UA46715C2 - Ізольована нуклеїнова кислота, що інгібує експресію протеїну grb2 або grb3-3, вектор, фармацевтична композиція (варіанти) - Google Patents

Abstract

Дійсний винахід відноситься до нового гена, позначеного Grb3-3, його варіантів та їх застосування, наприклад, для протиракової генної терапії.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к новому гену, обозначенному Сгр3-3, к его вариантам и к их 2 применениям, например, в генной противораковой терапии.

Различнье геньії, назьіваемье онкогенами и супрессорньми генами, вовлеченьі в контроль клеточного деления. Среди них гавз-геньі и их продуктьії, обьічно обозначаемье протеинами р21, играют ключевую роль в пролиферации клеток во всех зукариотньїх организмах, где они бьіли исследованьї. Так, бьіло показано, что некоторье специфические модификации зтих протеинов лишень! своего нормального контроля и становятся 70 онкогенньми. Так, большое число человеческих опухолей бьло ассоциировано с наличием модифицированньх газ-генов. Кроме того, гиперзкспрессия зтих протеинов р21 может привести к нарушению пролиферации клеток.

Следовательно, понимание точной роли зтих протеинов р21 в клетках, способа их функционирования и их характеристик является основной целью для понимания и подхода к терапийи канцерогенеза.

Различнье факторь, причастнье к пути газ-зависимой сигнализации, бьіли идентифицированьі. Среди них 12 фигурирует ген сгр-2, которьій кодирует протеин 23 - 25кДа, имеющий структуру 5НЗ-5Н2-5НЗ (І ожепзііепега|,

Сеї! 70 (1992) 431; МайшоКа еї аІ., РНА5З 89 (1992) 9015). Возможно продукт гена (3гр-2 взаймодействует с протеинами, фосфорилированньіми по тирозину в его 5Н2 области и с фактором обмена СОР класса 505 его

ЗНЗ области (Едап еї аїЇ., Маїшге 363 (1993) 45). Таким образом он является одним из компонентов трансформирующей активности продукта газ-гена. Настоящее изобретение вьтекает из обнаружения, клонирования и характеристики изоформь! гена сгр-2, обозначенной СгЬр3-3, имеющей делецию в области 5Н2.

Зтот ген определен во взросльїх тканях: соответствующая мРНК находится под единой полосой 1,5К5 и транслируется в протеин 19кДа. Из-за наличия делеции в области ЗНО продукт гена Сгр3-3 не способен взаймодействовать с фосфорилированньіми по тирозину протеинами (фосфорилированньій ЕСЕ рецептор), но он осохраняет способность взаймодействовать с областями, богатьми пролином, протеийнов 505. с 29 Следовательно, благодаря наличию делеции продукт гена СгЬ3-3 способен препятствовать клеточньм Ге) воздействиям продукта гена сгр2. Перенос зтого гена іп мімо или его вариантов, включая антисмьісловье последовательности, позволяет следовательно препятствовать процессам пролиферации, дифференциации и/или смерти клеток.

Итак, первьій обьект изобретения относится к нуклеотидной последовательности, включающей весь или о 30 дасть гена Сгр3-3 (последовательность ЗЕО ІЮ Мо 1). «ч-

Другой обьект изобретения относится к нуклеотидной последовательности, происходящей из ЗЕО ІЮ Мо 1 и способной ингибировать, по крайней мере частично, зкспрессию протеина (сгр-2 или сгр3-3. В частности в изобретение относится к антисмьісловьїм последовательностям, зкспрессия которьїх в клетке-мишени Ге) позволяет контролировать транскрипцию клеточной мРНК. Такие последовательности могут бьіть, например, 3о транскрибировань в клетке-мишени в РНК, комплементарнье клеточнье мРНК сОгр-2 или Огр3-3, и блокировать З таким образом их трансляцию в протеийн согласно методике, описанной в европейском патенте ЕР 140 308.

Такие последовательности могут бьть составленьь полностью или частично из нуклеотидной последовательности ЗЕО ІЮ Мо 1, транскрибированной в обратной ориентации. «

Как указьівалось вьіше, Сгр-2 является по крайней мере бифункциональньм протеийном, имеющим в его З 40 области 5Н2 специфические последовательности, фосфорилированньє по тирозину, и в его двух областях ЗНЗ с факторьї обмена семейства 505. (згр3-3, потерявший свою способность ассоциироваться с протеинами, з» фосфорилированньми по тирозину, может, следовательно, образовать только комплекс с протеинами 505.

Следовательно гр3-3 может препятствовать ообразованию комплекса Сгр-2-305 на рецепторах аутофосфорилированньїх факторов роста или на ассоциированньїх протеинах, таюже фосфоридированньїх по 45 тирозину, таких как 5НС иди ІК 5І. (згЬ3-3 способен блокировать зто комплексообразование, он способен е блокировать митогенньсе пути и вьізвать смерть клетки. Заявитель действительно показал, что протеин огЬ3-3

Ге»! проявляет свое действие во время некоторьїх физиологических процессов, например, при созреванийи тимуса у крьіс. Заявитель также показал, что Сгр3-3 способен вьізвать смерть клеток при апоптозе различньїх типов 7 клеток. Зти очень ценнье свойства могут бьіть доказаньі (І) путем иньекции рекомбинантного протеина в -к 70 фибробласть! ЗТЗ и (Ії) путем переноса последовательности, кодирующей сгЬр3-3, в клетки ЗТЗ (пример 4).

Следовательно Сгр3-3 способен вьізьшать клеточную смерть живьїх клеток, таких как иммортализованнье сл (бессмертньсе), раковне или зародьішевье клетки. Как показано в примерах, огр2 способен противодействовать действиям сгр3-3.

Кроме того, исследование зкспрессии сгЬ3-3, проведенное во время заражения лимфоцитарньїх клеток вирусом НІМ, позволяло показать, что массированноє продуцированиє вируса, наблюдаємоє через 7 дней

ГФ) после заражения, коррелирует с гиперзкспрессией мРНК сСгр3-3 зараженньми клетками (пример 5). Зтот зксперимент показьшаєт, что удаление или противодействие клеточньм зффектам сгЬр3-3 также может о позволить сохранить жизнь зараженньїм клеткам, а именно зараженньм МІН, и также позволить лимфоцитам Т4 продолжать вьіполнять роль иммунной защитьї. В зтом отношений изобретение также относится к применению 60 соединений, способньх устранить или препятствовать по крайней мере частично клеточньмм аффектам сгьЬз3-3, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения СПИДа. Более конкретно используемьі!ми соединениями могут бьть: - генетические антисмьісловне последовательности, такие как определено вьіше, - специфические олигонуклеотидьі гЬ3-3, модифицированнье или нет для лучшей стабильности или бо биодоступности (фосфоротиоать, вставки и т.п.. Предпочтительно речь идет об олигонуклеотидах,

содержащих локализованную кодирующую последовательность между М-концевой ЗНЗ областью и остаточной

ЗН2 областью. - любая последовательность, перенос которой в зараженньсе клетки вьізьівает гиперзкспрессию гр.

Нуклеотиднье последовательности согласно изобретению могут бьіть использовань! как таковье, например, после иньекции человеку или животному, чтобь вьізвать защиту или лечить раковье заболевания. В частности, они могут бьіть иньецированьі в форме голой ДНК по методике, описанной в заявке УУО 90/11092. Они также могут бьіть введеньі в форме комплексов, например, с ДЕАЕ-декстраном (Радаго еї аї., У. Мігої. І (1967) 891), с ядерньми протеинами (Кайеда еї аіЇ., Зсіепсе 243 (1989) 375), с липидами (РеЇдпег еї аі., РМАЗ 84 (1987) 7/0. 7413), в форме липосом (Ргаїеу еї а/., у). Віо!. Спет. 255 (1980) 10431) и т.д.

Предпочтительно нуклеотиднье последовательности согласно изобретению являются частью вектора.

Применение такого вектора позволяет в действительности улучшить введение нуклейновой кислоть! в обрабатьшвшаемую клетку, а также повьісить ее стабильность в указанньїх клетках, что позволяет получить длительньій терапевтический зффект. Кроме того, можно вводить несколько последовательностей нуклейновой /5 КиИслоть! в одном и том же векторе, что таюже повьішаєт зффективность лечения.

Используемьїй вектор может бьіть различного происхождения, лишь бьї он бьіл способен трансформировать клетки животньїх, предпочтительно чЧчеловеческие опухолевье клетки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используют вирусньій вектор, которьій может бьіть вьібран среди аденовирусов, ретровирусов, аденоассоциированньїх вирусов (ААМ), вируса герпеса, цитомегаловируса (СМУ), вируса го Осповакциньі и т.п. Вектор, происходящие из аденовирусов, ретровирусов или ААМ, включающие гетерологические последовательности нуклеиновьх кислот, бьіли описаньй в литературе |АКІї еї аї., Майшге

Сепеїйїсв З (1993) 224; Біганога-Регтісапаєї еї ам, Нитап Сепе Тпегару І (1990) 241; ЕР 185 573, І емгего еї ам, Сепе 101 (1991) 195; Їе СбаїЇ Іа ЗаїЇе еї аЇ., Зсіепсе 259 (1993) 988; Коетег еї Егіедтапп, Еиг. 3.

Віоспет. 208 (1992) 211; Юорвоп еї аЇ.,, Мецгоп 5 (1990) 353; СПпіосса еї аіЇ., Мем/ Віої. 2 (1990) 739; сч Міуапопага еї а1., Мем Віої. 4 (1992) 238; УУО 91/180881.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к любому рекомбинантному вирусу, содержащему і) вставленную в его геном нуклеотидную последовательность, такую, как описано вьіше.

Целесообразно, чтобьї рекомбинантньій вирус согласно изобретению бьл дефектньм вирусом. Термин "дефектньїй вирус" означает вирус, неспособньій реплицироваться в клетке-"мишени. Обьічно, следовательно, ю зо геном дефектньїх вирусов, используемьх в рамках настоящего изобретения, лишен по крайней мере последовательностей, необходимьїх для репликаций указанного вируса в зараженной клетке. Зти области или 87 могут бьіть удалень! (полностью или частично), или сделаньі нефункциональньми, или замещень другими м. последовательностями и, например, нуклеиновой кислотой изобретения. Предпочтительно, чтобь! дефектньй вирус тем не менее сохранил последовательности своего генома, которне необходимь! для инкапсидации ісе) з5 вирусньх частиц. «г

Особенно вьгодно использовать нуклейиновьіе последовательности изобретения в форме включения в аденовирус, в ААМ или в рекомбинантньїй дефектньй ретровирус.

Что касается аденовирусов, существуют различньсе серотипь, структура и свойства которьїх мало меняются, но которье не являются патогенньіми для человека, а именно не угнетающими иммунную систему. Кроме того, «

Зти вирусьй не интегрируются геномом клеток, которье они заражают, и могут включать значительнье в с фрагменть! зкзогенной ДНК. Среди различньїх серотипов предпочтительно использовать в рамках настоящего изобретения аденовирусьі типа 2 или 5 (Ай 2 или Ай 5). В случае аденовируса Ад 5 последовательности, ;» необходимье для репликации, представляют собой области ЕІА и ЕІВ. Рекомбинантнье дефектнье вирусь изобретения могут бьіть полученьі путем гомологичной рекомбинаций между дефектньім вирусом и плазмидой, несущей наряду с другими нуклеотидную последовательность, такую, как определено вьіше (І емгего еї аі., бепе їх 101 (1991) 195; Стгапйат, ЕМВО 3. 3/12/ (1984) 2917). Гомологичная рекомбинация происходит после

Ко-трансфекции указанного вируса и плазмидь! в соответствующую клеточную линию. Используемая клеточная

Ме, линия предпочтительно должна бьть (І) трансформируемой указанньми злементами и (Ії) содержать -І последовательности, способнье дополнять часть генома дефектного вируса, предпочтительно в интегрированной форме, чтобь! избежать опасностей рекомбинации. В качестве примера линии, используемой - для получения рекомбинантньїх дефектньїх аденовирусов, можно провести линию человеческой зародьшевой сп почки 293 (Сгапат еї аї., 9У. Сеп. Мігої. 36 (1977) 59), которая содержит, например, интегрированную в ее геном левую часть генома аденовируса Аа 5 (12965). В качестве примера линии, используемой для получения рекомбинантньїх дефектньїх ретровирусов, можно привести линию СКІР (Оапоз еї Миїїдап, РМАЗ 85 (1988)

Б 58460).

Затем размножившиеся вирусь! собирают и очищают по классическим методикам молекулярной биологии. (Ф, Обьектом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая по крайней ка мере один рекомбинантньй вирус или одну нуклеотидную последовательность, такие, как определено вьіше.

Фармацевтические композиции изобретения могут бьіть сформулировань! с учетом пути введения как для бор Мместного введения, оральнье, парентеральньєе, интраназальнье, внутривеннье, внутримьішечньєе, подкожнье, внутриглазнье и т.п.

Предпочтительно фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемье носители для рецептурьї для иньекций, необязательно непосредственно в обрабатьшваемую опухоль. В частности, можно привести солевне растворьї (мононатрийфосфат, динатрий фосфат, хлорид натрия, калия, кальция или магния, бе Мо тло или осмеси озтих солей), стерильнье, изотонические, или сухие композиции, например, лиофилизированньюе, которье при добавлениийи в зависимости от ситуации стерилизованной водь или физиологической сьіворотки позволяют получить растворь! для иньекций.

Дозьї нуклеиновьїх кислот (последовательности или векторьї), используемье для введения, могут бьть адаптированьі в зависимости от различньїх параметров, например, в зависимости от используемого способа Ввведения, конкретной патологии, действующей нуклейновой кислотьї, или еще от длительности желаемого лечения. Обьічно, что касается рекомбинантньїх вирусов согласно изобретению, их формулируют и вводят в форме доз, содержащих между 107 и 10'"ріш/мл, предпочтительно 105 - 10'Оргш/мл. Термин ри ("бляшкообразующая единица") соответствует заражающей мощности раствора вируса и определяется путем заражения соответствующей клеточной культурьі и измеряется обьічно через 48 часов по числу бляшек 70 зараженньх клеток. Методики определения титра ріш раствора вируса хорошо документировань в литературе.

Такие фармацевтические композиции могут бьіть использованьії для людей для лечения и/или профилактики рака. В частности, продуктьї изобретения способньї модулировать активность газ-протейнов, они позволяют включаться в процессьй развития раков, а именно, они могут ингибировать активность онкогенов, транспормирующая активность которьїх проходит через функциональное р21-3ЗАР взаиймодействие. 75 Действительно, многочисленнье ради ассоциируются с наличием онкогенньїх газ-протеинов. Среди раков, найболее часто содержащих мутированньюе газ-гень, можно привести, например, аденокарциномь поджелудочной железь!ї, 9095 которьїх имеют мутированньй Кі-газ-онкоген в двенадцатом кодоне (АІтодіїега еї сої, Сеї! 53 (1988) 549), аденокарциномь! ободочной кишки и раки щитовидной железьї (5095) или карциномь! легких и миелоиднье лейкемии (3095), (Вов5, У. Ї. Сапсег Кев. 49 (1989) 4682). Более обьічно композиции согласно изобретению могут бьіть использованьі для лечения любого типа патологий, в которьіх наблюдается аномальная пролиферация клеток, путем индукции апоптоза, а также любьїх патологий, характеризующихся смертью клеток при апоптозе (СПИД, хорея Хантингтона, Паркинсон), с помощью соединений, блокирующих зффектьї Огр3-3 (например, антисмьсловнье).

Настоящее изобретение будет более полно описано с помощью примеров, приведенньїх ниже, которье с должнь рассматриваться как иллюстрирующие, но не ограничивающие.

Подписи к фигурам: і9)

Фиг.1: Схематическая иллюстрация структурньїх областей - сгр2 и согр3-3.

Фиг.2: Изучение связи Сгр3-3 и рецептором ЕГО (фиг.2а) и с пептидами, богатьмми пролинем (фиг.2в).

Фиг.3: Действие сгр3-3 на трансактивацию через газ-ККЕ-производное гена-усилителя полиома вируса. ю

Фиг.4: Вьіявление смерти клетки, вьізванное СгЬ3-3 на фибробластах ЗТ.

Фиг.5: Вніявление зкспрессии сгр3-3 в клетках, зараженньїхх вирусом НІМ. --

Обьічнье методики молекулярной биологии -

Методики, обьчно используемье в молекулярной биологии, такие как препаративнье зкстракции плазмидньїх ДНК, центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия, злектрофорез в агарозном о или акридамидном гелях, очистка фрагментов ДНК злектрозлюцией, зкстракция протеинов фенолом или «І фенолом-хлороформом, осаждение ДНК в солевой среде зтанолом или изопропанолом, трансформация

Езапегіснпіа соїї, и т.п. хорошо известньії специалистам в зтой области и подробно описаньі в литературе (Мапіаєйв Т. еї аїЇ., "МоІесшаг Сіопіпу, а Іарогагу Мапиа!", Со бргіпд Нагрог Іарогаїгу Соїй Зргіпд «

Нагрог, М,МУ., 1982; А!йЄвибБре! Р.М. еї аї. (едв), "Сигтепі РгоїосоЇїв іп Моіесціаг Віоїоду, 9дойп УМПеу апа 5опв,

Мем Могк, 1987). - с Плазмидьі типа рВКЗ322, ріС и фаги серий М1ІЗ имеют коммерческое происхождение (Ве(пезаа Кезеагсп ц Ї арогаюгіев). "» Для датирования фрагменть! ДНК могут бьіть разделень! в соответствии с их размером злектрофорезом на агарозном или акриламидном гелях, зкстрагированьь фенолом или смесью фенол/хлороформ, осаждень! зтанолом, потом инкубировань! в присутствии ДНК лигазь! фага ТА (Віоіарв) в соответствии с рекомендациями «» изготовителя.

Заполнение вьіступающих 5'і-концов может бьіть проведено фрагментом ДНК полимеразь! | Кленова Е.сої б (Віоїарв) по описанию изготовителя. Деструкцию вьступающих 3-концов проводят в присутствимй ДНК -І полимеразь фага Т4 (Віоіїарв), используемой в соответствии с рекомендациями изготовителя. Разрушение (деструкцию) вніступающих 5-концов проводят осторожной обработкой нуклеазой |. - Направленньй мутагенез іп міго синтетическими олигонуклеотидами может бьіть проведен в соответствий с с методикой, разработанной Тауог еї аї., (Мисієїс Асідз Кез. 13 (1985) 8749-8764), используя набор, вьіпускаемьй Атегзпат.

Ферментативная амплификация фрагментов ДНК по методике, назьіваемой РОК (Полимеразная цепная реакция, заїкі Р.К. еї аї., Зсіеєпе 230 (1985) 1350-1354; Миїїїв К.В. еї Раїсопа Р.А. Мей. Епвут. 155 (1987) 335-350), может бьть проведена с использованием "ДНК термального циклера" (Регкіп ЕІтег Сейв5) по о описаниям изготовителя. ко Проверка нуклеотидньїх последовательностей может бьіть проведена по методике, разработанной Заподег еї а. (Ргос. Май. Асад. Зсі. О5А, 74 (1977) 5463-5467) с использованием набора, вьіпускаемого Атегепат. во Примерь! 1. Вьіделение гена сгЬ3-3

Ген Сгр3-3 вьіделяют скринингом полосьі человеческой ДНК с помощью зонда, происходящего из последовательности гена ограІ. 500 000 рекомбинантньїх фагов Лямбда д11, несущих фрагменть! ДНК, вьіделенной из банка человеческой 65 плаценть (Сіопіесі) бьіли скринированьї с помощью зонда, происходящего из последовательности гена согр2.

Мспользованньй зонд соответствует первьм 8 аминокислотам протеина Сгр2 и имеет следующую последовательность:

АТОСААДОССАТСОССАААТАТОАС (5ЕО ІО пе2)

Таким образом бьіло идентифицировано 10 положительньх клонов. Вставка из 10 клонов бьіла изолирована в виде фрагментов ЕсокКіІ, клонирована в плазмиде М1З р18 и секвенирована. Среди зтих 10 клонов 9 имеет вставки, идентичнье последовательности сОгр2. Один из них имеет вставку размером меньше, чем ген огр2 из-за делеции в области 5Н2 (фиг.1). Анализ остальной последовательности показал полную идентичность с соответствующими областями Сгр2, включая некодирующие области 5' и 3. Фаза открьітого считьіївания зтого клона кодирует протейин из 177 аминокислот (ЗЕО ІЮ Мо 1), содержащий 2 области ЗНЗ по краям незавершенной 7/0 ЗН2 области (фиг.1). Аминокислотьї, отсутствующие в области ЗН2 (остатки 60 - 100 в протеине ОгБг), соответствуют остаткам, участвующим в связьшвании Сгр2 с пептидами, содержащими фосфорилированнье тирозинь. 2. Активность связьівания протеина сгр3-3

Как указьвалось вьше, протейин Сгр2 является медиатором взаймодействия между рецепторами 75 фосфорилированньїх факторов роста и факторами ЗО5. Зтот пример показьваеєт, что протеин Сгр3-3 не способен взаймодействовать с фосфорилированньм рецептором ЕСЕ, но он сохраняет свою способность взаймодействовать с пептидом, обогащенньім пролинем, происходящим из последовательности человеческого фактора 5051.

Способность связьшания гр3-3 бьла изучена с использованием опротейнов слияния в Глутатион-5-Трансферазу (5), биотинилированньїх. Зтот тип слияния позволяєт бьістро и зффективно очистить рекомбинантнье продуктьі. Для зтого последовательности изобретения бьіли проявленьі в штамме

Е.соїї ТОЇ в форме протейнов слияния с 351 по методике, описанной Зтіїй еї доппзоп (Сепг 67 (1988) 31).

Короче, геньі (3гр2 и Сгр3-3 сначала бьли модифицированьі введением с обеих сторон стартового и стоп-кодонов сайта Ватні. Для зтого фазьі открьітого считьіївания зтих генов біли амплифицированьі! РСК с с помощью следующих олигонуклеотидов:

Олигонуклеотид І (5): о

СААТТСОСАТССАТОСААССАТСОССАААТАТОАСТТС

Олигонуклеотид ІІ (3) (ЗЕО ІЮ Мо 4):

СААТТСОСАТССТТАСАСОСТТССОСТТСАСОСООСТОАС ю

Подчеркнутая часть соответствует созданному сайту Ватні, следующему за или предшествующему стартовому и стоп-кодонам. --

Амплифицированньсєе таким образом геньі затем клонируют в форме фрагментов ВатНі в вектор рРОЕХ 271. (Рпагтасіа), лианеризованньій тем же самьім ферментом, в 3 и в фазу кДНК, кодирующей 5. Полученнье таким образом векторь! затем используют для трансформации штамма Ес.соїї ТСІ. Трансформированнье таким о образом клетки предварительно культивируют в течение ночи при 372С, разбавляют 1/10 в среде ІВ, «І прибавляют ІРТО, чтобьї вьізвать зкспрессию (2 часа 257С), потом культивируют 21 час примерно при 2570.

Затем клетки лизируют и полученнье слитье протеиньі очищают за счет сродства на колонке Агароза-СЗН. Для зтого бактериальньй лизат инкубируют в присутствий геля (полученного и уравновешенного с буфером лизиса) « в течение 15 минут при 4"С. После З промьівок Трис-НСІ рН 7,4, протеиньі злюируют в присутствиий буфера 420 Трис-НСЇІ рН 7,7, содержащего избьтток О5Т. Супернатант собирают и центрифугируют. - с Тот же протокол используют для получения мутанта Огр2, в котором глицин 203 заменен аргинином ц (огр20203К), и мутант)| Огр3-3, в котором глицин 162 заменен аргининов (Сгр3-35162К). Мутант Сгр2020О3ЗА бьіл "» описан как не имеющий активности в тесте на реинициацию синтеза ДНК (І ожмепзіевїп еї.аіІ., вьіше). Мутант

Сгр3-35162К несет ту же мутацию в том же положений и, следовательно, тоже должен бьїть неактивнь!м.

Зти мутантьі бьіли полученьії мутагенезом с помощью РСК генов (Сгр2 и Сгр3-3, используя в 5 г» олигонуклеотид І, описанньй вьіше, и в З3' олигонуклеотид ЇЇ, приведенньїй ниже, в которое мутированньй кодон подчеркнут:

Ф Олигонуклеотид ІІІ (3) (ЗЕО ІО Мо 5): -І САССТТССОСТТСАСОСОООСТОАСАТААТТОСОСОСО АААСАТОСООССОСТС шу 20 Амплифицированнье таким образом фрагментьь затем злюируют, реамплифицируют РСК с олигонуклеотидами | и ІЇ, потом клонируют в вектор рОЕХ 2Т. Затем получают мутанть, как описано вьіше. с Затем протеиньі, слитье с 5 ((351-Огр2, 5тТ-огр3-3, З5Т-огр3-3 (3162К и 5), биотинидируют по классическим методикам, известньм специалистам (См. общие методики молекулярной биологии, а также

Мауег еї аі. РМАБЗ 88 (1991) 627), и используют в качестве зондов для определения связьшвания с ММмМмобилизованньм фосфорилированньім рецептором ЕСЕ (2.1), потом с пептидом, происходящим из ЗОБІ (2.2). о 2.1. Связьівание с фосфорилированньїм рецепторов ЕСЕ ко Протокол: Используемьій ЕСЕ рецептор очищают, исходя из клеток А431, путем иммобилизации на

МУ/СА-сефарозе по методике, описанной Юиспезне еї аї. (Зсіепсе 259 (1993) 525). Сначала стимулируют 2мКкг бо зтого рецептора 1мкМ ЕСЕ в течение 10 минут при 222С, потом инкубируют с или без холодной АТР (10мкМ) в присутствий 2,5мММ Мписі» в буфере НМТС (20мМ Нерез, 150мМ Масі, 0,195 Тритон, 1095 глицерина, рН 7,5) при 4"С в течение 2 минут, затем останавливают фосфорилирование рецептора добавлением буфера разложения.

Потом образцьй помещают она гель 5О5-РАСЕ 4 - 2095, потом переносят на мембрань из поливинилидендифторида (РМОР). Пятна затем инкубируют в присутствим различньїх /слитьх 65 биотинилированннх ЗТ (2мкг/мл), потом проявляют с помощью стрептавадина, соединенного со щелочной фосфатазой (Рготеда). Рецепторь ЕСЕ также подвергают иммуноблоттингу в присутствиий антител анти-фосфотирозинов (анти-РУ) для подтверждения, что рецепторьї уже фосфорилировань.

Результать: Полученнье результатьі представленьії на фиг.24. Они показьивают, как и ожидалось, что протеийн сгр2 взаймодействует с рецептором ЕСЕ только в фосфорилированной форме. Затем они показьівают, что протеин сСгр3-3 не связан с рецептором ЕСЕ, какой бьї ни бьіла его степень фосфорилирования. 2.2. Связьівание пептида, производного от ЗОБІ

Протокол: Синтезируют два пептида, обогащенньїх пролинем:

Пептид А5О5І: ОТРЕМРУРРРМРРАККЕАРЕЗФЗА: Зтот пептид соответствует остаткам 1143-1162 протеина АБО5І (сі ега!ї., Мате 363 (1993) ответственного за взаимодействие между гр2 и ЗОБІ (ЗЕО ІЮ Мо 6). 70 Пептид ЗВРІ: РРРІРРІМ: Зтот пептид происходит из протеина ЗВРІ, которьій известен для зффективного связьівания области ЗНЗ АБІ и Згс /(Сісспнеїі еї а!., Зсіепсе 257 (1992) 803) (ЗЕО ІЮ Мо 7).

Каждьй из зтих пептидов (1мкл, 1Омг/мл) иммобилизуют на мембране из нитроцеллюлозьї. Затем мембрань инкубируют в блокирующем буфере (Трис 20мМ рН - 7,6, 150мМ Масі, 0,195 Твин, 395 сьівороточньій альбумин).

Потом мембраньй инкубируют всю ночь при 47"С в присутствиий различньїх слитьїх биотинилированньїх СЗТ 7/5 (Ямкг/мл), потом проявляют с помощью стрептавидина, соединенного со щелочной фосфатазой (Рготеоа).

Результать: Полученнье результатьі представлень на фиг.28. Они показьшают, что (сгр3-3, как и согв2, способен связьшать пептид ЗОБІ. Они кроме того показьвают, что зто взаймодействие является специфическим, потому что не наблюдается никакого связьвания с пептидом ЗВРІ. Кроме того, результать также показьівают, что мутант сгр3-30162К не способен связьівать пептид АЗО5БІ, что подтверждаєт важность

Зтого остатка и функциональную роль зтого взайимодействия.

З. Активность протеина сгр3-3

Зтот пример показьшаєт, что несмотря на его делецию 5Н2 области протеин сСгр3-3 обладает функциональньм зффектом.

Активность протеина сгЬ3-3 бьіла исследовала путем определения его способности кооперироваться с гав с ов для трансактивациий промотора, обладающего ответом к газ (ККЕ) и управляющего зкспрессией гена-репортера. і)

МИспользованньій протокол описан, например, ЗспулеїдпоПйег еї а). Зсіепсе 256 (1992) 825. Короче, использованньій промотор является синтетическим промотором, составленньм из промотора гена тимидин каназь! мьіши и 4 злементов РЕАЇ, повторяющихся, происходящих из усилителя полиомь! (УуазуїукК еї аі., ЕМВО ю зо 3. 7 (1988) 2475); промотор Ру-ТК. Зтот промотор управляет зкспрессией гена-репортера, в случає бактериального гена хлорамфеникол ацетил трансферази (САТ): вектор Ру-ТКА-САТ. Векторьй зкспрессий (787 испьітанньїх генов бьіли сконструировали вставкой указанньїх генов в форме фрагментов ВатНі в сайт Ваї! М ллазмидь! ремМ2. Зтот сайт позволяет поместить геньї под контроль раннего промотора ЗМ40.

Клетки ЕР22 с 4095 слияния бьіли заражень! 0,5мкг вектора Ру-ТК-САТ, одного (Ру) или в присутствий ісе) зв вектора зкспрессии, несущего под контролем раннего промотора ЗМ40 ген: сгр2, 2мкг, ОгрЗ3-3, 2мКкг, «Е огЬ2(С203Р) 2мкг, ОгЬ3-3(С162Р) 2мкг, или СгЬ3-3 2мкг ж- Огр2, 2мкг. В каждом случає устанавливают суммарное количество ДНК бмкг с вектором зкспрессии без вставки. Проводят заражение в присутствий липоспермина (Тгапетесіат, ІВЕ-Зергасог). Клетки вьідерживают 48 часов в культуре в среде ДМЕМ, дополненной 0,595 фетальной сьіворотки теленка. Затем определяют активность САТ (трансактивацию РРЕ), «

Как описано У/азуук еї аї. (РМА 85 (1988) 7952). з с Подученнье результать! представлень на фиг.3. Они четко показьшвают, что зкспрессия протеина огЬ3-3 препятствует зффектам активации рецептора фактора роста. Они таюже показьшвают, что избьток (огр2 ;» противодействует влияниям сгр3-3 на ответ фактора роста. 4. СгЬ3-3 вьізьівает апоптоз клеток.

Зтот пример показьшаєт прямое участие Сгр3-3 в клеточном апоптозе. Зто свойство делает особенно ї5» целесообразньми применения для лечения патологий, вьізванньіїх в результате пролиферации клеток (раки, рестенозии т.п.).

Ме, Возникновение апоптоза клеток с помощью сгр3-3 показано (І) путем иньекции рекомбинантного протеина в -І фибробласть ЗТЗ и (ІІ) путем переноса последовательности, кодирующей Сгр3-3, в клетки ЗТ3. (І) Иньекция рекомбинантного протеина - Рекомбинантньй протеин сгЬ3-3 бьіл получен в форме слитого протеина с 51 по протоколу, приведенному с в примере 2. Слитьїй протеин затем обрабатьівают тромбином (0,2595, Зідта) для отделения части О5Т, потом очищают ионообменной хроматографией на колонке монос). Затем фракции, содержащие рекомбинантньй протеин, концентрируют с помощью микроконцентраторов Місгозер (Рійгоп) в фосфатном буфере 20мМ (рН 7), ов бодержащем Т00мМ Масі. Полученньй таким образом очищенньй протеийн инжектируют (1 - Змг/мл) в культивируемье клетки ЗТЗ с помощью автоматического микроинжектора Зппендорфа. Затем клетки (Ф, инкубируют при 3492 и фотографируют с регулярньми интервалами, чтобьї проследить морфологические ко превращения. Полученнье результать! показьвают, что через 5 часов после иньекции сгЬ3-3 основная часть клеток умирает, тогда как иньекция в тех же условиях сОгр2 или мутанта (сгЬ3-3/С162К) не оказьіваєт никакого бо влияния на вьїживаєемость клеток. (І) Перенос последовательности, кодирующей рекомбинантньй протеийн.

Конструируют плазмиду, содержащую последовательность ЗЕО ІЮО Мо 1, кодирующую протеин сгЬ3-3 под контролем раннего промотора вируса 5М40.

Фибробласть! ЗТЗ с 4095 слияния бьіли заражень! в присутствии липоспермина (Тгапзіесіат, ІВЕ-Зергасог) 65 0,5 или 2мг зтой плазмидь зкспрессии. Через 48 часов после заражения 5095 зтих клеток суспендируют в среде, а оставшиеся клетки, прилипшие к стенкам, имеют очень сильнье морфологические изменения (фиг.4). Анализ с помощью злектрофореза на агарозном геле показал, кроме того, что клетки имеют конструкцию фрагментации олигонуклеосомальной ДНК, характерную для мертвьїх клеток (фиг.4). Напротив, клетки, зараженнье в тех же условиях плазмидой зкспрессии Огр2, огр3-3 (С162К), или сгЬ2(С20О3К), сохраняют нормальную морфологию, являются всегда живьми и не имеют никакой фрагментации ДНК. Как показано на фиг.4 созкспрессия Огр2 позволяет препятствовать действиям огЬр3-3.

Зти результать! четко показьшвают, следовательно, что сгЬ3-3 представляет собой ген-убийцу, способньй вьізьувать апоптоз клеток. Как указьівалось вьіше, зто свойство делает применения особенно вьігодньімМи для лечения паталогий, возникших в результате пролиферации клеток, таких как, например, раки, рестенозии т.п. 70 5. Подтверждение зкспрессии ОгЬ3-3 в лимфоцитах, зараженньїх вирусом НІМ.

Зтот пример показьшаєт, что во время цикла заражения лимфоцитов Т вирусом НІМ относительное количество МРНК Огр2 и согЬ3-3 модифицировано и что информационная РНК СгЬ3-3 сверх проявляется в момент обильной продукции вируса и смерти клеток.

Лимфоцитьї! периферической крови заражают вирусом НІМ-1 в двух разбавлениях (1/10 и 1/100) в течение 1, у75 й или 7 дней. Затем анализируют мРНК клеток путем обратной РСК с помощью олигонуклеотидов, специфических к гр2 и сгЬр3-3, чтобьї определить относительную пропорцию информационньїх мРНК сгЬ2 и сгЬ3-3. Использованнье олигонуклеотидьі, специфические к СгбЬ3-3, являются следующими:

Олигонуклеотид ІМ (3):

АТСОСТТССААДАСОСАТОТОСТТТ (5ЕО 10 пев)

Олигонуклеотид М (5):

АТАСАААТОАААССАСАТССОТТТ (5ЕО 10 9)

Полученнье результать! представлень! на фиг.5. Они четко показьівают, что через 7 дней после заражения вирусом НІ мРНК сСгЬ3-3 сверх проявляется. Как показано определением протеина р24 и обратной транскриптазьі вируса, день 7 также соответствует периоду, за которьій наблюдается обильная продукция с

Ввируса.

Іівїе де зедпепсез о (1) Іптогтаїйоп депегаїе: (І) аерозапі: (а) Мот: Кпопе-Рошепс Когег 5.А. ою (в) Кие: 20, амепцие Каутопа Агоп (с) мійе: Апіопу - (е) Раузг: Егапсе ї- (0 Соде розіа!: 92165 (І) Тіге де І Іплепіоп: Сепе ОгЬ3-3, зез магіапів еї Іеиге шіізайопв. о (І) Мотьге де зедшиепсев: 9 «І (ІМ) Рогте Іівіріе раг огаіпаєенг: (а) Туре де зиррогі: Порру аїзк (в) Огаїіпа(еиг: ІВМ РС сотраїйіріє (с) Зувіете 0 Ехріойайоп: РО-ЮОБ/М5-БО5 « (9) І одісівєї: Рабепі іп геіеазе Я1.0, мегвіоп Я1.25 (ОЕВ) шщ с ЗБОЮ Мо 1: й (2) Информация для: «» (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 933 пар оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота «їз» (с) Тип нитей: двунитевая (4) Конфигурация: линейная

Фо (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК -І (І) Гипотетическая: нет (І) Антисмьісловая: нет - (МІ) Происхождение: 4 (а) Организм: Ното 5аріепв (ІХ) Дополнительньсе характеристики: (а) Мот/Сівє: СО5 (Б) Етріасетепі: 37 - 567 (а) Ацігез Кепзеідпетепів: /ргодисі - "Згр-3" іФ) Описание последовательности: ко (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 1: 60 б5

СААТТСССОС СТОСТСАбСА СТСАССАСОС СТСАСА АТО САЛА ОСС АТС СОС АЛА

Мес біз Аза ї1е А1а Буз 1 5

ТАК САС ТРОС ААА ОСТ АСТ ОСА САС САС САС СТО АОС То ААА доб соб тТук Азр Рпе цуз Аза Твг Аза Ар Ар Ар Тем бек Ре Буз Акд 03у 0 15 20

САС АТС СТО ААС ОСТТ ОТТО ААС ОбАА бАА ТО? САТ САб ААС ОТОб ТАС ЛАЄ

Ар Ііє Пем Пух Уаї Те Ап б10 бій Сує Авр біп Або Ткр о Тук Вуз 25 30 35 70 б5СА САС СТТ ЛАТ ОСА ЛАА САС СОС ТТС АТ? СОС ДАЄ ААС ТАС АТА САА

Азіа біз це Азп біу Був Авр б1іу Ре ї1е Рко Буз Азп Тух Х1іе їм

АТС ААА ССА САТ ССС ТТТ ОСА ААС САТ СТО САб САС ТТС ААС ств сте

Меж бує Рко Ніє Рго Рпе сіу Аєп Азр Уаї біп Ні Ре цує Уаї Геа 55 60 55 70

ССА САТ СбА СОС Обб ААС ТАС ТТ СТО тоб сто ото ААб ТТ ААТ ТСт

Ак АБр с1у Аза сіу Буз Тух Рпе рем Тгр Маї Уаї цуз Ре Азп Бех 75 80 85

ТО ААТ САС СТО СТО САТ ТАТ САС АСА ТСТ АСА ТСТ ОСТ ТОС АСА АС їй АБп бій Тех Уа)! Азр Тук Ніз Ак бег Тіт БбБег Маії бег Аг А5зп 30 95 100

САС САС АТА ТС ОСТС ССС САС АТА САЛА САС СТО ССА САС САС ССС АСА бів с1іп І1е Ре ем Агу Ар І1е сії Сів Уаі Ро Сіп біб Рхо Таг 105 110 115

ТАС ТС САС СОС Сто ТТ САС ТТТ САТ СОС САС САС САТ ССА САС сте

Тук Маї сіп А1їа Бей Рве Азр Рпе Азр Рхго біл сій Азр с1у С1ч Тем 120 125 130 Га

Фбс тТТс сс сб оба СУТ ТТТ АТС САТ СТО АТС САТ ААС ТСА бас сс о біу Бе Аку Акуд біу Ар Ре Х1е Ніз Уаї Мес Азр Авп бет Ар Ркго 135 140 145 150

ЛАС ТОС ТОС ААА СА ССТ ТоС САС Осо САС СС ССС АТО ТТ ссс сос аАзп Ткр Ткр Буз біу діа Суз Ніз б1у біп Так біу Меї Рре Рко Аха 155 160 165 ів) вАФ ТАТ ОТО АОС ОСО СТО АМС ОСС ЛАС СТС ТААСАСТСАА САЛОСААТТА -

Авіп оТух Уаї Тіх Рко УМаї Азоп Акд Азп о Уаї 170 175 ч-

ТТТАДАСААА СТСЛАЛААТС ТАЛААСАСАТ АСААААСААТ ТАААСССАСА АССТеССТСТ со

САСАССАССС ТСТСАСССАС ТОСАСААСАС СТОСССОСТО АСССТСТСАС ССТСТСАСТТ «

ТОСТТССААС ТТТАСССССТ ОССАСССбоС СТТОбАТТТА ААЛАТОССАА ААСТТАССТА

ТАААТТААСА АСАСТІТТТРА ТТАСАДАТТТ ТСАСТОоСТоС Тостстттос сстестттТст

СТРІТТТТТС ТТОСТТТТТТ СТСТТСТОТС САТСАСТОСА ТОАСОТІТАА ОбССАСОСТАТ « 20 АСТССТАССТ САССССААТА АААААСАЛСА ДАССАЛААЛА ССССАдТТС - с Информация для а (2) БЕО ІО Мо 2: "» (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 24 пар оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота т» (с) Тип нитей: однониточная б (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК -і (МІ) Происхождение: ши 20 (а) Организм: олигонуклеотид

Описание последовательности сл (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 2:

АТОСБААОССА ТСОССАААТА ТОАС

Информация для (2) БЕО ІО Мо 3: о (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 19 пар оснований іме) (в) Тип: нуклеиновая кислота (с) Тип нитей: однониточная 60 (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК (МІ) Происхождение: (а) Организм: олигонуклеотид

Описание последовательности 65 (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 3:

СААТТСОСАТ ССАТОСАСС САТСОССААА ТАТОАСТТС

(2) БЕО ІО Мо 4: (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 39 пар оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота (с) Тип нитей: однониточная (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК (МІ) Происхождение: 70 (а) Организм: олигонуклеотид ЇЇ

Описание последовательности (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 4:

СААТТСОСАТ ССТТАСАСОСТ ТССОСТТСАС СОбООТОАС (2) БЕО ІО Мо 5: (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 49 пар оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота (с) Тип нитей: однониточная (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК (МІ) Происхождение: (а) Организм: олигонуклеотид ПЇ

Описание последовательности (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 5: сч

САССТТССОО ТТСАСОоСОоОб ТОАСАТААТТ ССОСОСБАААС АТОСООСТС (2) ЗЕО ІО Мо 6: і) (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 20 аминокислот (в) Тип: аминокислота ю зо (с) Тип нитей: однониточная (4) Конфигурация: линейная -- (ІЇ) Тип молекуль!: протеин М (МІ) Происхождение: (а) Организм: пептид (остатки 1143-1162) ісе)

Описание последовательности «г (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 6:

Сіу Тпг Рго біз уаї Рго Уаї Рго Рко Рго Уаї Рго Рго Агу Ат4 АгФ 1 5 10 15 « - с Рко біз бех Аза "» (2) БЕО ІО Мо 7: " (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 8 аминокислот (Б) Тип: аминокислота о (с) Тип нитей: однониточная

Ге» (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: протеин

Ш- (МІ) Происхождение: -о 70 (а) Организм: пептид ЗВРІ

Описание последовательности сл (ХІ) ЗЕО ІО Мо 7:

Рко Рко Рго рем Рго Рхо цем Хаї 1 5

Ф! (2) БЕО ІО Мо 8: (І) Характеристики последовательностей: де (а) Длина: 24 парьі оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота 6о (с) Тип нитей: однониточная (4) Конфигурация: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК (МІ) Происхождение: (а) Организм: олигонуклеотид ЇМ бо Описание последовательности

(ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 8:

АТСОТТТССА ААСОСАТОТО ОТТ

(2) БЕО ІО Мо 9: (І) Характеристики последовательностей: (а) Длина: 24 парьі оснований (в) Тип: нуклеиновая кислота (с) Тип нитей: однониточная (4) Конфигурация: линейная 70 (ІЇ) Тип молекуль!: КДНК (МІ) Происхождение: (а) Организм: олигонуклеотид М

Описание последовательности (ХІ) ЗЕО ІЮ Мо 9;

АТАСААДАТОА АДАССАСАТСС ОСТТ

Claims (8)

Формула винаходу

1.Изолированная нуклеиновая кислота, представленная последовательностью КУТИ, ІП Мо 1 с (8) ІС) «- ча (Се) « « ші с ;» щ» (22) -І - 50 сл Ф) іме) 60 б5

СААТТСОООос СТОСТОАДОСА СТСАССАССС СТСАСА АТС САД ОСС АТС ОСС ААА Меє сії Аза Ії1е А1а Цув 1 5

9 . ТАТ САС ТТС ААА ССТ АСТ ОСА САС САС САС СТО АС ОТТО АДА доб соб Тухк АБр Рпе Пуз А1а Тік Аза Авр АБр АбБр Тем Бех Рпе ПЦув Агкд б1у 2 АС АТС СТО ААб о стТтТ ТТ ААС ОСАА САА ТСТ САТ САС ААС ОТО ТАС АС Авр І1е Пец Ппуз Уаї1ї Гем Аб5п бій Сі Сув АБр біп Азп Тгр Тук Пцуз , 35 15 ССА САС СТТ ААТ ба ААА САС СоС ТРОС АТТ ССС ААб ААС ТАС АТА бАА А1а біз цей Авп о біу Був АБр с1у Рпе Іїе Рго цув Авп Тук І1е 11 40 45 | 50 АТС ААА ССА САТ ССО ТТТ ОбА ДАС САТ СТО САС САС ТС Ал сто сте 20 Меї Ппцув Рхо Нів Рго Рпе сіу Авзп Азр Уаі1 сбіп Ні Ре пуб Уа1ї Ге) 55 60 65 70 ССА САТ ОбА ССС об ААС ТАС ТС СТО ТОСб сто СТО ААС ТТС ААТ ТТ Агу АБр с1у А1а сіу пуб Тух Рпе Те) Тгр Ма1і Уа1ї Пуб5 Рпе Абвп Бех с 25 75 80 85 о ТГС ДАТ САС Сто СТО САТ ТАТ САС АСА ТТ АСА ТСТ ст тес АСА ААС тем Ап бі Іем УМаії1ї Абр Тух Нібв Аку беїт ТиЬх Бех Уа1і1 бек Ак АБпП 90 95 1090. о 30 ! «- "САС САС АТА ТТС СТО СбО САС АТА САД САС СТО ССА САС САС ССО АСА біп біп І1е РБе Пей Акд Авр Ізе бій Сіп Ма1ї Рго Сіп Сіп Ркго Тік - 105 110 115 со ТАС СТО САС ОСС Сто ТТТ САС ТТІ САТ ССС САС САС САТ ОСА СА сто ч Тух Уа1 біп А1а Цей Рпе АБр Рбе АБр Ркго біп сії Авр б1у 610 Тей 120 125 130 « 20 СОС ТС СОС Со ОбА САТ ТТТ АТС САТ Сто АТО САТ ДАС ТСА до сес з с бі1у Рре Акод Аку б1у АБр Рпе Іїе Ніз Уа1ї Меє Азр Абзп бек Авр Ркго 135 140 145 150 ;» І ! ААСОТОоС тоб ААА ОбА ОСТ ТОоС САС соб САС АС бос АТО ТТ СОС СОС 35 Авп Тер Тур Пубє біу А1ї1а Суз НівБ б1у біп Тпг с1у Меї Рпе Рго Ахг4д їз 155 160 165 Ф ААТ ТАТ СТО АС ССС СТО АС ОСОБ ААС СОТС ТААбАСТСАА СААССААТТА -І АБп Тух Уа1 Тіпх Ркго Маї Азп Аку Абп Уа1 цу 5 170 175 сл ТТТАААСААА СТОСАААААТО ТАЛА САСАТ АСААААСААТ ТАААСССАСА АдОоСсТОоССТСТ САСсАоСсАоСсС ТОоТОодОобоАс ТОСАСААСАС СтТоСссоооТо АСССТОТОАС ССТСТСАСТТ ГФ! ТОСТТОСААС ТТТАСОоСОосТ СбСАооСооСс СТТОСОАТТІТА ААААТОССАА ААСТТАССТА йо ТАДАТТААСА АСАСТТТТТА ТТАСАДАТТТ ТСАСТОСТоС ТОСТоТТТоС сотостттст 60 еттттТтттТТс ТТССТТТТТТ СТСТІСТОТО САТСАСТОСА ТОАССТТТАА ООССАССТАТ АСТОСТАССТ САСОССААТА ААДАДАСААСА ААССАААААА СССОААТТО б б , йней , я. ве которая способна ингибировать, по краинеи мере частично, зкспрессию протеина Ск 2 или Ск Е! Е!

2. Вектор, отличающийся тем, что содержит изолированную нуклеийновую кислоту по пункту 1.

3. Вектор по пункту 2, отличающийся тем, что представляет собой вирусньй вектор.

4. Вектор по пункту З, отличающийся тем, что представляет собой вектор, происходящий из аденовирусов, ретровирусов вирусов или вируса осповакцинь. "ДАК пс - У -

5. Вектор по пунктам З или 4, отличающийся тем, что представляет собой вирус дефектньїй для репликации.

6. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит один или несколько векторов по одному из пунктов 2-5.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что предназначена для лечения рака. 70

8. Фармацевтическая композиция по п. б, отличающаяся тем, что предназначена для лечения СПИДа.

9. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит одну или несколько изолированньх нуклеиновьїх кислот по пункту 1, в форме комплекса с Для дД ій сдекстраном, с ядерньми протеинами или с липидами, в сьіром виде или еще включенньсе в липосомь! и предназначена для лечения рака.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что предназначена для лечения рака.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что предназначена для лечения СПИДа. с щі 6) ів) «- у (Се) «

- . и? щ» (о) -і - 70 сл іме) 60 б5