KR100420799B1

KR100420799B1 - 혈소판의 미생물 정화방법

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Publication number: KR100420799B1
Application number: KR1019970707380A
Authority: KR
Inventors: 마르조리 에스. 리드; 아더 피. 보드; 루이스 제이. 수마리아
Original assignee: 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐; 아모르 파마세티칼 컴퍼니; 이스트 캐롤라이나 유니버스티
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2004-05-20
Also published as: AU5481596A; EP0821595B1; IL117722A0; CA2217298A1; CA2217298C; DE69603174T2; CN1124160C; KR19990007857A; DK0821595T3; BR9608147A; HUP9802706A3; HUP9802706A2; WO1996032969A1; CN1185117A; ATE181838T1; EP0821595A1; IL117722A; ZA962883B; UA56131C2; AU701723B2

Abstract

인간 혈소판제제에 미생물 오염의 불활성화 방법이 개시된다. 방법은 우선 미생물로 오염이 될 우려가 있는 혈소판, 특히 인간의 혈소판을 제공한다. 혈소판을 고정제와 혈소판을 고정하기에 충분한 시간동안(바람직하게는 45분 내지 1시간 동안) 접촉한다(바람직하게는 1.8% 파라포름알데하이드 용액과 이들을 결합하여). 고정 후, 혈소판은 바람직하게 세정하고 건조하여 고정-건조 혈소판을 생산한다. 혈소판을 고정제와 접촉하는 단계는 오염 미생물의 일부 또는 모두를 사멸하기에 충분한 시간동안 실시된다.

Description

혈소판의 미생물 정화방법

수혈약제에 혈소판 농축제의 사용은 지난 30여년 동안 잘 정착되어왔다. 그러나, 저장기간동안 혈소판 기능의 빠른 손실과 세균의 오염 위험은 혈액은행에서 혈소판의 효과적인 재고관리를 매우 곤란하게 하고 있다. 많은 경우에서, 혈소판 농축제의 제한된 저장수명은 이의 사용을 크게 단축하는 것이다.

E. Klein등은 J. Pediatrics 49, 517-522(1956)에서 동결건조된 혈소판물질의 제조 및 급성 백혈병 및 혈소판 결핍 빈혈을 가진 어린이에게 이를 투여하는 것을 설명하고 있다. 주입자리에서 통증과 정맥수축이 보고되었다. 이 물질의 제한된 효과는 본 명세서 표 2에 나와 있다. 30여년 후에, 이들 물질은 유용한 치료제로서 사용되고 있지는 않다.

혈소판 수혈치료를 혈액은행에서 잘 관리할 수 있도록 만들기 위해서, 저장기간동안 혈소판 기능의 손실을 방지하거나 지연하기 위한 다양한 방법에 지속적인 관심이 있어 왔다. 한 방법은 플라즈마가 없는 보존매질의 개발의 일환으로 이루어졌다. 일례로 S. Holme의 미국특허 제4,695,460호 참조. 다른 시도는 혈소판을 안정화하는 생화학적 기술을 적용하는 것이 있었다. A. Bode 등의 미국특허 제4,994,367호 참조. 이들 기술이 저장수명의 연장에 유용하지만, 이들은 장기간동안의 저장수명의 연장은 제공하지 못한다. 결국, 이들 중에서 오래된 혈소판으로부터 혈소판 막의 미세소포의 제조가 F. Chao의 미국특허 제5,185,160호에 개시되었다.

진단용 분석을 위해 사용되고 있는 고정 건조된 혈소판은 Brinkhous 등의 미국 특허 제4,287,087호에 개시되어있다. 그러나 이들 고정 건조된 혈소판제조는 진단을 목적으로 장기간 저장될 수 있을 지라도, 지금까지 인간을 위한 약제의 용도의 형태로 제공되어진 적이 없다. 따라서, 장기간의 저장수명을 가진 인간 환자에게 투여하기에 적합한 혈소판 제제의 제조방법에 대한 지속적인 요구가 있어 왔다.

M. Read 등은 PCT출원 제WO93/23997호(1993년 12월 9일 공개)에서 고정 건조된 혈소판 및 이의 제조공정을 개시하였다.

본 발명은 인간환자에게 투여하기에 적합한 고정 건조된 혈소판의 제조방법으로서, 제조 동안 혈소판의 미생물 정화를 달성할 수 있는 방법이다.

본 발명에서는 인간 혈소판 제제에 미생물 오염물을 불활성화하는 방법이 개시된다. 본 방법은 우선, 미생물(예를 들면, 박테리아, 바이러스)에 의한 오염의 우려가 있는 혈소판, 특히 인체 혈소판을 제공하는 것을 포함한다. 그후, 혈소판을 고정하기에 충분한 시간동안 혈소판을 고정제(fixative)에 접촉하고, (바람직하게는) 세정하고, 건조하여 고정 건조된 혈소판을 제조한다. 혈소판을 고정제에 접촉시키는 단계는 일부 또는 모든 오염 미생물을 사멸하는데 충분한 시간 동안 실시한다. 그러나, 접촉 단계는 건조 및 환원(reconstitution) 시에 혈소판이 다음의 기능을 잃지 않을 시간동안 실시된다.

(ⅰ) 트롬보젠의 표면에 부착함;

(ⅱ) 트롬보젠 이외의 표면에 부착 안함;

(ⅲ) 트롬보젠의 표면에 부착시 형태변환(퍼짐) 실시;

(ⅳ) 트롬보젠의 표면에 부착시 서로서로 지혈성 플러그를 형성하도록 부착함; 및

(ⅴ) 그들의 과립형 내용물을 분비.

즉, 혈소판은 고정 처리후에도 활성이 남아있어야 한다.

본 발명의 다른 목적과 태양은 이하의 명세서에서 상세히 설명될 것이다.

혈액에서 유도된 생약제의 제조에서는, 미생물 전염성의 적어도 수 로그 사이클(log cycle)을 제거 또는 불활성(즉 사멸)하는 과정을 포함하는 것이 바람직하다. 미생물의 부분 사멸 (예를 들면, 박테리아 사멸 또는 바이러스 사멸과정) 또는 미생물의 완전 박멸(예를 들면, 멸균과정)과 같은 불활성화는 시작 물질로 유입될 수 있는 오염물을 포함한 우발성제제(adventitious agent)가 최종 산물에 존재하지 않는 다는 확신을 제공한다.

본 발명의 방법은 포름알데하이드, 파라포름알데하이드 및 글루타르알데하이드로 이루어진 군에서 선택된 고정제로 수행될 수 있다. 상기 제제에 의한 고정은 미국 특허 제4,287,087호에 개시된 과정에서 혈소판의 생존력의 손상을 피하기 위해 주의 깊은 수정이 필요하게 된다. 일반적으로 세정된 혈소판을 실온에서 60분 이하 동안(30분 정도에서 불활성화되는 일단의 바이러스와 함께 30 내지 45분 이상이 바람직하다) 1.8% 이하의 고정제 용액(바람직하게는 1 내지 2% 고정제)에서 배양을 함으로서 이를 고정한다. 이하에서 더욱 상세하게 설명될 바와 같이, 보관은 혈소판을 충분히 고정하도록 실시되어야하고 그렇지 않으면 과도한 분해가 이의 제조과정 동안 발생할 것이다.

다른 기술은 퍼망가네이트 용액(예를 들면, 소디움 퍼망가네이트, 포타슘 퍼망가네이트)에 혈소판을 배양하여 혈소판을 고정하는 것이다. 일반적으로, 세정된 혈소판은 KMnO₄또는 NaMnO₄용액의 0.001 내지 1g/dL에서 5 내지 20분 동안 배양하고, 보다 바람직하게는 KMnO₄또는 NaMnO₄용액의 0.005 내지 0.5g/dL에서 5 내지 15분 동안 배양하고, 가장 바람직하게는 KMnO₄또는 NaMnO₄용액의 0.005 내지 0.05g/dL에서 8 내지 12분 동안 배양하여 이 방법으로 제조된다.

약제학적 제제로 제조하기 위한 혈소판 제제는 필수적으로 외래물질이 제거되어야 하고, 특히 유리 트롬보젠제를 제제가 투여된 환자에게 제공하는 분해된 혈소판이 없어야 한다. 따라서, 관리는 건조전에 혈소판을 충분히 고정하도록(이상의 특징으로 지시되는 바와 같이, 그의 생존력을 파괴하지 않으면서) 실시되어야 한다. 왜냐하면 그렇지 않으면 과도한 분해가 건조 과정 동안 발생할 것이다. 예를 들면 인간 약제학적 조제물 제조에 사용하기에 적당한 혈소판 제제는 용액 1밀리리터에서 10⁹혈소판의 환원, 적어도 밀리리터당 10×10⁶마이크로파티클(분해된 혈소판에 남아있는 분획)을 보이고, 바람직하게는 재현탁과 펠렛팅(pelleting) 후에 상청액에 있는 락테이트 디하이로게나제 1 리터당 150 국제단위(IU)이하를 보이는 것이 바람직하다(1 리터당 2200IU는 1 밀리리터에 10⁹세포의 총 분해를 의미한다).

고정 단계후 혈소판의 건조는 적당한 수단으로 수행될 것이지만, 동결건조로 수행되는 것이 바람직하다. 관리는 건조전에 혈소판 제제를 안정화하도록 실시되어만 한다. 그렇지 않으면 혈소판 분해는 수용될 수 없는 수준으로 발생할 수 있다. 안정화는 알부민 또는 트레할로스(trehalose)와 같은 분자(또는 "안정제")를 대치할 적당한 물을 함유한 용액에 혈소판을 현탁하고, 상기 용액을 건조하여 실시한다. 한 실시예에서는, 0.1 내지 20중량%의 알부민을 사용하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%의 알부민을 사용하고, 가장 바람직하게는 5 내지 10중량%의 알부민을 사용하는 것이다. 대상에 투여하기 위해서는, 제제중의 알부민은 대상과 동일한 종의 알부민이 될 것이다. 또한, 제제는 다른 종류의 알부민, 환원시 혈소판에서 분리된 알부민, 및 대상에게 투여하도록 환원된 제제로 만들기 위해서 첨가한 이종의 알부민과 함께 건조할 수 있다. 그러나 관리는 대상자 치료시 이종 알부민이 항원이 될 수도 있기 때문에, 모든 비-동류의 특이적 알부민을 제거하도록 실시하여야만 한다.

본 발명의 약제학적 조제물은 피로겐이 없고, 살균된 무균의 포장물에 간단히 건조(바람직하게는 동결건조된) 혈소판을 포함한다. 상기한 바대로 알부민은 포함될 수 있을 것이다. 약제학적 조제물은 약제학적으로 수용가능한 캐리어에 환원된 본 발명의 혈소판제제를 포함할 수 있을 것이다. 혈소판을 재수화하여 상기에서 열거한 여러 가지 특성을 가지고 정맥내 주사에 적당한 수성 캐리어가 이용될 수 있다(예를 들면, 살균, 피로겐이 없고(pyrogen free), 생리학적 식염수 용액). 버퍼, 방부제, 및 다른 치료학적 활성제와 같은 추가적인 제제는 환원된 조제에 포함할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,994,367호 참조(개시 내용을 본 명세서에서 참조로 삽입함).

본 발명의 환원된 약제학적 조제물은 전형적으로 정맥내 주사로 인간 환자에게 투여된다. 이러한 치료가 필요한 환자는 혈소판 감소증(thrombocytopenia)(유실된 혈소판 감소증 포함)으로 고통 받는 환자, 출혈성 혈소판 기능부전으로 고통 받는 환자 및 심각한 상처를 경험한 외상의 피해자를 포함한다. 투여된 약제학적 조제물의 함량은 환자의 체중 및 상태에 따라서 다르지만, 부피로 20 내지 350 밀리리터이고, 농도로는 밀리리터당 1×10⁹내지 3×10⁹의 혈소판(보다 바람직한 것으로는 밀리리터당 2×10⁹내지 3×10⁹의 혈소판)이다. 약제학적 조제는 살균되고 피로겐 없는 용기에 포장되어 한 단위 투여량으로 부피를 정하고 조제될 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예로 보다 자세히 예시될 것이다. 이들 실시예는 다만 이해를 위한 것이고, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

고정 건조된 혈소판의 조제

A. 동결건조된 인간 혈소판의 제조(프로톨콜 1)인간 혈소판은 에시드 시트레이트 덱스트로즈(ACD) 항응고제(0.085M 트리소디움 시트레이트, 0.0702 M 시트릭 에시드, 0.111M 덱스트로즈, pH 4.5)로 처리한 혈액에서 조제된다. 혈소판은 원심분리로 분리되고 에시드 시트레이트 식염수로 3회 세정된다(0.00544 M 트리소디움 시트레이트, 0.154M NaCl, 0.1N HCl로 pH 6.5 조정).

세정 후, 혈소판은 100㎖의 혈액에서 세정된 혈소판을 1.8% 파라포름알데하이드 용액(4% 파라포름알데하이드 용액 9.0㎖에 ACD 1.0㎖, 0.135 M NaH₂PO₄10.0㎖ 더하여 제조) 5.0㎖에서 실온에서 45분간(고정 시간은 60분까지 연장될 수 있다) 배양하여 고정한다. 다른 방법은 100㎖의 혈액에서 세정된 혈소판을 1.0% 파라포름알데하이드 용액에서 실온에서 45분간(고정시간은 60분까지 연장할 수 있다) 배양하는 것이다.

파라포름알데하이드를 제거하기 위해, 파라포름알데하이드 배양후, 이미다졸 완충된 식염수 동일 부피(0.084M 이미다졸; 0.146M NaCl; 1.0N HCl로 pH 6.8로 조정)가 각 시험관에 첨가되고 혈소판은 실온에서 8분간 1500×g로 원심분리되어 펠렛화되었다. 상청액만을 천천히 따르고, 혈소판은 혈소판 펠렛을 pH 7.35의 이미다졸 완충된 식염수로 5 내지 10㎖에서 재현탁하여 세정된다. 세정은 파라포름알데하이드를 제거하기 위해서 2회 더 재처리한다. 3회 세정 후에, 혈소판은 혈청 알부민 5% 용액(시트레이트 식염수 100㎖당 5 gm 알부민, 0.0054M 소디움 시트레이트, 0.154M NaCl, pH 6.5)에서 재현탁된다. 혈소판은 상 대비 마이크로스코프(phase contrast microscope) 및 American Optical Bright-Line Hemocytometer를 이용하여 계수된다. 혈소판 농도는 입방 밀리미터(cmm)당 800,000으로 조정된다.

혈청 알부민 용액에 농축-조정된 혈소판의 수적(10㎖)은 20㎖의 글라스 바이알(glass vial)에 정치하고, -70℃에서 동결된다. 혈소판은 12시간동안 또는 금(cracked)이 생기기 전까지 동결건조되고, 백색분말이 남게된다. 혈소판 산물은 100 내지 500㎖의 다량으로 표면 동결될 수 있고, 4시간 동안 -40℃에서 동결건조된다. 그후에, 온도를 건조시간 동안 -25℃까지 상승한다. 동결건조된 산물은 사용 때까지 -20℃ 내지 -70℃에서 저장한다.

동결건조된 혈소판은 0.084 M 이미다졸 버퍼(염이 첨가되지 않음)로 재수화되고 1.0M NaOH로 7.35의 pH로 조정된다. 이미다졸 버퍼의 첨가후, 용액은 방치되고, 수분 동안 방해하지 않고 상기 바이알을 굴리거나 회전하여 온화하게 혼합하여 재수화된 단일 혈소판의 균일한 현탁물을 생산한다.

B. 동결건조된 인간 혈소판의 제조(프로토콜 2)

전체 혈액을 건강한 자발적 수여자가 제공하고, 항응고제(CPDA-1)의 표준 보충물을 포함한 상업적 혈액 수집팩(Fenwal 4R6402, Baxter Health Care)으로부터 얻는다. 시트레이트화된 수집된 전체 혈액의 각 단위의 최종 부피는 500cc이다. 전체 혈액의 각 백은 원심분리되어서 혈소판이 풍부한 플라즈마(PRP)가 얻어지고, 이것은 백에서 취해지고 포스페이트-완충된 식염수 용액에서 3회의 원심분리/재현탁 단계로 세정된다(상기 A에서 설명된 바와 동일하게). 상기 세정된 혈소판은 다시 원심분리되고, 펠렛은 1.8% 파라포름알데하이드(상기 A에서 설명된 바와 동일)를 함유한 완충된 용액에서 실온에서 45분 내지 1시간동안 처리된다. 안정화제의 제거하고, 파라포름알데하이드를 제거하기 위해 세정된 혈소판의 수율은 안정화전에 현탁된 혈소판을 기준으로 60 내지 80%이다. 알부민이 안정화 이후에 세정 버퍼에 포함되지 않으면 혈소판 수율이 감소된다.

동결건조전 최종 혈소판 재현탁의 조성은 적당한 수율을 얻기 위해서 중요하다. 일반적으로, 완충된 식염수에 알부민 또는 트레할로스와 같은 안정화제의 효과적인 양은 동결건조/재수화 단계동안 혈소판의 85 내지 100%의 수율을 얻기 위해서 필수적인 것이다. 알부민은 0.1 내지 50g/dL정도의 함량으로 포함될 것이고, 보다 바람직하게는 1 내지 25g/dL이고, 가장 바람직한 것은 5 내지 10g/dL의 범위이다. 트레할로즈는 0.1 내지 10M의 범위로 포함되어야 하고, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5M이고, 가장 바람직한 것은 0.5 내지 1.0M 인 것이다. 용액의 여러 형태는 다음의 변수 결과에서 인식할만한 차이 없으면 사용될 것이다: 즉, 포스페리트 완충된 식염수 pH=7.3, 트리스-완충된 식염수 pH=7.4, 이미다졸-완충된 식염수 또는 UNISOL^TM생리학적 균형된 식염수 용액.

실시예 2

혈소판의 박테리아 정화

본 연구의 목적은 혈소판 보존 공정에서 1.8% 파라포름알데하이드로 박테리아의 운동성을 불활성화하는 것을 설명하는 것이다.

12개의 혈소판 백을 미국 적십자에서 얻었다.Bacillus cereus를 각 백에 주입하여 모든 단위에 50 콜로니 형성단위(CFU)/㎖의 최종 농도를 얻었다. 상기 백의 6개로부터 얻어진 혈소판은 실시예 1, 프로토콜 1에서 설명된 방법으로 친유화된 혈소판으로 가공되어 혈소판 저장백에 되돌려졌다. 6개의 다른 샘플은 원래 저장백에 남겨졌다. 전체적으로 오염될 때까지 모든 백에게 7일 동안 매일 정량적인 박테리아 배양(연속 희석물 0.1㎖을 혈액 아가 플레이트 위에 펴 바르고, 2개로 48시간 동안 37℃에서 배양)을 7일간 실행하였다. 결과:Bacillus Cereus가 모든 6개의 정기적 저장 단위에서 성장하였으나 가공 처리된 혈소판에는 생기지 않았다.

제2실험에서는 6개의 혈소판 백이Staphylococcus epidermis로 배양되어 50CFU/mL의 최종 농도가 되었다. 각 혈소판 백은 2개의 균등한 샘플로 분배되었다. 한 샘플은 실시예 1, 프로토콜 1에 설명된 고정 및 세정단계를 거쳤고, 새로운 혈소판 저장백에 되돌려 졌다. 결과: 처리되지 않은 샘플에서는S. epidermis성장이 저장 3일 동안 모든 백에서 발견되었다. 이전 실험에서는 7일 동안 혈소판 단위에서 50 CFU/㎖의 최종농도로 접종된S. epidermis로 단위의 100%가 성장되었다는 것을 보여주었다. M. Brecher et al., Transfusion 34, 750-755(1994) 참조. 실시예 1에서 설명된 고정 및 세정 단계를 통해 처리된 혈소판은 전체 7일간의 관찰 기간동안 살균되었다.

실시예 3

혈소판의 바이러스 정화

본 연구에서는, 광범위한 바이러스의 특성을 보여주는 모델 바이러스를 실시예 1에서 설명된 것과 같이 1.8% 파라포름알데하이드로 배양함으로써 5개의 별도 시간 포인트에서 불활성에 대한 실험을 실시하였다.

시작 물질에서 잠재적인 오염물을 반영하는 것인 생물리적 및 구조적인 특성을 나타내는 다음의 바이러스가 본 연구를 위해서 선택되었다. ,

1)Bovine viral diarrhea virus(BVD, KY-22 계통)는 40 내지 70㎚이고, 엔벨로프형(enveloped) 이고, RNA-함유 바이러스이다. 바이러스 게놈과 C형 간염 바이러스의 물리적 특성(HCV, 이전에는 비-A형 및 비-B형 간염으로 알려짐)에 대한 최근 연구는 다수의 플라비바이러스 과(flavivitus family)에 속한 것으로 보이고, 가장 밀접하게는 페스티바이러스 종(pestivirus genus)에 관련된 것 같다. HCV는 실험실에서는 번식할 수 없으므로, 침팬지 이외에는 HCV 감염에 유효한 동물 모델이 없기 때문에, BVD가 공정 확인 연구에 HCV 대신 모델에 사용되었다.

2)Encephalomyocarditis virus(EMC, EMC 계통)는 28 내지 30㎚이고, 논엔벨로프형(nonenveloped)이고, 많은 표준 바이러스 불활성화 기술에 매우 저항적인 RNA-함유 피코나바이러스(picornavirus)이다.

3)Human Immunodeficiency virus(HIV, HTLV-IIIB 계통)은 80 내지 100㎚이고, 엔벨로프형이고, 인체 혈액의 잠재적인 오염원인 RNA-함유 레트로바이러스이다. HIV는 CEM-A 세포 신시튬(syncytium) 분석으로 실험실에서 타이트레이션된다. HIV로 감염시, CEM-A 세포는 7 내지 10일 동안 용이하게 측정될 수 있는 멀티뉴클레이트(multinucleated)된 세포 또는 신시티아(syncytia)를 발전한다. HIV를 포함한 모든 작업은 Quality Biotech's BSL-3 작업장에서 실시되었다.

Ⅰ. 공정

A. 재료

소독된 시작물질(시트레이트/식염수 버퍼의 혈소판)의 수적이 상기에서 설명한 바대로 제조되었다. 실험 물질은 22℃ 내지 28℃에서 저장되었다. 4% 파라포름알데하이드, 0.135M 소디움 포스페이트 버퍼, ACD 버퍼 및 이미다졸/식염수 버퍼의 수적은 실온에서 저장하였다.

B. 독성 연구

예비연구에서 본 연구에 사용될 실험물질이 BVD의 타이트레이션에 사용된 BT-1 인디케이터 세포, EMC의 타이트레이션에 사용된 VERO 인디케이터 세포 및 HIV-1의 타이트레이션을 위해 사용된 CEM-A 인디케이터 세포에 대한 독성을 위해 실험되었다. 각 바이러스는 다음의 실험 샘플로 독성실험을 하였다.

1) 파라포름알데하이드 처리 전에 혈소판 용액

2) 1.8% 파라포름알데하이드 처리 후의 혈소판 용액

실험 개시시, "파라포름알데하이드 처리 전에 혈소판 용액"(PV-001) 1.8㎖은 바이러스 재현탁 버퍼의 0.2mL로 "목크 스파이크(mock spiked)"하였다. 그후, 4% 파라포름알데하이드 1.8mL을 첨가하였다. 제2 수적은 바이러스 재현탁 버퍼 0.7mL로 혈소판 용액(PV-001) 3.3mL로 목크 스파이크하여 조제하였다. 이것은 샘플 PV-003, PV-005 및 PV-007을 제공하였다. 모든 샘플은 각각의 바이러스에 적당한 기준 타이터 프로토콜(4.60 섹션 참조)을 통해서 원액에서, 10배 희석에서, 100배 희석(EMEM에서- Eagle's Minimal Essential Medium) 에서 적당한 인디케이터 세포에 대한 혈독소를 위해 2회 실험되었다. 인디케이터 세포의 단층을 50% 미만 합치게 하는 샘플은 혈독소로 간주하였다.

예비 독소연구의 결과는 파라포름알데하이드를 함유한 샘플에서 독소의 유의적인 치수를 보여주었다. 따라서, 부가적인 샘플은 파라포름알데하이드 처리 후에 혈소판을 포함하여 제공되고 파라포름알데하이드는 원심분리 및 세정에 의해서 제거되었다. 이들 샘플은 직접 상기한 바와 같이 독성을 위해 실험되었다. 이는 샘플 PV-032, PV-033 및 PV-034를 제공하였다.

C. 비활성 연구

분석된 바이러스의 각각은 다음의 실험샘플을 제공하였다.

1) T_initial

2) T_{30 minute}

3) T_{1 hour}

4) T_{1.5 hour}

5) T_{2 hour}

25±3℃의 온도에 있었던 시작 물질(시트레이트/식염수 버퍼에 있는 혈소판 3.6mL)이 높은 타이터의 바이러스 0.4mL로 스파이크되었다. 샘플은 pH6.8 내지 7.6으로 조정되었고, 2개의 균등한 수적으로 분배되었다. 하나의 수적은 -70℃이하로 즉시 동결되어 예비로 보관되었다. 남은 수적은 아래의 섹션 E에 설명된 바와 같이 적당한 바이러스 타이트레이션 프로토콜을 이용하여 즉시 실험되었다. 이것으로 T_initial용의 샘플을 제공하였다.

25±3℃의 시작물질(시트레이트/식염수 버퍼에 있는 혈소판)의 21.6mL이 25±3℃에서 800×g에서 8분 동안 원심분리되어서 혈소판으로 펠렛화되었다.

4.0% 파라포름알데하이드의 12.5mL을 0.135 M 소디움 포스페이트 버퍼의 11.5mL, ACD 버퍼 1.0mL과 혼합하여 2.0% 파라포름알데하이드 용액을 즉시 준비하였다. 시트레이트/식염수 상청액을 제거한 후에, 펠렛화된 혈소판을 즉시 준비된 2.0% 파라포름알데하이드 용액의 21.6mL에서 재현탁하였다. 이 펠렛 현탁액은 높은 타이터 바이러스의 2.4mL로 스파이크 되어서 파라포름알데하이드를 제공하였다. 1.8% 파라포름알데하이드와 함께 스파이크된 시작 물질은 세 개의 4mL 수적과 한 개의 10mL 수적으로 나뉘었고, 샘플은 워터베스에서 25±3℃에서 배양되었다. 워터베스의 온도(25±3℃)는 조사되어 기록되었다.

T_{30 minute}, T_{1 hour}및 T_{1.5 hour}시간 포인트(시간은 ±1분의 편차가 있다)에서 4mL의 샘플이 제거되었다. 이미다졸 완충된 식염수의 4mL이 각 4mL의 수적에 첨가되었다. 이들 샘플은 3회 전화(invert)되었고, 25±3℃에서 8분 동안 800×g에서 원심분리되었다. 상청액은 제거되었고 혈소판은 이미다졸/식염수 버퍼의 4mL에서 재현탁되었다. 샘플은 3회 전화되었고, 8분 동안 800×g에서 원심분리되었다. 이 세정 단계는 2회 이상 반복되었다. 최종 원심분리 후에, 이미다졸/식염수 버퍼 4mL이 재현탁된 혈소판에 이용되었다. 샘플은 2개의 균등한 수적으로 분배되었다. 하나의 수적은 -70℃ 이하로 즉시 동결되어 예비로 보관되었다. 남은 수적은 아래의 섹션 E에 설명된 바와 같이 적당한 바이러스 타이터 프로토콜을 이용하여 즉시 실험되었다. BVD 및 EMC를 위해서, 희석되지 않은 샘플 및 희석된 샘플 0.5mL이 총 1.5mL용 3개의 웰(well)에 각각 정치되었다. HIV를 위해서는 희석되지 않은 샘플 및 희석된 샘플 0.2mL이 4개의 (총 0.8mL용) 웰(well)에 각각 담아졌다.

T_{2 hour}시간 포인트(시간은 ±1분의 편차가 있다)에서 10mL의 샘플이 제거되었다. 이미다졸 완충된 식염수 10mL이 10mL의 수적에 각각 첨가되었다. 이들 샘플은 3회 전화(invert)되었고, 25±3℃에서 8분 동안 800×g에서 원심분리되었다. 상청액은 제거되었고 혈소판은 이미다졸/식염수 버퍼의 10mL에서 재현탁되었다. 샘플은 3회 전화되었고, 25±3℃에서 8분 동안 800×g에서 원심분리되었다. 이 세정단계는 2회 이상 반복되었다. 최종 원심분리 후에, 이미다졸/식염수 버퍼 10mL이 재현탁된 혈소판에 이용되었다. 샘플은 2개의 동등한 수적으로 분배하였다. 하나의 수적은 -70℃ 이하로 즉시 동결되어 예비로 보관되었다. 남은 수적은 아래의 섹션 E에 설명된 바와 같이 적당한 바이러스 타이터 프로토콜을 이용하여 즉시 실험되었다. BVD 및 EMC를 위해서, 희석되지 않은 샘플 및 희석된 샘플 0.5mL이 총 4mL용의 8개의 웰(well)에 각각 정치되었다. HIV를 위해서는 희석되지 않은 샘플 및 희석되지 않은 샘플 0.2mL이 20개의 (총 0.8mL용) 웰(well)에 각각 정치되었다. 모든 희석된 샘플은 1/4 시간 포인트 동안 상기에서 설명된 바와 같이 정치되었다.

D. 대조군

(1) 스톡 바이러스 대조군(stock virus Controls). 각 바이러스에게, 스톡 바이러스 용액이 양성 대조군으로 제공되었다.

(2) 음성 대조군(negative control). 각 바이러스 타이트레이션에 이용되는 세포 배양 배지가 각 분석을 위한 음성 대조군으로 제공되었다.

E. 바이러스 타이트레이션

바이러스 타이터의 개시시, 각 샘플 및 대조군(다른 것은 예비로 보관된)의 하나는 마지막 포인트(적절하게 10⁰, 3배, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-7, 및 10^-8)까지 세포배양 배지에서 희석되었다. 각 희석은 각 바이러스에 대해 이하에서 설명된 바와 같이 기준 바이러스 타이트레이션 프로토콜에 의해서 감염성 바이러스의 입자에 대해서 실험하였다.

BVD: BVD-함유 샘플의 각 희석액은 소의 갑개골(BT) 인디케이터 세포를 이용하여 BVD 플라그 분석하여 감염성 바이러스의 입자를 분석하였다.

FMC: EMC-함유 샘플의 각 희석액은 Vero 인디케이터 세포를 이용한 EMC 플라그 분석으로 감염성 바이러스 입자를 분석하였다.

HIV: HIV-함유 샘플의 각 희석액은 CEM-A 인디케이터 세포를 이용한 CEM-A 신시튬 분석으로 감염성 바이러스 입자를 분석하였다.

Ⅱ. 결과와 해석

A. 활성

실험은 효과가 있었다. 양성 대조군은 감염성 바이러스의 증거를 보여주었고, 음성 대조군에서는 바이러스가 검출되지 않았다.

B. 독성 연구

바이러스의 타이트레이션에 이용된 BT, CEM-A 및 Vero 인디케이터 세포주에 연구된 독성의 결과가 표 1에 나타나 있다. 추후의 파라포름알데하이드 세정은 유의적으로 이들 처리물로부터 독성을 감소하였다(PV-032, PV-033 및 PV-034); 모든 바이러스의 연구는 이 세정 단계를 이용하여 실행되었다.

독성연구의 결과

PV 번호	샘플 설명	인디케이터 세포주	세포독성
PV-003	파라포름알데하이드 처리후의 혈소판 용액	BT	비독성
PV-004	1.8% 파라포름알데하이드 처리후의 혈소판 용액	BT	비희석액 독성,10^-1,10^-2
PV-032	포스트 파라포름알데하이드 세척	BT	비독성
PV-005	파라포름알데하이드 처리 전의 혈소판 용액	Vero	비독성
PV-006	1.8% 파라포름알데하이드 처리후의 혈소판 용액	Vero	비희석액 독성,10^-1,10^-2
PV-033	포스트 파라포름알데하이드 세척	Vero	비독성
PV-007	파라포름알데하이드 처리전의 혈소판 용액	CEM-A	비독성
PV-008	1.8% 파라포름알데하이드 처리후의 혈소판 용액	CEM-A	비희석액 독성,10^-1, 10^-2, 10^-3
PV-034	포스트 파라포름알데하이드 세척	CEM-A	비희석액 독성

C. 불활성 연구

불활성 연구에서 각 샘플과 대조를 위한 바이러스 타이터는 표 2 내지 표 4에 나타나 있다. 바이러스의 타이터는 1mL당 신시튬 형성 단위(SFU)의 1mL당 플라그 형성 단위(PFU)로 표현된다. 타이터는 바이러스가 없거나 또는 1mL당 5 PFU(SFU) 이하가 검출된 경우 ≤5.0×10°PFU(SFU)/mL로 표현된다. CEM-A 세포에서 HIV 분석을 하기 위해서, 3-배 희석액이 사용되었다. 타이터는 3배 희석액에서 바이러스가 없거나 또는 1mL당 5 PFU(SFU) 이하가 검출된 경우와 비희석 샘플에서 세포 독성인 경우에서 ≤1.5×10¹PFU(SFU)/mL로 표현된다. Log₁₀환원치는 T_initial샘플의 Log₁₀PFU(SFU)/mL에서 각 처리된 샘플의 Log₁₀PFU(SFU)/mL의 값을 빼서 계산된다. 파라포름알데하이드 바이러스 불활성화 공정은 BVD의 경우 6.93 Log₁₀정도(바이러스는 불검출 수준으로 검출), EMC의 경우 8.78 Log₁₀정도(바이러스는 불검출 수준으로 검출), EMC의 경우 4.77 Log₁₀정도(바이러스는 불검출 수준으로 검출)로 바이러스 타이터를 감소하였다.

D. 통계분석

포이송(poisson)-기준 통계분석이 2시간 샘플로 사용되어 추가적인 웰을 이용한 추가 실험 대상의 플레이팅에 결과로 바이러스의 타이터의 변화를 결정하기 위해서 사용하였다. 예를 들면, 분석 감도는 현재 수준 이하로 감소할 수 있다. BUD 및 EMC의 경우에는 추가적인 웰을 이용한 희석액에서 바이러스가 검출되지 않았다면, 타이터는 0.58PFU/mL로 보고되다. HIV의 경우, 추가적인 웰을 이용한 희석액에서 바이러스가 검출되지 않았다면, 타이터는 0.29SFU/mL로 보고된다.

소의 바이러스성 설사 바이러스 타이터

PV 번호	샘플 서술	바이러스 타이터 (PFU/mL)	PFU/mL Log₁₀	Log₁₀환원
PV-014	스톡 바이러스 대조	6.5×10⁷	7.81	NA
PV-009	T_initial	4.9×10⁶	6.69	NA
PV-010	T_{30 minute}	3.3×10³	3.52	3.17
PV-011	T_{1 hour}	=≤5.0×10⁰	≤0.70	≥5.99
PV-012	T_{1.5 hours}	=≤5.0×10⁰	≤0.70	≥5.99
PV-013	T_{2 hours}	=≤5.8×10¹	-0.24	6.93

=: 바이러스가 검출 불가능 수준.

PFU: 플라그 형성 단위

NA: 적용되지 않음

Log₁₀환원치는 T_initial샘플(PV-009)의 Log₁₀PFU/mL에서 각 처리된 샘플의 Log₁₀PFU/mL의 값을 빼서 산출된다.

엔세팔로마이오카르디티스 바이러스 타이터

PV 번호	샘플 설명	바이러스 타이터 (PFU/mL)	PFU/mL Log₁₀	Log₁₀환원
PV-020	스톡 바이러스 대조	2.1×10⁹	9.32	NA
PV-015	T_initial	3.5×10⁸	8.54	NA
PV-016	T_{30 minute}	3.8×10⁵	5.58	2.96
PV-017	T_{1 hour}	=≤5.0×10⁰	≤0.70	≥7.84
PV-018	T_{1.5 hours}	=≤5.0×10⁰	≤0.70	≥7.84
PV-019	T_{2 hours}	=≤5.8×10¹	-0.24	8.78

=: 바이러스가 검출 불가능 수준

PFU: 플라그 형성 단위

NA: 적용되지 않음

Log₁₀환원치는 T_initial샘플(PV-015)의 Log₁₀PFU/mL에서 각 처리된 샘플의 Log₁₀PFU/mL의 값을 빼서 산출된다.

인간 면역결핍성 바이러스 타이터

PV 번호	샘플 설명	바이러스 타이터 (PFU/mL)	PFU/mL Log₁₀	Log₁₀환원
PV-026	스톡 바이러스 대조	5.6×10⁵	5.75	NA
PV-021	T_initial	1.7×10⁴	4.23	NA
PV-022	T_{30 minute}	=≤1.5×10¹	≤1.18	≥3.05
PV-023	T_{1 hour}	=≤1.5×10¹	≤1.18	≥3.05
PV-024	T_{1.5 hours}	=≤1.5×10¹	≤1.18	≥3.05
PV-025	T_{2 hours}	=2.9×10¹	-0.54	4.77

=: 바이러스가 검출 불가능 수준

PFU: 플라그 형성 단위

NA: 적용되지 않음

Log₁₀환원치는 T_initial샘플(PV-021)의 Log₁₀SFU/mL에서 각 처리된 샘플의 Log₁₀SFU/mL의 값을 빼서 산출된다.

이상의 실시예는 본 발명을 설명하는 것으로 이를 제한하기 위해서 이루어진 것은 아니다. 본 발명은 이하의 특허청구의 범위에서 한정되는 것으로 본 청구항의 균등물은 이에 포함할 것이다.

Claims

미생물에 의한 오염의 우려가 있는 혈소판을 제공하는 단계;

상기 혈소판을 고정하기에 충분한 시간동안 상기 혈소판을 고정제에 접촉하는 단계; 및

상기 혈소판을 건조하여 고정-건조된 혈소판을 생산하는 단계;

를 포함하는 인간 혈소판 제제에서 미생물 오염물을 불활성화하는 방법으로서,

상기 접촉 단계는 상기 미생물을 사멸하기에 충분한 시간동안 수행하고;

상기 접촉 단계는 환원시 상기 혈소판이 다음의 활성을 손실하지 않을 시간동안 수행되는 인체 혈액 혈소판 제제의 미생물 오염물을 불활성화하는 방법.

(ⅰ) 트롬보젠 표면에 부착함,

(ⅱ) 트롬보젠 이외의 표면에는 부착안함,

(ⅲ) 트롬보젠 표면에 부착시 형태변화(퍼짐)를 실시함;

(ⅳ) 트롬보젠의 표면에 부착시 서로서로 지혈제 플러그를 형성하도록 부착함; 및

(ⅴ) 그들의 과립형 내용물을 분비함.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 박테리아 및 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 혈소판을 상기 고정제를 함유한 용액과 혼합하는 것으로 수행되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 건조 단계는 동결건조로 수행되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 고정제는 포름알데하이드, 파라포름알데하이드 및 글루타르알데하이드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 고정제는 퍼망가네이트인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혈소판을 알부민으로 안정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혈소판을 트레할로즈로 안정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.