожну з чотирьох лунок до кінцевого об'єму 0,8мл. Для створення зразку Т 5 (41 хвилина) вийняли зразок об'ємом 1Омл. До кожної бо аліквоти об'ємом 1Омл додали 17Омл імідазольного сольового буферного розчину. Ці зразки перемішали, перевертаючи, три рази і центрифугували протягом 8 хвилин при 8009 та при температурі 25537"С. Супернатант злили та тромбоцити ресуспендували у 10мл імідазольного сольового буферного розчину. Зразки перемішали, перевертаючи, три рази і центрифугували протягом 8 хвилин при 8009 та при температурі 255370. Цю процедуру повторили ще двічі. Після останнього центрифугування тромбоцити ресуспендували у 1Омл 65 імідазольного сольового буферного розчину. Зразок поділили на дві рівні частини. Одну з частин одразу ж заморозили до температури -707"С або нижче для того, щоб використати її як дублікат. Паралельно зробили аналіз іншої частини, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д.

Для аналізу на ВМО та ЕМС, 0,5мл нерозведених зразків нанесли у кожну з восьми лунок до кінцевого об'єму 4мл. Для аналізу на НІМ, 0,2мл нерозведених зразків нанесли у кожну з двадцяти лунок до кінцевого об'єму 4мл.

Усі розведені зразки наносили у лунки, як описано для перших чотирьох часових точок.

Г. Контроль (1) Позитивний контроль. Як позитивний контроль для кожного вірусу використовували материнський розчин вірусу. (2) Негативний контроль. Як негативний контроль в кожному аналізі використовували чисте середовище для 7/0 Культивування клітин, яке застосовували при титруванні вірусів.

Д. Титрування вірусів

На початку процедури одну аліквотну пробу від кожного зразку та контролю розвели у середовищі для культивування клітин у таких пропорціях: 109, в З рази, 107, 1072, 1073, 107, 1075, 1076, 1077 та 108,

Кожне розведення аналізували на присутність інфекційних вірусних часточок, використовуючи стандартну 75 процедуру вірусного титрування, яка описана нижче для кожного вірусу.

ВМО: кожне розведення зразків, які містять ВМО, аналізували на присутність інфекційних вірусних часточок за допомогою тесту на стерильні плями з використанням індикаторних клітин ВТ.

ЕМС: кожне розведення зразків, які містять ЕМС, аналізували на присутність інфекційних вірусних часточок за допомогою тесту на стерильні плями з використанням індикаторних клітин МЕКО.

НІМ: кожне розведення зразків, які містять НІМ, аналізували на присутність інфекційних вірусних часточок за допомогою синцитіального тесту з використанням СЕМ-А індикаторних клітин.

ЇЇ. Результати та пояснення

А. Валідність

Тест виявився валідним. Позитивний контроль виявив ознаки інфекційних вірусів, і негативний контроль не Га виявив вірусів.

Б. Дослідження токсичності о

Результати дослідження токсичності на індикаторних клітинних лініях ВТ, СЕМ-А та МЕКО, що використовувалися для титрування вірусів, подано в Таблиці 1. Вимивання параформальдегіду після обробки ним тромбоцитів, значно знижує токсичність, яка спричинена такою обробкою (РМ-032, РУМ-0О33 та РМ-034). Усі «ч- дослідження вірусів проводили, використовуючи таке вимивання. р -

Ф зв ю

РУ-004 Розчин тромбоцитів після обробки 1,895 розчином параформальдегіду вт Токсичний нерозведений,

По попів НИКА Кесеч нан « й ? 1071,102 - ї» 10-71, 102, 103 сл

Ге») В. Дослідження інактиваційних властивостей -з Титри вірусів у кожному зразку та контрольному зразку для дослідження інактиваційних властивостей вказано в таблицях 2-4. Титр вірусів виражено через кількість плямоутворюючих одиниць (ПО) на мл або (95) 90 кількість синцитій-формуючих одиниць (СО) на їмл. Якщо виявлено менше 5БПО(СО) у Імл або не виявлено ще зовсім, титри вірусів виражали як «5,0х100ПО(СО)мл. У випадку визначення НІМ на клітинах СЕМ-А використовували трикратне розведення. Якщо виявлено менше 5ПО(СО) у мл або не виявлено зовсім, титри вірусів виражали як «1,5Х10 ПО(СО)умл для трикратно розведених та нерозведених зразків. Значення логарифму зниження титру розраховується шляхом віднімання ІДІПО(СО)/млі кожного зразку від відповідного значення зразку "То". (Ф. Процес інактивації вірусу розчином параформальдегіду знижував титр вірусу для ВМО до значення Ід-6,93 ко (вірус не визначається), для ЕМС - до значення Ід-8,78 (вірус не визначається), для НІМ - до значення Ід-4,77 (вірус не визначається). во Г. Статистичний аналіз

Для визначення змін у титрі вірусів, виявлених після тестування додаткових зразків на додаткових лунках, застосовували статистичний аналіз на основі розподілу Пуасона. Для таких випадків чутливість методу може бути зменшена нижче поточного рівня. У випадках ВМО та ЕМС, якщо вірусу не було виявлено після серії розведень на додаткових лунках, титр виражали як 0,58ПО/мл. У випадку НІМ, якщо вірусу не було виявлено 65 після серії розведень на додаткових лунках, титр виражали як 0,29СО/мл.

Таблиця 2

Титри вірусу діареї, великої рогатої худоби (ВМО)

Номер зразку Опис зразку Титр вірусу, Ід Ід (ПО/мл) (ПО/мл) зниження титру

РМ-014 Материнський розчин вірусу) 6,5х107

РУ-то зактоз "- титр вірусу не визначається;

ПО - плямоутворюючі одиниці;

Значення Ід зниження титру розраховується шляхом віднімання Ід(ПО/мл) кожного зразку від відповідного значення зразку "То" (РМ-009).

Таблиця З

Титри вірусу енцнефаломіокардиту (ЕМС)

Номер зразку Опис зразку Титр вірусу, Ід Ід (ПО/мл) (ПО/мл) зниження титру

РМ-020 Материнський розчин вірусу) 2,1х109 7 РУте зако о " - титр вірусу не визначається; со

ПО - плямоутворюючі одиниці; -

Значення Ід зниження титру розраховується шляхом віднімання Ід(ПО/мл) кожного зразку від відповідного з5 значення зразку "То" (РМ-015). юю

Таблиця 4

Титр вірусу імунодефіциту людини «

Ш твою блюз в Й

СО/мл СоО/мл) зниження титі ( ) ( ) ру в с РУ-026 Материнський розчин вірусу 5,вх105

Ручог тлкої .

РУ-о2в тек! (о) "- титр вірусу не визначається; - СО - синцитій-формуючі одиниці; (95) х Значення Ід зниження титру розраховується шляхом віднімання Ід(СО/мл) кожного зразку від відповідного значення зразку "То" (РМ-021).

Вищезгадані приклади ілюструють даний винахід, але не обмежують його. о

Claims (8)

Формула винаходу

1. Спосіб інактивації мікробіологічних забруднювачів у препаратах, виготовлених із тромбоцитів крові людини, який включає 60 - отримання тромбоцитів крові, які можливо забруднені мікроорганізмами; - обробку вищезгаданих тромбоцитів людини фіксатором протягом часу, що достатній для їх фіксації; - висушування вищезгаданих тромбоцитів з отриманням фіксованих сухих тромбоцитів крові, причому - вищезгадану обробку проводять протягом часу, що достатній для того, щоб знищити вищезгадані мікроорганізми і бо - вищезгадану обробку проводять протягом часу, що недостатній для того, щоб вищезгадані тромбоцити втратили такі властивості, як: а) адгезія до тромбогенних поверхонь; б) відсутність адгезії до нетромбогенних поверхонь; в) зміну форми (округлення) під час адгезії до тромбогенних поверхонь; г) агрегацію та формування гемостатичного згустку під час контакту з тромбогенними поверхнями; д) викид вмісту внутрішніх гранул.

2. Спосіб за п. 1, де вищезгадані мікроорганізми обираються з групи, що складається з бактерій та вірусів.

З. Спосіб за п. 1, де вищезгадану обробку проводять, змішуючи вищезгадані тромбоцити з розчином, що 7/0 Містить згаданий фіксатор.

4. Спосіб за п. 1, де висушування проводять шляхом ліофілізації.

5. Спосіб за п. 1, де згаданий фіксатор обирається з формальдегіду, параформальдегіду та глутаральдегіду.

6. Спосіб за п. 1, де фіксатор є перманганатом.

7. Спосіб за п. 1, де після фіксації тромбоцити стабілізують альбуміном.

8. Спосіб за п. 1, де після фіксації тромбоцити стабілізують трегалозою. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2003, М 5, 15.05.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «- (зе) «- (Се) ІС в) -

с . и? 1 (о) - о) 70 - іме) 60 б5